增殖及侵袭能力（精选3篇）
增殖及侵袭能力 篇1
摘要：目的 探讨培养基中氘浓度的下降对宫颈癌Hela细胞增殖、侵袭能力的影响。方法 用含不同氘浓度的培养基培养Hela细胞, 分为150×10-6、100×10-6、75×10-6和50×10-6共4组, 其中, 氘浓度为150×10-6的培养基为对照组, 其他为实验组;用四甲基噻唑蓝 (MTT) 法、划痕实验检测随着培养基中氘浓度下降, Hela细胞增殖和迁移侵袭力的变化;流式细胞术检测含不同氘浓度的培养基对Hela细胞周期的影响;蛋白免疫印迹和免疫组化实验检测含不同氘浓度的培养基对Hela细胞肿瘤相关蛋白p21、Na+/K+-ATPase表达的影响。结果 MTT实验结果显示, 随着培养基中氘浓度的降低Hela细胞增殖得到明显的抑制, 其中氘浓度为50×10-6的培养基抑制效果最明显, 相同条件下与对照组相比在72 h抑制率达到39.54% (P<0.01) ;划痕实验可观察到Hela细胞在氘浓度为75×10-6、50×10-6的培养基中细胞迁移能力得到明显抑制 (P<0.05) ;Hela细胞在氘浓度为75×10-6、50×10-6的培养基中培养24 h后, 流式细胞术检测S期明显低于对照组 (P<0.01) ;Hela细胞肿瘤相关蛋白p21在氘浓度为100×10-6、75×10-6和50×10-6的培养基中的表达与对照组比较, 差异均有高度统计学意义 (P<0.01) 。结论 培养基中氘浓度的下降对宫颈癌Hela细胞增殖、侵袭能力有明显的抑制作用。
关键词：低氘水,Hela,增殖,p21蛋白
宫颈癌是全球女性恶性肿瘤中第3 位最常见的癌症, 也是导致女性癌症患者死亡的第4 大原因, 并占了近10%的新诊断癌症病例和8%的癌症死亡总数[1]。 全球宫颈癌发病率在1980 年每年约378 000 例, 到2010 年已增加到每年约454 000 例[2]。 据估计每年我国新发宫颈癌病例约100 000 例, 占世界子宫颈癌新发病例总数的1/5[3]。 目前宫颈癌的主要治疗手段是手术、放射治疗和化学药物治疗。
在自然界中, 水是由氕 (H) 和氘 (D) 两种氢的非放射性稳定同位素和氧组成的化合物。 氘与氧组成的水称为重水, 天然水中, 氘和氕的比率 (D∶H) 大约是1 ∶ 6600 , 即自然界水中氘的体积分数为0 . 0139 % ~0.0151%[4,5,6,7,8]。 因此, 把氘体积分数低于0.015%的水称为低氘水 (DDW) 。 由于氘对氕在质量上相差约1 倍以及C-D键比C-H键牢固不易断裂, 水中同位素氕和氘含量的变化会导致水的物理化学和核性质显著差异。 有研究表明, 氘能置换生物体内的氕并蓄积下来, 随着生物体内氘浓度的增加, 氢键间交联发生改变, 从而使细胞质刚性显著增加, 有丝分裂受阻滞[9,10,11,12]。饮用DDW可以预防疾病、延缓衰老、活化机体免疫细胞[13,14]。近年国外核医学领域和水生理学领域对DDW在某些癌症等疾病的辅助治疗的应用研究有了重大突破[15,16,17,18]。 本文中将比较多种含有不同浓度氘的培养基对Hela细胞株生长影响。
1 材料与方法
1.1试剂与材料
DDW (体积分数为0.005%, 50×10-6) 购自上海奥特泉公司;胎牛血清 (FBS) 购自Gibco公司;宫颈癌细胞株Hela购自美国ATCC, 并由中美肿瘤所保种;DMEM、RPMI 1640 培养基购自Gibco公司;PI染料购自北京索莱宝公司;核糖核酸酶A (RNase A) 购自Invitrogen;MTT试剂盒购自北京索莱宝公司;p21Waf1/Cip1 (12D1) Rabbit m Ab购自Cell Signaling;β-actin (13E5) Rabbit m Ab购自Cell Signaling;Alexa Flour 800 goat anti -rabbit lg G (H +L) 购自Invitrogen;Na+/K+-ATPase ɑ (H-3) mouse monoclonal lg G2b购自Santa Cruz; 免疫组化试剂Ultra Vision Quanto Detec-tion System HRP Quanto & DAB Quanto购自Thermo Scientific;其他试剂均为进口分析纯。
1.2 细胞培养及实验分组
