血红蛋白的提取和分离的一些思考（共6篇）
血红蛋白的提取和分离的一些思考 篇1
关于血红蛋白的提取和分离的一些思考
普通高中课程标准实验教科书中血红蛋白的提取和分离,设计了用凝胶色谱法分离血红蛋白的方法.在一般中学实施这个实验还存在一定的`困难.本文对实验的部分内容进行重新设计,使成本和难度大大降低,实验时间也缩短到3小时左右.
作 者：姚梁 作者单位：莆田市第四中学,福建莆田,351100刊 名：科教导刊英文刊名：THE GUIDE OF SCIENCE & EDUCATION年，卷(期)：“”(12)分类号：G633.91关键词：血红蛋白 实验 效果
血红蛋白的提取和分离的一些思考 篇2
1 材料
鹿角托盘(吉林省东风药业有限公司);中空纤维膜滤柱(购于GE Healthcare);电泳槽DYCZ-24D和电泳仪DYY-8C(北京六一仪器厂);胰蛋白酶(购自Hyclone公司);BCA蛋白试剂盒(购自PIERCE公司);牛血清白蛋白、丙烯酰胺、N,N-甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵(AP)、十二烷基硫酸钠(SDS)、甘氨酸、溴酚蓝、TEMED和考马斯亮兰R250(均购于Sigma公司)。
2 实验方法
2.1 水溶性总蛋白浸提
称取鹿角托盘粉100g,用20mM Tris-HCl pH8.0(含0.1mol NaCl、1mmol EDTA、1 mmol PMSF)缓冲液于4℃浸提24h,10 000 r·min-1离心5min得上清液;沉淀用上述缓冲液反复浸提3次,合并上清液。
2.2 中空纤维膜过滤分离
选择膜孔径0.45μm,滤柱通道长度为60cm,纤维管内径0.75mm,剪切速率8 000~12 000·sec-1,在室温下对鹿角托盘总蛋白浸提液进行过滤澄清。再选择截留分子量为10KD的中空纤维柱在室温下对鹿角托盘总蛋白过滤澄清液进行分离,内液冻干即得鹿角托盘水溶性总蛋白。
2.3 蛋白纯度测定(BCA法)
2.3.1 标准曲线的绘制
按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液,充分混匀。完全溶解蛋白标准品,取10μL稀释至100μL,使终浓度为0.5mg·mL-1。将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μL加到96孔板的标准品孔中,加用于稀释标准品的溶液补足到20μL。各孔加入200μL BCA工作液,37℃放置30min。于562nm处测定吸光度值,绘制标准曲线。
2.3.2 测定蛋白纯度
称鹿角托盘水溶性总蛋白冻干品10mg溶于1mL蒸馏水,取总蛋白溶液20μL,加到96孔板中。各孔加入200μL BCA工作液,37℃放置30 min。于562nm处测定吸光度值,根据标准曲线方程,计算出鹿角托盘水溶性蛋白纯度。
2.4 SDS-PAGE电泳[5]
采用分离胶浓度为10%,浓缩胶浓度为5%,分离胶电压为70V,浓缩胶电压为140V。采用考马斯亮蓝R-250进行染色,最后用脱色液(甲醇∶冰醋酸∶蒸馏水=4.5∶4.5∶1)脱色,至背景清楚。
2.5 胶内酶解
