侵袭及转移（精选7篇）
侵袭及转移 篇1
骨桥蛋白(osteopontin,OPN)为多功能的磷酸化糖蛋白,能强化细胞的黏附、趋化和迁移,从而促进恶性肿瘤的侵袭转移,与多种肿瘤的发生、发展、预后有关[1]。基质金属蛋白酶-9 (matrix metallo- proteinases-9,MMP-9)为一种与肿瘤侵袭和转移密切相关的蛋白酶,其主要作用是降解细胞外基质及基底膜,目前的研究认为MMP-9参与了肿瘤生长、侵袭及转移的多个阶段[2]。故此我们应用免疫组化的方法,对不同组织分级、临床分期的胰腺癌组织标本中的OPN、MMP-9进行检测,以判断这两种大分子物质与胰腺癌的浸润转移有无关联。
1 资料与方法
1.1 研究对象
46例标本均取自2007-2010年于我院行胰腺癌根治性切除的患者,肿瘤组织均被术后病理证实,正常胰腺组织取自距肿瘤组织3cm以上的正常胰腺组织,且病理切片证实切缘无癌细胞残留。患者男性25例,女性21例,年龄56.36±12.59岁。所有标本均为导管腺癌,病理分级:高分化腺癌14例;中分化腺癌17例;低分化腺癌15例。临床分期:采用2002年胰腺癌国际分期(TNM分期),其中Ⅰ期12例;Ⅱ期18例;Ⅲ 16例;Ⅳ 0例。46例患者中术后病理有淋巴结转移34例,无淋巴结转移12例。
1.2 实验方法
采用免疫组化二步法对病理切片进行染色,抗体稀释度均为1:100(兔抗人骨桥蛋白多克隆抗体、鼠抗人基质金属蛋白酶-9单克隆抗体及UltraSensitiveTSP试剂盒均购自福州迈新生物工程有限公司),阴性对照采用PBS及正常血清, 采用阳性表达的胃癌组织切片作为OPN阳性对照, 采用阳性表达的乳腺癌组织切片作MMP-9阳性对照。具体实验步骤如下:⑴切片脱蜡、水化 ;⑵PBS洗2-3次各5min ;⑶3%过氧化氢滴加在TMA上,室温静置10min; ⑷PBS洗2-3次各5min; ⑸抗原修复;⑹PBS洗2-3次各5min ;⑺滴加正常山羊血清封闭液,室温20min,甩去多余液体;⑻滴加Ι抗50μL,室温静置1h或4℃过夜或37℃1h;⑼4℃过夜后需在37℃复温45min;⑽PBS洗3次每次2min;⑾滴加Ⅱ抗45-50μL,室温静置或37℃1h;⑿Ⅱ抗中可加入0.05%的 tween-20;⒀PBS洗3次各5min;⒁DAB显色5-10min,在显微镜下掌握染色程度 ;⒂PBS或自来水冲洗10min; ⒃苏木精复染2min,盐酸酒精分化;⒄自来水冲洗10-15min; ⒅脱水、透明、封片、镜检。
1.3 结果判定
于400倍光学显微镜下观察每张切片的10个视野,根据染色程度和染色细胞百分比分为阴性和阳性,阳性:阳性细胞>5%或色深染;阴性:阳性细胞<5%或无阳性细胞(OPN、MMP-9阳性表达以细胞浆或细胞膜中存在棕褐色颗粒物为准)。
1.4 统计学方法
采用SPSS 12.0软件包进行统计学分析,计数资料采用x2检验和(或)四格表的Fisher精确概率法,P<0.05有显著性差异。
2 结果
2.1 OPN、MMP-9在肿瘤及正常组织中的表达情况
两种大分子均主要表达于细胞胞质中。46份正常胰腺组织标本中OPN阳性表达13份(28.3%);46份胰腺癌组织中31份(67.4%)表达呈阳性,胰腺癌与正常组织之间阳性表达率有显著性差异(P<0.01)。46份正常胰腺组织标本中MMP-9阳性表14份(30.4%);46份胰腺癌组织中30份(65.2%)表达呈阳性,胰腺癌与正常组织之间阳性表达率有显著性差异(P<0.05)。
2.2 肿瘤分化程度与两种大分子蛋白表达之间的关系
2.2.1 肿瘤分化程度与OPN表达的关系
14份高分化腺癌标本中有6份(42.9%)OPN呈阳性表达,17份中分化腺癌标本中有13份(76.5%)呈阳性表达,高、中分化腺癌阳性表达率无显著性差异(P>0.05);15份低分化腺癌标本中有12份(80.0%)OPN呈阳性表达,高、低分化腺癌阳性表达率有显著性差异(P<0.05);中、低分化腺癌阳性表达率无显著性差异(P>0.05),见表1。
2.2.2 肿瘤分化程度与MMP-9表达的关系
14份高分化腺癌标本中有5份(35.7%) MMP-9呈阳性表达,17份中分化腺癌标本中有12份(70.6%)呈阳性表达,高、中分化腺癌阳性表达率无显著性差异(P<0.05);15份低分化腺癌标本中有13份(86.7%) MMP-9呈阳性表达,高、低分化腺癌阳性表达率有显著性差异(P<0.05);中、低分化腺癌阳性表达率无显著性差异(P>0.05),见表2。
2.3 临床分期与两种大分子蛋白表达表达之间的关系
2.3.1 OPN表达与临床分期之间的关系
12份临床分期为Ⅰ期胰腺癌标本中有4份(33.3%)OPN呈阳性表达,18份临床分期为Ⅱ期胰腺癌标本中有13份(72.2%)呈阳性表达,临床分期Ⅰ、Ⅱ期胰腺癌之间阳性表达率有显著性差异(P<0.05);16份临床分期为Ⅲ期胰腺癌标本中有14份(87.5%)OPN呈阳性表达,Ⅰ、Ⅲ期之间阳性表达率有显著性差异(P<0.05);Ⅱ、Ⅲ期阳性表达率无显著性差异(P>0.05),以上说明随着临床分期增长,OPN表达率升高,见表3。
2.3.2 MMP-9表达与临床分期之间的关系
12份临床分期为Ⅰ期胰腺癌标本中有5(41.7%) MMP-9呈阳性表达,18份临床分期为Ⅱ期胰腺癌标本中有11份(61.1%)呈阳性表达,临床分期Ⅰ、Ⅱ期胰腺癌之间阳性表达率有显著性差异(P>0.05);16份临床分期为Ⅲ期胰腺癌标本中有14份(87.5%) MMP-9呈阳性表达,Ⅰ、Ⅲ期之间阳性表达率有显著性差异(P<0.05);Ⅱ、Ⅲ期阳性表达率无显著性差异(P>0.05),见表4。
2.4 淋巴结转移与两种大分子表达之间的关系
2.4.1 OPN表达与淋巴结转移之间的关系 有淋巴结转移的34份标本中,28份(82.4%) OPN阳性表达,无淋巴结转移的12份标本中,3份(25.0%) OPN阳性表达,两组间有显著性差异(P<0.05), 见表5。
2.4.2 MMP-9表达与淋巴结转移之间的关系 有淋巴结转移的34份标本中,25份(73.5%) MMP-9阳性表达,无淋巴结转移的12份标本中,5份(41.7%) MMP-9阳性表达,两组间无显著性差异(P>0.05), 见表6。
3 讨论
骨桥蛋白存在于人的膀胱、肺、支气管、胃肠道、胰腺等组织以及乳汁、尿等体液中,伴有远处脏器转移的肿瘤患者血液中也可检测到。1979年SENGER等[3]报道了一种特异性分泌蛋白与肿瘤的转化、浸润和转移存在密切关系,遂称之为转化相关性磷酸蛋白。之后FRANZEN等从骨组织中分离出了这种蛋白,并正式命名为骨桥蛋白。OPN被发现后受到学术界的很大关注,目前大量基础研究已证实OPN与多种肿瘤的发生、发展及转移密切相关[4]。通过我们的研究我们认为OPN在胰腺癌组织中的表达显著高于正常胰腺组织,且肿瘤分化程度越低、临床分期越晚其表达越显著,同时有淋巴结转移的患者较无淋巴结转移的患者表达显著。
基质金属蛋白酶-9是一系列能降解细胞外基质及基底膜的内肽酶一种,它能有效降解基质中的明胶胶原和Ⅳ型、Ⅴ型,目前的大量研究认为它与肿瘤浸润转移关系密切[5]。我们的研究我们证明MMP-9在胰腺癌组织中的表达显著高于正常胰腺组织,且肿瘤分化程度越低、临床分期越晚其表达越明显,但有淋巴结转移的患者和无淋巴结转移的患者之间表达无显著性差异。
参考文献
[1] Coppola D, SzaboM, Boulware D, et al.Correlation of osteopontin protein expression and pathoogical stage across a wide variety of tumor histologies[J]. Clin CancerRes, 2004, 10(1): 184-190.
[2] Pryczynicz A, Guzińska Ustymowicz K, Dymicka Piekarska V,et al.Expression of matrix metalloproteinase-9 in pancreatic ductal carcinoma is associated with tumormetastasis formation[J]. Folia Histochem Cytobio,2007, 45(1): 37-40.
[3] Senger DR,Wirth DF,Hynes RO.Transformation specific secreted phosophoproteins[J]. Nature,1980,286(5773):619-621.
[4]Jens Koopmann,Neal S,Fedar ko,et al.Evaluation of Osteopontinas Biomarker for Pancreatic Adenocarcinoma[J].Cancer Epidemi-ology Biomarkers&Prevention,2004,13:487-491.
[5]Sienel W,Hellers J,Alicia MH,et al.Prognostic impact of matrixmetalloproteinase 9 in operable non-small cell lumg cancer[J].Int J Cancer,2002,103:647-651.