宫颈癌Hela细胞培养于含有10% FBS的1640培养基中, 置于含5% (体积分数) CO2的37℃培养箱培养。 DDW (100×10-6、75×10-6、50×10-6, 实验组) 与普通超纯水 (150×10-6, 对照组) 按体积比分别配置成用于Hela培养的1640 培养基。
1.3 MTT法检测DDW对细胞增殖活性的影响
用不含血清的1640 培养基饥饿培养Hela细胞24 h后, 用含乙二胺四乙酸 (EDTA) 0.25%胰酶消化, 计数, 以5×103个细胞/孔的密度接种于96 孔培养板中, 每孔分别加入100 μL含10%FBS普通1640 培养基 (150×10-6, 对照组) 或含不同氘浓度 (100×10-6、75×10-6、50×10-6) 1640 培养基 ( 实验组) , 各设3 个复孔, 置于37℃ 、5% ( 体积分数) CO2培养箱中培养24、48、72 h后, 每孔加入20 μL MTT溶液继续培养4 h, 吸去培养液, 每孔加100 μL二甲基亚砜 (DMSO) , 振荡10 min, 选择490 nm波长, 测定各孔的光密度 (OD) 值。结果取3 次实验平均值。计算DDW对细胞的增殖抑制率。 抑制率= (1-实验组OD/对照组OD) ×100%。
1.4 细胞划痕实验
按实验“1.3”项下方法收集细胞加入6 孔板中, 密度为6×105个细胞/孔。 用10%FBS普通1640 培养基 (150×10-6, 对照组) 及含不同氘浓度 (100×10-6、75×10-6、50×10-6) 的1640 培养基 (实验组) 进行培养12 h。 等细胞贴壁完全后, 用移液枪的10 μL无菌枪头在各个孔内轻划一条直线, 在同一放大倍数下测量直线宽度并做好记录, 作为0 h数据。 48 h后, 从培养箱中取出细胞放置在显微镜下观察所划直线宽度变化, 并拍照, 在同一放大倍数下测量直线宽度并做好记录作为24 h数据。将实验组 (100×10-6、75×10-6、50×10-6) 0 h数据与24 h数据差值, 分别和对照组 (150×10-6) 0 h数据与24 h数据差值对比。分析DDW对细胞的侵袭能力影响差异是否有统计学意义。
1.5 流式细胞术检测细胞周期
按实验“1.3”项下方法收集Hela细胞以1×105个细胞/m L的密度接种于直径为6 cm的培养皿中, 分别加入含10%FBS的普通1640 培养基 (150×10-6, 对照组) 或不同氘浓度 (100×10-6、75×10-6、50×10-6) 的1640 培养基 (实验组) 培养24 h, 用0.25%不含EDTA的胰酶消化并收集细胞。 用70%乙醇固定, 4℃过夜, PBS清洗1 次, 1000 r/min离心5 min, 弃上清;PBS再清洗1 次, 1000 r/min离心5 min, 弃上清;每管加入500 μL染色液 (500 μL PBS+2.5 μL PI+2 μL RNase A) , 37℃水浴避光染色30 min, 经60 目尼龙网筛过滤, 立即用流式细胞仪分析。 计数1×104个细胞, 观察细胞周期各期的分布特征。
1.6 Western blot法检测Hela细胞p21 蛋白的表达水平
按实验“1.3”项下方法收集Hela细胞并计数, 以1×105个细胞/m L的密度接种于直径6 cm培养皿中, 分别加入含10%FBS的普通1640 培养基 (150×10-6, 对照组) 或含不同氘浓度 (100×10-6、75×10-6、50×10-6) 的1640 培养基 (实验组) 培养24 h, 弃培养基, PBS洗涤3 次, 加入细胞裂解液RIPA 200 μL裂解, 并加入蛋白酶混合抑制剂20 μL, 置冰上30 min让其充分裂解, 细胞刮子收集细胞, 4℃、10 000 r/min离心15 min, 吸取上清液分装置-80℃备用。 Nano Drop微量紫外分光光度计测定蛋白含量, 各孔的蛋白上样总量一致, 均为100 μg。 电泳浓缩胶80 V, 50 min, 分离胶110 V, 150 min。 经过10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后, 110 V 500 m A转膜120 min, 将蛋白转移至聚偏二氟乙烯 (PVDF) 膜上。采用室温含2.5%脱脂奶粉的PBST (400 m L PBS+40 μL吐温20) 封闭60 min, 按抗体要求的比例加入兔抗p21 一抗 (1∶3000) 、兔抗 β-actin一抗 (1∶3000) , 4℃过夜, 室温复性1 h, PBST洗膜4 次, 10 min/次, 按一定比例 (1 ∶10000) 加入相应的Alexa Flour 800 goat anti-rabbit lg G (H+L) 二抗, 室温避光孵育120 min。 PBST洗去未结合的二抗3 次, 10 min/次, Western blot红外荧光显像仪显影。
