蛋白分离

蛋白分离（共10篇）

蛋白分离 篇1

菠萝蛋白酶是以菠萝的果、茎、叶和皮等为原料, 运用现代生物分离提纯技术制成, 其外观为微黄色粉末状, 分子量为33 000, 等电点为9.5。菠萝蛋白酶能够水解大豆分离蛋白制作大豆肽, 该方法价廉, 且易进行、易控制及易分离, 安全性高, 受到行业人士广泛关注。本试验通过研究菠萝蛋白酶水解大豆分离蛋白的工艺条件, 探究菠萝蛋白酶对大豆分离蛋白的水解能力和最佳的工艺参数, 控制水解度, 为行业应用提供科学依据。

1 试验材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆分离蛋白, 河南郑州同创益生食品有限公司;菠萝蛋白酶 (2500GDU/g) , 广西南宁杰沃生物制品有限公司;盐酸溶液 (0.1141mol/L) 、Na OH溶液 (1.075mol L) , 河南省洛阳市化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

凯氏定氮仪、碱式滴定管, 天津玻璃仪器厂;90W电动搅拌器, 金坛市金城教学仪器厂;DELTA-320型pH计, 梅特勒公司;HH-4数显恒温水浴锅, 国华电器公司;T-500型电子天平, 上海精密仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 蛋白含量测定

参照GB/T 5009.5-2003。

1.3.2 水分含量测定

参照GB 5009.3-2003。

1.3.3 大豆分离蛋白水解度测定方法

大豆分离蛋白水解度采用pH-State法。在大豆分离蛋白水解过程中及时加入NaOH标准溶液维持pH值不变, 随预定的反应时间记录维持反应体系pH值恒定所消耗的NaOH溶液的毫升数, 最后计算大豆分离蛋白水解度。

1.3.4 大豆分离蛋白水解方法

配制一定浓度 (W/V) 的大豆分离蛋白溶液, 加热至水解温度, 用酸或碱调节溶液pH值至预定值, 按蛋白酶添加量称取蛋白酶加入大豆分离蛋白溶液中, 在反应过程中及时加入NaOH溶液维持pH值不变, 随预定的反应时间记录维持反应体系pH值恒定所消耗的NaOH溶液的毫升数, 最后计算大豆分离蛋白水解度。

2 结果与讨论

2.1 大豆分离蛋白成分分析

注:氮换算为蛋白质的系数为6.25。

2.2 菠萝蛋白酶水解大豆分离蛋白最佳参数确定

2.2.1 温度对波萝蛋白酶水解的影响

在设定pH值为7.5、底物浓度为4%、酶浓度为2.5%和时间为30min条件下, 测定不同温度下菠萝蛋白酶水解大豆分离蛋白的水解度, 结果如图1所示。

由图1可知:温度45~70℃, 大豆分离蛋白水解度随着温度的增大而增大, 当温度为60℃时, 水解度达到最大, 60℃之后大豆分离蛋白水解度呈下降趋势。这说明菠萝蛋白酶的活性在60℃时最大, 在60℃以下菠萝蛋白酶活性随温度增大而增加, 超过60℃时, 菠萝蛋白酶因温度过高而开始变性失活。

2.2.2 pH值对波萝蛋白酶水解的影响

在设定温度为60℃、底物浓度为4%、酶浓度为2.5%和时间为30min条件下, 测定不同pH值下菠萝蛋白酶水解大豆分离蛋白的水解度, 试验结果如图2所示。

由图2可知:pH值6.5~7.5时, 大豆分离蛋白水解度随着pH值的增大而增大, 当pH值为7.5时, 水解度达到最大, pH值7.5之后大豆分离蛋白水解度呈下降趋势。这说明菠萝蛋白酶的活性在pH值7.5时最大, 在pH值7.5以下菠萝蛋白酶活性随pH值增大而增加, pH值超过7.5时, 菠萝蛋白酶的活性因pH值上升而下降。

2.2.3 底物浓度对波萝蛋白酶水解的影响

在设定温度为60℃、pH值为7.5、酶浓度为2.5%和时间为30min条件下, 测定菠萝蛋白酶在不同大豆分离蛋白底物浓度下的水解度, 试验结果如图3所示。

由图3可知:底物浓度从3%~4%时, 大豆分离蛋白水解度随着底物浓度的增大而增大, 当底物浓度为4%时, 水解度达到最大, 底物浓度超过4%时, 大豆分离蛋白水解度呈下降趋势。这说明菠萝蛋白酶水解最佳底物浓度为4%。底物浓度过低, 影响酶和底物结合几率, 水解度下降, 底物浓度过高会抑制大豆分离蛋白的水解。

2.2.4 酶浓度对波萝蛋白酶水解的影响

在设定温度为60℃、pH值为7.5、底物浓度为4%和时间为30min条件下, 测定不同酶浓度下菠萝蛋白酶水解的水解度, 试验结果如图4所示。

由图4可知:酶浓度2.5%~6%时, 大豆分离蛋白水解度随着酶浓度的增大而快速增加, 当酶浓度达到6%时, 大豆分离蛋白水解度开始增加缓慢。当菠萝蛋白酶的浓度超过5%时大豆分离蛋白水解度增加很小, 这是因为当酶与底物完全作用时, 过量的酶不会增加水解速率, 因此菠萝蛋白酶水解时酶浓度为5%即可。

2.2.5 时间对波萝蛋白酶水解的影响

在设定温度为60℃、pH值为7.5、底物浓度为4%和酶浓度为5%, 测定不同时间下菠萝蛋白酶水解的水解度, 试验结果如图5所示。

由图5可知:菠萝蛋白酶水解反应时间10~30min时, 大豆分离蛋白水解度随着反应时间的增加而增加较快, 菠萝蛋白酶水解反应30min之后水解度增加缓慢。当反应时间超过30min时水解度增加很小, 这是因为水解反应超过30min时, 菠萝蛋白酶酶作用点数目所剩很少, 因此考虑反应效率, 菠萝蛋白酶水解时间为30min即可。

2.2.6 菠萝蛋白酶水解大豆分离蛋白工艺条件优化

选用L9 (34) 正交表试验方案, 以水解度最大值为评价指标, 在水解时间为30min下, 对温度、pH值、底物浓度和酶浓度进行优化。正交试验方案及结果分析见表2。

由表2可知:影响菠萝蛋白酶水解大豆分离蛋白参数的大小顺序 (即R值大小顺序) 为:酶浓度>温度>底物浓度>pH值;菠萝蛋白酶水解大豆分离蛋白的最佳参数组合:酶浓度为6%、温度为65℃、底物浓度为5%和pH值为8.0。在此条件下验证表明, 菠萝蛋白酶水解大豆分离蛋白的水解度可以达到8.18%。

3 结论

菠萝蛋白酶水解大豆分离蛋白最佳工艺条件为酶浓度为6%、温度为65℃、底物浓度为5%和pH值为8.0, 在此条件下菠萝蛋白酶水解大豆分离蛋白30min, 水解度为8.18%。

为了增加菠萝蛋白酶水解大豆分离蛋白的水解度, 可延长反应时间, 在此条件下水解4h, 水解度可达11.07%。

摘要：以水解度为指标, 研究了温度、pH值、底物浓度和酶浓度等因素对菠萝蛋白酶水解大豆分离蛋白的影响。影响菠萝蛋白酶水解大豆蛋白的影响因素顺次为酶浓度、温度、底物浓度和pH值。最佳参数组合是酶浓度为6%、温度为65℃、底物浓度为5%和pH值为8.0。在此条件下, 菠萝蛋白酶水解大豆分离蛋白的水解度在30min内可以达到8.18%。

关键词：菠萝蛋白酶,大豆分离蛋白,水解度

参考文献

[1]GB/T5009.5-2003食品中蛋白质的测定方法[M].