侵袭及转移 篇2
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料:
人乳腺癌细胞株MDA-MB-231 (重庆医科大学病理系惠赠) 、小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞 (重庆医科大学检验系惠赠) 、人脐静脉内皮细胞ECV304 (重医附一院神经病实验室惠赠) ;Millicell小室 (Millipore公司) 。
1.1.2 试剂:
MTT (Sigma公司) ;芹菜素 (纯度:99.9%, 陕西慧科植物开发有限公司) ;Matrigel胶、纤维连接蛋白 (BD公司) ;Bcl-2、Bax、cyclinB1、VEGF、MMP9、E-cd单克隆抗体, 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG、DAB显色试剂盒 (北京中衫公司) 。
1.1.3 仪器:
恒温培养箱 (Thermo公司) ;超净工作台 (安泰公司) ;高速离心机 (Beckman公司) ;倒置相差显微镜 (OLYMPUS公司) ;电子天平 (精天公司) ;酶标仪 (北京艾普) ;GD-8型病理影像系统 (成都金盘电子科大多媒体技术有限公司) 。
1.1.4 培养基:
RPMI-1640 (Gibco公司) ;胎牛血清 (天津TBD公司) 。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养:
用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液置于37℃、5% CO2的培养箱, 按常规方法换液、传代。芹菜素溶于二甲基亚砜 (DMSO) , 用1640培养基稀释至所需浓度, DMSO终浓度均为0.1%。
1.2.2 芹菜素对MDA-MB-231增殖抑制及IC50测定:
将对数生长期MDA-MB-231细胞胰酶消化, 制成5.0×104个/mL单细胞悬液, 接种于96孔板, 每孔加入200μl (即1.0×104个/孔) , 置于37℃、5% CO2培养箱培养12h后, 设试剂对照组 (含等量溶剂不含药物及细胞) 、细胞对照组 (接种细胞不含药物) 、实验组 (接种细胞加入干预药物至最终浓度分别为20μmol·L-1、40μmol·L-1、80μmol·L-1、160μmol·L-1) , 每组设6个复孔, 分别培养24h、48h、72h后加入MTT (5g·L-1) 20μl, 继续培养4h后吸出上清, 每孔加DMSO 150μl振荡溶解, 570nm处测定各孔吸光度A值。计算增殖抑制率 (%) =[ (对照组吸光度值一处理组吸光度值) /对照组吸光度值]×100%。用直线回归方程求得芹菜素分别作用不同时间的半数抑制浓度IC50, 实验重复3次, 取平均值。
1.2.3 芹菜素对MDA-MB-231细胞凋亡率和周期变化的影响:
取对数生长期细胞, 待细胞贴壁后实验组加入芹菜素至最终浓度40μmol·L-1、80μmol·L-1, 48h后分别收集细胞, 用10%胎牛血清的RPMI-1640调整细胞浓度为1×106个/ml, 冷PBS洗2遍, 加入预冷70%乙醇固定, 用碘化啶 (PI) 进行DNA染色, 流式细胞仪测定细胞周期和凋亡率, 实验重复3次, 取平均值。
1.2.4 细胞黏附能力试验:
实验分为对照组和AP组, 每组设6个平行孔, 将Matrigel与1640培养基按1∶3稀释后取20μl均匀地铺在96孔板上, 置37℃ 1～2h, PBS洗2次待用。AP组细胞处理同1.2.3, 用10%胎牛血清的RPMI-1640调整细胞浓度为1×106个/ml, 每孔加入100μl细胞悬液, 于37℃、5% CO2培养箱分别培养30min、60min、120min后, 弃培养液, PBS洗2次, 加入100μl无血清RPMI-1640, 120min后各孔加入MTT (5g·L-1) 20μl, 测定各孔吸光度A值。计算黏附抑制率 (%) =[ (对照组吸光度值一处理组吸光度值) /对照组吸光度值]×100%, 实验重复3次, 取平均值。
1.2.5 体外侵袭实验:
将1mg/ml的纤维连接蛋白用1640培养液稀释至50μg/ml, 取30μl均匀铺在Millicell小室聚炭酯膜的下层面, 置37℃1h烘干;再将稀释后Matrigel取50μl均匀铺在上层面, 置37℃ 1～2h烘干待用, 上室加入400μl浓度为5×105个/ml的无血清1640单细胞悬液, 下室加入600μl趋化剂 (NIH3T3细胞在无血清1640培养液中培养24h后, 离心收集的上清液) 实验分成两组:对照组 (含等量溶剂培养48h后的细胞) ;AP组 (最终浓度为34.5μmol/L芹菜素培养48h后细胞) , 每组设3个平行孔。培养24h后, 小心擦去上层面细胞, PBS洗3次, 95%乙醇固定30min, HE染色;将膜反贴在载玻片上树脂封片, 并计数穿过膜的细胞数。每张膜中间部分和周围部分各随机取5个视野, 计数每个视野穿过膜的细胞数, 取其平均值, 结果以 (±s) 表示。以穿过膜细胞的相对数反映肿瘤细胞的侵袭能力。
1.2.6 迁移实验:
Millicell小室内聚碳酯膜上层面不铺Matrigel胶, 下层面铺纤维连接蛋白, 用趋化剂诱导肿瘤细胞穿过聚碳酯膜, 其余步骤与侵袭实验相同。以穿过膜细胞的相对数反映肿瘤细胞的迁移能力。
1.2.7 血管形成实验:
实验分对照组和AP组, MDA-MB-231细胞处理同1.2.5, 每组设3个Millicell小室, 上室加入400μl浓度为5×105个/ml人脐静脉内皮细胞ECV304, 下室加入600μl浓度为5×105个/ml MDA-MB-231细胞。每24h取200μl下室上清液处理细胞ECV304, 37℃培养96h后于100×低镜下观察个管型分布均匀的视野计数管腔数, 取均值。并用图象分析系统随机测定10个管腔的长度, 取均值。
1.2.8 细胞免疫化学 (SP法) 检测Bcl-2、Bax、cyclinB1、VEGF、MMP9、E-cd表达:
实验分为对照组和AP组, 收集对数生长期的MDA-MB-231细胞爬片于盖玻片上, AP组加入芹菜素至最终浓度为34.5μmol·L-1, 48h后用95%的乙醇固定40min。按SP试剂盒说明进行操作, 封片, 在光镜 (400×) 下观察, 以细胞核或细胞浆呈明确的棕黄色为阳性染色, 采用GD-8型病理影像多媒体图文操作系统进行分析。
1.3 统计学方法
采用SPSS 11.5统计软件进行统计学分析。所测数据均以undefined表示, 进行t检验和方差分析, P<0.05有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 芹菜素对MDA-MB-231增殖抑制
最终浓度为20～160μmol/L芹菜素分别作用MDA-MB-231细胞24h、48h、72h, 抑制作用呈明显时间和剂量依赖性。随浓度增加抑制率增加明显, 随时间延长抑制作用增强。48h与72h之间有明显差异P<0.05, 48h的IC50为76.1μmol·L-1 (表1) 。
*P<0.05, **P<0.01;vs control group.
2.2 芹菜素对MDA-MB-231细胞凋亡率和周期变化的影响
芹菜素作用细胞48h后, G2/M期细胞比例、细胞凋亡率都明显增加 (P<0.01) , 且呈剂量依赖性。80μmol·L-1芹菜素处理后作用显著, G2/M期细胞比例为 (35.24±1.25) %, 凋亡率为 (25.74±0.52) %。差异有统计学意义 (P<0.05) (表2) 。
*P<0.05, **P<0.01;vs control group.
2.3 细胞黏附能力试验
随药物浓度增加能力减弱, 细胞黏附数量减少, 提示处理后的MDA-MB-231细胞能力降低, 表明芹菜素对细胞的黏附能力的抑制效应逐渐增高, 差异有统计学意义 (P<0.05) (表3) 。
*P<0.05, **P<0.01;vs control group.
2.4 芹菜素对MDA-MB-231细胞侵袭迁移能力的影响
38.1μmol·L-1芹菜素作用MDA-MB-231细胞48h后, 与对照组相比, 实验组侵袭及迁移穿膜细胞数减少, 差异有统计学意义 (P<0.05) (表4、图2) 。
*P<0.05, **P<0.01;vs control group.
A:The invasion in control group; B:The invasion in AP treated group; C:The migration in control group; D:The migration in AP treated group.
2.5 芹菜素对MDA-MB-231细胞形成新生血管能力的影响
ECV304细胞经MDA-MB-231细胞上清诱导96h后, ECV304细胞变长呈条状排列形成官腔。AP组官腔数及官腔长度明显下降 (P<0.05) (见表5、图3) 。
2.6 免疫细胞化学检测Bcl-2、Bax、cyclinB1、E-cd、VEGF、MMP9的表达
38.1μmol·L-1芹菜素作用MDA-MB-231细胞48h后, 与对照组相比, 实验组的Bcl-2、 cyclinB1、VEGF、MMP9表达增加, Bax、E-cd表达降低, 差异有统计学意义 (P<0.05) (表6、图4) 。
*P<0.05, **P<0.01;vs control group.
A:The angiogenesis in control group; B:The angiogenesis in AP treated group.
*P<0.05, **P<0.01;vs control group.