1.7 免疫组织化学LP法检测p21、Na+/K+-ATPase蛋白表达变化
按实验“1.3”项下方法将Hela细胞消化后, 分别在6 孔板中每孔平行加入6×105个细胞。 用普通含10%FBS 1640 普通培养基 (150×10-6) 及低氘浓度 (50×10-6) 的1640 培养基进行培养24 h后, 除去培养基, 3%H2O2封闭内源性过氧化物酶, 10% 正常羊血清孵育, 滴加一抗4℃孵育过夜, PBS缓冲液 (Na2HPO48.1 mmol/L, KH2PO41.5 mmol/L, Na Cl 137 mmol/L, 2.7 mmol/L, p H 7.4) 振荡清洗后分别滴加二、 三抗, DAB显色, 苏木精复染。 阳性信号呈棕色细颗粒状。
1.8 统计学方法
采用SPSS 17.0 统计学软件进行数据分析, 计量资料数据用均数±标准差 (±s) 表示, 多组间比较采用单因素方差分析, 组间两两比较采用LSD-t检验, 以P < 0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 低氘水对Hela细胞增殖的影响
含氘浓度为100×10-6、75×10-6、50×10-6的培养基培养24 h对Hela细胞的抑制率分别为16.01%、26.17%和33.39%, 48 h的抑制率分别为7.98%、25.27%和34.5%, 72 h的抑制率分别为11.42%、21.46%和39.54%。各实验组与对照组比较差异均有统计学意义 (P < 0.05或P < 0.01) 。 见表1。
注:与对照组比较, *P < 0.05, **P < 0.01
2.2 低氘水对Hela细胞迁移侵袭能力的影响
含100×10-6、75×10-6、50×10-6DDW的培养基 (实验组) 培养48 h对Hela细胞的迁移侵袭能力有抑制作用, 与对照组 (150×10-6) 相比, 75×10-6、50×10-6DDW的抑制作用较为明显 (P < 0.01) 。 见图1。
*P<0.05, **P<0.01
2.3 低氘水对Hela细胞周期的影响
从图2 可以看出, DDW对宫颈癌Hela细胞周期具有抑制作用, 随着培养基中氘浓度的降低, Hela细胞主要表现为G1、G2期静止或略微增加, S期逐渐降低;其中, 氘浓度为75、50 ppm的抑制作用较为明显, S期明显减少 (P < 0.01) , 见表2。
注:与对照组比较, *P < 0.05, **P < 0.01
2.4 低氘水对p21 蛋白的表达的影响
分别用含氘浓度100×10-6、75×10-6、50×10-61640 培养基 (实验组) 和氘浓度150×10-6的正常1640 培养基 (对照组) 处理Hela细胞24 h后, Western blot法检测发现DDW能够明显上调宫颈癌Hela细胞中p21 蛋白的表达 (图3) 。Hela细胞中p21 蛋白在氘浓度为100、75、50 ppm的培养基 (实验组) 中表达灰度值分别为 (0.717±0.037) 、 (0.979±0.082) 、 (1.146±0.087) , 与对照组 (0.539±0.042) 比较, 差异有统计学意义 (P < 0.05) 。
*P<0.05, **P<0.01
2.5 低氘水对p21、Na+/K+-ATPase蛋白表达的影响
分别用氘浓度为150×10-6普通1640 培养基和氘浓度为50×10-6的1640 培养基处理Hela细胞24 h后, 免疫组化检测p21、Na+/K+-ATPase蛋白表达变化。从图4 中可以看出, 经过染色后可以发现p21 蛋白在氘浓度为50×10-6的1640 培养基中的表达明显高于氘浓度为150×10-6正常1640 培养基;而Na+/K+-ATPase在氘浓度为50×10-6的1640 培养基中的表达明显低于氘浓度为150×10-6正常1640 培养基。