[2]GB5009.3-2003食品中水分的测定方法[M].

[3]Adler-Nissen J.Enzymic hydrolysis of food proteins[M].New York:Elsevier Applied science Publishers, 1986:74-78.

[4]Hevia P.et al.Flavor of Enzyme-solubilized fish protein concen-tration fractions[J].J Agr Food Chem, 1977, 25 (4) :772.

蛋白分离 篇2

晚期氧化蛋白产物的分离纯化和鉴定

目的分离纯化以人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)为原料生成的晚期氧化蛋白产物(advanced oxidation protein products,AOPP),即AOPP-HSA,并对其进行鉴定,以寻求一种制备高纯度且具生物活性的`AOPP-HSA的方法.方法采用HSA-HOCl孵育法体外制备AOPP-HSA粗纯品,经凝胶层析和离子交换高压液相层析(high performance liquid chromatography,HPLC)两步层析分离纯化其中的AOPP-HSA,并经紫外和荧光光谱、SDS-PAGE、单核细胞TNF-α分泌实验鉴定其结构特征和生物学活性.结果分离的蛋白质纯度达99.4%,分子质量为700×103,是含有双酪氨酸的蛋白交联聚合物,能够显著刺激单核细胞TNF-α的分泌.结论采用上述两步层析方法能够由粗纯品中成功分离出高纯度并具生物活性的AOPP-HSA,为AOPP的进一步研究奠定了基础.

作 者：孙岩 吴雄飞 金锡御 SUN Yan WU Xiong-fei JIN Xi-yu 作者单位：第三军医大学西南医院肾科,重庆,400038刊 名：第三军医大学学报 ISTIC PKU英文刊名：ACTA ACADEMIAE MEDICINAE MILITARIS TERTIAE年，卷(期)：28(10)分类号：Q503 Q51 Q591.2关键词：晚期氧化蛋白产物 尿毒症毒素 色谱法 凝胶 离子交换 单核细胞

蛋白分离 篇3

关键词：大豆分离蛋白；聚集体；界面性质；冰淇淋；应用

中图分类号：TS201.2 文献标识码：A 文章编号：1674-1161（2016）08-0043-04

随着人口剧增导致资源供应日趋紧张，食品的蛋白质资源逐渐被研究者立为重点。肉类食品虽蛋白质含量高，但其中含有大量脂肪及固醇。而大豆是“完全蛋白质”的植物来源，其蛋白质含量高达40%以上，氨基酸模式与人体必需氨基酸的需求量比较吻合，且不含胆固醇，其特有的生理活性物质——异黄酮还具有降低胆固醇的作用。

大豆蛋白优质、廉价，可以用于装饰高级糕点和生产冰淇淋及啤酒，作为饮料、冰淇淋及乳化型制品的表面活剂来稳定乳化结构，是水、糖、油脂及其他食品配合物的良好载体。近年来，国内外学者对不同种蛋白质在不同环境条件下及经过各种改性处理后的功能性质进行大量研究，例如：Hemansson等人分析了不同环境条件对蛋白凝胶性质的影响；Sarah等人研究了热致蛋白凝胶的流变学特性；华欲飞等人比较了大豆蛋白与不同多糖的流变性質，并探讨了相分离在凝胶过程中的机理。但是，目前关于蛋白质在不同条件下热致聚合后形成不同微观形貌的聚集体的功能性质的研究少有报道。

李向红等人[1-4]研究表明：在不同的pH值下，不同浓度的大豆分离蛋白会以不同的结构形式（如单体、二聚体、四聚体、八聚体）存在，再通过高温加热，形成不同形状（如纤维状、絮状、块状）的聚集体。因此，本课题以大豆分离蛋白为原料，在一定的条件下制得不同的蛋白聚集体，分析和比较聚集体的界面性质，得到最优聚集体；再用蛋白聚集体以不同的取代率代替脱脂乳粉制备冰淇淋，探讨大豆分离蛋白聚集体对冰淇淋粘度和硬度的影响。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

大豆分离蛋白，脱脂乳粉，奶油，白糖，黄原胶，单甘酯，蔗糖酯，SDS，金龙鱼大豆色拉油，6%盐酸溶液，6%氢氧化钠溶液。

1.2 仪器和设备

组织捣碎机，pH测定仪，UV-2000型紫外分光光度计，高速离心机，磁力搅拌器，HH-6型电子恒温水浴锅，NDJ-5S型旋转粘度计，质构仪，以及其他试验用玻璃器皿。

1.3 试验方法

1.3.1 大豆分离蛋白聚集体的制备 大豆分离蛋白聚集体的制备方法主要参考Utsumi[5]的方法而有所改进。配置浓度分别为1%，2%，4%，7%（W/V）的大豆分离蛋白溶液，用6%盐酸溶液和7%氢氧化钠溶液调pH值，每个浓度的溶液均调节3个pH值（2.0，3.5，7.0），然后置于80 ℃的水浴锅中加热2 h，制得大豆分离蛋白的不同聚集体。

1.3.2 大豆分离蛋白聚集体界面性质的测定

1） 溶解性的测定。将制备的浓度分别为1%，2%，4%，7%（W/V）的大豆分离蛋白聚集体以10 000 r/min的转速离心15 min，取上清液并稀释，使浓度为1%和2%的样品料液比为1∶5，浓度为4%和7%的样品料液比为1∶10，然后在波长280 nm处测吸光值。采用蛋白质含量的标准曲线（如图1所示），求出溶液中蛋白质含量，再乘其稀释倍数得到溶液中蛋白质浓度。

2） 起泡性和泡沫稳定性的测定。参照Watanabe等人[6]的方法而有所改进。取浓度分别为1%，2%，4%，7%（W/V）的样品各40 mL，用转速为6 500

r/min的组织捣碎机捣碎40 s，置于量筒中，记录泡沫的高度V1，静置30 min后记录泡沫高度V2。计算起泡性（FC）及泡沫稳定性（FS）。

3） 乳化性和乳化活性的测定。参照Watanabe等人的方法而有所改进。取5 mL浓度分别为1%，2%，4%，7%（W/V）的样品各加入5 mL金龙鱼大豆色拉油，用转速为7 500 r/min的组织捣碎机捣碎1 min，制成乳化液，在0 min和10 min时取底部样液50 μL，置于5 mL SDS溶液中稀释，测定500 nm处的吸光值A0和A10。以SDS溶液作为空白。

乳化性用乳化活力指数（EAI）表示：

EAI（m2/g）={（2×2.303）/[C×（1-φ）×104]}×

A500×dilution

乳化稳定性用乳化稳定指数（ESI）表示：

ESI（%）=100×（A10/A0）

式中：N为稀释倍数；C为蛋白质的浓度，g/mL；L为比色池光径，1 cm。

1.3.3 大豆分离蛋白聚集体取代脱脂乳粉制备冰淇淋及其品质的测定 用上述试验确定的最佳大豆分离蛋白聚集体，按照表1的配方，分别以20%，30%，40%，50%的取代率取代脱脂乳粉，制备冰淇淋[7-8]。

