侵袭蛋白（共5篇）
侵袭蛋白 篇1
肾癌, 又称肾细胞癌, 是成人中一种较为常见的泌尿系统恶性肿瘤, 约占成人恶性肿瘤的3%左右[1]。在全世界范围内, 肾癌的发病率和死亡率都不断升高, 我国的发病率也有上升的趋势, 同时城市人口发病率高于农村人口[2]。在肾细胞癌中, 肾透明细胞癌 (clear cell renal cell carcinoma, CCRCC) 是最为常见的病理亚型, 占肾癌的60%~85%[3,4], 其致病是由于肾小管上皮细胞的一系列基因突变或功能损伤造成瘤变所诱导的[5]。因此CCRCC的致病机制研究对于肾癌的治疗势必起着重要的作用。
DONG等[6]在前列腺癌细胞中首次发现了能够抑制前列腺癌转移的新基因, 被称为前列腺癌转移抑制基因———KAI1。JIANG等[7]在对原发性胆囊炎的研究中也发现了KAI1能够在肿瘤的转移、增殖方面发挥显著的作用。当KAI1基因发生突变、蛋白结果发生变化时, 其正常功能被破坏或丧失, 从而导致了肿瘤细胞的增殖能力、黏附力、侵袭性发生变化。其他众多研究还表明, KAI1也可在结直肠癌、非小细胞肺癌、胃癌、鼻咽癌等[8,9,10]多种肿瘤细胞的转移、侵袭过程中发挥作用。但是KAI1在肾透明细胞癌的侵袭及转移中是否发挥作用, 目前尚未见文献报道。
本研究拟将KAI1克隆至慢病毒载体p CMV-VSV-G中, 并使KAI1基因在786-O细胞中稳定表达, 观察慢病毒介导的KAI1基因的表达对人肾透明细胞癌细胞株786-O的侵袭、转移的影响, 为后续肾透明细胞癌的发病机制的研究奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料和实验分组
786-O细胞株购自中国科学院基础所;p CMV-VSV-G慢病毒载体购自上海北诺生物科技有限公司;兔抗人KAI1抗体及羊抗兔辣根过氧化物酶二抗均购自美国Santa Cruz公司;黏附分子CD44抗体购自美国Invitrogen公司;胎牛血清购自杭州四季青公司;细胞稳定转染试剂G418购自上海前尘生物科技有限公司;RPMI 1640细胞培养基购自美国Hycolone公司。本实验分为3组:KAI1基因稳定表达786-O细胞作为实验组 (p CMV-KAI1) 、转染稳定表达p CMV空载体的786-O细胞作为阴性对照组 (p CMV-NEG) 、未进行处理的786-O细胞作为空白对照组 (CON) 。
1.2 细胞培养及KAI1稳定表达细胞株的建立
将786-O细胞接种于细胞培养瓶中, 用含有20%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养, 置于37℃、5%的二氧化碳CO2的恒温培养箱中培养。每2、3天传代1次, 细胞消化使用胰酶, 之后进行培养, 并取对数生长期的786-O细胞进行培养。选用G418对786-O阳性表达株进行筛选, 具体方法参见应明真等[11]的实验方法, 获得稳定转染的786-O细胞株。
1.3 半定量逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR)
为鉴定转染前后KAI1的转录水平变化, 本研究利用半定量RT-PCR进行研究。根据Gene Ban K中收录的KAI1的基因序列 (收录号U207701) , 设计KAI1的扩增引物:上游5'--3';下游5'--3', 扩增长度为798 bp, 反应条件为:94℃50 s, 75℃54 s, 72℃90 s, 共进行30个循环。同时, 以细胞骨架蛋白 (肌球蛋白) β-actin的转录水平作为内对照, 引物设计参见NAKAJIMA等[12]的报道, 扩增长度为776 bp, 特异性引物见表1。本研究中, 对PCR产物进行1.4%的琼脂糖凝胶电泳, 利用带有CCD显示屏和图像分析功能的数码相机, 用delta delta Ct法进行图像分析。每种相关因子的相对转录水平用特异性PCR产物的信号灰度和β-actin的信号灰度比率来表示。
1.4 免疫细胞化学法
免疫细胞化学法使用链霉素亲生物素过氧化物酶链接法 (SP法) 。收集稳定表达KAI1蛋白的786-O细胞涂片, 3︰1的乙醇-冰醋酸固定液固定30min, 利用3%的双氧水浸泡10 min, 胰蛋白酶消化10 min, 加入抗KAI1单克隆抗体作用30 min, PBS洗涤, 继续加入二抗及SP复合物各10 min, DAB显色, 用苏木精进行复染, PBS冲洗后观察。
1.5 细胞黏附实验
参照曾维忠等[13]的方法, 并进行了适当的改进。将3组细胞按照每孔2×104个细胞的密度接种于24孔板, 5%的CO2孵箱、37℃培养8 h, 吸去细胞培养液, 再次接种细胞, 水平摇床摇动30 min, 吸出含有未黏附细胞的培养液, 记录黏附的细胞数, 并计算黏附率。
1.6 细胞侵袭实验
采用Boyden Chamber侵袭实验方法。于上室和下室内加入37℃的血清培养液0.5 m L, 培养箱培养2 h, 移除培养液。加入含10%胎牛血清的培养基0.75 m L于下室, 将小室置于细胞培养板孔内, 并加入0.5 m L细胞悬液 (无血清培养基) 于上室, 置于37℃、5%的CO2孵箱中培养48 h, 去除上室底部未侵袭的细胞, 纯甲醇固定30 min, PBS洗涤2次, 以Wright Giemsa染液染色40 min, 冲洗。取下PET膜, 随机选择5个视野观察并记录总细胞数。
1.7 蛋白免疫印迹反应实验
利用蛋白免疫印迹法检测细胞黏附因子CD44的表达情况, 收集786-O细胞, 应用细胞裂解液对786-O细胞进行裂解, 蛋白质电泳并将蛋白转移至醋酸纤维素膜, 包被CD44抗体、二抗, 最后进行DAB显色、拍照, 具体步骤参见王新等[14]方法。同样方法检测肿瘤转移抑制因子MRP-1/CD9的表达情况。
1.8 统计学方法
采用SPSS 17.0软件进行数据处理, 计量资料用均数±标准差 (±s) 表示, 定量资料使用ANOVA进行方差分析, 样本间的两两比较用LSD-t方法, 以P<0.05差异有统计学意义。
2 结果