A:150×10-6培养基处理, 孵育p21抗体;B:50×10-6培养基处理, 孵育p21抗体;C:150×10-6培养基处理, 孵育Na+/K+-ATPase抗体;D:50×10-6培养基处理, 孵育Na+/K+-ATPase抗体
3 讨论
在前期研究中发现, DDW可以抑制肺癌、鼻咽癌和肝癌肿瘤细胞的生长以及在延长癌症患者生存期方面具有积极的作用[19,20,21,22,23]。 然而目前尚未见低氘水对宫颈癌的作用研究的相关报道。 本研究将Hela细胞用不同DDW浓度的培养基处理, 用MTT法、划痕实验观察到随着培养基中氘浓度下降, Hela细胞的增殖和侵袭转移能力得到明显的抑制, 在氘浓度为50×10-6的培养基, 72 h的增殖抑制率达到39.54% (P < 0.01) 。 划痕实验发现, DDW对宫颈癌细胞的侵袭能力具有抑制作用, 同样在50×10-6时差异性最明显 (P < 0.01) 。Western blot和免疫组化检测相关蛋白的表达情况, 发现DDW能选择性上调Hela细胞中p21 蛋白的表达水平, 下调Na+/K+-ATPase的表达。 p21waf基因是p53 基因重要的下游基因之一, 其表达产物p21 蛋白是目前已知的具有最广泛激酶抑制活性的细胞周期抑制蛋白。 p21 可以和p53 共同构成细胞周期G1检查站。 因DNA损伤后不经过修复则无法通过G1检查站, 减少了受损DNA的复制和积累, 从而发挥抑癌作用。 Sultana等[24]研究发现, 宫颈癌患者对化疗的敏感性是通过p53-Bax调节通路, 诱导细胞凋亡而起作用;先期化疗可以促进宫颈癌患者CD8+和CD4+阳性的T细胞、自然杀伤细胞诱导产生干扰素 γ, 通过免疫系统而起作用。 Gy觟ngyi等[25]证实, DDW能降低经致癌源处理大鼠C-myc、Ha-ras和p53 基因表达。 本研究用流式细胞术检测含不同氘浓度的培养基对Hela细胞周期的影响。 随着DDW氘浓度的降低, 主要表现为G1、G2期逐渐增加, S期逐渐减少。 这很可能是DDW选择性抑制Hela宫颈癌细胞株增殖和转移能力的分子机制之一, 即通过p53 介导, 有效上调p21影响细胞的周期进程和凋亡, 从而达到对肿瘤细胞的抑制作用。 Na+/K+-ATPase是肿瘤组织异常增生的物质基础之一, 与正常细胞相比, 肿瘤细胞内的Na+/K+-ATPase活性是显著升高的。李春晓等[26]及Usta等[27]研究表明, 抑制Na+/K+-ATPase活力可作为一种新的治疗乳腺癌和肝癌的有效手段。 本研究Western blot和免疫组化结果显示, 经DDW处理的Hela细胞, Na+/K+-ATPase蛋白明显下调。 这些结果说明, 降低细胞生长环境中的氘体积浓度, 可以抑制Hela宫颈癌细胞株的增殖和转移能力, DDW具有选择性抗肿瘤的靶向生物效应。
人类乳头状瘤病毒 (HPV) 和吸烟是宫颈癌的两大危险因素, HPV感染是最主要的因素, 几乎所有的宫颈癌都与HPV感染有关[28]。 宫颈癌的主要治疗手段是手术、放射治疗和化学药物治疗。 手术治疗主要适用于早期宫颈癌 (ⅠA~ⅡA期) 患者。虽然传统上认为, 宫颈癌对化疗药物不敏感, 治疗方法以手术和放疗为主, 但是大量的肿瘤细胞学研究进展和临床实践证实, 对于亚临床和微小的转移灶手术和放疗并不能完全控制和消除。 因此, 作为治疗癌症有效方法之一的化疗在宫颈癌的综合治疗中的地位也越来越受到重视。 近年来, 研究表明, 癌细胞增长机制与氘原子有很大的关系, 通过降低体内氘的浓度, 可以抑制体内癌细胞的增长。 因此, DDW作为新型无毒副作用抗癌辅助治疗剂在肿瘤治疗中将具有重要应用前景。
增殖及侵袭能力 篇2
1 材料和方法
1.1 细胞系和细胞培养
小鼠腹水型肝癌高、淋巴道转移株Hca-F和Hca-P细胞由大连医科大学病理教研室自建并冻存。复苏液氮冻存的Hca-F和Hca-P细胞,用含10%胎牛血清(PPA公司)的RPMI 1640完全培养基(Invitrogen公司)37℃、5%二氧化碳(CO2)孵箱(Thermo公司)培养细胞24 h,收集细胞分别进行下列实验。