1） 冰淇淋粘度的测定。将制备的冰淇淋在4 ℃下老化12 h后，利用NDJ-5S型旋转粘度计，选用2号转子，转速12 r/min，测其粘度。

2） 冰淇淋硬度的测定。利用质构仪的检测探头两次下压测定制备的冰淇淋的质地特征曲线。将样品在冰箱中硬化，取出后迅速测定。参数设定：测试前探头下降速度为2 mm/s，测试速度为3 mm/s；测试后探头回程速度为5 mm/s；测试距离为15 mm；触发力为20×10-2 N；探头类型为P/6。

nlc202309081306

2 結果与分析

2.1 不同种聚集体的溶解性

不同浓度的大豆分离蛋白在不同pH值下制备的聚集体的溶解性测定结果如图2所示。

由图2可以看出：大豆分离蛋白浓度相同时，其聚集体的溶解性随pH值升高呈先降低再升高的趋势；pH值相同时，大豆分离蛋白浓度为4%（W/V）的聚集体的溶解性最高，且在pH值为7.0时其溶解度达到最高、为7.099 mg/mL，而在pH值为3.5时其溶解度最低。这可能是因为蛋白质在等电点时呈电中性，分子间的静电推斥力缺乏，而疏水作用使蛋白质聚集和沉淀，从而降低了蛋白质的溶解性。

2.2 不同种聚集体的起泡性和泡沫稳定性

不同浓度的大豆分离蛋白在不同pH值下制备的聚集体的起泡性（FC）和泡沫稳定性（FS）测定结果如图3和图4所示。

由图3和图4可以看出：大豆分离蛋白浓度相同时，其聚集体的起泡性及泡沫稳定性随pH值升高呈先降低再升高的趋势，在pH值为7.0时最高，起泡性达到40%和泡沫稳定性达到75%，而在pH值为3.5时最低；pH值相同时，起泡性和泡沫稳定性虽变化不明显，但仍能得出起泡性在浓度为7%（W/V）时达到最高，泡沫稳定性在浓度为4%（W/V）时最高。出现这种结果的可能原因，一是蛋白质的内在因素，即蛋白质的组成和结构，如蛋白质分子大小与组成等[10]；二是外在因素，即物理因素，如超声波、有机溶剂等[11]。

2.3 不同种聚集体的乳化性和乳化活性

不同浓度的大豆分离蛋白在不同pH值下制备的聚集体的乳化性和乳化活性测定结果如图5和图6所示。

由图5和图6可以看出：在大豆分离蛋白浓度相同时，其聚集体的乳化性及乳化活性随pH值升高呈先降低再升高的趋势，在pH值为7.0时最高，乳化性为0.07和乳化活性为36%，而在pH为3.5时最低；pH值相同时，乳化性在浓度为7%（W/V）时达到最高，乳化活性在浓度为4%（W/V）时最高。

2.4 大豆分离蛋白聚集体的不同取代率对冰淇淋硬度和粘度的影响

浓度为4%的大豆分离蛋白在pH值为7.0时制备的聚集体的界面性质最佳。用该聚集体以不同的取代率代替脱脂乳粉制备冰淇淋，测定产品硬度和粘度，结果见表2。

由表2可知：随着大豆分离蛋白聚集体取代率的升高，冰淇淋的粘度和硬度均呈升高趋势，在50%的取代率时达到最高，硬度为1 800.03 g左右，粘度为2 152 mg/s左右。这可能是因为大豆分离蛋白聚集体有良好的吸水性，使含有大豆分离蛋白聚集体的冰淇淋混料的粘度升高了，而其良好的持水性又使冰淇淋获得了更高的粘度[12]。

3 结论

上述试验结果表明：不同浓度的大豆分离蛋白在不同pH值条件下制备的大豆分离蛋白聚集体，其溶解性、起泡性、泡沫稳定性、乳化性、乳化活性均有明显差异。在试验选取的3个pH值和4个浓度中，当大豆分离蛋白浓度为4%（W/V）、pH值为7.0时制备的聚集体界面性质最佳。用制备的性能最佳的大豆分离蛋白聚集体取代脱脂乳粉制备冰淇淋，随着取代率的升高，冰淇淋的粘度和硬度均呈升高趋势。

参考文献

[1] 李向红，华欲飞.不同浓度大豆分离蛋白热诱导聚集体的研究[J].中国油脂，2007（32）：74-77.

[2] 李向红，华欲飞.不同离子强度大豆分离蛋白热诱导聚集体的研究[J].中国食品学报，2010（10）：104-109.

[3] 华欲飞.醇法大豆浓缩蛋白的物理改性[D].无锡：无锡轻工业学院，1993.

[4] 华欲飞.醇变性大豆蛋白的结构特征及物理化学性质的研究[J].无锡轻工大学学报，1996（15）：129-134.

[5] DAMODARANS，PARAF A.Food protein sand the irap plieations[M].New York：MareelDekke，1997：257-291.

[6] MOLINA E，LEDWARD DA.Emulsifying properties of high pressure treated soy protein isolate and 7S and 11S globulins[J].Food hydrocoll，2001，15（3）：263-269.

[7] 刘丽.大豆分离蛋白冰淇淋的研制及其功能特性的研究[J].哈尔滨：东北农业大学，2013.

[8] 刘梅森，何唯平，盛明珠.老化时间和温度对软冰淇淋品质的影响[J].中国乳品工业，2006（34）：33-36.

[9] 孙艳婷，黄国清，孙萍，等.大豆分离蛋白溶解性和乳化性影响因素研究[J].粮油食品科技，2011（19）：32-35.

[10] 王盼盼.食品中蛋白质的功能特性综述[J].肉类研究，2010（5）：62-71.

[11] 赵维高，刘文营，黄丽燕，等.食品加工中蛋白质起泡性的研究[J].农产品加工，2012（11）：69-72.

[12] 李维瑶，何志勇.温度对大豆分离蛋白起泡性影响的研究[J].食品工业科技，2010，31（2）：86-88.

Abstract： Under the condition of different pH value， soy protein isolated form different microstructures of aggregates after high temperature heating. This paper studied the different kinds of aggregate's interfacial property （solubility， foamability， foam stability， emulsibility， emulsifying activity） and used aggregation prepared instead of dried skim milk with different replacement ratio and measure rigidity and viscosity. The experimental results showed that： with the concentration of 4%（W/V）of the soy protein isolate and the pH value of 7.0 the aggregate's interfacial property is optimum. In the application of ice cream， along with the increase of the replacement rate， the ice cream's rigidity and viscosity rise. When the replacement rate is 50%， the rigidity and viscosity reach the highest.

Key words： soy protein isolate； aggregation； interfacial property； ice cream； application

大豆蛋白分离机改造 篇4

分离机是大豆蛋白制取工序的关键设备,作用是分离蛋白液中的豆渣、凝乳与乳清液。离心机高效、可靠的运行是保证产品质量、产量、获得率的有效保证。离心机的合理设计和操作是保证离心机高效运行的关键。

1存在的问题

生产中使用国产LW650型卧式螺旋卸料沉降分离机进行大豆蛋白Ⅰ萃、Ⅱ萃及酸沉阶段的大豆蛋白分离,其中酸沉阶段分离数据统计见表1。

表1数据显示,LW650卧式螺旋卸料沉降分离机在酸沉工序段清液含固率0.1%~0.3%,其得率可以满足正常蛋白生产的工艺要求。但仍有0.1%~0.3%的大豆蛋白随分离出的豆清水流失,现场观察发现,从离心机清液出口分离出的豆清水含有大量的蛋白泡沫,而蛋白泡沫就是纯大豆蛋白。由于蛋白泡沫浮在水面上,离心机无法把蛋白泡沫中的大豆蛋白分离沉淀在转鼓壁上。大豆蛋白泡沫随着分离澄清的豆清水溢流出离心机而造成大豆蛋白的流失。由于离心机是24 h连续运行,随蛋白泡沫流失掉的大豆蛋白造成很大的经济损失,同时流失的蛋白会增加后续废水处理的成本。