2.1 KAI1稳定表达细胞株KAI1表达情况
由于p CMV慢病毒携带有GFP标签, 因此本研究检测KAI1稳定表达786-O细胞株的表达效率。结果显示, KAI1阳性表达细胞接近100%, 说明KAI1稳定表达细胞株构建成功 (见图1) 。
2.2 稳定表达细胞中KAI1 m RNA转录水平上调
实验组 (p CMV-KAI1) KAI 1 m RNA的灰度明显升高 (见图2) , 与阴性对照组 (p CMV-NEG) 和空白对照组 (CON) 相比, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。见图3。
2.3 KAI1蛋白的表达情况
通过免疫组织 (细胞) 化学分析也显示, KAI1阳性染色细胞数目接近100%, 且显著高于其他两组 (见图4) (P<0.01) , 与2.1的实验结果一致。
2.4 KAI1对786-O细胞黏附的影响
图5、6显示, 在作用8 h后空白对照组和阴性对照组间细胞黏附率差异无统计学意义 (P>0.05) , 实验组 (p CMV-KAI1) 与前两组细胞差异有统计学意义 (P<0.01) 。
2.5 KAI1对786-O细胞迁移的影响
本研究结果显示, 稳定表达KAI1的实验组 (p CMV-KAI1组) 细胞数较阴性对照组 (p CMV-NEG组) 和空白对照组 (CON组) 细胞显著减少 (P<0.01) (见图7及表2) , 表明KAI1基因的稳定表达可降低细胞的侵袭能力。
A:p CMV-KAI1组;B:p CMV-NEG组;C:CON组
A:p CMV-KAI1组;B:p CMV-NEG组;C:CON组
A:p CMV-KAI1;B:p CMV-NEG;C:CON
A:p CMV-KAI1;B:p CMV-NEG;C:CON
A:p CMV-KAI1;B:p CMV-NEG;C:CON
2.6 CD44及MRP-1/CD9分子的表达
为探讨KAI1抑制786-O细胞黏附和细胞侵袭的机制, 本研究检测了黏附分子CD44及肿瘤转移抑制因子MRP-1/CD9的表达水平 (见图8) , 结果证实, KAI1稳定表达细胞CD44的表达水平显著低于p CMV-NEG组和CON组 (见表2 (P<0.05) ;同时, MRP-1/CD9的表达高于其他两组的表达水平, 且差异具有统计学学意义 (见图9) (P<0.01) 。
3 讨论
癌细胞的侵袭和黏附是恶性肿瘤最为重要的生物学特征之一, 近年来的大量研究表明[15]KAI1在肿瘤细胞的侵袭和黏附作用方面发挥着十分重要的作用, 可能是反应肿瘤发展和预后的一个重要标识。但有关KAI1基因与肾透明细胞癌的侵袭、黏附的研究却未见报道, 以往的研究大都是从临床组织病理学角度开展的分析。本研究构建了KAI1慢病毒表达载体, 并通过G418筛选使其在786-O细胞中稳定表达, 通过观察稳定表达细胞株在表达、侵袭、黏附等情况, 试图明确KAI1基因对肾透明细胞癌侵袭转移的影响及可能的发生机制, 为肾透明细胞癌的临床防治提供理论基础。
半定量RT-PCR实验结果表明, KAI1稳定表达株稳定表达KAI1m RAN转录水平显著高于空白对照组和阴性对照组, 同时, 免疫细胞化学分析显示稳定表达KAI1细胞株的KAI1染色阳性率高, 说明本研究构建的稳定表达细胞株稳定、可靠, 可用于后续的侵袭及黏附实验研究。
国内外学者通过相关研究后认为[16,17], 转染正义KAI1基因后肝癌MHCC97-H细胞的线粒体及内质网的数量显著减少, 提示KAI1基因表达的升高, 可能通过抑制肿瘤细胞中某些因子的产生而阻断其转移或侵袭的能力。这与本研究基本相同。
癌细胞从原发病灶或组织脱落后, 与相邻组织结合并黏附时发挥肿瘤转移作用。本研究中, KAI1稳定表达细胞株的细胞黏附能力显著低于其他两组, 提示KAI1基因的表达可能不仅降低了肾癌细胞与原发病灶的黏附性, 同时也降低了肾癌细胞与其他周围组织或远端组织的黏附性, 从而抑制癌细胞向其他组织的转移。肿瘤细胞的侵袭作用是恶性肿瘤的一个重要特征, 本研究结果证实, 通过786-O细胞内稳定表达KAI1基因, 抑制了肾透明细胞癌的迁移和转移能力, 说明KAI1在肾透明细胞癌786-O细胞的浸润和迁移中起到了至关重要的作用。
为探讨KAI1基因的表达诱导细胞黏附能力降低及侵袭能力降低的具体机制, 本研究检测了KAI1表达细胞的黏附因子CD44及肿瘤转移抑制因子MRP-1/CD9, 结果表明CD44及MRP-1/CD9的表达水平都显著降低 (P<0.01) , 说明786-O细胞黏附性的降低可能是由于KAI1的表达下调了CD44蛋白的表达, 同时细胞侵袭性的降低有可能又是KAI1的表达上调了MRP-1/CD9蛋白的表达。
因此, KAI1基因在786-O细胞中的稳定表达, 可降低癌细胞的黏附性及细胞的侵袭性, 其促发黏附性及迁移性的降低是由于诱导了CD44蛋白表达的下调及MRP-1/CD9蛋白表达的增加。
侵袭蛋白 篇2
1 材料和方法
1.1 主要实验材料
si RNA表达载体pRNA-U6.1/Neo(GenScript公司),脂质体转染试剂LipofectAmineTM2000(Invitrogen公司),细胞增殖检测试剂盒(日本同仁化学研究),鼠抗CB单克隆抗体(USA Santa Cruz公司),辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG抗体(USA Santa Cruz公司),Transwell小室(Corning公司),人低分化胃腺癌细胞BGC-823购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。
1.2 si RNA载体的构建
利用si RNA靶片段分析设计在线软件确定19个碱基634～652位(GCTTGGAACTTCTGGACAA)、242-260位(CGGATGAGCTGGTCAACTA)为si RNA靶序列,合成发卡样DNA单链,退火成双链后与si RNA载体pRNAT-U6.1重组连接,PCR扩增筛选转化重组子,DNA序列测定鉴定插入序列,分别提取重组子即得到2个针对CB基因的si RNA载体。