1.2 细胞增殖能力的检测
1.2.1 制作吸光度与细胞数关系的标准曲线
无血清培养基培养Hca-F和Hca-P细胞24 h,调整细胞浓度为1×104/m L、2×104/m L、4×104/m L、8×104/m L和1.6×105/m L分别加入96孔板中,每孔加100μL,每组设5个复孔,然后再向每孔细胞悬液中加入10μL CCK8(日本Dojindo公司),37℃、5%CO2孵箱继续孵育1 h,酶标仪(Thermo公司)在450 nm波长下测每组的吸光度。RPMI 1640完全培养基加CCK8作为空白对照,细胞吸光度为测得的吸光度减去空白对照。
1.2.2 CCK8法检测细胞增殖能力
收集Hca-F/Hca-P细胞,用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养基调整细胞浓度为1×104/m L,加入96孔板中,每孔加100μL,每组设5个复孔,分别在5%CO2孵箱中37℃孵育0、24和48 h,然后再向每孔细胞悬液中加入10μL CCK8,37℃、5%CO2孵箱继续孵育1 h,酶标仪在450 nm波长下测每组的吸光度,观察不同的时间点细胞数目的变化。RPMI 1640完全培养基加CCK8作为空白对照。
1.3 Transwell小室法检测细胞侵袭能力
无血清培养基培养Hca-F和Hca-P细胞24 h,然后分别稀释Hca-F和Hca-P细胞至3×105/m L,每个Transwell小室加入50μL Matrigel(BD公司),5%CO2孵箱37℃孵育1 h,无血清培养基水化30min。各组细胞悬液按每孔100μL加入Transwell小室(Coring公司)的上室,在下室加入500μL含20%胎牛血清的RPMI 1640完全培养基37℃、5%CO2孵箱培养细胞24 h。0.1%的结晶紫染色20 min。在正置显微镜(Olympus公司)下观察Transwell小室下室面发生侵袭的细胞,每组随机选取5个视野进行计数。同时对下室培养基进行计数,以观察下室有无细胞的漏出。
1.4 膜联蛋白A7在亚细胞结构中的表达
1.4.1 亚细胞结构的分离提取
利用Proteo Extract subcellular Proteome Extraction Kit(S-PEK)(Calbiochem公司)分别分离提取上述Hca-F细胞和Hca-P细胞中细胞浆、细胞膜、细胞核和细胞骨架成份。
1.4.2 双向凝胶电泳
在10%聚丙烯酰胺凝胶中进行,膜联蛋白A7抗体(Sigma公司)浓度1︰1 500,HRP标记山羊抗鼠Ig G多克隆抗体(北京中杉金桥公司)浓度1︰1 500。内参:细胞浆采用GAPDH(康晨公司);细胞膜采用Pan-cadherin(Abcam公司);细胞核采用C-jun(Abcam公司);细胞骨架采用β-actin(Santa Cruz公司)。为了最小化各种变量的影响,蛋白表达采用相对值,即目的蛋白与内参之比。
1.5 统计学方法
所有实验数据应用SPSS 13.0(snow panther,USA)进行分析,数据结果以均数±标准差(±s)表示,膜联蛋白A7亚型差异用独立样本的t检验,采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 细胞增殖能力的检测
2.1.1 制作标准曲线
Hca-F/Hca-P细胞数对应的吸光度(见附表)及标准曲线(见图1)。
2.1.2 CCK8检测细胞增殖能力
无细胞单纯1640孵育0、24和48 h后加入CCK8的吸光度为(0.106±0.001 vs 0.097±0.003 vs 0.097±0.003,P>0.05),1640空白对照在3个时间点差异无统计学意义。孵育第0 h,Hca-F和Hca-P细胞各1 000个,未孵育(即孵育0 h)CCK8检测吸光度(0.146±0.015 vs 0.147±0.03,P>0.05),Hca-F和Hca-P细胞各1 000个,继续孵育24 h及48 h,CCK8检测吸光度为(0.866±0.102 vs 0.190±0.003;2.414±0.020vs 0.424±0.030,均P<0.05),即在第24 h和第48 h两个时间点,Hca-F细胞的增殖能力都高于Hca-P细胞,二者差异有统计学意义(见图2)。
注:吸光度值=测量值-空白对照