3 讨论
乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一, 目前我国女性乳腺癌的发病率逐渐升高, 且发病年龄提早, 严重威胁女性的身体健康。手术治疗对患者造成严重的心身创伤;放疗、化疗虽然有效, 但毒副作用很大;故研究低毒, 高效且抑制侵袭、转移的天然植物成分对乳腺癌临床治疗意义重大。芹菜素是广泛的食物源性黄酮类化合物, 抗肿瘤作用显著, 与其它黄酮类化合物相比有低毒、无诱变性等特点, 已成为抗肿瘤研究的热点之一。Parminder Kaur等[11]研究发现, 芹菜素降低Akt蛋白磷酸化的水平抑制其活性, 从而诱导前列腺癌细胞凋亡。由于Sun- Ryung Lee等[12]提出Akt磷酸化后, cyclin B1和CDK1表达增加, G2期过渡至M期的重要激酶P34Cdc2的活性增强, 促使细胞进行有丝分裂。本实验结果显示, 芹菜素作用后, cyclin B1表达减少, Bcl-2/ Bax比值降低, G2/M期细胞比例由4.73%上升至36.12% (P<0.01) 。由此推断芹菜素使细胞周期特异性阻滞于G2/M期很可能是因为芹菜素降低Akt磷酸化的水平所引起的。
乳腺癌患者的死亡与侵袭转移直接相关, 侵袭转移是多步骤, 多阶段的复杂过程。Liotta LA等[13]提出这一过程可分为黏附、降解和运动3个步骤。E-cadherin是一类重要的细胞粘附分子, 通过与相关蛋白catenins (α-、β-、γ-、P120-catenin) 形成E-cd/catenins复合物介导细胞同质黏附而具有抑制肿瘤侵袭转移的作用[14]。Sanjeev Shukla等[14]发现在前列腺癌中, 芹菜素抑制β-catenin信号通路降低细胞的粘附能力。细胞外基质 (extracellular matrix, ECM) 是肿瘤侵袭和转移的天然屏障, 基质金属蛋白酶 (MMPs) 则是一类重要的ECM降解酶。其中, μMMP-9是降解Ⅳ型胶原最主要的酶[16], 在多种恶性肿瘤中呈现过度表达, 在恶性肿瘤的浸润转移中扮演着重要角色。血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor, VEGF) 的表达是影响乳腺癌总生存率和无瘤生存率的独立预后因素。在调控VEGF表达的众多外部因子中, 缺氧诱导因子-1α (HIF-1α) 在基因水平上直接诱导VEGF转录活性的增强和表达增加[10,15]。由于肿瘤不断生长, 体积增大而引起肿瘤组织供血不足进入缺氧状态。此时, HIF-1α与其下游携带有HRE特异区域的VEGF靶基因结合增加VEGF蛋白表达, 增强VEGF在缺氧条件下的稳定性。Jing Fang等[16]发现芹菜素通过PI3K/AKT/ p70S6K1和HDM2/p53途径抑制HIF-1α表达从而在转录水平上抑制VEGF表达。本实验结果发现, 芹菜素促进E-cd表达, 抑制VEGF和MMP-9表达, 从而引起MDA-MB-231细胞的黏附、新生血管形成、侵袭和转移能力的显著下降, 达到抗肿瘤的目的。
综上所述, 芹菜素的抗肿瘤机制是多层次、多因素的。芹菜素是前景广阔的抗肿瘤天然药物, 应对其抗乳腺癌机制进行深入研究以期早日应用于乳腺癌的临床治疗。
摘要：目的:研究芹菜素对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖及侵袭转移能力的影响, 探讨其作用机制。方法:芹菜素处理MDA-MB-231细胞, MTT法及流式法检测细胞增殖、粘附和周期变化;Millicell小室检测新生血管形成、侵袭转移能力的改变;免疫细胞化学检测Bcl-2、Bax、cyclinB1、VEGF、MMP-9、E-cd蛋白的表达差异。结果:芹菜素明显抑制MDA-MB-231细胞增殖, 诱导细胞凋, G2/M期细胞比例由4.79%增至36.12% (P<0.05) ;细胞的黏附、新生血管形成能力均显著降低;侵袭转移穿膜细胞数明显低于对照组, 分别由88.67、106.33降至45.67、68 (P<0.05) ;Bcl-2、cyclinB1、VEGF、MMP-9蛋白表达明显降低;Bax, E-cd的表达则增加。结论:芹菜素有效抑制MDA-MB-231细胞增殖, 阻滞细胞于G2/M期, 诱导细胞凋亡;抑制细胞粘附、新生血管形成、侵袭与转移的能力, 其机制与抑制Bcl-2、cyclinB1、VEGF、MMP9表达, 促进Bax、E-cd表达有关。
侵袭及转移 篇3
1资料与方法
1.1一般资料收集2010年3月~2015年6月深圳市南山区人民医院收治行手术切除上皮性卵巢癌组织43例,术前均未行放疗、化疗等辅助治疗,术后均经病理证实,排除临床资料不完整者。年龄24~71(44.82±11.65)岁;分化程度:高17例,中13例,低13例;临床分期:I、II期23例,III、IV期20例;淋巴结转移20例。另收集同期行卵巢活检的正常卵巢组织28例作为对照,均经病理证实为正常卵巢组织,年龄23~73(45.30±11.48)岁。两组一般资料比较无显著差异,具有可比性。
1.2实验方法采用免疫组织化学染色法检测上皮性卵巢癌组织和正常卵巢组织中DJ-1和HSP27蛋白的表达情况,操作严格按照SP试剂盒说明书进行,SP试剂盒、DJ-1鼠抗人单克隆抗体和HSP27兔抗人多克隆抗体均购自武汉博士德生物工程有限公司。
1.3诊断标准DJ-1呈棕黄或棕褐色颗粒表达于细胞浆或细胞核,HSP27呈棕黄或棕褐色颗粒表达于细胞浆。随机选择5个视野共计数200个细胞,计算阳性细胞数和染色强度,(1)阳性细胞数<1%、1%~10%、11%~50%、51%~80%、81%~100%分别记为0、1、2、3、4分;(2)阳性细胞基本不着色、淡黄色、黄色、棕黄色分别记为0、1、2、3分,上述两项得分相乘0分为阴性(-),1~12分为阳性(+)。
1.4统计学处理所有数据均经SPSS 17.0统计学软件进行分析,计量资料采用±s的形式表示,组间计量资料比较应用t检验,计数资料采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 D J-1和H SP27蛋白在上皮性卵巢癌组织和正常卵巢组织中的表达DJ-1、HSP27蛋白在卵巢癌组织中的表达率均明显高于正常卵巢组织,差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。
2.2 DJ-1和HSP27蛋白的表达与卵巢癌病理特征的关系上皮性卵巢癌组织中DJ-1和HSP27蛋白的表达与分化程度、淋巴结转移相关(P<0.05),与临床分期无关(P>0.05)。见表2。
3讨论
卵巢癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一,具有高复发率、高死亡率、预后差等特点,对患者身心健康造成严重不良影响,其早期诊断和治疗一直是妇科临床研究的热点之一。研究[2,3]发现DJ-1蛋白、HSP27蛋白在乳腺癌、胰腺神经内分泌肿瘤等恶性肿瘤组织中表达上调,且与肿瘤发生、发展、预后密切相关,但其在卵巢癌组织中的表达及临床意义的报道较少。
DJ-1蛋白广泛存在于人体各种组织中,并在各种生理病理活动中参与重要角色。随着对DJ-1蛋白与肿瘤关系研究的日渐深入,发现DJ-1蛋白在肿瘤细胞凋亡调节、细胞增殖和转录等多方面均起重要作用,与恶性肿瘤发生、发展及预后等密切相关[4]。此外,研究[5]发现乳腺癌组织中DJ-1蛋白表达上调,乳腺癌患者外周血中DJ-1抗体明显高于正常健康者,可见乳腺癌组织中DJ-1蛋白高表达可刺激机体产生抗体,而正常组织中的DJ-1蛋白则无此功能,提示DJ-1蛋白是一种潜在的肿瘤抗原与标记物,可能成为恶性肿瘤分子靶向治疗的新靶点。HSP27蛋白是HSP家族成员之一。研究表明HSP27蛋白具有调节细胞分化增殖、代谢平衡、凋亡、维持细胞骨架稳定、影响癌细胞转移等多种生物学功能,从而在多种肿瘤发生、发展中参与重要角色[6,7]。本研究结果显示,DJ-1蛋白、HSP27蛋白在上皮性卵巢癌组织中的阳性表达率均明显高于正常卵巢组织,且与肿瘤分化程度、淋巴结转移有关,提示DJ-1蛋白、HSP27蛋白可能不仅参与上皮性卵巢癌的发生、发展过程,同时可能对上皮性卵巢癌侵袭、转移等生物学行为有重要影响,故DJ-1蛋白、HSP27蛋白可能成为判断上皮性卵巢癌患者预后的新标志物。
综上所述,上皮性卵巢癌组织中DJ-1和HSP27蛋白表达上调,其高表达可能促进上皮性卵巢癌侵袭转移。
摘要：收集我院卵巢上皮性肿瘤石蜡组织标本43例和正常卵巢组织标本28例,采用免疫组织化学染色法检测DJ-1和HSP27蛋白的表达情况。结果DJ-1、HSP27蛋白在卵巢癌组织中的表达率均明显高于正常卵巢组织(P<0.05);皮性卵巢癌组织中DJ-1和HSP27蛋白的表达与分化程度、淋巴结转移相关(P<0.05)。上皮性卵巢癌组织中DJ-1和HSP27蛋白表达上调,其高表达可能促进上皮性卵巢癌侵袭转移。
关键词：上皮性卵巢癌,DJ-1,HSP27,侵袭转移
参考文献
[1]桂建中.卵巢癌化疗的临床疗效观察[J].现代诊断与治疗,2013,24(4):903-904.
[2]杨立新,张丽娜,张天彪.胰腺神经内分泌肿瘤中DJ-1蛋白高表达的临床意义[J].中国癌症杂志,2015,25(2):112-118.