1.3 细胞分组及转染
实验分为4组:(1)转染pRNAT-U6.1-si CB634,沉默1组;(2)转染p RNAT-U61-si CB242,沉默2组;(3)转染pRNAT-U6.1-Con,无关si RNA对照组;(4)不转染任何质粒,空白对照组。参照Lipofectamine2000说明书转染CB基因si RNA。
1.4 RT-PCR检测BGC-823细胞CB mRNA表达情况
CB基因引物为:上游序列为:5'-GCAGCGCTG GGTGGATCTAGGATCC-3',下游序列为:5'-GGCCC ACCCAGGAAGGTACCAC-3',产物片断长度为232bp;内参β-actin的上游引物为5'-GCGAGCACA-GAGCCTCGCCTTT-3',下游引物为5'-GCACATGC-CGGAGCCGTTGTC-3',产物长度为112 bp。采用荧光定量PCR法,检测各组细胞CB m RNA表达水平,以CB的表达量与内参照β-actin表达量的比值为其相对表达水平。扩增使用ABI 7500 fast PCR仪进行扩增。
1.5 Western-blot检测CB蛋白表达
提取各组细胞总蛋白,用Bradford法测定蛋白质浓度。各组样品分别取总蛋白300μg,经100g/L SDS-PAGE电泳后转PVDF膜。与特异性一抗室温孵育1～2 h或4℃过夜。与二抗室温孵育1 h后,ECL化学发光剂于暗室中曝光和显影。测定蛋白条带的光密度值,以表示蛋白的相对表达水平。
1.6 细胞增殖检测
取转染48 h后各组BGC-823细胞接种于96孔细胞培养板内,每孔1.0×104个细胞,各组细胞均设置5个复孔,接种后的1～5 d内,分别采用CCK-8细胞增殖检测试剂盒测定各组细胞孔内的吸光度值,记录读取这数据,计算出平均值,然后绘制各组细胞的生长曲线。
1.7 细胞基质黏附实验
在96孔培养板中分别加入40μL纤维粘连蛋白和基质胶,置37℃、5%二氧化碳培养箱中孵育1h,PBS液小心冲洗2次,加入0.1%BSA 200μL37℃孵育2 h,PBS液清洗2次。转染48 h后,各组细胞分别用含0.1%BSA无血清DMEM培养液制成细胞悬液,调整细胞密度均至1×105/m L。将上述细胞悬液100μL分别接种于已包被纤维粘连蛋白和基质胶的96孔培养板中。37℃、5%二氧化碳培养1 h后,取出96孔板用PBS液清洗未黏附的细胞2次,每孔分别加入100μL含0.1%BSA的DMEM培养液和20μL的MTT(5 mg/m L),继续培养4 h后,去除孔中培养液加入120μL DMSO,室温孵育10 min。用酶标仪检测波长为492 nm时的OD值以表示细胞的黏附情况。每组设3个复孔,实验重复3次。
1.8 Transwell实验检测细胞侵袭能力
按照Corning公司Transwell小室说明书操作,制备细胞悬液,加于Transwell小室(每孔200μL培养液,1×105细胞)。培养48 h后,擦去基质胶和上室内的细胞,台盼蓝染色,正置显微镜观察,3～5个视野计数取均值。
1.9 统计学处理
所有实验数据均使用SPSS 13.0统计软件进行分析处理,所有数据用均数±标准差(x±s)表示,结果采用单因素方差(One-way ANOVA)分析,以P<0.05为有显著性差异。
2 结果
2.1 针对CB基因siRNA载体的构建结果
si CB634和si CB242发卡样si RNA单链DNA退火产物与pRNAT-U6.1双黏质粒连接后,以通用引物进行PCR扩增鉴定,并进行DNA序列测定,其插入序列与设计序列完全一致,见图1。
2.2 RT-PCR检测各组细胞CB mRNA表达结果
各实验组细胞CB m RNA的相对表达量见图2,其中空白对照组与无关si RNA对照组CB m RNA的相对表达量差异无显著性(P>0.05);与2个对照组比较,沉默1组和沉默2组CB m RNA的相对表达量都显著降低,差异有非常显著性(P<0.01)。说明转染pRNAT-U6.1-si CB634和pRNAT-U61-si CB242的沉默1、2组胃癌BGC-823细胞中CB m RNA表达都受到抑制,其中沉默2组的抑制效果优于沉默1组。
2.3 Western-blot检测CB蛋白表达结果
空白对照组和无关si RNA对照组的细胞中CB蛋白呈现高表达;然而沉默1组和沉默2组细胞中,CB蛋白表达被显著抑制,其中沉默2组的抑制效果优于沉默1组,与RT-PCR结果一致,见图3。说明设计针对CB基因的si RNA片段构建出的si RNA载体能够有效干扰胃癌BGC-823细胞中CB m RNA和蛋白的表达。
2.4 测定细胞生长曲线结果
绘制各组细胞的生长曲线见图4,统计学分析显示,空白对照组与无关si RNA对照组细胞孔内的吸光度值比较,差异无显著性(P>0.05);与2个对照组比较,沉默1组和沉默2组在2 d、3 d、4 d及5d细胞孔内的吸光度值显著减少,差异有显著性(P<0.05)。说明抑制胃癌BGC-823细胞CB基因表达,可以降低胃癌BGC-823的生长速度。
2.5 基质黏附能力实验结果
测定与纤维粘连蛋白和基质胶黏着的四组细胞在波长492 nm的吸光度值,结果见表1,其中空白对照组与无关si RNA对照组吸光度值,差异无显著性(P>0.05);与2个对照组比较,沉默1组和沉默2组吸光度值都显著降低,差异有非常显著性(P<0.01)。由此表明,转染pRNAT-U6.1-si CB634和pRNAT-U61-si CB242的沉默1、2组胃癌BGC-823细胞中抑制CB表达对胃癌BGC-823细胞与基质黏附具有显著的抑制作用。
2.6 细胞体外侵袭实验结果
各实验组穿透Matrigel的平均细胞数见表2。与2个对照组相比,转染pRNAT-U6.1-si CB634和pRNAT-U61-si CB242的沉默1、2组胃癌BGC-823细胞穿透Matrigel的平均细胞数显著减少,提示抑制胃癌BGC-823细胞CB基因表达,可以降低细胞侵袭和转移的能力。