将电泳分离的主要蛋白带分别从脱色清晰的凝胶上切下,置于含50%乙腈、50mmol·L-1碳酸氢铵溶液100μL中浸泡20min,移去溶液,重复操作两次。再向其中加入100%乙腈100μL处理10min,移去乙腈,将其置于37℃烘箱中5~10min以确保完全干胶。向干胶中加入5~10μL浓度为12.5ng·μL-1的trypsin酶溶液,4℃冰箱中酶解约30min,取出后在37℃烘箱中酶解过夜。向酶液中加入50%乙腈、0.1%TFA 60μL作用30~40min,将溶液转移到新的96孔板内,重复2~3次得肽段溶液。将肽段溶液在N2流下吹干浓缩,完全干燥的肽段重新溶解于0.7μL0.5g·L-1CHCA溶液(0.1%TFA+50%ACN)中,并将其全部点到不锈钢MALDI靶板上,室温下自然干燥,用于MAL-DI-TOF-MS鉴定。
2.6 MALDI-TOF-MS鉴定
样品用4700串联飞行时间质谱仪[4700 Proteomics Analyzer(TOF/TOFTM)(Applied Biosystems,USA)]进行质谱分析,激光源为355nm波长的Nd:YAG激光器,加速电压为20kV,采用正离子模式和自动获取数据的模式采集数据。PMF质量扫描范围为700~3 500 Da,对强度最大的5个峰进行串级质谱分析,谱图用myoglobin酶解肽段进行外标校正,所得结果进行数据库检索。
3 结果
3.1 鹿角托盘水溶性总蛋白的收率
100g鹿角托盘粉末经中性缓冲液浸提和中空纤维膜过滤分离,得蛋白粗品8g,水溶性总蛋白收率为8%。
3.2 鹿角托盘水溶性蛋白纯度
使用PIERCE公司生产的BCA蛋白试剂盒测定纯度,测得蛋白纯度为86%。
3.3 SDS-PAGE电泳分析
如图1所示。
注:从左至右分别是:标准Marker(分子量从上而下依次为:97.4KD,66.2KD,43KD,31KD,20.1D,14.4KD);鹿角托盘水溶性总蛋白(a,b.c d.e为被鉴定出的蛋白带)。
从电泳结果可知,鹿角托盘中水溶性蛋白分子量主要分布在10~110 KD之间,主要包括蛋白分子量约为110KD、66KD、51KD、30KD、17KD、16KD、14KD、10KD蛋白带。从带上看,含量最高的是分子量为66KD的蛋白,其次是分子量为51KD、30KD、17KD的蛋白。
3.4 MALDI-TOF质谱分析
处理后样品经MALDI-TOF质谱分析和NCBI数据库检索,同时结合SDS-PAGE电泳中相应蛋白质的表观分子量和等电点等进行综合分析和鉴定,鉴定出5种蛋白质,分别为:β-3亚型血红蛋白;抗菌肽1;肽聚糖识别蛋白;β-c亚型血红蛋白;Pre-pro血清白蛋白。如表1所示。
4 讨论
已有研究表明鹿角托盘中除含有无机成分外,还含有大量蛋白质类有机物,因此建立一条快速、简单、高效的鹿角托盘水溶性总蛋白提取工艺显得尤为重要,本研究采用的提取分离工艺可获得较高的蛋白收率和纯度,这为鹿角托盘水溶性蛋白更深入的研究与开发奠定了基础。在鉴定出的5种蛋白中,β-3亚型血红蛋白、β-c亚型血红蛋白、Pre-pro血清白蛋白为动物血液中的主要蛋白,来源于鹿角托盘残存血液。另外两种蛋白:抗菌肽是在哺乳动物体内发现的一类结构多变的抗微生物肽,除了主要的抗菌活性外,它还具有抑制组织损伤,促进创伤修复,结合内毒素,诱导血管生成等多种生物学功能[6]。肽聚糖识别蛋白是一类可识别肽聚糖和含肽聚糖细菌的模式识别受体,机体通过有限的模式识别受体迅速识别大量不同的病原微生物,进行及时有效的初步防御[7],在天然免疫应答中发挥着重要的识别和调节功能。
抗菌肽1和肽聚糖识别蛋白在机体中的含量通常很低,而本研究表明它们在鹿角托盘中的含量很高,这可能与旧鹿角脱落,角基上大面积的骨组织暴露在外,机体为防御炎性感染,快速愈合伤口而大量表达有关,对它们进行更深入的研究可望开发具有抗炎、促组织愈合等功能的创新药物。
参考文献
[1]高士贤.中国动物药志[M].长春:吉林科学技术出版社,1996:693-694.