2原因分析

LW650卧式螺旋卸料沉降分离机结构如图1所示,工作原理:大豆蛋白悬浮液经进料口进入螺旋输料器的布料腔内,经螺旋出料口进入高速旋转的转鼓内,由于转鼓的转速比螺旋输料器转速稍快,同时转鼓内直径大于螺旋输料器内直径,因此从螺旋输料器出料口加速后物料的线速度小于转鼓内蛋白悬浮液的线速度,蛋白悬浮液从线速度较低的螺旋输料器进入线速度较大的转鼓时产生激烈的撞击,由于转鼓内有大量的空气,撞击的蛋白遇到大量的空气产生大量的蛋白泡沫,又因为蛋白本身所具有的发泡性,更容易产生大量的泡沫。蛋白泡沫的比重比豆清水轻从而漂浮在豆清水面上,无法沉淀在转鼓壁,随着在直段沉降区澄清后的豆清水通过豆清水溢流口溢流而出,导致含有大量蛋白的蛋白泡沫流失。

具有的发泡性,更容易产生大量的泡沫。蛋白泡沫的比重比豆清水轻从而漂浮在豆清水面上,无法沉淀在转鼓壁,随着在直段沉降区澄清后的豆清水通过豆清水溢流口溢流而出,导致含有大量蛋白的蛋白泡沫流失。

3改进措施及效果

改进后的分离机结构如图2所示,为了防止蛋白泡沫随豆清水流失,在螺旋输料器螺旋芯管大端端部焊接蛋白消泡板,消泡板外缘插入豆清水液面下20~30 mm,使漂浮在豆清水上的蛋白泡沫被消泡板拦截在转鼓内,从豆清水溢流口溢流出的豆清水不含蛋白泡沫。在转鼓内不断积聚的蛋白泡沫被螺旋输料器输送到锥段脱水区,经螺旋输料器的输送和挤压,蛋白泡沫被挤爆后随脱水蛋白凝乳输送到出渣口排出离心机外。部分在直段沉降区被螺旋输料器挤爆的蛋白泡沫被进一步沉降分离,被沉降分离的蛋白被螺旋输料器输送到出渣口排出离心机外。解决了蛋白泡沫随豆清水流失的问题。改进后的分离机在实际用用中,不但提高了大豆蛋白的获得率,为公司创造了的经济效益,而且降低了后续蛋白废水的处理费用。

参考文献

[1]章棣.分离机械选型与使用手册[M].北京:机械工业出版社,1998,5.

[2]聂幼华.大豆分离蛋白制取新工艺的研究[D].无锡轻工大学,1991.

差异蛋白质组学的分离鉴定技术 篇5

文章综述了差异蛋白质组学中主要分离技术如双向电泳、差异凝胶电泳、多维色谱技术及以质谱为基础的`分离鉴定技术.

作 者：喻小燕 陈锋菊 作者单位：喻小燕(湖南信息职业技术学院;湖南师范大学)

陈锋菊(湖南师范大学;湖南科技大学)

大豆分离蛋白凝胶值的测定 篇6

1 术语

1.1 大豆分离蛋白

是以大豆为原料, 采用先进的加工技术制取的一种蛋白含量高达90%以上的功能性食品添加剂, 它具有很好的凝胶性、粘弹性和乳化性, 又兼有蛋白含量高的营养性, 广泛应用于肉制品、冷饮制品、烘焙食品中。

1.2 凝胶性

是指大豆分离蛋白形成胶体状结构的性能, 它使分离蛋白具有较高的粘性、可塑性和弹性, 即可做水的载体, 也可做风味剂及其他配合物的载体, 可赋予产品良好的凝胶组织结构, 增加咀嚼感。

2 测定方法

2.1 方法提要

物性测定仪可对样品的物性概念作出数据化的准确表述, 使用统一方法的测试, 是精确的感官量化。本方法是利用物性测定仪, 配置专用探头, 在一定的条件下, 模仿人的牙齿压缩产品胶体, 得到第一次压缩时的峰值 (硬度) 、压缩后的回复程度 (弹性) 及二次压缩的耐受能力 (凝集性) 三个数值, 对这三个数值的综合评价即为咀嚼性, 用凝胶值来表示。

2.2 仪器和设备

(1) 物性测定仪:英国TA.XTplus。 (2) 恒温循环水浴锅。 (3) 小型搅拌机:Cuisnart DLC-1。 (4) 真空包装机。 (5) 不锈钢模具:直径5cm, 高35cm, 或用肠衣代替。

2.3 测定步骤

2.3.1 称量

量取2.5%的盐水170ml+30g样品于搅拌机中 (蛋白液浓度15%) 。

2.3.2 均质处理

先点动, 再快速充分搅拌1min, 20s停一次, 把粘在盖上和壁上的蛋白粉刮入杯中。搅拌完毕后, 无残留地转入大的塑料袋中进行抽真空, 使搅拌过程中产生的气泡脱出。

2.3.3 填充

将抽真空的样品填入2个模具中 (注意充填过程不要有空隙) 。

2.3.4 加热冷却

80℃水浴加热30min, 凉水冷却1h。

2.3.5 测试方法

选特定的内置测定程序TPA测定方法, 铝质探头直径15mm。

参数设置

开始运行, 将传感器感应到的数据变化输送到电脑显示器上, 绘出Force-Time曲线, 从曲线上可以看到凝胶块被外来作用力压迫的情况, 曲线如下:

一个样品制备两个凝胶体, 分别进行测定, 取平均值。记录Hardness (硬度) 和Chewiness (咀嚼性)

Chewiness (咀嚼性) =Hardness (硬度) ×Cohseiveness (凝集性) ×Springness (弹性)

硬度 第一个峰的最高点。

凝集性 (粘着性) 第二次压缩面积和第一次压缩面积之比。

弹性 4到5之间的距离和1到2之间的距离之比。

(注:凝集性和弹性两个值都应小于1, 咀嚼性大约是硬度的1/2, 否则有问题, 电脑有可能把等待的时间计入, 使弹性值大于1) 粘性 (粘合性) 在第一次压缩后, 当探头从样品中拔出时, 由于样品和探头的粘连性而形成的负峰区域。

3 不同浓度的盐水对凝胶值的影响

不同浓度的盐水使用以上方法, 进行凝胶值的测定, 数据如下:

在较高的温度下加热凝胶体, 随盐水浓度的增加, 蛋白凝胶的硬度和咀嚼性先增加后减小, 直到无法形成凝胶。其原因是在盐浓度较低时, 蛋白表现为易于溶解, 称为盐溶现象;在盐浓度较高时, 蛋白质会出现沉淀现象, 称为盐析现象。

4 方法说明

4.1

方法中使用2.5%的盐水制备胶体更接近用户的生产工艺, 使测定数据更有意义。

4.2

方法中使用模具制备的样品胶体, 大小、高度一致及表面平整光滑, 减少了样品胶体不一致产生的误差。使用肠衣和离心杯都得不到高度一致的胶体, 如果进行切割, 表面也不平整。