注:覮与2个对照组相比,P<0.01
注:覮与2个对照组比较,P<0.01
3 讨论
肿瘤细胞向邻近部位的侵袭和远处的转移是恶性肿瘤有别于良性肿瘤一个重要的生物学特征之一,也是影响治疗效果及愈后的重要因素。在浸润、转移的过程中,肿瘤细胞与细胞外基质(extracellular matrixc,ECM)的黏附是肿瘤侵袭和转移的重要步骤。肿瘤细胞同ECM黏附后,肿瘤细胞本身和其周围的相关细胞(如成纤维细胞、炎性细胞等)产生大量蛋白酶对其周围的基底膜和基质进行酶解,有助于肿瘤细胞向远处迁移[6,7]。
组织蛋白酶B与肿瘤的发生发展有着密切的关系。CB是溶酶体含有的一种半胱氨酸蛋白水解酶,可以水解多种蛋白质,包括体内的血红蛋白、血清蛋白、明胶和卵黄磷蛋白等[1]。在多种恶性肿瘤中,如肺癌、乳腺癌、神经胶质瘤、食管癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌和恶性黑色素瘤中,CB m RNA和CB蛋白表达显著上调,活性明显升高[8,9]。研究发现,CB能够通过调节肿瘤细胞与ECM的黏附反应、降解ECM和影响肿瘤细胞的增殖来促进肿瘤的发生发展[10]。
本研究采用RNA干扰技术、基质黏附能力实验、细胞体外侵袭实验和CCK-8细胞增殖检测实验观察了抑制CB基因表达对胃癌细胞BGC-823的黏附作用、侵袭性和增殖作用的影响。结果显示抑制了CB的表达以后,胃癌细胞同ECM的黏附能力下降,胃癌细胞穿透基质胶的能力下降,胃癌细胞的增殖能力下降,说明CB的表达增加可以促进胃癌细胞的黏附,有助于其对正常组织的侵犯;同时抑制了CB的表达以后,胃癌细胞的增殖能力下降,说明CB的表达增加可以促进胃癌细胞的增殖。临床研究表明,胃癌组织中CB的表达和活性显著高于癌旁正常组织,并且CB的表达同胃癌浸润深度和淋巴转移程度密切相关[5],这一点与该研究相吻合。
综上所述,抑制胃癌BGC-823细胞CB基因表达,可以降低胃癌细胞的生长速度、降低胃癌细胞与基质黏附能力以及降低胃癌细胞侵袭和转移的能力。本研究为揭示胃癌细胞增殖、侵袭和转移的机制积累了实验依据。
参考文献
[1]GRAY RS,CHEUNG KJ,EWALD AJ.Cellular mechanisms reg-ulating epithelial morphogenesis and cancer invasion[J].Curr OpinCell Biol,2010,22(5):640-650.
[2]GOLE B,DURAN ALONSO MB,DOLENC V,et al.Post-trans-lational regulation of cathepsin B,but not of other cysteinecathepsins,contributes to increased glioblastoma cell invasivenessin vitro[J].Pathol Oncol Res,2009,15(4):711-723.
[3]WITHANA NP,BLUM G,SAMENI M,et al.Cathepsin B inhi-bition limits bone metastasis in breast cancer[J].Cancer Res,2012,72(5):1199-1209.
[4]KILLEEN SD,WANG JH,ANDREWS EJ,et al.Bacterial endo-toxin enhances colorectal cancer cell adhesion and invasionthrough TLR-4 and NF-kappaB-dependent activation of theurokinase plasminogen activator system[J].Br J Cancer,2009,100(10):1589-1602.
[5]EBERT MP,KRUGER S,FOGERON ML,et al.Overexpressionof cathepsin B in gastric cancer identified by proteome analysis.Proteomics[J].2005,5(6):1693-1704.
[6]SPRENGER CC,PLYMATE SR,REED MJ.Aging-related alter-ations in the extracellular matrix modulate the microenvironmentand influence tumor progression[J].Int J Cancer,2010,127(12):2739-2748.
[7]SERCU S,ZHANG L,MERREGAERT J.The extracellular ma-trix protein 1:its molecular interaction and implication in tumorprogression[J].Cancer Invest,2008,26(4):375-384.
[8]吴丹,李柱南,许颖,等.组织蛋白酶B在宫颈鳞癌中表达及意义[J].南方医科大学学报,2010,30(6):1330-1332.[8]WU D,LI ZN,XU Y,et al.Clinical significance of cathepsin Bexpressions in cervical cancer in tissues[J].Journal of SouthernMedical University,2010,30(6):1330-1332.
[9]NALLA AK,GORANTLA B,GONDI CS,et al.TargetingMMP-9,uPAR,and cathepsin B inhibits invasion,migrationand activates apoptosis in prostate cancer cells[J].Cancer GeneTher,2010,17(9):599-613.