[2]王丽虹,高志光.鹿花盘水溶性成分的药理活性与临床应用[J].经济动物学报,1999,3(3):18-22.
[3]张维滋,王振玉.鹿花盘注射液治疗乳腺增生病146例临床观察[J].中国生化药物杂志,1987(2):16-18.
[4]陈玉山,王振玉,王本祥.鹿花盘注射液治疗乳腺增生的药理实验研究[J].中国生化药物杂志,1987(2):12-15.
[5]杨璐璐,迟程,秦非,等.鹿茸的化学成分与药理作用[J].云南中医学院学报,1995,18(4):19.
[6]李明.Cathelicidin的特性及其应用[J].免疫学杂志,2006,22(3):345.
血红蛋白的提取和分离的一些思考 篇3
关键词： 凝胶色谱法；凝胶电泳法； 血红蛋白
G633.91
DNA和蛋白质技术包括DNA的粗提取与鉴定、PCR技术和血红蛋白的提取和分离等，是开展分子生物学研究的基本技术。蛋白质是生命活动不可或缺的物质。血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中的氧气和二氧化碳的运输。
一、血红蛋白蛋白质提取和分离的原理
血红蛋白蛋白质提取和分离的原理是根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等，可以分离不同种类的蛋白质。
二、血红蛋白蛋白质提取和分离技术方法有凝胶色谱法和电泳法。
凝胶色谱法是根据分子量的大小来分离蛋白质的，而电泳法是根据各种分子带电性质的差异以及分子本身形状、大小的不同来把蛋白质分离开的。
1. 凝胶色谱法
凝胶色谱法分离蛋白质的原理：在多孔球体的凝胶内，蛋白质相对分子质量的大小不同，大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；小分子通过凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。相对分子质量的不同蛋白质因此得以分离。凝胶材料是微小的多孔性球体，如葡聚糖或琼脂糖。
2.凝胶电泳法
电泳法是带电颗粒在电场中向电荷相反的电极移动的现象。凝胶电泳法原理是：不同蛋白质的带电性质（正电荷或负电荷）、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向和阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同，因而可聚集形成不同的条带，因而达到分离的目的。影响蛋白质分子运动速度的因素中，蛋白质的电荷性质决定蛋白质运动方向，蛋白质带电荷量的多少决定电场作用力的大小，分子形状和大小形成阻力大小，蛋白质的运动速率由电荷量、分子形状和分子大小共同决定。
实验探究 蛋白质为什么带有带电荷？
蛋白质是由氨基酸组成的，还有一个羧基和一个氨基，在一定的PH下，蛋白质可解离的基因会带上电荷。
三、实验操作步骤
蛋白质的提取和操作一般分为五个阶段：材料的选择和预处理、粗分离（细胞的破碎）、提取、纯化（包括盐析，层析，有机溶剂提取，有机溶剂沉淀等）和浓缩干燥及保存。我们取哺乳动物红细胞（猪的新鲜血液）为材料，来进行血红蛋白的分离方法。
1.样品处理及粗分离
⑴样品前处理 包括细胞的破碎有机械方法、物理方法和化学及生物化学方法。
⑵ 细胞器的分离 从样品水溶液中提取、用有机溶剂提取、利用表面活性剂提取和对提取物进行保护。
①样品分离器材：离心机，0.9%的NaCl溶液和20mmol/L的磷酸缓冲液。