4.3

方法中使用抽真空的方法, 使制备胶体时在搅拌过程中产生的气泡脱出, 降低测试误差。如果使用离心的方法, 凝胶性差的样品容易出现析水现象, 无法得到均匀的胶体。

5 实验总结

经过这项技术试验, 我个人得到了不少的收获, 一方面加深了我对大豆分离蛋白功能性的认识, 另一方面也提高了电脑软件的应用能力。这项试验跟我以前做的试验不同, 以前是依据标准来做, 这次是在日本大豆蛋白专家的指导下, 亲自动手, 开动脑筋, 结合自己的试验经验, 经过反复试验形成了本次实验方法, 并纳入我们实验室的作业指导书中, 作为化验室的检验依据, 所以我觉得这项试验最宝贵, 最深刻。

在本次试验中遇到的困难是胶体的制备。由于产品的质量不完全一致, 就是同样的样品量放置在同样的器具中, 制备的胶体高低也不一样, 经过切割表面不光滑, 这样测得的数据代表性很差, 在这种情况下, 我们发明了不锈钢模具, 并申请了专利, 解决了这一难题。所以我们做实验不要一成不变和墨守成规, 应该有改良创新的精神。在试验的过程中要培养自己的独立分析问题和解决问题的能力。

参考文献

[1]邢小鹏, 吴高峻, 孙华.大豆分离蛋白的功能特性[J].食品工业科技, 2000 (04) .

[2]王欣, 乔玲.大豆分离蛋白的营养、功能特性及应用研究[J].农业科技与装备, 2013 (05) .

油葵饼粕分离蛋白的制备工艺研究 篇7

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

油葵, 购于盐源县油葵种植基地;石油醚、乙醇、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、1.5%的纤维素酶、果胶酶、10%NaCl、0.25%Na2SO3、蒸馏水、1.0mol/L的盐酸溶液和1.0mol/L的氢氧化钠溶液。

1.2 仪器设备

W.SY21-K型号的水浴锅, 北京市长风仪器仪表有限公司;FA2004型电子天平, 上海精科天平;PHS-3C型pH计, 上海日岛科学仪器有限公司;TGL-18LM-W型台式高速冷冻离心机, 湖南星科仪器有限公司;HC.TP12B.5型架盘天平, 上海精密仪器有限公司;冷冻干燥机, 上海比朗仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 油葵饼粕制备

葵花籽仁经破碎后, 加入一定量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液, 胶磨后加入1.5%的纤维素酶和果胶酶, 酶解后经冷冻离心处理, 除去最上层的油脂, 经真空浓缩后冷冻干燥得到葵花粕。

1.3.2 分离蛋白制备方法

取一定量的葵花饼粕, 称量, 记为m1, 然后将所称油葵饼粕用石油醚脱去残存油脂, 加入10倍体积的一定浓度的乙醇在一定温度和pH值条件下醇洗2次, 每次机械搅拌2h, 过滤后在温度40℃过夜风干。然后用10%NaCl、0.25%Na2SO3进行盐提, 调整适当粕液比, 机械搅拌2h, 离心取上清液, 酸沉离心回收沉淀。用蒸馏水透析数次后再冷冻干燥可得分离蛋白, 称量蛋白记为m2。

1.3.3 蛋白质提取率的测定

蛋白质提取率= (m2/m1) ×100%

式中:m1为所称量的饼粕的质量;m2为分离蛋白的质量。

2 结果与分析

2.1 乙醇浓度对蛋白提取率的影响

在提取过程中将粕液比、p H值和温度分别固定于1∶15、4.5和50℃, 用75%、80%、85%、90%及95%的乙醇进行洗涤, 测定蛋白质提取率如图1所示。

由图1可知:随着乙醇浓度的增加, 蛋白质的提取率逐渐增加, 当乙醇浓度达到90%时, 提取率最高, 而后又有小幅度降低。原因可能是:此处乙醇的作用是除去残余的乙醚, 其原理是相似相溶原理, 乙醇浓度越大可能对乙醚的去除更有利, 但是当乙醇浓度过高的时候, 可能会使蛋白发生变性而影响提取率。因此, 可以确定较好的乙醇浓度为90%。

2.2 粕液比对蛋白质提取率的影响

在提取过程中将乙醇浓度、pH值和温度分别固定于90%、4.5和50℃, 调节粕液比分别为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20和1∶25, 测定蛋白质提取率如图2所示。

由图2可知:随着粕液比的增加, 蛋白质的提取率有所增加, 当粕液比为1∶10时提取率增加趋势已不明显。考虑到加水量过多对设备处理能力的要求也相应提高, 需加大设备投资。因此可以初步确定较好的粕液比为1∶10。

2.3 pH值对蛋白质提取率的影响

在提取过程中将乙醇浓度、粕液比和温度分别固定于90%、1∶10和50℃, 调节pH值分别为2.5、3.5、4.5、5.5和6.5, 测定蛋白质提取率如图3所示。

由图3可知:在pH值2.5~4.5之间, 随着pH值的增加提取率不断增加, 当pH值4.5时达到最高的提取率 (11.42%) , 而后随着pH值的增加提取率降低。因此可以初步确定当p H值4.5时较好。

2.4 温度对蛋白质提取率的影响

在提取过程中将乙醇浓度、粕液比和pH值分别固定于90%、1∶10和4.5, 控制温度在30、40、50、60和70℃进行蛋白质提取, 测定蛋白质提取率如图4所示。

由图4可知:随着温度的增加, 蛋白质提取率有所增加, 当温度为50℃时, 提取率达到最大, 但是当温度继续增加时, 提取率就随之下降, 特别是到了70℃时提取率非常低, 可能是因为温度到60℃以上时, 蛋白质明显变性, 蛋白质的可溶性降低。因此, 温度可以初步确定为50℃。

2.5 正交试验结果分析

在单因素试验的基础上, 设计了四因素三水平的正交试验, 试验方案及试验结果见表1。

由表1可知:通过R值的大小比较, 影响蛋白质提取率的主次因素为:p H值>粕液比>乙醇浓度>温度。通过直观分析, 提取的最佳条件为A2B1C3D3, 即p H值为4.5、温度40℃、粕液比为1∶15和乙醇浓度95%, 在此条件下进行验证试验, 油葵饼粕分离蛋白的提取率可达到12.86%。

3 结论

通过单因素试验和正交试验对油葵饼粕分离蛋白提取条件进行了优化, 得到了蛋白质的最佳提取条件:以95%乙醇为提取溶剂、粕液比为1∶15、pH值为4.5和温度为40℃, 在此条件下, 油葵饼粕分离蛋白的提取率可达到12.86%。

摘要：从油葵饼粕中提取分离蛋白, 通过单因素试验和正交试验对乙醇浓度、粕液比、pH值和温度等因素进行了研究, 得出了最佳的蛋白质提取条件。结果表明:油葵饼粕分离蛋白提取的最佳工艺条件为pH值4.5、温度40℃、粕液比1:15和乙醇浓度95%, 在此条件下油葵饼粕分离蛋白的提取率可达到12.86%。

关键词：油葵饼粕,分离蛋白,提取

参考文献

[1]中国粮油协会编.粮油加工手册[M].北京:北京科学技术出版社, 1990.

[2]商业部教材编写组编.油料生物化学及油脂化学[M].哈尔滨:黑龙江科学技术出版社, 1986.

[3]王立新, 等.葵花蛋白提取及在食品中的应用[J].食品工业科技, 1992 (2) :7.

[4]任健, 郑喜群, 王文侠, 等.葵花粕中分离蛋白的成分及特性[J].农业工程学报, 2007, 23 (6) :252-255.

[5]杨伟强, 李鹏, 袁涛, 等.从花生蛋白粉中提取花生分离蛋白的条件优化[J].中国油脂, 2009, 34 (1) :34-37.