[3]高霞,钱晓龙,付丽.热休克蛋白27在乳腺癌发生发展中的作用[J].中国肿瘤临床,2013,40(10):612-614.
[4]秦龙飞.非小细胞肺癌患者癌组织DJ—1表达及其与临床病理的相关性[J].中国老年学杂志,2013,33(18):4533-4534.
[5]李森.三阴性乳腺癌中DJ-1和HSP27的表达及其临床意义[J].现代肿瘤医学,2013,21(6):1231-1234.
[6]张凯丽,冀宏.HSP27与FAS/FASL在三阴性乳腺癌侵袭转移中的作用[J].中国肿瘤临床,2015,42(3):147-151.
内皮素与恶性肿瘤侵袭转移 篇4
关键词：内皮素,内皮素受体,信号途径,肿瘤侵袭转移
内皮素由日本学者于1988年在培养的猪主动脉内皮细胞中首次分离提纯, 被认为是目前所知机体内最强的缩血管活性多肽, ET及其受体广泛存在于人体血管及非血管组织中, 是某些病理过程中机体的一种内源性致病因子, 对包括肿瘤在内的许多疾病的发展起着重要的作用。本文就内皮素和肿瘤侵袭转移进展作一综述。
1 内皮素及其受体
内皮素是由21个氨基酸组成的活性多肤, 是一个由3种异构体多肽包括ET-l、ET-2和ET-3组成的多肽家族。ET通过细胞膜上的内皮素受体产生生物学效应, 内皮素受体有ETA受体及ETB受体2种类型 (属于G蛋白耦联受体) , 而ETB存在ETB1和ETB2两种亚型。
2 内皮素的主要生物学作用
(1) 强烈的缩血管作用。 (2) 引起血压双向性变化, 先短暂降低后持续升高。 (3) 收缩肾血管, 降低肾小球滤过率。 (4) 促分裂作用。
3 内皮素影响肿瘤生长和侵袭转移的基础机制
3.1 内皮素与肿瘤细胞增殖
内皮素与其同源的G蛋白偶联受体的结合触发了一个多种信号途径的网络系统的激活, 包括磷脂酶C (PLC) 的激活, 细胞内Ca2+浓度升高, 蛋白激酶C的激活, 有丝分裂激活蛋白激酶 (MAPK) 的激活等, 它们协同和联合作用, 交替将有丝分裂信号传递给细胞核并促进细胞增殖。再者, 内皮素还可以通过激活PI3K介导的AKT, 促进细胞生长和增殖。总之, 内皮素在多种肿瘤细胞中刺激DNA合成和细胞增殖。
3.2 内皮素与肿瘤神经血管生成
内皮素可使血管内皮生长因子 (VEGF) 的m RNA的表达增加, 诱导时间和剂量相关的VEGF浓度水平。血管内皮生长因子表达的上调与低氧诱导因子-1α相关, 当内皮素刺激时低氧诱导因子-1α蛋白浓度升高。在低氧条件下, 内皮素可通过扩大低氧诱导因子-1α的稳定性和VEGF的产生来达到目的, 促进低氧诱导因子-1α诱导的血管生成基因的转录。同时, 内皮素通过促使COX-1和COX-2的表达增加, 前列腺素E2产生, 基质金属蛋白酶的激活协同低氧诱导因子-1α共同扩大肿瘤进展的信号途径。
3.3 内皮素与肿瘤侵袭转移
内皮素与受体结合在多个水平持续诱导两大转移相关蛋白酶家族:基质金属蛋白酶家族和尿激酶型纤溶酶原激活系统, 可致肿瘤细胞的高侵袭潜力。再者, 内皮素通过刺激局部黏附激酶和桩蛋白磷酸化来诱导肿瘤侵袭转移, 还可通过激活血管生长因子受体部分诱导肿瘤侵袭。
内皮素刺激, ILK活性增加, PI3-K-依赖途径激活, 可激活金属基质蛋白酶促进降解和诱导肿瘤细胞运动侵袭, 应用阻断剂可阻止这一过程的发生。其次, 另一个肿瘤细胞侵袭转移过程的标志是内皮间叶转换 (EMT) , 可使细胞间失去极性和细胞与细胞间连接, 获得一个间叶的表型, 从而获得侵袭细胞外基质和转移到远处的能力。最后, 在肿瘤细胞中, 内皮素轴通过下调E-cadherion和相关的β-catenin的表达以及上调间叶N-cadherion的表达来破坏正常的宿主和肿瘤内联系[1]。
4 内皮素与肿瘤侵袭转移相关进展
内皮素轴, 包括内皮素和它的受体, 通过调节有丝分裂, 细胞存活, 血管生成, 骨重塑, 刺激伤感感受器受体, 肿瘤浸润免疫细胞, 上皮间叶转换, 侵袭转移等方式在不同的肿瘤的生长和转移中发挥一个举足轻重的作用[2]。
4.1 卵巢癌
90%原发性的和100%转移性的癌都能检测到内皮素的m RNA, 首先, 内皮素受体A在卵巢癌中决定内皮素诱导EMT发生起到重要作用, EMT的关键在于E-cadherion的下调和N-cadherion的上调。其次, 内皮素还通过抑制糖原合成激酶-3β (GSK-3β) 来诱导Snail的上调和β-catenin的核移位。再者内皮素选择性与内皮素受体结合能诱导低氧诱导因子-1α依赖型的血管生成, 刺激血管内皮生长因子 (重要的肿瘤血管生成的介质) 的生成, 同时也增加低氧诱导因子-1α (HIF-1α) 的积聚和激活HIF-1转录复合物, 使作用更强[3]。
4.2 黑素瘤
内皮素-1和内皮素-3与内皮素受体B结合后通过HIF-1α和VEGF的激活在黑素瘤中促进侵袭转移进程。另外, 黑素瘤细胞黏附分子 (MCAM) 是一个细胞表面黏附分子, 在超过70%的转移性黑素瘤细胞表面表达。MCAM的水平与肿瘤细胞侵袭转移能力成正相关关系, 内皮素-1可能通过改变转录水平来上调MCAM的表达[4]。再者, 在黑素瘤细胞中, 内皮素可降低E-cadherion的表达影响侵袭转移。
4.3 乳腺癌
在乳腺癌以及相关的侵袭转移中内皮素 (ET-1和ET-2) 表达增加, 内皮素-1与受体A结合作用和HIF-1α协调共同促进肿瘤细胞表达趋化因子受体CCR7, 而CCR7能诱导趋化现象和侵袭转移通过肌动蛋白的聚合和伪足形成等的作用, 主要靠近淋巴结附近, 通过淋巴转移, 在肿瘤转移中表现出器官特异性[5]。其次, 内皮素 (ET-2) 协同巨噬细胞浸润刺激MMP的分泌, 增加肿瘤侵袭转移的能力。低氧协同的内皮素也可调节肿瘤相关的巨噬细胞的再分布和激活, 启动侵袭转移机制[6]。
4.4 前列腺癌
内皮素与前列腺骨转移的作用是以转移细胞与局部微环境之间的关系为基础, 关闭旁分泌环, 减少骨细胞的再吸收和移动, 促进侵袭转移[7]。再者, β-catenin, Wnt信号途径的组成之一, 通过β-catenin/T细胞因子 (β-cat/Tcf-4) 途径在前列腺癌进展中发挥作用。β-cat/Tcf-4的转录刺激内皮素-1的表达, 激活PI3K依赖的信号途径;内皮素增强β-cat/Tcf-4的作用, 使内皮素表达更多, 两者协调共同促进前列腺癌的进程[8]……
可见, 在肿瘤的侵袭转移中内皮素的作用是不可小确的。
5 问题与展望
内皮素发挥作用基本上是通过激活内皮素受体, 诱导信号途径的发生来完成的。应用内皮素受体拮抗剂阻断信号传导途径可抑制肿瘤的发生发展。但是, 是否只能通过受体抑制剂的方面来治疗肿瘤, 可否就已知的发生途径中的某一环节的阻断来发挥相同的治疗肿瘤的目的呢?其实, 目前对于内皮素的研究还不尽详然, 进一步详细深入的研究将有助于深入理解肿瘤发生与转移的机制, 同时为寻找抑制肿瘤侵袭的新靶点提供了希望。
参考文献
[1]Anna Bagnato, Laura Rosan.The endothelin axis in cancer[J].ScienceDiect, The International Journal of Biochemistry&Cell Biology40, 2008, 1443-1451.
[2]Nelson, J.B, Bagnato.A Battistini, B, Nisen, P.The endothelin axis:Emerging role in cance[J].Nature Review Cancer, 2003, 3, 110-116.
[3]Francesca Spinella, Laura Rosano, Valeriana Di Castro, Pier Giorgio Natali, Anna Bagnato.Endothelin-1Induces Vascular Endothelial Growth Factor by In-creasing Hypoxia-inducible Factor-1in Ovarian Carcinoma Cells.The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, 2002, Vol.277, No.31, Issue of Au-gust2, pp.27850-27855.
[4]Catherine R.Mangahas, Gelo V.dela Cruz, Robert J.Schneider, w and Sumayah Jamal.Endothelin-1Upregulates MCAM in Melanocytes.J Invest Der-matol123:1135-1139, 2004.
[5]Julia L.Wilson, Joy Burchell, Matthew J.Grimshaw.Endothelins Induce CCR7Expression by Breast Tumor Cells via Endothelin Receptor A and Hypoxia-In-ducible Factor-1.Cancer Res2006, 66 (24) :11802-11807, December15.
[6]Matthew J.Grimshaw, Thorsten Hagemann, Ayse Ayhan, Cheryl E.Gillett, Claudia Binder, Frances R.Balkwill.A Role for Endothelin-2and Its Receptors in Breast Tumor Cell Invasion[J].CANCER RESEARCH64, 2461-2468, April1, 2004.