②步骤包括：红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液和透析。采集的血样要及时分离红细胞，分离时采用低速短时间离心（500r/min离心2min），然后用胶头吸管吸上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的0.9%的NaCl溶液，缓慢搅拌10min，低速短时离心，如此重复洗涤三次，直至上清液不再呈现黄色为止。将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积，再加40%体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10min。然后转移到离心管中，以2000r/min的速度离心10min，就可以明显看到试管中溶液分四层，从上往下数，第一层为无色透明的甲苯层，第二层为白色波层固体，是脂溶性物质沉淀层，第三层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第四层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的分层液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，静置后分出下层的红色透明液体。取1mL血红蛋白溶液装入透析袋子中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量浓度20%mmol/L的磷酸缓冲液中（PH为7.0），透析12h即可。
⒉ 凝胶色谱操作
⑴凝胶色谱柱的制作 取长40cm，内径为1.6cm的玻璃管，两端磨平。玻璃管两端色上合适的橡皮塞，中间打孔，孔径为0.5mL插入移液管，在色譜柱下端用移液管头部作出口部位，连接一细的尼龙管，用螺旋塞控制尼龙管的打开与关闭，尼龙管的另一端放入收集色谱液的收集器内。
⑵凝胶色谱柱的装填凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成配成凝胶悬浮液，在于下端连接的
尼龙管打开的情况下，一次性缓慢倒入色谱柱内，轻轻敲动色谱柱使凝胶装填均匀。并立即用20mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤，使凝胶装填紧密。
⑶血红蛋白样品的加入和洗脱 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液下降到与凝胶面平，关闭出口。用吸管小心地将透析后的样品加到色谱柱的顶端，并打开下端出口，是样品渗入凝胶床内。等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口，并加入20mmol/L的磷酸缓冲液到适当的高度，连接洗脱瓶，打开下边出口，进行洗脱。待红色色谱柱接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，连续收集。
⒊ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
⑴原理 蛋白质在十二烷基硫酸钠（SDS）和巯基乙醇的作用下，分子中的二硫键还原，氢键等打开，形成按1.4gSDS/1g蛋白质比例的SDS-蛋白质多肽复合物，该复合物带负电，故可在聚丙烯酰胺凝胶电泳中向正极迁移，且主要由于凝胶的分子筛作用，迁移速率与蛋白质的分子量大小有关，因此可以浓缩和分离蛋白质多肽。
聚丙烯酰凝胶电泳分离蛋白质多数采用一种不连续的缓冲系统，主要分为较低浓度的成层胶和较高浓度的分离胶，配制凝胶的缓冲液，其pH值和离子强度也相应不同，故电泳时，样品中的SDS-多肽复合物沿移动的界面移动，在分离胶表面形成了一个极薄的层面，大大浓缩了样品的体积，即SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩效应。