用CCK8法检测各时间点(0、24和48 h)的吸光度。0 h:细胞未孵育;24 h:细胞孵育24 h后;48 h:细胞孵育48 h后。F cell为Hca-F细胞;P cell为Hca-P细胞;1640为无细胞,单纯加入1640
2.2 Transwell小室检测细胞侵袭能力
Hca-F细胞在Transwell小室穿过膜的细胞数明显高于Hca-P细胞,二者有统计学意义[(90±4)个和(69±9)个,P<0.05]。下室未发现有细胞漏出。结果见图3。
用Transwell小室检测各组细胞的侵袭能力(即穿膜细胞数)。Hca-F细胞在Transwell小室穿过膜的细胞数[(90±4)个]明显高于Hca-P细胞[(69±9)个](P<0.05)
2.3 膜联蛋白A7在亚细胞结构中的表达
膜联蛋白A7的47 k D和51 k D两种亚型在Hca-F细胞和Hca-P细胞均有表达。其中,47 k D亚型在Hca-F细胞的细胞浆、细胞膜细胞器膜、细胞骨架中的表达均明显高于Hca-P细胞,两株细胞在上述3种亚细胞器的表达依次为(73±7)%vs(49±19)%(P<0.05)、(36±8)%vs(24±9)%(P<0.05)和(53±7)%vs(40±12)%(P<0.05)。47 k D亚型在Hca-F细胞和Hca-P细胞细胞浆中的表达都明显高于在细胞膜细胞器膜、细胞核、细胞骨架中的表达,Hca-F细胞为(73±7%)vs(36±8)%、0及(53±7)%(P<0.01);Hca-P细胞为(49±18)%vs(24±9)%、0及(40±12)%(P<0.05)。在Hca-F细胞和Hca-P细胞细胞膜、细胞核、细胞骨架中未见明显51 k D亚型的表达。见图4。
Hca-F细胞Hca-P细胞A为膜联蛋白A7在Hca-F/P细胞的表达结果;B为GAPDH在Hca-F/P细胞细胞浆的表达结果;C为Pan-cadherin在Hca-F/P细胞细胞膜、细胞器膜的表达结果;D为C-jun在Hca-F/P细胞细胞核的表达结果;E为β-actin在Hca-F/P细胞细胞骨架的表达结果
3 讨论
Hca-F细胞和Hca-P细胞是利用可移植性小鼠腹水性肝癌细胞(H22)接种于有正常免疫功能的615小鼠足垫,经多次淋巴系统筛选而得到的2个来源于同一亲本细胞的细胞株,但两者淋巴道转移能力明显不同,Hca-F细胞淋巴道转移率为70%~80%,而Hca-P细胞淋巴道转移率为20%~30%[1,2,3]。体外实验证实[1,11,12],Hca-F细胞无论是在增殖能力还是侵袭能力都明显高于Hca-P细胞。膜联蛋白A7主要在细胞浆表达,其次为细胞骨架结构及细胞膜和细胞器膜;两种细胞均以47 k D亚型表达为主,且在Hca-F细胞的表达高于Hca-P细胞。
膜联蛋白A7是Ca2+依赖的磷脂结合蛋白,已有实验[13]表明大多数的膜联蛋白A7位于静息细胞的胞浆中,至少是在培养细胞中。膜联蛋白A7在细胞中的分布直接间接地与细胞浆和内膜系统相联系,参与胞吐胞饮,与细胞骨架蛋白结合,并与膜运输、Ca2+的自稳态调节与信号转导、细胞分化和细胞增殖等有关[4]。这些均与定位实验结果,膜联蛋白A7特别是47 k D蛋白亚型主要分布于细胞浆、细胞膜、细胞骨架中相符合。实验表明[13,14,15]膜联蛋白A7的分布依赖于细胞钙离子的水平,在钙离子载体中孵育30 min,膜联蛋白A7显示定位于细胞膜,而孵育4 h后,则显示为核膜定位。本实验所发现的膜联蛋白A7特别是47 k D亚型在细胞浆中的大量表达,是否与高淋巴道转移潜能的肿瘤细胞具有更加富集的钙离子浓度有关,还值得进一步深入研究。但研究中有关肿瘤细胞侵袭实验结果已表明[1],高淋巴道转移潜能的Hca-F细胞较之低淋巴道转移潜能的Hca-P细胞具有更加活跃的增殖与侵袭能力。因此可以推测其与细胞内钙离子调节具有某种相关。
膜联蛋白A7由于在其N末端不同的剪切产生了47 k D和51 k D两个蛋白亚型,有文献[9]表明,在人和小鼠的大部分组织仅表达47 k D亚型;骨骼肌仅表达51 k D亚型;而在脑和心脏这两种亚型都表达。本实验显示膜联蛋白A7在高/低淋巴道转移细胞模型中,47 k D亚型的表达都明显高于51 k D亚型,而51 k D亚型仅少量存在于胞浆中,即在肝癌组织中仍以47 k D亚型表达为主。这些可能与细胞的分化状态有关。
增殖及侵袭能力 篇3