[7]Masood A.Khan, Alan W.Partin.Endothelin-A Receptor Antagonists and Advanced Prostate Cancer.Rev Urol.2004, 6 (1) :47-48.
侵袭及转移 篇5
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 细胞株和主要试剂
肺腺癌A549细胞株购自中南大学肿瘤研究所;苦参碱注射液由广州明兴制药厂提供;小牛血清白蛋白 (四季青公司) ;RPMI1640培养液 (Hyclone公司) ;四甲基偶氮唑盐 (MTT) 、二甲基亚砜 (DMSO, Sigma公司) ;人工重构基底膜胶 (Matrivgel, 威格拉斯公司) ;聚碳酸酯微孔滤膜 (Transwell小室, BD公司) ;Trizo (lInvitrogen公司) ;RT-PCR试剂盒 (MDI公司) ;兔抗人基质蛋白酶9多克隆抗体、免疫组织化学试剂盒 (中杉金桥生物技术有限公司) ;Tag DNA聚合酶 (晶美公司) 。
1.1.2细胞培养和分组
A549细胞培养在含10%BSA (牛血清白蛋白, Bovine serum albumin) 、青霉素、链霉素 (各100 u/mL) 、pH 7.4的RPMI 1640培养液中, 置37℃、5%二氧化碳 (CO2) 细胞培养箱内培养。取对数生长期的细胞用于实验, 培养液中加入苦参碱, 使其终浓度分别为0.0625、0.1250、0.2500和0.5000 g/L, 对照组加等量培养液。
1.2 实验方法
1.2.1 MTT法检测苦参碱对A549细胞增殖作用的影响
取对数生长期的A549细胞, 以1×108个/L接种于96孔板中, 培养24 h细胞贴壁后, 分组处理细胞, 分别加入终浓度为0、0.0625、0.1250、0.2500和0.5000 g/L的苦参碱100μL, 对照组仅加入等量培养液, 各浓度设4个复孔。培养48 h后加入MTT (5 mg/m L) 20μL, 继续孵育4 h后弃上清, 每孔加入150μL DMSO, 轻微振荡15 min, 酶标仪测570 nm处吸光度值 (A) 。
1.2.2 细胞黏附实验
96孔培养板, 每孔加入体积分数2%的BSA 20μL封阻, 置37℃培养箱中, 保温1 h后, 收集不同浓度苦参碱预处理48 h的细胞, 调整细胞密度为1×109个/L, 将细胞悬液分别接种于包被基质胶的96孔培养板, 100μL/孔。分组处理, 每组设5个复孔, 置37℃、5%CO2的细胞培养箱内培养1 h后, 弃上清, PBS冲洗除去未黏附细胞, 每孔加入MTT液 (5 mg/m L) 20μL, 置37℃培养箱内继续培养4 h, 弃上清, 加入DMSO 150μL, 振荡2min, 酶标仪测各孔细胞570 nm处光吸收值 (A值) 。
1.2.3 细胞迁移实验
收集不同浓度苦参碱处理48 h的A549细胞, 以无血清RPMI 1640制成1×109个/L单细胞悬液。将Transwell小室上室加入150μL细胞悬液, 下室加入含30%胎牛血清RPMI1640培养液各500μL。另设空白组, 分组处理, 每组设5个复孔, 置37℃、5%CO2细胞培养箱内培养10 h后, 取出Transwell小室, 以棉签小心刮除滤膜上室面的细胞, 吸净24孔板内培养液。侵袭并黏附至下室面的细胞以4%多聚甲醛固定, 常规HE染色。在400倍高倍镜下计数细胞, 随机6个视野/孔或膜。
1.2.4 细胞侵袭实验
在Transwell小室膜的内表面涂基膜成分Matrivgel 50μL (0.5 g/L) , 超净台通风过夜使之干燥;收集不同浓度苦参碱处理48 h的A549细胞, 以无血清RPMI 1640制成1×109个/L单细胞悬液。将Transwell小室上室加入150μL细胞悬液, 下室加入含30%胎牛血清的RPMI 1640培养液各500μL, 每组设4个复孔。置37℃、5%CO2细胞培养箱内培养48 h后, 取出Transwell小室, 用棉签擦去微孔滤膜上层的细胞, 用4%多聚甲醛固定染色穿过微孔滤膜侵袭至下室面的细胞, 在400倍倒置显微镜下计数侵袭穿膜细胞数, 每张膜随机选取6个视野。
1.2.5 RT-PCR法检测MMP-9 m RNA的表达
取对照组、0.0625、0.1250和0.2500 g/L苦参碱处理48 h的A549细胞, 以Trizol试剂提取总RNA, RT-PCR采用两步法, 按试剂盒说明书操作。引物人工合成由上海生物工程技术有限公司提供。MMP-9的引物序列:MMP-9正义链为5'-GCAGAGGAATACC TGTACCGC-3', 反义链为5'-AGGTTTGGAATCTGCC AGGT-3', 扩增长度为196 bp。20μL体系扩增, 扩增条件为95℃5 min一个循环, 94℃30 s, 55℃30s, 72℃30 s, 共40个循环, 72℃5 min延伸。以β-actin为内参照, 其引物序列:上游5'-AGCGAGCATC CCCCAAAGTT-3', 下游5'-GGGCACGAAGGCTCAT ATT-3', 扩增片段长度285 bp, 扩增40个循环。2%琼脂糖凝胶 (含0.5μg/m L EB) 电泳, EB显色, 紫外线灯下观察, 用凝胶扫描仪和图像分析系统做光密度测定, 与β-actin光密度的比值作为目的m RNA的相对含量。
1.2.6 免疫细胞化学实验检测MMP-9蛋白的表达
参考贾兰玲等[6]的方法, 取对数生长期细胞, 以5.0×104个/孔接种于24孔板上, 每孔体积1 m L。24 h贴壁后加入含苦参碱培养基, 使终浓度为0.0625、0.1250和0.2500 g/L, 对照组仅加等量的培养液, 处理48 h后, 加入4%多聚甲醛固定约30 min。用免疫组织化学法检测MMP-9蛋白的表达, 一抗按1︰100稀释。细胞浆出现褐色均匀分布的细颗粒状物质为阳性, 细胞浆无色或淡黄色为阴性。每张切片在400倍光镜下任意选取5个视野观察MMP-9的表达, 用Image plus 6.0图像分析软件测其积分光密度 (IOD) , 计算MMP-9阳性表达率。
1.3 统计学方法
采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析, 所有计量资料采用均数±标准差 (±s) 表示, 多个样本均数的比较用方差分析, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 苦参碱对A549细胞增殖的抑制作用
不同浓度的苦参碱作用A549细胞48 h后, MTT法测得的各组A570 nm值结果显示, 0.1250、0.2500和0.5000 g/L苦参碱处理组均能有效抑制A549细胞的增殖 (均P<0.05) , 且随着苦参碱浓度的增加抑制作用增强, 提示苦参碱对A549细胞的增殖抑制作用具有浓度依赖性 (见表1) 。
注:1与对照组比较, P<0.05;2) 与苦参碱0.0625 g/L组比较, P<0.05;3) 与苦参碱0.1250 g/L组比较, P<0.05;4) 与苦参碱0.2500 g/L组比较, P<0.05
2.2 苦参碱对A549细胞黏附力的抑制作用
不同浓度的苦参碱作用A549细胞48 h后, 测定其在1 h内与基质胶的黏附力。结果显示, 苦参碱0.0625 g/L组A549细胞黏附力降低, 与对照组比较差异无统计学意义 (P=0.275) , 苦参碱0.1250 g/L组和苦参碱0.2500 g/L组A549细胞黏附力明显增强, 与对照组比较差异均有统计学意义 (P<0.05) , 随着苦参碱浓度的增加, 对A549细胞黏附力的抑制作用增强, 提示苦参碱对A549细胞的黏附抑制作用具有浓度依赖性 (见表2) 。
注:1) 与对照组比较, P<0.05;2) 与苦参碱0.0625 g/L组比较, P<0.05;3) 与苦参碱0.1250 g/L组比较, P<0.05
2.3 不同浓度苦参碱对A549细胞迁移能力的影响
结果显示, 各浓度苦参碱处理组迁移细胞数均明显减少, 与对照组比较差异有统计学意义 (P<0.05) , 且随着苦参碱浓度的增加, 转移细胞数逐渐减少, 组间差异具有统计学意义 (P<0.05) , 提示苦参碱对A549细胞迁移能力的抑制作用具有浓度依赖性 (见表3) 。
2.4 苦参碱对A549细胞侵袭力的抑制作用
结果显示, 不同浓度苦参碱处理组侵袭细胞数明显减少, 与对照组比较差异有统计学意义 (P<0.05) , 且随着苦参碱浓度的增加, 侵袭细胞数逐渐减少, 细胞逐渐肿胀变圆, 细胞伪足减少, 组间差异有统计学意义 (P<0.05) , 提示苦参碱对A549细胞侵袭能力的抑制作用具有浓度依赖性 (见表3及图1) 。
2.5 苦参碱对A549细胞MMP-9 mRNA及蛋白表达的影响
结果显示, 与对照组比较, 各浓度苦参碱处理组MMP-9 m RNA及蛋白表达均降低 (P<0.05) , 且随着浓度的增加, MMP-9 m RNA及蛋白表达量逐渐下降, 组间差异有统计学意义 (P<0.05) , 提示苦参碱对A549细胞MMP-9 m RNA及蛋白表达具有下调作用, 且下调作用具有浓度依赖性 (见表4及图2、3) 。
2.6 A549细胞MMP-9 mRNA和蛋白的表达与细胞侵袭力之间的相关性分析