⑵具体操作包括：①红细胞的洗涤 ；②色谱柱填料的处理；③凝胶色谱柱的装填；④蛋白质的分离。
⑶小结
血红蛋白的提取和分离的一些思考 篇4
一、实验目的 1.学会提取和分离叶绿体中色素的方法。2.比较、观察叶绿体中四种色素：理解它们的特点及与光合作用的关系
二、实验原理 光合色素主要存在于高等植物叶绿体的基粒片层上，而叶绿体中的色素能溶于有机溶剂 中。故要提取色素，要破坏细胞结构，破坏叶绿体膜，使基粒片层结构直接与有机溶剂接 触，使色素溶解在有机溶剂中。叶绿体中的色素有四种，不同色素在层析液(脂溶性强的有机溶剂)中的溶解度不同，因而随层析液的扩散速度也不同。
三、材料用具 取新鲜的绿色叶片、定性滤纸、烧杯、研钵、漏斗、纱布、剪刀、小试管、培养皿、毛细吸管、量筒、有机溶剂、层析液(20份石油醚、2份丙酮、1份苯混合)、二氧化硅、碳酸钙。
四、实验过程（见书Ｐ54）1.提取色素： 2.制备滤纸条： 3.色素分离，纸层析法。（不要让滤液细线触及层析液）4.观察： 层析后，取出滤纸，在通风处吹干。观察滤纸条上出现色素带的数目、颜色、位置和宽窄。结果是：4条色素带从上而下依次是：胡萝卜素(橙黄色)、叶黄素(黄色)、叶绿素a(蓝绿色)、叶绿素b(黄绿色)。
血红蛋白的提取和分离的一些思考 篇5
一、实验目的
1、通过绿色植物色素的提取和分离，了解天然物质分离提纯方法；
2、通过柱色谱和薄层色谱分离操作，加深了解微量有机物色谱分离鉴定的原理。
二、实验原理
绿色植物如菠菜叶中含有叶绿素（绿）、胡萝卜素（橙）和叶黄素（黄）等多种天然色素。
叶绿素存在两种结构相似的形式即叶绿素a(C55H72O5N4Mg)和叶绿素b(C55H70O6N4Mg)，其差别仅是叶绿素a中一个甲基被甲酰基所取代从而形成了叶绿素b。它们都是吡咯衍生物与金属镁的络合物，是植物进行光合作用所必需的催化剂。植物中叶绿素a的含量通常是b的3倍。尽管叶绿素分子中含有一些极性基团，但大的烃基结构使它易溶于醚、石油醚等一些非极性的溶剂。
胡萝卜素（C40H56）是具有长链结构的共轭多烯。它有三种异构体，即-胡萝卜素、β-胡萝卜素和γ-胡萝卜素，其中β-胡萝卜素含量最多，也最重要。在生物体内，β-胡萝卜素受酶催化氧化形成维生素A。目前β-胡萝卜素已可进行工业生产，可作为维生素A使用，也可作为食品工业中的色素。
叶黄素（C40H56O2）是胡萝卜素的羟基衍生物，它在绿叶中的含量通常是胡萝卜素的两倍。与胡萝卜素相比，叶黄素较易溶于醇而在石油醚中溶解度较小。
三、主要仪器与试剂
仪器：研钵、布氏漏斗、圆底烧瓶、直形冷凝管、层析缸
试剂：硅胶G，中性氧化铝，甲醇，石油醚（60-90℃），丙酮，乙酸乙酯，菠菜叶。
四、实验流程
五、操作步骤
1、菠菜色素的提取
称取2g洗净后的新鲜（或冷冻）的菠菜叶，用剪刀剪碎并与10mL甲醇拌匀，在研钵中研磨约5min然后用布氏漏斗抽滤菠菜汁，弃去滤渣。
将菠菜汁放回研钵，每次用10mL 3:2（体积比）的石油醚-甲醇混合液萃取两次，每次需加以研磨并且抽滤。合并深绿色萃取液，转入分液漏斗，每次用5mL水洗涤两次，以除去萃取液中的甲醇。洗涤时要轻轻旋荡，以防止产生乳化。弃去水-甲醇层，石油醚层用无水硫酸钠干燥后滤入圆底烧瓶，在水浴上蒸去大部分石油醚至体积约为1mL为止。
2、薄层层析
取四块显微载玻片，用硅胶G加0.5%羧甲基纤维素调制后制板，晾干后在110℃活化1h。展开剂：（a）石油醚-丙酮=8:2（体积比）（b）石油醚-乙酸乙酯=6:4（体积比）