蛋白分离 篇8

花椒籽的主要成分

在花椒籽当中, 包含有很多不同的成分, 例如脂肪酸、蛋白质、氨基酸、矿质元素和生育酚等物质。经过采用气相色谱法对花椒籽进行分析实验, 能得出其中主要含有棕榈油酸、油酸、亚麻酸、亚油酸、硬脂酸、棕榈酸和十七碳烯酸等。其中, 亚麻酸、亚油酸和油酸为主要成分, 能够达到58% ~ 88% 的总含量。在原料花椒籽当中, 含有14% ~ 16% 的蛋白质, 在经过脱脂处理后, 其饼粕当中的蛋白质含量能够达到48% 以上。而在脱脂处理的花椒仁当中, 能够达到更高的蛋白质含量, 约为64%。经过相关部门的检验分析, 证明了在脱脂处理后的花椒仁和花椒饼蛋白质当中, 含有较为齐全的氨基酸组成, 而各种必需氨基酸的含量也相对较高。相比于大豆, 除了赖氨酸以外的其他必需氨基酸含量, 花椒籽都要更高, 由此可以看出花椒籽是一种较为完全的蛋白质资源。利用原子吸收分光光度计检测和分析精制之后能够发现, 花椒籽主要包含锰、锶、铁、镁、钾、钙、钠等矿质元素, 其中, 镁、钾、钙、钠等物质的含量较高, 锰、锶、锌、铁等物质也较为丰富, 而一些重金属元素的含量要远远低于使用卫生标准。利用高效液相色谱对花椒籽进行检测, 发现在每一百克花椒籽当中, 含有27.1 毫克的 α- 生育酚、0.3 毫克的 γ- 生育酚、27.4 毫克的维生素E总量, 但是其中并没有发现 β- 生育酚的成分。

花椒籽蛋白的提取

在提取花椒籽蛋白的过程中, 可采用传统的碱溶酸析法进行制备。提取条件是p H值为12 的溶液酸碱性, 按照1:15 的比例将原料与溶剂进行混合。首先在p H为6 的环境下进行沉淀和离心, 然后在p H为3.6 的环境中进行二次沉淀。在得到花椒籽蛋白后, 加水将溶液p H调至中性环境, 最后进行喷雾干燥。通过这种方法, 能够达到56.4% 的花椒籽蛋白回收率。

除此之外, 还可以利用较为高效的膜分离法进行提取。通过相应的预处理, 得到花椒籽蛋白溶液, 通过超滤浓缩将一部分离子成分、低聚糖、可溶性有毒成分、溶剂等除去, 从而得到花椒籽蛋白。通过超滤的方式, 能够对全部的可溶性花椒籽蛋白进行浓缩和纯化, 不会有所损失。在超滤之后, 利用20% 的三氯乙酸溶液对全部透过物进行检测, 证明其中没有蛋白质, 只有一些肽类物质和一些小分子含氮物质。采用超滤处理的防范, 能够提升可溶性清蛋白自由水剂萃取物当中的含量, 并且迅速除去大部分有毒化合物。在脱毒实验当中, 花椒籽饼粕蛋白质氯化钠萃取液当中, 可以利用渗透和超滤的方式, 完全除去其中的植酸盐。采用超滤处理方法处理水相酶解法得到的花椒籽蛋白溶液, 在202 ~ 203MPa操作压力下, 将温度控制在50℃, 选取p H为9 ~ 10 的溶液环境, 能够得到纯度较高, 且不含毒素的花椒籽蛋白, 回收率远远高于传统方法, 能够达到90% 以上。

花椒籽蛋白质的功能性质

随着p H值的变化, 花椒籽蛋白质的溶解度也会随着发生变化, 并且其变化的趋势与其他很多蛋白质基本相同。在等电点左侧, 随着p H的上升, 花椒籽蛋白质的溶解度会下降。在等电点附近, 溶解度会下降到最低值。而在等电点右侧, 随着p H的上升, 花椒籽蛋白质的溶解度也会上升。但是, 如果p H高于一定限度, 蛋白质的溶解度还会发生下降。随着温度的上升, 花椒籽蛋白当中的持水力会有所降低, 这主要是由于在温度上升的过程中, 蛋白质分子会发生构象变化, 相互之间产生凝聚, 从而降低了持水力。对于花椒籽蛋白质的起泡性来说, 其浓度会产生一定的影响。如果浓度上升, 蛋白质的起泡性也会上升。当处于1% ~ 2% 的浓度之间时, 起泡性将会大幅度上升。同时, 当花椒籽蛋白质浓度处于0.1% ~ 0.5% 之间的时候, 随着浓度的上升, 蛋白质的乳化性和乳化稳定性都会有所提高。如果其浓度在0.1% ~ 0.2% 之间的时候, 乳化稳定性将会迅速提升, 而后其浓度继续提高, 乳化稳定性的增幅就会逐渐减小。

结论

蛋白分离 篇9

1 材料

鹿角托盘(吉林省东风药业有限公司);中空纤维膜滤柱(购于GE Healthcare);电泳槽DYCZ-24D和电泳仪DYY-8C(北京六一仪器厂);胰蛋白酶(购自Hyclone公司);BCA蛋白试剂盒(购自PIERCE公司);牛血清白蛋白、丙烯酰胺、N,N-甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵(AP)、十二烷基硫酸钠(SDS)、甘氨酸、溴酚蓝、TEMED和考马斯亮兰R250(均购于Sigma公司)。

2 实验方法

2.1 水溶性总蛋白浸提

称取鹿角托盘粉100g,用20mM Tris-HCl pH8.0(含0.1mol NaCl、1mmol EDTA、1 mmol PMSF)缓冲液于4℃浸提24h,10 000 r·min-1离心5min得上清液;沉淀用上述缓冲液反复浸提3次,合并上清液。

2.2 中空纤维膜过滤分离

选择膜孔径0.45μm,滤柱通道长度为60cm,纤维管内径0.75mm,剪切速率8 000~12 000·sec-1,在室温下对鹿角托盘总蛋白浸提液进行过滤澄清。再选择截留分子量为10KD的中空纤维柱在室温下对鹿角托盘总蛋白过滤澄清液进行分离,内液冻干即得鹿角托盘水溶性总蛋白。

2.3 蛋白纯度测定(BCA法)

2.3.1 标准曲线的绘制

按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液,充分混匀。完全溶解蛋白标准品,取10μL稀释至100μL,使终浓度为0.5mg·mL-1。将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μL加到96孔板的标准品孔中,加用于稀释标准品的溶液补足到20μL。各孔加入200μL BCA工作液,37℃放置30min。于562nm处测定吸光度值,绘制标准曲线。

2.3.2 测定蛋白纯度

称鹿角托盘水溶性总蛋白冻干品10mg溶于1mL蒸馏水,取总蛋白溶液20μL,加到96孔板中。各孔加入200μL BCA工作液,37℃放置30 min。于562nm处测定吸光度值,根据标准曲线方程,计算出鹿角托盘水溶性蛋白纯度。

2.4 SDS-PAGE电泳[5]

采用分离胶浓度为10%,浓缩胶浓度为5%,分离胶电压为70V,浓缩胶电压为140V。采用考马斯亮蓝R-250进行染色,最后用脱色液(甲醇∶冰醋酸∶蒸馏水=4.5∶4.5∶1)脱色,至背景清楚。