A549细胞MMP-9 m RNA的表达与细胞侵袭力呈正相关 (r=0.973, P<0.05) ;A549细胞MMP-9蛋白的表达与细胞侵袭力呈正相关 (r=0.575, P<0.05) 。
注:1) 与对照组比较, P<0.05;2) 与不同浓度组间比较, P<0.05
注:1) 与对照组比较, P<0.05;2) 与0.1250 g/L组比较, P<0.05;3) 与0.0625 g/L组比较, P<0.05
M:DNA标准参照物;1:对照组;2:苦参碱0.0625 g/L;3:苦参碱0.1250 g/L;4:苦参碱0.2500 g/L
3 讨论
肿瘤细胞侵袭转移的过程主要包括细胞与基底膜的黏附、细胞外基质的降解、细胞的运动和侵袭及转移灶的形成等基本环节, 只要能阻断该过程中的任一或者多个环节就有可能抑制肿瘤细胞的侵袭转移。苦参碱是从我国传统中药豆科植物苦参干燥根中提取的主要生物碱之一, 有良好的药理活性。新近研究表明, 苦参碱还具有多方面的抗肿瘤活性, 苦参碱能抑制肿瘤细胞与内皮细胞的黏附, 抑制多种黏附因子如CD44、CD54、E钙黏素的表达, 减少内皮细胞的通透性及肿瘤转移[1,7], 能抑制多种肿瘤细胞如人恶性黑素瘤A375细胞株、多发性骨髓瘤RPMI8226细胞黏附转移能力[1,2,3,4,5], 但对肺腺癌A549细胞黏附和侵袭的影响的研究尚未见报道。
肿瘤细胞的黏附性和运动性是肿瘤转移的重要因素。细胞内普遍存在的骨架调节蛋白血管扩张刺激磷蛋白 (vasodilator-stimulated phosphoprotein, VASP) 与细胞黏附性和运动性密切相关[8,9,10,11]。蛋白激酶A (CAMP-dependent protein kinase, PKA) 介导的VASP磷酸化在细胞的迁移过程中起到了重要的调节作用[12,13,14]。苦参碱能抑制He La细胞及SGC7901细胞的黏附和运动, 并降低其PKA活性及抑制骨架调节蛋白VASP磷酸化, 发挥了抑制肿瘤转移的作用[15,16]。
研究[17,18,19]表明, MMPs对肿瘤侵袭和转移起重要作用, MMPs通过多种机制促进肿瘤的侵袭和转移。大量体内、外实验研究表明[17,18,19], MMP-9稳定地在恶性肿瘤组织中过度表达, 并且与肿瘤的侵袭转移及预后相关。YANG等[20]将MMP-9反义寡核苷酸转染到A549细胞中, 结果MMP-9反义寡核苷酸在体外能够显著抑制转染细胞中MMP-9 m RNA及其蛋白的表达, 并且能有效阻止转染细胞的黏附、迁移及侵袭, 认为通过下调MMP-9 m RNA及蛋白的表达可以抑制A549细胞的侵袭转移能力。本研究发现, 不同浓度苦参碱作用于A549细胞48 h后, 各处理组MMP-9 m RNA及蛋白的表达均降低, 且随着浓度的增加, MMP-9 m RNA及蛋白表达量逐渐下降。相关性分析表明, A549细胞MMP-9的表达与细胞侵袭力呈正相关, 提示苦参碱可能通过下调MMP-9m RNA及蛋白的表达而抑制A549细胞的侵袭转移能力, 与ZHANG、YU等[21,22,23]的报道一致。近年来发现NF-kappa B在多数肿瘤中活化, 如肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌等, 在肿瘤细胞的增殖、分化、血管形成及转移等多个阶段发生效应, 相关研究[24,25]表明, 与肿瘤细胞浸润及转移相关一些生物分子均能通过NF-kappa B受调节, 如基质金属蛋白酶-9、丝氨酸蛋白酶等, 提示苦参碱抑制MMP-9可能通过下调NF-kappa B、VEGF-Akt-NF-kappa B等信号途径实现[22,23]。本研究结果表明, 苦参碱可抑制肺腺癌A549细胞增殖、黏附、迁移和侵袭, 其抑制作用随着苦参碱浓度的增加而增强, 呈浓度依赖性。在侵袭实验中发现随着苦参碱浓度的增加, A549细胞逐渐肿胀变圆, 细胞伪足减少, 提示苦参碱抑制A549细胞侵袭能力可能还有其他作用环节。苦参碱抑制肿瘤细胞侵袭、转移的具体机制, 目前尚不完全清楚。
总之, 苦参碱能从黏附、迁移和侵袭等多个环节抑制A549细胞的侵袭转移能力, 其作用机制可能与下调A549细胞MMP-9 m RNA及其蛋白的表达有关, 是一种较好的抗肿瘤侵袭转移的药物, 具有良好的临床应用前景。
摘要：目的 探讨苦参碱对肺腺癌A549细胞侵袭能力的影响及其作用机制。方法 MTT实验、细胞黏附实验、细胞迁移实验、Matrivgel侵袭实验分别检测不同浓度苦参碱对A549细胞增殖、黏附、迁移、侵袭能力的影响。半定量RT-PCR方法、细胞免疫化学法检测苦参碱处理后的A549细胞基质金属蛋白酶9 (MMP-9) mRNA、MMP-9蛋白表达的变化。结果 0.1250、0.2500和0.5000 g/L苦参碱处理组均能抑制A549细胞的增殖 (均P<0.05) ;0.1250 g/L和0.2500 g/L的苦参碱能抑制A549细胞黏附能力 (P<0.05) ;在0.0625、0.1250和0.2500 g/L的苦参碱能抑制A549细胞迁移及侵袭能力 (均P<0.05) , 下调MMP-9 mRNA及蛋白的表达 (P<0.05) , 不同浓度组间比较差异有统计学意义 (P<0.05) , 其抑制效应呈浓度依赖性。结论 苦参碱在体外能抑制A549细胞的黏附、迁移和侵袭能力;其抑制侵袭转移的机制可能与下调MMP-9的表达有关。
侵袭及转移 篇6
1. 乳腺癌干细胞概述
1.1 乳腺癌干细胞的发现
2003年Al Hajj等[1]利用人类乳腺癌细胞接种免疫缺陷动物模型首次在实体瘤中证实了乳腺癌干细胞的存在。他们筛选CD44, CD24作为乳腺癌细胞的表面标志, 利用流式细胞仪从1例原发病灶和8例癌性胸水中分离出不同表型的癌细胞, 接种于免疫缺陷 (NOD/SCID) 小鼠体内, 发现注射表型为CD44-或CD24+细胞的小鼠体内很少有肿瘤形成, 而具有CD44+CD24�/low标志的100个乳腺癌细胞就可以在小鼠体内形成肿瘤, 并且新形成的肿瘤与原发肿瘤组织病理学特征相似。
1.2 乳腺癌干细胞的起源
乳腺癌干细胞究竟起源于何种细胞至今仍无定论, 人们普遍认为其起源于正常干细胞[2], 因为正常干细胞存在被激活的自我更新机制, 获得较少突变即有可能发生癌变;而且干细胞生存周期长, 容易积累致瘤性基因突变。也有学者认为[3]乳腺癌干细胞是已经分化的细胞在致癌因子作用下去分化重新获得干细胞特性而形成的。另外一种学说[4]认为, 肿瘤干细胞可能是非肿瘤干细胞经由上皮间质转换 (EMT) 而来。Mani等首先证明EMT和乳腺癌干细胞具有相关性, 他们发现诱导乳腺癌细胞EMT可以使乳腺上皮细胞获得干细胞特性, 表现为EMT细胞中CD44+CD24�/low样细胞数及体外培养乳腺微球形成大量增加, 表明EMT可以产生CSC样细胞, 体内试验也同样支持上述结论。
1.3 乳腺癌干细胞的表面标志
自从A l-H a j j首次分离鉴定出乳腺癌干细胞以来, 人们已经普遍接受CD44+CD24�/low作为乳腺癌干细胞的生物学标志。乙醛脱氢酶1 (ALDH1) 也是乳腺癌干细胞常用的识别标志。研究者[5]用试剂标记乳腺癌细胞, 并将其异种移植到NOD/SCID小鼠乳房中, 发现ALDH1+细胞具有干细胞特性, 只需500个便可在小鼠体内成瘤, 而5万个ALDH1-细胞也不能形成肿瘤。相对于普通乳腺癌细胞, 高表达ALDH1的CD44+CD24�/low乳腺癌细胞致瘤性更强。一管标记乳腺癌细胞表面标志可以更加简便精准的筛选乳腺癌干细胞, 但是仍然有很多问题亟待解决。首先, 并非所有的乳腺癌都含有表达现有干细胞标志的细胞亚群, 那么, 不含有已认知标志物的肿瘤干细胞该如何识别?其次, 有些表面标志广泛存在于各种癌组织当中, 乳腺癌干细胞缺乏公认的特异性识别标志, 不利于描述干细胞在乳腺癌发生发展过程中的作用。
2. 乳腺癌干细胞的自我更新调控机制
参与乳腺干细胞自我更新调控的信号途径主要包括Wnt/β-catenin、Hedgehog和Notch信号通路, 他们与乳腺癌的侵袭、转移密不可分。
Wnt蛋白是一种能够影响细胞行为的分泌性信号蛋白。无Wnt信号时, 胞浆中的β-catenin与抑癌基因APC、axin及糖原合成酶激酶3 (GSK3) 以复合物形式存在。GSK3能磷酸化β-catenin, 启动β-catenin的泛素化降解途径。Wnt蛋白与膜受体frizzled结合后激活Wnt途径, GSK3活性受抑制, 磷酸化β-catenin能力下降, 从而阻碍了β-catenin降解过程, 导致β-catenin大量累积。非磷酸化的β-catenin进入细胞核与转录因子 (如TCF/LEF家族) 相互作用, 导致下游基因 (c-Myc、cyclinD1等) 的激活[7]。一项关于Wnt信号途径在人类正常、癌前病变及恶性乳腺上皮细胞基因表达的研究发现[8], Wnt3a/Frizzled8/β-catenin/TCF4/LEF1/c-Myc信号途径过表达在乳腺癌上皮细胞恶性转化中发挥重要作用。
Hedgehog信号[9]传递受靶细胞膜上两种蛋白受体Ptc和Smo介导。当Hh蛋白与Ptch结合时, Ptch活性受抑制, Smo被激活, 从而活化转录因子Gli蛋白, 使其从蛋白复合物中释放并转移到核内诱导目的基因表达。研究者发现Hh信号途径在侧群细胞SP及表型为CD44+CD24�/low的乳腺癌细胞群中mRNA和蛋白水平呈高度表达状态。而抑制Hh信号活性, SP细胞和CD44+CD24�/low细胞增殖能力下降。这表明Hh信号通路对于乳腺癌的发生发展具有重大意义。