侵袭蛋白 篇3
程中发挥重要的作用[7,8]。本研究通过比较正常乳腺组织、导管原位癌以及侵袭性导管癌中AnnexinⅡ水平,分析AnnexinⅡ在乳腺癌组织中的表达情况, 通过比较高侵袭性乳腺癌细胞株及低侵袭性乳腺癌细胞株中AnnexinⅡ的表达情况, 分析AnnexinⅡ在乳腺癌侵袭及转移过程中的作用。现将结果报道如下:
1 材料与方法
1.1 组织标本及细胞株
正常乳腺组织以及乳腺癌组织均由浙江省台州医院病理室提供。人乳腺癌细胞株包括高侵袭性人乳腺癌细胞株MDA-MB-435s株和低侵袭性人乳腺癌细胞株MCF-7,购自上海拜力生物科技有限公司。
1.2 主要试剂
小鼠抗人AnnexinⅡ单克隆抗体,小鼠抗人β-actin单克隆抗体,FITC标记的兔抗上样Ig G,由美国SantaCruz公司提供; 辣根过氧化酶标记的羊抗小鼠Ig G,辣根过氧化酶标记的兔抗羊Ig G,TRITC标记的山羊抗小鼠Ig G,SP免疫组化试剂盒, 由上海鑫乐生物科技有限公司提供。细胞培养箱,双垂直板蛋白电泳槽,电泳仪,凝胶数字成像系统。
1.3 实验方法
1.3.1 AnnexinⅡ在正常乳腺组织、乳腺癌组织中的表达采用免疫组织化学法进行检测。标本脱蜡,加入3% H2O2浸泡,去除内源性过氧化氢酶,清水冲洗2次 ,加入0.01 mol/L的柠檬酸 , 蒸煮3 min, 冷却后再蒸煮1次,冷却,抗原修复。水洗2次后将载玻片放置于PBS液中5 min洗2次,擦干,加正常山羊/兔血清封闭,37℃温箱中放置30 min。加一抗,4℃保存过夜,置于37℃下复温后在PBS液中冲洗5 min,3次,加二抗,37℃温箱中放置20 min。PBS冲洗5 min,3次,加SABC,37℃温箱内放置30 min。PBS液冲洗5 min,3次,加DAB显色液。清水冲洗后浸泡入苏木精复染1 min。脱水,封片。在显微镜下观察图像,并采用软件分析染成黄色区域的累积光密度(IOD)值。
1.3.2 AnnexinⅡm RNA以及蛋白在高侵袭人乳腺癌细胞株以及低侵袭人乳腺癌细胞株中的表达MDAMB-435s以及MCF-7细胞株接种于培养基上进行细胞培养,取对数生长期细胞进行实验。采用RT-PCR方法测定AnnexinⅡm RNA的表达情况。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。提取乳腺癌细胞的总RNA, 所得RNA行逆转录合成c DNA。PCR反应,50μL体系,预变性94℃2 min,变性94℃30 s,退火58℃30 s,延伸72℃35 s,延伸72℃5 min。其中变性-退火-延伸循环28次。凝胶电泳成像,分析灰度值。采用Western blot测定人乳腺癌细胞中AnnexinⅡ蛋白的表达。提取总蛋白,测定蛋白含量,SDS-PAGE电泳,转膜,分别加一抗、二抗进行免疫反应,显色,采用Quantity One凝胶图像处理系统分析条带的光密度值。
1.4 统计学方法
采用SPSS 12.0统计学软件对数据进行分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,采用方差分析,两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 AnnexinⅡ在 正常乳腺组织 、导管原位癌 、侵袭性导管癌组织中的表达
AnnexinⅡ在正常乳腺组织中主 要表达在间质内,在乳腺导管上不表达,在导管原位癌以及侵袭性导管癌组织中在间质、血管、肿瘤组织上均有表达。AnnexinⅡ在正常乳腺组织表达的IOD值为(6.5±1.0)×106,在导管原位癌中表达的IOD值为 (27.5±3.0)×106,在侵袭性导管癌组织中表达的IOD值为(40.0±11.0)×106。三组间比较,差异有高度统计学意义(P < 0.01),导管原位癌、侵袭性导管癌组织中的表达量显著高于正常乳腺组织,而侵袭性导管癌中的表达量显著高于导管原位癌(均P < 0.01)。见图1~4。
2.2 AnnexinⅡ m RNA 及蛋白在不同人乳腺癌细胞株中的表达
AnnexinⅡm RNA在高侵袭性人乳腺癌细胞株MDA-MB-435s中的表达显著高于MCF-7株中的表达,差异有高度统计学意义(P < 0.01);AnnexinⅡ蛋白在高侵袭性人乳腺癌细胞株MDA-MB-435s中的表达显著高于MCF-7株中的表达, 差异有高度统计学意义(P < 0.01)。见表1。
3 讨论
AnnexinⅡ是一种依赖钙离子的磷脂结合蛋白 ,又名P36、ANX2、LIP2、LPC2、CAL1H、LPC2D、ANX2L4、PAP-IV。其基因位于15q21-q22,蛋白分子量为36 k D,在人体内皮细胞、单核/巨噬细胞、骨髓细胞和某些肿瘤细胞中表达丰富。以单体、二聚体以及四聚体方式存在,不同的形式生物学功能不同。人AnnexinⅡ的结构基因位于15q21-q22,含1.4 kb编码基因,并有3个假基因分别位于4号、9号、10号染色体上。人AnnexinⅡ结构基 因含13个外显子 和12个内含子 。AnnexinⅡ由339个氨基酸残基组成,是Annexins家族A亚家族成员。与该家族其他成员一样 ,它在结构上都具有一个保守的羧基末端和一个可变的氨基末端。保守的羧基末端一般具有4个Annexin重复子,每一个重复子由大约70个高度保守氨基酸残基构成。每一个重复子有5个α螺旋结构,它们堆叠成致密的圆盘状。该结构域具有结合钙离子的能力, 从而调节Annexin分子与磷脂分子的结合 , 故被称为所有Annexins家族成员的核心区域 ,被钙离子活化后可与膜磷脂结合的蛋白,参与膜转运及膜表面其他一系列依赖于钙调蛋白的活动。