2.5 胶内酶解

将电泳分离的主要蛋白带分别从脱色清晰的凝胶上切下,置于含50%乙腈、50mmol·L-1碳酸氢铵溶液100μL中浸泡20min,移去溶液,重复操作两次。再向其中加入100%乙腈100μL处理10min,移去乙腈,将其置于37℃烘箱中5~10min以确保完全干胶。向干胶中加入5~10μL浓度为12.5ng·μL-1的trypsin酶溶液,4℃冰箱中酶解约30min,取出后在37℃烘箱中酶解过夜。向酶液中加入50%乙腈、0.1%TFA 60μL作用30~40min,将溶液转移到新的96孔板内,重复2~3次得肽段溶液。将肽段溶液在N2流下吹干浓缩,完全干燥的肽段重新溶解于0.7μL0.5g·L-1CHCA溶液(0.1%TFA+50%ACN)中,并将其全部点到不锈钢MALDI靶板上,室温下自然干燥,用于MAL-DI-TOF-MS鉴定。

2.6 MALDI-TOF-MS鉴定

样品用4700串联飞行时间质谱仪[4700 Proteomics Analyzer(TOF/TOFTM)(Applied Biosystems,USA)]进行质谱分析,激光源为355nm波长的Nd:YAG激光器,加速电压为20kV,采用正离子模式和自动获取数据的模式采集数据。PMF质量扫描范围为700~3 500 Da,对强度最大的5个峰进行串级质谱分析,谱图用myoglobin酶解肽段进行外标校正,所得结果进行数据库检索。

3 结果

3.1 鹿角托盘水溶性总蛋白的收率

100g鹿角托盘粉末经中性缓冲液浸提和中空纤维膜过滤分离,得蛋白粗品8g,水溶性总蛋白收率为8%。

3.2 鹿角托盘水溶性蛋白纯度

使用PIERCE公司生产的BCA蛋白试剂盒测定纯度,测得蛋白纯度为86%。

3.3 SDS-PAGE电泳分析

如图1所示。

注:从左至右分别是:标准Marker(分子量从上而下依次为:97.4KD,66.2KD,43KD,31KD,20.1D,14.4KD);鹿角托盘水溶性总蛋白(a,b.c d.e为被鉴定出的蛋白带)。

从电泳结果可知,鹿角托盘中水溶性蛋白分子量主要分布在10~110 KD之间,主要包括蛋白分子量约为110KD、66KD、51KD、30KD、17KD、16KD、14KD、10KD蛋白带。从带上看,含量最高的是分子量为66KD的蛋白,其次是分子量为51KD、30KD、17KD的蛋白。

3.4 MALDI-TOF质谱分析

处理后样品经MALDI-TOF质谱分析和NCBI数据库检索,同时结合SDS-PAGE电泳中相应蛋白质的表观分子量和等电点等进行综合分析和鉴定,鉴定出5种蛋白质,分别为:β-3亚型血红蛋白;抗菌肽1;肽聚糖识别蛋白;β-c亚型血红蛋白;Pre-pro血清白蛋白。如表1所示。

4 讨论

已有研究表明鹿角托盘中除含有无机成分外,还含有大量蛋白质类有机物,因此建立一条快速、简单、高效的鹿角托盘水溶性总蛋白提取工艺显得尤为重要,本研究采用的提取分离工艺可获得较高的蛋白收率和纯度,这为鹿角托盘水溶性蛋白更深入的研究与开发奠定了基础。在鉴定出的5种蛋白中,β-3亚型血红蛋白、β-c亚型血红蛋白、Pre-pro血清白蛋白为动物血液中的主要蛋白,来源于鹿角托盘残存血液。另外两种蛋白:抗菌肽是在哺乳动物体内发现的一类结构多变的抗微生物肽,除了主要的抗菌活性外,它还具有抑制组织损伤,促进创伤修复,结合内毒素,诱导血管生成等多种生物学功能[6]。肽聚糖识别蛋白是一类可识别肽聚糖和含肽聚糖细菌的模式识别受体,机体通过有限的模式识别受体迅速识别大量不同的病原微生物,进行及时有效的初步防御[7],在天然免疫应答中发挥着重要的识别和调节功能。

抗菌肽1和肽聚糖识别蛋白在机体中的含量通常很低,而本研究表明它们在鹿角托盘中的含量很高,这可能与旧鹿角脱落,角基上大面积的骨组织暴露在外,机体为防御炎性感染,快速愈合伤口而大量表达有关,对它们进行更深入的研究可望开发具有抗炎、促组织愈合等功能的创新药物。

参考文献

[1]高士贤.中国动物药志[M].长春:吉林科学技术出版社,1996:693-694.

[2]王丽虹,高志光.鹿花盘水溶性成分的药理活性与临床应用[J].经济动物学报,1999,3(3):18-22.

[3]张维滋,王振玉.鹿花盘注射液治疗乳腺增生病146例临床观察[J].中国生化药物杂志,1987(2):16-18.

[4]陈玉山,王振玉,王本祥.鹿花盘注射液治疗乳腺增生的药理实验研究[J].中国生化药物杂志,1987(2):12-15.

[5]杨璐璐,迟程,秦非,等.鹿茸的化学成分与药理作用[J].云南中医学院学报,1995,18(4):19.

[6]李明.Cathelicidin的特性及其应用[J].免疫学杂志,2006,22(3):345.

蛋白分离 篇10

关键词：大豆蛋白质,分离,工业化提取,分散型功能

大豆分离蛋白作为一种食品添加剂, 在食品中不仅可有效提高蛋白质含量, 尤为重要的是不同的大豆蛋白质品种在食品中可体现出不同的功能特性。我国现在对大豆分离蛋白技术开发能力较低, 在产品质量, 生产技术等方面存在很多的问题。7S和11S是大豆蛋白中的主要成分, 它们约占大豆球蛋白总量的70%。因为分离蛋白7S、11S组分的特性不同, 有的甚至相反, 就说明分别提取, 并分别应用到不同的领域, 才能最大限度地体现和发挥出这两种蛋白的特性, 并收到良好的效果。目前应用“碱溶酸沉”工艺生产的大豆分离蛋白是7S和11S大豆球蛋白的混合物, 产品所体现的功能性质不突出, 当原料中7S和11S组分的比例发生变化时产品的性能会出现不稳定, 存在着应用领域窄的问题, 大部分产品仅用于肉制品中, 大大制约了大豆分离蛋白在食品加工中的应用。本研究技术是建立在传统分离蛋白“碱溶酸沉”的生产基础上, 由于原生产工艺路线的限制, 利用蛋白组分的特点先把7S组分大豆蛋白提取出来, 然后再将其他组分蛋白在辅助“酶技术”的作用下, 水解后浸提。得到富含7S和富含11S组分的大豆分离蛋白, 让7S、11S分别发挥其本身所具有的优良功能特性, 就可从本质上解决分离蛋白功能性质不突出的问题。

1 研究材料

豆粕及大豆分离蛋白 (甘肃天元植物蛋白公司提供) , 复合风味蛋白酶。

2 研究方法

2.1 蛋白质提取工艺参数实验

2.1.1 浸出实验

1) 水料比对蛋白得率的影响。pH7.5, 水温45℃, 时间30min, 低温粕20g。

2) pH值对蛋白得率的影响。确定H值的试验。水料比10∶1, 水温45℃, 时间30min, 低温粕20g, pH值分别设为8.5、8.0、7.5、7.0、6.5。

3) 浸出时间对蛋白得率的影响。确定浸出时间的试验。水料比10∶1, 水温45℃, pH值7.5, 低温粕20g, 浸出时间分别设为 40、30、20min。

2.1.2 酸沉实验

酸沉液重量分别为246.56、233.71、235.91、243.81、253.50、260.28、244.64g时, 对应pH值分别为4.45、4.47、4.49、4.51、4.53、4.55、4.64。通过蛋白得率的计算确定最佳酸沉pH值。