Notch信号途径与乳腺癌的发生和进展也有着密切的关联。Ming Qiu[10]等在对三阴性乳腺癌小鼠的研究中发现, 应用中和抗体特异性抑制肿瘤Notch1途径, 可以明显抑制肿瘤生长。Notch信号对乳腺癌的调控作用可能是通过诱导EMT过程实现的, 研究表明激活上皮细胞Notch信号可以促进EMT发生, 而下调Notch信号可以抑制EMT过程[11]。
3. microRNA与乳腺癌干细胞
miRNA是一组非编码蛋白质的短序列RNA, 通常的长度为21-23个核苷酸。miRNA在转录后水平控制靶基因的表达, 功能性的miRNA蛋白复合体与靶mRNA分子3'端非编码区域 (3U'TR) 互补结合而干扰该mRNA分子的正常翻译, 从而调控大多数生物学行为。50%的miRNA基因位于肿瘤相关的基因组区域或脆性位点, 肿瘤细胞与正常组织细胞的miRNA表达谱具有明显差异[12]。2004年, Calin等首先报道了人类乳腺癌染色体脆弱位点的miRNA表达发生改变, 表明miRNA在乳腺癌的发生发展中有重要意义[13]。miRNA能够调控多种蛋白质的表达, 影响多个信号通路的活性, 在乳腺癌的侵袭转移过程中起到重要作用。
3.1 microRNA调控肿瘤干细胞自我更新
乳腺癌干细胞的自我更新调控机制涉及许多信号通路, 这些信号途径受到多种miRNAs的调节。研究发现[14], 上调miR-125b表达能够富集CD44+CD24�/low乳腺癌干细胞, 而抑制miR-125b表达能够富集非干细胞群。研究者使用pMSCV质粒和表达miR-125b的pMSCV-miR-125b质粒转染细胞系, 结果发现含有miR-125b的细胞群中CD44+CD24�/low细胞数量显著提高, 说明了miR-125b能够提高乳腺癌中肿瘤干细胞的数量。并且miR-125b能够增加细胞群中乳腺微球体的形成。miR-125b是由Snail (一种锌指转录因子, 在乳腺癌干细胞的EMT过程中发挥重要作用) 介导的Wnt/β-catenin/TCF4途径转录激活的。
miR-17-92家族可以导致Hh信号途径激活。miR-17-92高表达调节Hh信号途径已经在多种肿瘤中有所描述。M.Kasper等在2009年关于膀胱癌的研究中发现癌细胞中高水平表达miR-17-92家族, 并且Hh配体基因和Gli诱导的靶基因 (FOXM1, IGF2OSF2, H19, and SPP1) 表达上调[15]。几个其他的小miRNAs涉及Hh信号途径的关键调节部分, 包括miR-326和miR-324-5p抑制Hh途径的跨膜蛋白受体smo, miR-324-5p抑制Hh转录因子Gli-1蛋白[13]。
3.2 microRNA调控乳腺癌干细胞侵袭转移
正常上皮依赖于细胞-细胞及细胞-细胞外基质之间一群黏着分子的稳定表达而紧密连接。癌细胞从原位向周围间质侵袭则需下调这些粘附分子的表达, 获得自由运动与迁徙能力。一些microRNA能够抑制乳腺癌细胞迁徙和向外侵袭, 如miR-200家族。miR-200家族主要通过调控EMT影响乳腺癌干细胞的侵袭和转移过程。
EMT是乳腺癌侵袭转移的关键步骤。在这个过程中, 乳腺癌细胞接受间质信号启动EMT程序, 提高了细胞的运动性和侵袭性, 得以淋巴结转移。待建立转移灶时, 间叶型癌细胞再经MET恢复上皮表型。在乳腺侵袭性导管癌、基底样细胞癌及瘤样化生中, E-cadherin表达缺失。E-cadherin在细胞连接的稳定维持中发挥重要作用, E-cadherin的减少或缺失破坏了细胞之间的正常连接状态, 使细胞运动能力增加。TGF-β是一种双重转录因子, 在抑瘤和成瘤过程中通过不同的途径发挥不同作用。TGF-β通过Smad信号与非Smad信号使乳腺癌细胞上皮表型E-cadherin下调及间叶表型N-cadherin与vimentin上调, 这个过程由转录因子Snail, Twist和ZEB (包括ZEB1和ZEB2) 调控, 他们是E-cadherin的转录抑制因子[13]。EMT时, 最常见的是miR-205和miR-200家族水平下降。miR-200家族通过直接抑制编码ZEB1和ZEB2的mRNA表达抑制EMT过程, 维持细胞的上皮表型[16]。
4. 结语
乳腺癌干细胞不仅具有自我更新和多向分化的潜能, 它对于放化疗抵抗作用也广为报道。相对于非干性细胞, 乳腺癌干细胞对放射治疗具有抵抗性。研究发现[18], 人体乳腺组织中已经分化的癌细胞经放射线照射后, 表现出BCSC的特性, 这种放疗抵抗性可能与Notch信号途径、转录因子Oct4和Sox2的活化有关。接受新辅助化疗后癌组织中乳腺癌干细胞的数量也会明显增加[19]。乳腺癌干细胞发挥化疗抵抗作用的原因可能是细胞膜上高水平表达的ABC转运蛋白, ABCG能够利用水解ATP的能量将各种药物从细胞质内转运到细胞外, 从而保护乳腺癌干细胞免受化疗药物的损伤[20]。因此, ABCG抑制剂可能成为杀死乳腺癌干细胞的潜在靶点。
侵袭及转移 篇7
1 材料与方法
1.1 材料
人绒癌细胞株BeWo购自协和医科大学基础细胞库;HamsF12培养基购自Gibco公司;胎牛血清购自四季青生物公司;forskolin由华诚生物技术有限公司惠赠;PCR mix和逆转录试剂盒购自Fermantas MB公司;Syncytin引物购自北京三博远志生物技术有限责任公司;MMP-2及E-cad购于美国sigma公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养及处理
人绒毛膜癌细胞系BeWo细胞用含有15%(体积分数)胎牛血清的HamsF12培养基,在37℃、5%(体积分数)CO2的培养箱中进行培养。细胞贴壁生长,每两天换1次液,按1∶2用0.125%胰酶(含0.01%EDTA)消化传代。取指数生长期的BeWo细胞(约为70%～80%),分为4组,用forskolin 100mmol/L分别作用0、24、48、72小时。按forskolin作用时间进行分组,作用时间为0小时者设为对照组。
1.2.2 RT-PCR检测Syncytin基因
按常规步骤消化并收集细胞,使细胞数达106/L～107/L,1000r/min,离心5分钟,PBS洗3遍后吸干PBS,按照总RNA提取试剂盒fast 200操作说明书操作。提取总RNA,再按照逆转录试剂盒说明将总RNA转录成cDNA。之后按PCR mix试剂盒说明进行PCR扩增。Syncytin引物为5′-CAACTGCTATCACTCTGCCACTC-3′(正义),5′-TTCTCTTGCCTGATCTTGAACTCC-3′(反义),扩增产物片段大小为169bp。β-actin引物为5′-GTGGA-CATCCGCAAAGAC-3′(正义),5′-AAAGGGTGTA-ACGCAACTAA-3′(反义),扩增产物片段大小为302bp。各组加入相应的引物后按反应条件:94℃欲变性5分钟,94℃变性30秒,58℃退火45秒,72℃延伸45秒,30个循环,最后72℃延伸7分钟。各扩增产物经2%(体积分数)琼脂糖凝胶电泳检测目的片段。
1.2.3 Westernblot检测MMP-2和E-cad蛋白的表达
蛋白质提取:常规消化、传代细胞。当细胞增长至80%时,各培养皿更换含100mmol/Lforskolin的培养基,分别作用0、24、48、72小时。吸净培养基,4℃PBS洗细胞3次,将PBS吸净,加入Triple裂解缓冲液200μl,将裂解物转移至2.5ml离心管,充分混匀后离心,将上清液吸出,留待蛋白定量和实验。SDS-PAGE电泳和免疫印迹:采用Bradford法测定蛋白质浓度,以30μg/孔上样,在12%(体积分数)的SDS-PAGE凝胶中进行电泳分离,电转移法23V 12小时将蛋白从SDS-PAGE凝胶转移至醋酸纤维素膜,在含0.5g/L脱脂奶粉的TBST中37℃封闭1小时,分别加入一抗(兔抗人MMP-2单克隆抗体,稀释度为1∶200或兔抗人E-cad多克隆抗体,稀释度为1∶500),4℃孵育过夜,TBST充分漂洗(3分钟×6次),加入二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠或羊抗兔IgG,稀释度1∶2000),37℃作用1小时,TBST充分漂洗(3分钟×6次),DAB显色,观察结果。数据分析采用凝胶成像系统。
1.2.4 统计学处理
每组实验至少重复3次以上,电泳图谱扫描图像用BandScan软件进行灰度分析,计算待检条带和内参条带的光密度比值,数据表示均值±标准差(n=3)。
2 结果
2.1 绒癌细胞系BeWo细胞中Syncytin基因表达变化
分别对来自对照组及forskolin处理组BeWo细胞中的RNA进行检测,结果表明,受100mmol/Lforskolin处理的BeWo细胞中Syncytin的转录显著升高,并有时间依赖性,随着forskolin作用时间的延长,Syncytin的表达越强,于48小时达到高峰,如图1所示。
2.2 Westernblot检测
forskolin作用后绒癌细胞系BeWo细胞中MMP-2及E-cad蛋白的表达
2.2.1 绒癌细胞系BeWo细胞中MMP-2蛋白的表达