AnnexinⅡ除了在细胞分泌、增殖、 细胞骨架连接、纤溶等方面发挥重要的作用外, 其还具有结合RNA的作用 ,结合到c-mycm RNA上 ,可上调c-Myc蛋白。越来越多的研究显示,AnnexinⅡ在肿瘤的发生和发展过程中发挥重要的作用。孟鑫等[9]研究显示AnnexinⅡ在胃癌中高表达。陈辉等[10]研究显示AnnexinⅡ可能参与了甲状腺乳头状癌的发生和发展。AnnexinⅡ四聚体在肿瘤的迁移过程中充当了组织型纤溶酶原活化剂、纤溶酶原的受体,产生活化的纤溶酶,活化基质金属蛋白酶,从而参与肿瘤的侵袭及转移过程[11,12,13]。
本研究对正常乳腺组织、乳腺癌组织中AnnexinⅡ的表达情况进行了分析, 结果显示AnnexinⅡ在正常乳腺组织内仅仅表达在组织间质,在乳腺导管上皮细胞内部表达,但是在乳腺癌的上皮细胞胞质以及胞膜内均呈现高表达,并且在乳腺癌组织中的血管内皮细胞上也出现高表达。通过IOD进行定量分析,结果显示,AnnexinⅡ在侵袭性导管癌组织中的表达最高,在导管原位癌组织中的表达其次,在正常乳腺组织中的表达最低。提示AnnexinⅡ可能与乳腺癌的侵袭有关。为了进一步进行验证,分别选择了高侵袭性人乳腺癌细胞株MDA-MB-435s以及低侵袭性人乳腺癌细胞株MCF-7进行研究, 分析不同侵袭性人乳腺癌细胞株中AnnexinⅡm RNA以及蛋白的表达情况。结果显示, 在高侵袭性人乳腺癌细胞MDA-MB-435s株中AnnexinⅡm RNA以及蛋白的表达均显著高于低侵袭性人乳腺癌细胞MCF-7株。这进一步证实AnnexinⅡ可能与乳腺癌肿瘤细胞的侵袭性相关。
既往的定位研究显示,AnnexinⅡ在细胞内的分布广泛,不仅存在于细胞浆内,还存在于细胞核[14,15]。细胞浆内的两个AnnexinⅡ与2个s100A10形成四聚体, 借助AnnexinⅡ的亲钙特性以及磷脂性转移到细胞膜,从而发挥一定的生物学功能。AnnexinⅡ可调节s100A10水平,并且能够屏蔽细胞内s100A10的泛素化信号,从而稳定细胞内s100A10蛋白水平。另外单体或者四聚体的AnnexinⅡ均能够结合F-肌动蛋白,发挥稳定细胞骨架的作用[16,17]。AnnexinⅡ还是一种生长调节基因,AnnexinⅡ单体可作为蛋白复合物的一部分,发挥增强DNA聚合酶α活性的作用,促进合成DNA[15]。AnnexinⅡ蛋白还可作为RNA结合蛋白,结合Poly G以及c-myc基因的m RNA上 , 形成m RNP,发挥调节c-myc基因m RNA翻译的作用, 而c-Myc蛋白参与了细胞的增殖、代谢、更新、分化、凋亡[18]。丁滔等[19]研究显示,AnnexinⅡ在不同Gleason评分、前列腺特异性抗原水平、临床分期、不同危险度中的表达存在显著差异, 认为AnnexinⅡ表达与前列腺癌的发生、进展及预后有关。
侵袭蛋白 篇4
1 材料和方法
1.1 细胞系和细胞培养
小鼠腹水型肝癌高、淋巴道转移株Hca-F和Hca-P细胞由大连医科大学病理教研室自建并冻存。复苏液氮冻存的Hca-F和Hca-P细胞,用含10%胎牛血清(PPA公司)的RPMI 1640完全培养基(Invitrogen公司)37℃、5%二氧化碳(CO2)孵箱(Thermo公司)培养细胞24 h,收集细胞分别进行下列实验。
1.2 细胞增殖能力的检测
1.2.1 制作吸光度与细胞数关系的标准曲线
无血清培养基培养Hca-F和Hca-P细胞24 h,调整细胞浓度为1×104/m L、2×104/m L、4×104/m L、8×104/m L和1.6×105/m L分别加入96孔板中,每孔加100μL,每组设5个复孔,然后再向每孔细胞悬液中加入10μL CCK8(日本Dojindo公司),37℃、5%CO2孵箱继续孵育1 h,酶标仪(Thermo公司)在450 nm波长下测每组的吸光度。RPMI 1640完全培养基加CCK8作为空白对照,细胞吸光度为测得的吸光度减去空白对照。
1.2.2 CCK8法检测细胞增殖能力
收集Hca-F/Hca-P细胞,用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养基调整细胞浓度为1×104/m L,加入96孔板中,每孔加100μL,每组设5个复孔,分别在5%CO2孵箱中37℃孵育0、24和48 h,然后再向每孔细胞悬液中加入10μL CCK8,37℃、5%CO2孵箱继续孵育1 h,酶标仪在450 nm波长下测每组的吸光度,观察不同的时间点细胞数目的变化。RPMI 1640完全培养基加CCK8作为空白对照。
1.3 Transwell小室法检测细胞侵袭能力
无血清培养基培养Hca-F和Hca-P细胞24 h,然后分别稀释Hca-F和Hca-P细胞至3×105/m L,每个Transwell小室加入50μL Matrigel(BD公司),5%CO2孵箱37℃孵育1 h,无血清培养基水化30min。各组细胞悬液按每孔100μL加入Transwell小室(Coring公司)的上室,在下室加入500μL含20%胎牛血清的RPMI 1640完全培养基37℃、5%CO2孵箱培养细胞24 h。0.1%的结晶紫染色20 min。在正置显微镜(Olympus公司)下观察Transwell小室下室面发生侵袭的细胞,每组随机选取5个视野进行计数。同时对下室培养基进行计数,以观察下室有无细胞的漏出。
1.4 膜联蛋白A7在亚细胞结构中的表达
1.4.1 亚细胞结构的分离提取
利用Proteo Extract subcellular Proteome Extraction Kit(S-PEK)(Calbiochem公司)分别分离提取上述Hca-F细胞和Hca-P细胞中细胞浆、细胞膜、细胞核和细胞骨架成份。
1.4.2 双向凝胶电泳