取活化后的层析板，点样后，小心放入预先加入选定展开剂的广口瓶内，盖好瓶盖。待展开剂上升至规定高度时，取出层析板，在空气中晾干，用铅笔做出标记，并进行测量，分别计算出Rf值。
分别用展开剂a和b展开，比较不同展开剂系统的展开效果。观察斑点在板上的位置并排列出胡萝卜素、叶绿素和叶黄素的Rf值的大小次序。注意更换展开剂时，须干燥层析瓶。
3、柱层析
在层析柱中，加3cm高的石油醚。另取少量脱脂棉，先在小烧杯用石油醚浸湿，挤压以驱除气泡，然后放在层析柱底部，轻轻压紧，塞住底部。将3g层析用的中性氧化铝（150~160目），从玻璃漏斗中缓缓加入，小心打开柱下活塞，保持石油醚高度不变，流下的氧化铝在柱子中堆积。必要时用橡皮锤轻轻在层析柱的周围敲击，使吸附剂装得均匀致密。柱中溶剂面由下端活塞控制，既不能满溢，更不能干涸。装完后，上面再加一片圆形滤纸，打开下端活塞，放出溶剂，直到氧化铝表面溶剂剩下1~2mm高时关上活塞（注意！在任何情况下，氧化铝表面不得露出液面）。
将上述菠菜色素的浓缩液，用滴管小心地加到层析柱顶部，加完后，打开下端活塞，让液面下降到柱面以上1mm左右，关闭活塞，加数滴石油醚，打开活塞，使液面下降，经几次反复，使色素全部进入柱体。待色素全部进入柱体后，在柱顶小心加洗脱剂—石油醚-丙酮溶液9:1（体积比）。打开活塞，让洗脱剂逐滴放出，层析即开始进行，用锥形瓶收集。当第一个有色成分即将滴出时，取另一锥形瓶收集，得橙黄色溶液，它就是胡萝卜素。
用石油醚-丙酮7:3（体积比）作洗脱剂，分出第二个黄色带，它是叶黄素（1）。再用丁醇-乙醇-水3:1:1（体积比）洗脱叶绿素a（蓝绿色）和叶绿素b（黄绿色）。
六、注释（1）叶黄素易溶于醇而在石油醚中溶解度较小，从嫩绿菠菜得到的提取液中，叶黄素含量很少，柱色谱中不易分出黄色带。
七、思考题
血红蛋白的提取和分离的一些思考 篇6
近年来, 不断有资料报道, 猪在免疫猪瘟兔化弱毒疫苗时出现较多的过敏现象, 临床有以下特点:发病快, 注射疫苗后几分钟即可发病;发病以纯种猪较为多见;发病猪只数量较多;在使用疫苗首免乳猪时也有过敏现象发生。IgE主要在寄生虫感染以及过敏反应中发挥重要作用[3]。过敏反应的发生与其体内IgE及其受体水平关系密切[4]。正常人和动物血清IgE含量极低, 而在有过敏体质者或长期寄生虫感染者体内IgE的含量会明显升高[5], 目前国内外分离、提取免疫球蛋白的方法较多[6,7,8,9,10], 但结果不尽一致, 因此如何成功分离、提取到猪血清中的IgE则是研究猪过敏反应的重要试验基础。
研究通过采集人工致敏条件下试验猪的血清, 采用盐析、层析及电泳技术成功分离并鉴定出寄生虫感染条件下猪体内的IgE, 为进一步研究猪只过敏反应与体内IgE水平的关系以及过敏反应的防治提供了试验依据。
1 材料与方法
1.1 主要仪器和试剂
低温冷冻离心机、电泳仪、玻璃层析柱、自动部分收集器、垂直板电泳槽、凝胶成像系统、MIKRO 22R型冷冻离心机、SIGMA 3K30型冷冻离心机、751型分光光度计、WFZ UV-2102 PCS型紫外分光光度计;DEAE-52、SephadexG-200、丙烯酞胺、 甲叉双丙烯酞胺、Tris碱、TEMED、 SDS、考马斯亮蓝R250、低分子质量蛋白质标准 (14.4～97.4 ku) 等, 购自北京鼎国生物技术公司。
1.2 人工致敏猪血清样品的制备
自吉林农业科技学院猪厂购得体重为100 kg左右的成年纯种长白猪, 经静脉注射牛血清白蛋白以获得致敏体质动物模型, 剂量为5 mL/头;首免2 d后采血, 自然析出后分离血清500 mL, 分装, -20 ℃冻存;1周后再次静脉注射1次, 方法、剂量与第1次相同, 观察试验猪是否发生过敏, 将阳性猪血清作为试验用血清样品。