分别对来自对照组和forskolin处理各组BeWo进行MMP-2蛋白表达检测,结果显示,发现forskolin作用后各个时间段的BeWo细胞株MMP-2蛋白的表达下降,并随forskolin作用时间的延长,其表达MMP-2蛋白的量逐渐减少,如图2所示。
2.2.2 绒癌细胞系BeWo细胞中E-cad蛋白表达的变化
同样的方法对来自对照组和forskolin处理各组BeWo进行E-cad蛋白表达检测,结果显示,发现forskolin作用后各个时间段的BeWo细胞株E-cad蛋白的表达升高,并随forskolin作用时间的延长,其表达E-cad蛋白的量逐渐增加,如图3所示。
3 讨论
肿瘤细胞浸润及转移是指瘤细胞由原发部位通过各种方式转移至继发组织及器官后继续增殖生长,形成与原发肿瘤性质相同的继发性肿瘤的过程。近年来研究表明该过程与肿瘤细胞表面的细胞黏附分子如E-cad及肿瘤细胞分泌的MMPs有密切的关系。
3.1基质金属蛋白酶(MMPs)与肿瘤细胞浸润及转移
MMPs是一组锌离子依赖酶,与肿瘤细胞浸润转移相关的细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)降解过程密切相关。人MMPs的基本结构包括3个部分:信号肽段、前肽段和包含保守锌离子连接位点(HEXGHXXGXXHS/T)的催化区。MMPs在肿瘤浸润和转移过程中的作用[3]:(1)破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障:MMPs可以通过分解ECM成分来调节其降解和重组之间的动态平衡;(2)促进新生血管的形成:MMPs在血管形成过程中的基底膜降解、细胞运动和管腔形成中起到重要的作用,并且能够提高促血管生成因子如VEGF、bFGF、TGF-β及TGF-α的作用;(3)调节肿瘤细胞与基质的黏附:纤维连接蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白和玻璃粘连蛋白等都是整合素家族的天然配体,而它们又是MMPs的天然底物,MMPs的活化将加强整合素与其配体的结合,从而改变细胞之间及细胞与细胞外基质之间的黏附能力;(4)激活具有潜在活性的蛋白质:有研究表明,MMPs能够激活的蛋白质有血浆纤维蛋白原和层粘连蛋白-5。按MMPs作用底物不同可将其分为5类,其中MMP-2属于明胶酶(IV型胶原酶),它可降解I、II、III型胶原明胶的特异能力,也可切割天然IV、V、VII、XI型胶原,对纤维结合素、弹性蛋白也有一定的作用。MMP-2是非糖化蛋白酶,来源于许多结缔组织细胞;其中MMP-2是MMPs家族中的主要成员之一,研究表明该基因与肿瘤组织浸润、基底膜破坏有关[4]。MMP-2蛋白过表达,使滋养细胞正常的浸润能力发生改变。肿瘤细胞从原发灶到转移器官必须多次穿透基底膜,而MMP-2可以降解基底膜的主要骨架成分IV型胶原,对肿瘤的浸润和转移研究是一个重要的指标;其次,MMP-2通过降解基底膜及细胞外间质为血管内皮的迁移和新生血管的延伸创造了必须的条件。
3.2 E-cad与肿瘤细胞浸润及转移
与浸润转移过程相关的另一种蛋白为E-cad,它广泛表达于子宫细胞的顶膜,表达水平受黄体酮和雌二醇共同调节。有研究显示,在围植入期E-cad表达明显升高,植入后表达显著下降[5]。若该侵入过程调节失控,滋养细胞发生失控性增殖,便对周围的组织血管进行浸润、破坏,最终发展成为绒癌,并在早期发生远处转移。
E-cad作为钙黏附素家族中的一类,是重要的细胞间的黏附分子,其功能的正常发挥对于维持上皮组织的完整性及防止肿瘤细胞的脱落、离散及远处种植起到重要的作用[6]。它能够在肿瘤的浸润转移过程发挥作用,主要是其在肿瘤细胞表面表达减少所致。有研究表明,在一些上皮来源的恶性肿瘤中,E-cad的表达下降或缺失,与肿瘤细胞的高侵袭力及低分化密切相关[7]。当E-cad表达下降或缺失,细胞间的相互黏附力下降,造成细胞容易分散而向外周浸润性生长,一旦获得转移的必要条件,就可脱离原发灶而发生侵袭和转移[8]。另外,E-cad还能抑制肿瘤细胞和宿主细胞产生MMPs,阻止肿瘤细胞周围基质和基底膜中的各种蛋白成分的降解[9]。进一步证实了E-cad是肿瘤侵袭的抑制因子。侵蚀性葡萄胎是妊娠滋养细胞肿瘤(GTT)中较常见的一种,具有较强的侵蚀性,容易早期浸润扩散转移。相关研究发现E-cad黏附功能的丧失可使滋养细胞转化为高度侵袭性表型[10]。
3.3 Syncytin与肿瘤细胞融合
Syncytin是人类内源性逆转录病毒(HERV-W)基因编码的膜糖蛋白(HERV-W Env),由538个氨基酸组成,Huppertz等研究发现,Syncytin可以促进滋养细胞融合。Syncytin基因在细胞中的表达受到多种因素的调节,如:低氧、低粒细胞-巨噬细胞刺激因子、内皮生长因子、MTX、forskolin、cAMP、地塞米松、雌激素、HCG。其中forskolin是一种腺苷酸环化酶激动剂,可以透过细胞激活腺苷酸环化酶,从而提高细胞中的cAMP。forskolin通过影响Syncytin基因的表达,从而能诱导绒癌细胞融合。
本研究中,将绒癌细胞融合和绒癌细胞浸润转移能力变化相结合还是第1次。研究发现,经过forsklin处理的绒癌细胞中Syncytin基因的表达明显增加,并有时间依赖性,随着forsklin作用时间的延长,Syncytin的表达量逐渐增加,这说明经过处理的绒癌细胞株发生融合,随作用时间延长,细胞融合的数量增加。同时测各组细胞中滋养细胞肿瘤浸润相关蛋白MMP-2及E-cad表达变化,结果显示:这两种蛋白的表达也有时间依赖性,随着作用时间的延长,MMP-2蛋白表达量逐渐减少;但是E-cad的蛋白量反而逐渐增加,从而说明,绒癌细胞的浸润及转移特性发生了变化。提示绒癌细胞的融合对其浸润转移能力有一定的影响。深入探讨两者关系,将为滋养细胞肿瘤的治疗,特别是对耐药性及复发性的滋养细胞肿瘤的治疗,提供一定的研究方向和基础。
参考文献
[1]吴卫平,郑肇簨.基质金属蛋白酶及其组织抑制剂与滋养细胞侵袭性生长关系的研究[J].诊断病理学杂志,2006,13(3):205-208.
[2]Floridon C,Nielsen O,Holund B,et al.Localization of E-cadherin in villous,extravillous and vascular trophoblasts during intrauterine,ec-topic and molar pregnancy[J].Mol Hum Reprod,2000,6(10):943-950.
[3]常静.基质金属蛋白酶与肿瘤浸润转移的相关性[J].中国实验诊断学,2008,12(2):268-271.
[4]Akgul B,Ptetterle R,Marcuzzi GP,et al.Expression of matrix metalo-proteinase(MMP-2,MMP-9,MMP-13and MT1-MMP)in skin tumors of human papilom avirus type8transgeniomce[J].Exp Dema-tol,2006,15(1):35.
[5]Jha RK,Titus S,Saxena D,et al.Profiling of E-cadherin,beta-catenin and Ca2+in embryo-uterine interactions at inplantation[J].FEBS Letters,2006,580(24):5653-5660.
[6]Hung KF,Chang CS,Liu CJ,et al.Differential expression of E-cad-herin in metastatic lesionscomparing to primary oral squamous cell carcinomal[J].Journal of Oral Pathology&Medicine,2006,35(10):589-594.
[7]Dursun P,Yuce K,Usubutun A,et al.Loss of epithelium cadherin ex-pression is associated with reduced overall survival and disease-free survival in early-stage squamous cell cervical carcinoma[J].Interna-tional Journal of Gynecological Cancer,2007,17(4):843-850.
[8]Gloushankova NA.Changes in regulation of cell-cell adhesion during tumor transformation[J].Biochemistry(Moscow),2008,7:742-750.
[9]Xie T,Yuan XL,Yu SY,et al.Interference of HIF-1alpha by RNAre-duces the expression of matrix metalloproteinase-2in human cervical carcinoma HeLa cells[J].Ai Zheng,2008,27(6):600-605.