CD31 又称为血小板- 内皮细胞黏附分子(plateletendothelialcelladhesionmolecule-1,PECAM-1/CD31),最早发现于1990 年[3],分子量约为130 k Da,其结构属于免疫球蛋白超家族成员,近年来的研究表明CD31 与动脉粥样硬化症、肺癌及卵巢癌[4,5,6]等多种疾病的发病机制有关,然而,CD31在肝细胞癌的发病机制中作用的报道尚少。本文旨在研究CD31 在肝细胞癌患者血清中的表达,以及干扰肝癌细胞中CD31 表达后,对肝癌细胞侵袭及增殖能力的影响,从而对于肝细胞癌的防治提供一定的理论基础。
1 资料与方法
1.1 临床资料
选取2013 年6 月-2015 年3 月,本科室肝癌手术患者45 例为研究组。男21 例,女24 例;年龄39~75 岁,平均(51.67±7.37)岁。所有患者术前均未经介入或放化疗等治疗,均接受了肝癌根治性切除术,所有患者术后病理学证实为肝细胞癌,且未发现远处转移,排除合并其他慢性病如高血压、糖尿病,或其他肿瘤的患者。对照组为同期健康体检人群45 例。其中,男20 例,女25 例;年龄37~78 岁,平均(54.02±7.98)岁。
1.2 主要试剂
SMMC-7721 细胞购自ATCC公司,DMEM培养基、胎牛血清(FBS)购自Gibco公司,荧光标记的2'-O- 甲基si RNA CD31-FAM、稳定阴性对照si R-NA CD31-NC和CD31 引物购自上海吉玛生物技术有限公司,RNA提取试剂盒Trizol购于Gibco公司,Real-time PCR试剂盒购自Roche公司,抗CD31 抗体购自Abcam公司,抗 β-actin抗体购自Santa Cruz公司,羊抗兔二抗购自Santa Cruz公司,CCK-8购自上海博谷生物科技有限公司。
1.3 细胞培养
SMMC-7721 细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养,细胞生长至对数生长期时,以1×105个/ 平皿,接种于6 cm平皿,或以4×106个细胞/ 平皿,接种于10 cm平皿,孵育细胞。
1.4 细胞转染
采用脂质体2000(美国Invitrogen公司)对人肝癌细胞SMMC-7721 中CD31 m RNA抑制表达,于48 h候检测其干扰效率。CD31 si RNA干扰序列:正向5'-UUCCGUUCUAGAGUAUCUG-3',反向5'-CAGA UACUCUAGAACGGAA-3'。
1.5 检测指标
1.5.1 ELISA检测肝癌患者血清CD31 表达水平取研究组和对照组患者外周血2 ml,静置6 h后,离心取上清,依照产品说明书,ELISA试剂检测两组CD31 的表达水平。
1.5.2 Real-time PCR检测肝癌细胞中CD31m R-NA表达水平将培养至对数生长期的肝癌细胞,用Trizol提取各组总RNA,反转录为c DNA,以作为GAPDH内参,依照产品说明书,测定TNF-α 的变化。CD31 引物序列正向:TCCAGGCCAGCTGCTC-CACTT;反向:GCCTTCCGTTCTCTTGGTGAGGC。
1.5.3 Western blot检测肝癌细胞中CD31 蛋白表达水平肝癌细胞培养至对数生长期,按照蛋白抽提步骤,提取总蛋白;采用BCA法测定总蛋白浓度,经SDS-PAGE电泳后转移到NC膜上,5%脱脂奶粉室温封闭1.5 h,TBST洗涤后,分别加入1∶1 000抗CD31 抗体、1∶500 抗 β-actin抗体,4 ℃孵育过夜,TBST洗涤后加入1∶5 000 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗,37℃孵育1 h,再用TBST洗涤,化学发光并曝光成像。Weastern blot检测以 β-actin条带作为内参,CD31 条带与其比较,观察CD31 蛋白表达变化。
1.5.4 细胞迁移实验将处于对数生长期的肝癌细胞,调整细胞密度至4×l05个/ml,按0.1 ml/ 孔加入到transwell小室的上层,小室下层加入1 ml的含有10%血清的培养液。培养24 h后,对己迁移至小室下层的细胞进行计数(随机选取5 个视野)。