1.3 人工致敏猪血清IgE的粗提
取血清样品与生理盐水等比例稀释, 按常规饱和硫酸铵沉淀法即逐滴加入20%、50%、33%、33%饱和硫酸铵分离γ-球蛋白, 操作过程如下:生理盐水和试验猪血清各40 mL, 混匀;于磁力搅拌器搅拌下逐滴加入饱和SAS (浓度为20%) 20 mL, 充分混匀, 4 ℃静置30 min;3 000 r/min离心20 min;弃去沉淀, 取上清液, 于磁力搅拌器搅拌下逐滴加入饱和SAS (浓度为50%) 60 mL, 充分混匀, 4 ℃静置30 min, 3 000 r/min离心20 min;弃去上清液, 在沉淀中加入40 mL生理盐水使之溶解, 于磁力搅拌器搅拌下逐滴加入SAS (浓度为33%) 20 mL, 充分混匀, 4 ℃静置30 min;3 000 r/min离心20 min;弃去上清液, 重复上一步骤2～3次;用20 mL生理盐水溶解沉淀, 装入透析袋, 流水透析过夜;以生理盐水4 ℃透析24 h, 中间换液3～4次;透析后蛋白样品经PEG6000浓缩得粗提样品, 可直接进行以下试验或-20 ℃冻存。
1.4 经DEAE-52和SephadexG-200层析分离、提取人工致敏猪血清IgE
1.4.1 人工致敏猪血清IgE的离子层析DEAE-52分离
取浓缩后的粗提样品于0.005 mol/L、pH值为8.0的PB缓冲液中平衡过夜;取平衡后的样品, 用分光光度计测定蛋白质含量, 按每克纤维素吸附40～100 mg蛋白质计算 (样品浓度以2.5%～3.0%为宜) ;将样品加到用pH值为8.0的PB缓冲液平衡好的DEAE-52层析柱中, 然后以pH值为8.0的0.01 mol/L PB缓冲液洗脱;至洗脱样品中蛋白质浓度<2% (用分光光度计测定蛋白质含量) 时, 改以0.025 mol/L PB缓冲液洗脱;每管收集3 mL洗脱液, 并测定每管洗脱液在波长为280, 260 nm处的吸光度值;收集洗脱液, 绘制洗脱曲线, 合并峰尖的洗脱液, 用PEG6000浓缩。
1.4.2 人工致敏猪血清IgE的凝胶层析SephadezG-200提取
取上述经纤维素分离后的样品 (用分光光度计测定蛋白质含量) , 以pH值为8.0的0.01 mol/L PBS缓冲液平衡过夜;将平衡好的样品加到用pH值为8.0的0.01 mol/L PBS缓冲液平衡好的SephadezG-200凝胶柱中;以pH值为8.0的0.01 mol/L PBS缓冲液洗脱, 测定每管洗脱液在波长为280, 260 nm处的吸光度值并收集第一蛋白峰, 绘制洗脱曲线, 样品用PEG6000浓缩, -20 ℃保存。
1.4.3 IgE浓度的测定
取上述分离、提取后的样品, 用分光光度计测定蛋白质含量。
1.5 经盐析、层析方法提取的猪IgE的SDS-PAGE电泳鉴定
将提取的IgE溶液和低分子质量蛋白质标准分别与等量的缓冲液混合后于100 ℃水浴3～5 min;吸取20 μL上述混合液加到制备好的12%分离胶及5%浓缩胶的凝胶点样孔内, 加入甘氨酸电泳缓冲液用100 V电泳30 min, 然后改用200 V电泳, 直到染料抵达分离胶底部时停止电泳。电泳结束后用考马斯亮蓝染液染色6 h, 染色结束后经脱色液脱色, 观察并记录结果。
2 结果
2.1 人工致敏猪IgE提取物的测定结果
2.1.1 人工致敏猪IgE的粗提结果
用分光光度计分别测定OD280值和OD260值, 经计算得蛋白质含量为39.04 mg/mL。
2.1.2 人工致敏猪IgE经DEAE-52和SephadexG-200层析
结果见图1、图2。