2.2 十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 (SDS-PAGE)

样品含0.2%蛋白质, 0.25mol Tris-HCl, 2% SDS, 2%巯基乙醇, 2%BPB, 6mol尿素, 与等体积甘油混合后放置过夜。分离胶含0.4%SDS, 0.375mol Tris-HCl, 胶浓度12.5%, 交联度2.7%。浓缩胶含0.4%SDS, 0.125mol Tris-HCl, 胶浓度4%, 交联度2.7%。电泳缓冲液体系为含0.1%SDS, 5mmol Tris-HCl 38.4mmol甘氨酸缓冲液体系。电泳结束后, 将胶片浸没于含33%甲醇和12%三氯乙酸的固定液中固定4h, 然后用含1.05mmol考马斯亮蓝, 1.0mol硫酸, 10mmol NaOH, 12%TCA的染色液染色3h。染色结束后, 用蒸馏水对胶片进行洗脱, 直到底色基本脱去为止。胶片经干燥后保存。用Scion Image 软件对电泳胶片上染色的蛋白谱带进行光密度扫描分析。染色强度和蛋白质浓度成线性关系。根据扫描图中染色浓度值计算各种蛋白质的相对含量。

2.3 高7S (7S-R) 组分分离蛋白的理化性质及功能性质评价

1) 蛋白质含量凯氏定氮的方法 (AACC) 测定。2) 氨基酸用高压液相色谱 (HPLC) 法分析。3) 蛋白溶解性用氮溶解指数 (NSI) 测定法评价。4) 分散稳定性测定:分散稳定性 = (10-沉淀) /10。5) 凝胶性的测定:膨胀率= (100ml未搅拌的分散液的重量-搅拌后100ml泡沫的重量) ×100%。6) 乳化性和乳化稳定性测定:乳化能力 (ml/g) =精炼油的毫升数X/1.0。乳化稳定性= (50-上清液) ×100%。7) 持水和持油性测定:持水性 (%) =100× (10-析出水的毫升数) /1.0。持油性 (%) =100× (10-析出油的体积) /1.0。8) 产品质量由中国发酵协会监测。

3 结果与分析

3.1 浸出阶段

1) 水料比对蛋白得率的影响。浸出时的水料比对蛋白的浸出率有一定的影响。水料比为14∶1、12∶1、10∶1、9∶1、8∶1时, 蛋白浸出率分别为40.1%、39.99%、40.6%、39.55%、39.45%, 可见当水料比为10∶1时, 蛋白浸出率最高。

2) pH值对蛋白得率的影响。pH值为8.5、8.0、7.5、7.0、6.5时, 浸出率分别为41.85%、41.65%、40.6%、39.45%、38.54%, 其中pH值为8.5时达到最高值。

3) 浸出时间对蛋白得率的影响。通过多次试验发现, 浸出时间对蛋白的浸出率有一定的影响。当浸出时间为40min时。浸出率达到最高值40.6%。

3.2 酸沉阶段

pH值对蛋白得率的影响结果表明, 酸沉时的pH值对蛋白得率有一定的影响。当pH值为4.47时, 浸出率达到最高值42.79%。

3.3 分离效果分析

对中试产品进行了SDS-PAGE电泳分析, 以普通的大豆分离蛋白作为对照, 结果如图1所示。

lane1, 2, 3分别为普通大豆分离蛋白、富含7S大豆分离蛋白、富含11S大豆分离蛋白。

应用光密度扫描软件对3个泳道进行分析, 结果表明:普通大豆分离蛋白7S和11S组分分别为46.2%、53.8%;富含7S大豆分离蛋白7S 组分66.8%;富含11S大豆分离蛋白11S组分81.3%。对扫描图谱分析所得结果来看, 富含7S组分分离蛋白中7S约占60%, 达到了实验室小试所得到的组分纯度水平。以上的分析可以看出, 通过以上的工艺, 可以在工厂化的条件下实现7S组分和11S组分的分离, 以达到利用简便的方法分离的目的。取得了良好的效果。

3.4 高7S (7S-R) 组分分离蛋白的功能性质及评价

功能性质评价:高7S组分分离蛋白7S-R SPI的蛋白质含量93.00%, 而脱脂豆粕只有51.38%。从氨基酸分析的结果可以看出, 高7S组分分离蛋白的氨基酸构成突出的特点是赖氨酸的含量较高, 添加于谷物食品中可以弥补谷物中赖氨酸含量低的不足, 提高食品的营养价值。

理化性质评价:高7S组分分离蛋白的溶解性NSI为91.66%;分散稳定性98.5%, 而市售大豆分离蛋白仅为66%。乳化能力600 ml/g、乳化稳定性97%, 远高于市售大豆分离蛋白 (400 ml/g、67%) 。随着7S组分比例的增加, 凝胶硬度下降。同时, 7S组分分离蛋白形成较软的凝胶, 可以利用此特性, 通过调整7S组分分离蛋白和11S组分分离蛋白的比例来得到不同的硬度的凝胶, 从而满足于不同食品加工的需要。

3.5 产品检测结果

经中国发酵协会检测, 送检产品可与国外同类产品媲美。研制产品蛋白质 (干基) ≥90%, 脂肪 (干基) ≤1.0%, 水分≤6.0%, NSI≥90.0%, 分散稳定性≥90%, 乳化稳定性≥90%, 乳化能力≥450%。

4 讨论与结论

根据实际的工艺现状, 为了达到尽量多地获取以7S组分为主的分散性蛋白这一设计目标, 将采用2次浸出的工艺方法。第一次浸出, 是根据7S蛋白组分和11S的蛋白组分特点, 最大限度地将7S组分蛋白浸出, 其他大于7S组分的蛋白尽量少地浸出来。按11S组分蛋白的特性设定浸出液的pH值为6.5。调节顺序及要求是:亚硫酸氢钠→盐酸。先将50%亚硫酸氢钠溶液在30s内加完, 再将20%的盐酸溶液在4.5min内加完并调节pH到6.5。第二次浸出是将第一次浸出后留在豆渣中的大组分蛋白, 通过加酶水解后, 将大分子链打断, 使其成为小分子链蛋白浸出出来。用氢氧化钠缓慢调解pH值到7.5, 保持10min, 将第一次浸出后留在豆渣中的蛋白浸出来, 再加风味蛋白酶溶液后保持35min。将大分子链打断, 使其成为小分子链蛋白被浸出来。

该技术建立在传统分离蛋白“碱溶酸沉”的生产基础上, 又突破了传统生产技术的束缚, 是一种全新的技术理念。经过专家考察认为, 该工艺技术操作简单, 中间环节少, 产品质量稳定, 产品的分散指数稳定性能达到95%, 色泽、口感、气味能满足分散型蛋白要求。经中国发酵协会检测, 产品的分散稳定性、乳化稳定性都≥90, 乳化能力≥450。用这一工业方法工业化生产出来的高7S组分的分离蛋白起泡性、乳化性和乳化稳定性要明显优于售用传统工艺生产的大豆分离蛋白。但试验产品与进口产品相比, 在产品稳定性、生产成本等方面还需要改进, 继续提高和稳定产品质量。生产工艺路线还有待改进, 完善。需要增加一条生产规模小一些的生产线, 这样既可以使生产连续, 又可以实现大豆蛋白组分分别提取。

参考文献

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