在10%聚丙烯酰胺凝胶中进行,膜联蛋白A7抗体(Sigma公司)浓度1︰1 500,HRP标记山羊抗鼠Ig G多克隆抗体(北京中杉金桥公司)浓度1︰1 500。内参:细胞浆采用GAPDH(康晨公司);细胞膜采用Pan-cadherin(Abcam公司);细胞核采用C-jun(Abcam公司);细胞骨架采用β-actin(Santa Cruz公司)。为了最小化各种变量的影响,蛋白表达采用相对值,即目的蛋白与内参之比。
1.5 统计学方法
所有实验数据应用SPSS 13.0(snow panther,USA)进行分析,数据结果以均数±标准差(±s)表示,膜联蛋白A7亚型差异用独立样本的t检验,采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 细胞增殖能力的检测
2.1.1 制作标准曲线
Hca-F/Hca-P细胞数对应的吸光度(见附表)及标准曲线(见图1)。
2.1.2 CCK8检测细胞增殖能力
无细胞单纯1640孵育0、24和48 h后加入CCK8的吸光度为(0.106±0.001 vs 0.097±0.003 vs 0.097±0.003,P>0.05),1640空白对照在3个时间点差异无统计学意义。孵育第0 h,Hca-F和Hca-P细胞各1 000个,未孵育(即孵育0 h)CCK8检测吸光度(0.146±0.015 vs 0.147±0.03,P>0.05),Hca-F和Hca-P细胞各1 000个,继续孵育24 h及48 h,CCK8检测吸光度为(0.866±0.102 vs 0.190±0.003;2.414±0.020vs 0.424±0.030,均P<0.05),即在第24 h和第48 h两个时间点,Hca-F细胞的增殖能力都高于Hca-P细胞,二者差异有统计学意义(见图2)。
注:吸光度值=测量值-空白对照
用CCK8法检测各时间点(0、24和48 h)的吸光度。0 h:细胞未孵育;24 h:细胞孵育24 h后;48 h:细胞孵育48 h后。F cell为Hca-F细胞;P cell为Hca-P细胞;1640为无细胞,单纯加入1640
2.2 Transwell小室检测细胞侵袭能力
Hca-F细胞在Transwell小室穿过膜的细胞数明显高于Hca-P细胞,二者有统计学意义[(90±4)个和(69±9)个,P<0.05]。下室未发现有细胞漏出。结果见图3。
用Transwell小室检测各组细胞的侵袭能力(即穿膜细胞数)。Hca-F细胞在Transwell小室穿过膜的细胞数[(90±4)个]明显高于Hca-P细胞[(69±9)个](P<0.05)
2.3 膜联蛋白A7在亚细胞结构中的表达
膜联蛋白A7的47 k D和51 k D两种亚型在Hca-F细胞和Hca-P细胞均有表达。其中,47 k D亚型在Hca-F细胞的细胞浆、细胞膜细胞器膜、细胞骨架中的表达均明显高于Hca-P细胞,两株细胞在上述3种亚细胞器的表达依次为(73±7)%vs(49±19)%(P<0.05)、(36±8)%vs(24±9)%(P<0.05)和(53±7)%vs(40±12)%(P<0.05)。47 k D亚型在Hca-F细胞和Hca-P细胞细胞浆中的表达都明显高于在细胞膜细胞器膜、细胞核、细胞骨架中的表达,Hca-F细胞为(73±7%)vs(36±8)%、0及(53±7)%(P<0.01);Hca-P细胞为(49±18)%vs(24±9)%、0及(40±12)%(P<0.05)。在Hca-F细胞和Hca-P细胞细胞膜、细胞核、细胞骨架中未见明显51 k D亚型的表达。见图4。
Hca-F细胞Hca-P细胞A为膜联蛋白A7在Hca-F/P细胞的表达结果;B为GAPDH在Hca-F/P细胞细胞浆的表达结果;C为Pan-cadherin在Hca-F/P细胞细胞膜、细胞器膜的表达结果;D为C-jun在Hca-F/P细胞细胞核的表达结果;E为β-actin在Hca-F/P细胞细胞骨架的表达结果
3 讨论
Hca-F细胞和Hca-P细胞是利用可移植性小鼠腹水性肝癌细胞(H22)接种于有正常免疫功能的615小鼠足垫,经多次淋巴系统筛选而得到的2个来源于同一亲本细胞的细胞株,但两者淋巴道转移能力明显不同,Hca-F细胞淋巴道转移率为70%~80%,而Hca-P细胞淋巴道转移率为20%~30%[1,2,3]。体外实验证实[1,11,12],Hca-F细胞无论是在增殖能力还是侵袭能力都明显高于Hca-P细胞。膜联蛋白A7主要在细胞浆表达,其次为细胞骨架结构及细胞膜和细胞器膜;两种细胞均以47 k D亚型表达为主,且在Hca-F细胞的表达高于Hca-P细胞。
膜联蛋白A7是Ca2+依赖的磷脂结合蛋白,已有实验[13]表明大多数的膜联蛋白A7位于静息细胞的胞浆中,至少是在培养细胞中。膜联蛋白A7在细胞中的分布直接间接地与细胞浆和内膜系统相联系,参与胞吐胞饮,与细胞骨架蛋白结合,并与膜运输、Ca2+的自稳态调节与信号转导、细胞分化和细胞增殖等有关[4]。这些均与定位实验结果,膜联蛋白A7特别是47 k D蛋白亚型主要分布于细胞浆、细胞膜、细胞骨架中相符合。实验表明[13,14,15]膜联蛋白A7的分布依赖于细胞钙离子的水平,在钙离子载体中孵育30 min,膜联蛋白A7显示定位于细胞膜,而孵育4 h后,则显示为核膜定位。本实验所发现的膜联蛋白A7特别是47 k D亚型在细胞浆中的大量表达,是否与高淋巴道转移潜能的肿瘤细胞具有更加富集的钙离子浓度有关,还值得进一步深入研究。但研究中有关肿瘤细胞侵袭实验结果已表明[1],高淋巴道转移潜能的Hca-F细胞较之低淋巴道转移潜能的Hca-P细胞具有更加活跃的增殖与侵袭能力。因此可以推测其与细胞内钙离子调节具有某种相关。