经对图1分析可知, 合并峰尖的洗脱液, 经PEG6000浓缩至适当浓度, 用分光光度计分别测定OD280值和OD260值, 并计算得蛋白质含量为12.6 mg/mL。
经对图2分析可知, 收集第一蛋白峰, 经PEG6000浓缩至适当浓度, 用分光光度计分别测定OD280值和OD260值, 并计算得蛋白质含量为0.173 mg/mL。
2.2 所得猪IgE的SDS-PAGE电泳结果
人工致敏猪血清提取物经DEAE-52和SephadexG-200层析后所得产物的SDS-PAGE电泳结果表明, 可得到IgE条带 (见图3) 。
M.低分子质量蛋白质标准;1.IgG;2.目的蛋白IgE。
3 讨论
3.1 试验中猪的IgE血清样品的获得
在试验中, 如何获得富含IgE血清样品是关键环节之一。鉴于正常猪血清中IgE的含量非常低, 而且没有正常数据参考, 因而试验以成年纯种长白猪为试验猪。试验结果表明, 在此种试验条件下的血清经合适方法可以提取出IgE, 而正常猪血清未能提取出IgE。因此, 要获得IgE, 必须从富含IgE的猪血清中提取。
3.2 猪血清IgE分离、提取策略的选择
关于血清IgE分离、提取的方法较多, 纯化后回收率、纯度差别也较大, 而且都含有少量IgG。试验采用硫酸铵 (20%、50%、33%、33%) 、DEAE-52以及SephadexG-200分离IgE, 这种三步连续提取的方法效果更好, 在人工致敏猪血清中可提取到IgE。
3.3 影响猪血清IgE分离、提取的因素
由于IgE的含量较低, 为获得更多样品, 试验需多次反复分离, 因而试验中制剂、设备的不一致会导致试验数据的不一致。此外, 每次分离时样品的保存时间、温度等条件不一致, 也会导致试验数据的不一致。因此, 在试验操作过程中, 操作温度应控制在低温 (4 ℃) ;pH值为6～8的缓冲液可以有效防止pH值引起的变性;应减少光氧化 (紫外光) 和离子辐射;提取步骤的简化可减少样品损失, 并降低环境因素所造成的不利影响。此外, 应尽可能快速提取, 各步骤尽可能联系紧密, 不需另外对物料进行处理。
参考文献
[1]钱爱东, 章金钢.猪免疫学基础[J].中国兽医杂志, 1997, 23 (3) :51-53.
[2]SMITHD H, MALONE D C, LAWSON K A, et al.A national esti-mate of the economic costs of asthma[J].Am J Respir Crit CareMed, 1997, 156:787.
[3]毕爱华.医学免疫学[M].北京:人民军医出版社, 2002:169-171.
[4]杨汉春.动物免疫学[M].北京:中国农业大学出版社, 2003:32-33.
[5]沈霞, 陶美华.IgE的纯化、抗IgE血清的制备以及血清中IgE测定的临床应用[J].上海免疫学杂志, 1985, 5 (1) :52-53.
[6]王世若.现代动物免疫学[M].2版.长春:吉林科学技术出版社, 2001:52-55.
[7]蔡美英.医学免疫学[M].北京:科学出版社, 2002:27.
[8]ISHIZAKA K, ISHIZAKA T, HORNBROOK M M.PhysicochemicalProperties of reaginic antibody.V.Correlation of reaginic activity wthganuna-E-globulin antibody[J].J Immunol, 1966, 97 (6) :40-53.
[9]王玲.豚鼠IgE提取与生物学特性鉴定[J].哈尔滨医科大学学报, 1991, 25 (1) :10-13.