1.5.5细胞增殖实验将对数生长期的细胞以50%的汇合率接种至96 孔板,每组设置3 个复孔,同时设置不含细胞的空白培养基作为对照,37℃,5%二氧化碳CO2,95%湿度下培养24 h后,分别在培养孔加入10μl CCK-8 溶液;再置于孵箱孵育2 h,酶标仪检测450 nm的吸光值,每孔实测OD值需减去空白对照OD值,取3 复孔平均值,记录OD值。
1.6 统计学方法
数据以均数±标准差(±s)表示,采用SPSS19.0 软件进行统计分析。两组间差异比较采用Student’s t检验,P <0.05 认为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 肝癌患者血清CD31 表达水平
与建康人群相比,CD31 在肝癌患者血清中的表达水平显著增高,差异有统计学意义(P <0.001),提示CD31 的高表达在肝癌的发生发展中可能发挥重要的调节功能(表1)。
2.2 肝癌细胞转染si RNA CD31 后CD31 表达变化
SMMC-7721 肝癌细胞转染si RNA CD31 后,同对照相比,CD31m RNA的表达水平明显下降(见图1A),CD31 蛋白表达水平也明显降低(见图1B),差异均具有统计学意义,提示低表达CD31 肝癌细胞构建成功。
2.3 肝癌细胞中CD31 对细胞侵袭功能的影响
SMMC-7721 肝癌细胞转染si RNACD31 后,同对照相比,transwell小室下层细胞数量显著减少(图2),差异具有统计学意义(P <0.001),提示了CD3具有增强肝癌细胞侵袭能力。
2.4 肝癌细胞中CD31 对细胞增殖的影响
SMMC-7721 肝癌细胞转染si RNA CD31 后,同对照相比,肝癌细胞增殖显著减少(图3),差异具有统计学意义(P <0.001),提示了CD31 具有增强肝癌细胞侵袭能力。
注:†与正常组对比,t =14.24,P <0.05
†P<0.001;A:肝癌细胞中CD31mRNA表达变化;B:肝癌细胞中CD31蛋白表达变化
3 讨论
肝癌是常见的恶性肿瘤之一,在全球范围内,肝癌的发病率居恶性肿瘤的第5 位,病死率居第3 位,而且55%的肝癌患者分布于我国[7]。目前,肝癌的发病机制尚未明确,诊断和治疗仍是临床难题之一。近年来,研究学者认为基因调控在肝癌发病机制中起到重要作用,特别是对肝癌细胞的黏附、侵袭和增殖的影响[8],所以,肝癌细胞特异性的基因调控靶点是肝癌的诊断和治疗的全新研究方向。
CD31/PECAM-1 是血管内皮细胞特异性标志物,可以通过细胞间、细胞核细胞基质间的相互作用,参与多种信号转导和炎症反应。随着研究的深入,在肿瘤细胞表达CD31,在肿瘤的基因调控中发挥作用[9,10]。本研究检测肝癌患者血清CD31 的表达水平明显高于正常健康人群,提示高表达CD31 可能起到调控肝癌细胞中的信号途径[11],从而影响肝癌的发生发展。这与DAROM等人[12]研究发现CD31/PECAM-1 在非何杰金氏胃淋巴瘤患者体内表达增高结果是一致的,从侧面支持了本研究。
小分子干扰RNA(small interference RNA,si R-NA)正逐渐取代反义核苷酸技术,成为肿瘤基因疗法的理想工具[13]。研究表明,阳离子脂质体可有效地实现si RNA的靶向输送,2'-O- 甲基修饰的si RNA可提高si RNA的稳定性[14]。本研究通过si RNA干扰抑制肝癌细胞中CD31 的表达,用以研究CD31 对肝癌细胞的影响。结果显示采用si RNA干扰抑制CD31 的表达后,检测肝癌细胞中CD31 的基因和蛋白表达水平均显著低于未受干扰的肝癌细胞,,说明低表达CD31 肝癌细胞株构建成功。
肿瘤细胞的侵袭和增殖能力与肿瘤的转移和生长速度密切相关,影响着肿瘤的发展和转归[15,16]。本研究运用已构建成功的低表达CD31 肝癌细胞与未受干扰抑制高表达CD31 肝癌细胞相比,通过tran-swell实验发现高表达CD31 肝癌细胞的侵袭能力显著强于低表达CD31 肝癌细胞,说明CD31 表达水平的高低影响着肝癌细胞的侵袭能力。此外,本研究运用CCK-8 实验研究肝癌细胞增殖能力发现,高表达CD31 肝癌细胞的增殖能力显著强于低表达CD31 的肝癌细胞,说明CD31 表达水平越高,肝癌细胞的增殖能力越强。CD31 的表达水平影响肝癌细胞的侵袭和增殖能力,这与TACHEZY M等人在导管内乳头状黏液性肿瘤中的研究结果是一致的[17]。