膜联蛋白A7由于在其N末端不同的剪切产生了47 k D和51 k D两个蛋白亚型,有文献[9]表明,在人和小鼠的大部分组织仅表达47 k D亚型;骨骼肌仅表达51 k D亚型;而在脑和心脏这两种亚型都表达。本实验显示膜联蛋白A7在高/低淋巴道转移细胞模型中,47 k D亚型的表达都明显高于51 k D亚型,而51 k D亚型仅少量存在于胞浆中,即在肝癌组织中仍以47 k D亚型表达为主。这些可能与细胞的分化状态有关。
侵袭蛋白 篇5
1资料与方法
1.1一般资料收集2010年3月~2015年6月深圳市南山区人民医院收治行手术切除上皮性卵巢癌组织43例,术前均未行放疗、化疗等辅助治疗,术后均经病理证实,排除临床资料不完整者。年龄24~71(44.82±11.65)岁;分化程度:高17例,中13例,低13例;临床分期:I、II期23例,III、IV期20例;淋巴结转移20例。另收集同期行卵巢活检的正常卵巢组织28例作为对照,均经病理证实为正常卵巢组织,年龄23~73(45.30±11.48)岁。两组一般资料比较无显著差异,具有可比性。
1.2实验方法采用免疫组织化学染色法检测上皮性卵巢癌组织和正常卵巢组织中DJ-1和HSP27蛋白的表达情况,操作严格按照SP试剂盒说明书进行,SP试剂盒、DJ-1鼠抗人单克隆抗体和HSP27兔抗人多克隆抗体均购自武汉博士德生物工程有限公司。
1.3诊断标准DJ-1呈棕黄或棕褐色颗粒表达于细胞浆或细胞核,HSP27呈棕黄或棕褐色颗粒表达于细胞浆。随机选择5个视野共计数200个细胞,计算阳性细胞数和染色强度,(1)阳性细胞数<1%、1%~10%、11%~50%、51%~80%、81%~100%分别记为0、1、2、3、4分;(2)阳性细胞基本不着色、淡黄色、黄色、棕黄色分别记为0、1、2、3分,上述两项得分相乘0分为阴性(-),1~12分为阳性(+)。
1.4统计学处理所有数据均经SPSS 17.0统计学软件进行分析,计量资料采用±s的形式表示,组间计量资料比较应用t检验,计数资料采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 D J-1和H SP27蛋白在上皮性卵巢癌组织和正常卵巢组织中的表达DJ-1、HSP27蛋白在卵巢癌组织中的表达率均明显高于正常卵巢组织,差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。
2.2 DJ-1和HSP27蛋白的表达与卵巢癌病理特征的关系上皮性卵巢癌组织中DJ-1和HSP27蛋白的表达与分化程度、淋巴结转移相关(P<0.05),与临床分期无关(P>0.05)。见表2。
3讨论
卵巢癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一,具有高复发率、高死亡率、预后差等特点,对患者身心健康造成严重不良影响,其早期诊断和治疗一直是妇科临床研究的热点之一。研究[2,3]发现DJ-1蛋白、HSP27蛋白在乳腺癌、胰腺神经内分泌肿瘤等恶性肿瘤组织中表达上调,且与肿瘤发生、发展、预后密切相关,但其在卵巢癌组织中的表达及临床意义的报道较少。
DJ-1蛋白广泛存在于人体各种组织中,并在各种生理病理活动中参与重要角色。随着对DJ-1蛋白与肿瘤关系研究的日渐深入,发现DJ-1蛋白在肿瘤细胞凋亡调节、细胞增殖和转录等多方面均起重要作用,与恶性肿瘤发生、发展及预后等密切相关[4]。此外,研究[5]发现乳腺癌组织中DJ-1蛋白表达上调,乳腺癌患者外周血中DJ-1抗体明显高于正常健康者,可见乳腺癌组织中DJ-1蛋白高表达可刺激机体产生抗体,而正常组织中的DJ-1蛋白则无此功能,提示DJ-1蛋白是一种潜在的肿瘤抗原与标记物,可能成为恶性肿瘤分子靶向治疗的新靶点。HSP27蛋白是HSP家族成员之一。研究表明HSP27蛋白具有调节细胞分化增殖、代谢平衡、凋亡、维持细胞骨架稳定、影响癌细胞转移等多种生物学功能,从而在多种肿瘤发生、发展中参与重要角色[6,7]。本研究结果显示,DJ-1蛋白、HSP27蛋白在上皮性卵巢癌组织中的阳性表达率均明显高于正常卵巢组织,且与肿瘤分化程度、淋巴结转移有关,提示DJ-1蛋白、HSP27蛋白可能不仅参与上皮性卵巢癌的发生、发展过程,同时可能对上皮性卵巢癌侵袭、转移等生物学行为有重要影响,故DJ-1蛋白、HSP27蛋白可能成为判断上皮性卵巢癌患者预后的新标志物。
综上所述,上皮性卵巢癌组织中DJ-1和HSP27蛋白表达上调,其高表达可能促进上皮性卵巢癌侵袭转移。
摘要：收集我院卵巢上皮性肿瘤石蜡组织标本43例和正常卵巢组织标本28例,采用免疫组织化学染色法检测DJ-1和HSP27蛋白的表达情况。结果DJ-1、HSP27蛋白在卵巢癌组织中的表达率均明显高于正常卵巢组织(P<0.05);皮性卵巢癌组织中DJ-1和HSP27蛋白的表达与分化程度、淋巴结转移相关(P<0.05)。上皮性卵巢癌组织中DJ-1和HSP27蛋白表达上调,其高表达可能促进上皮性卵巢癌侵袭转移。
关键词：上皮性卵巢癌,DJ-1,HSP27,侵袭转移
参考文献
[1]桂建中.卵巢癌化疗的临床疗效观察[J].现代诊断与治疗,2013,24(4):903-904.
[2]杨立新,张丽娜,张天彪.胰腺神经内分泌肿瘤中DJ-1蛋白高表达的临床意义[J].中国癌症杂志,2015,25(2):112-118.
[3]高霞,钱晓龙,付丽.热休克蛋白27在乳腺癌发生发展中的作用[J].中国肿瘤临床,2013,40(10):612-614.
[4]秦龙飞.非小细胞肺癌患者癌组织DJ—1表达及其与临床病理的相关性[J].中国老年学杂志,2013,33(18):4533-4534.
[5]李森.三阴性乳腺癌中DJ-1和HSP27的表达及其临床意义[J].现代肿瘤医学,2013,21(6):1231-1234.
[6]张凯丽,冀宏.HSP27与FAS/FASL在三阴性乳腺癌侵袭转移中的作用[J].中国肿瘤临床,2015,42(3):147-151.