血红蛋白释放（精选3篇）
血红蛋白释放 篇1
2007年,本研究组在研究1例轻型β-地中海贫血病例的红细胞电泳过程中偶然发现,在停电一段时间后再次电泳,该患者标本从原点释放出较多的血红蛋白,从而开始创建血红蛋白释放试验(HRT)[1]。利用这种技术筛查一些普通外科住院患者的血液,其中有4例胆结石标本的HRT结果有差异,另1例标本是脑梗死后遗症,其HRT异常最明显[2]。在大量筛查过程中,笔者也注意到脑梗死及其后遗症患者HRT增强者较多。由于血液流变学检测在脑梗死辅助诊断中有一定的参考意义[3,4,5,6],故决定研究HRT与血液流变学结果的关系,探讨前者的可能作用机制。
1 材料与方法
1.1 血液样品来源
患者全血标本均来自包头医学院第一附属医院检验科2008年12月~2009年2月共48例门诊样本。所用仪器为普利生N6C全自动血液流变学分析仪。本文使用的数据来自血液流变学检测报告单。
1.2 低渗37℃HRT
每个标本取全血8μl,加双蒸水12μl,混匀后37℃水浴保温2 h。使用我科研究室的常规-淀粉琼脂糖混合凝胶电泳[1],将保温后的标本借助3 mm滤纸加在凝胶的阴极侧。第一次电泳2 h(5 V/cm)。停电30 min后再电泳30 min,共3 h。然后用丽春红、联苯胺染色,拍照留图。
1.3 结果判定
首先观察第2次释放(定点释放)时有无血红蛋白泳出,有定点释放血红蛋白者判为阳性结果,无则为阴性(定为0级)。出现阳性结果者进行数量比较。定点释放的血红蛋白数量可参考碳酸酐酶、血红蛋白A1、A2区带,由少到多定为1、2、3、4级。
1.4 统计学分析
使用SPSS 11.0软件进行分析。用Spearman相关分析计算出HRT与全血黏度的高切、中切、低切的相关性,P<0.05表示有显著性差异。
2 结果
2.1 HRT结果
一次电泳检测12个定点释放结果见图1。
2.2 相关分析结果
HRT与各种全血黏度值的相关系数分别为:HRT与低切r=0.642(P<0.001)、HRT与中切r=0.636(P<0.001)、HRT与高切r=0.641(P<0.001)。
3 讨论
HRT创建不久,由于它能在诸多临床标本中发现差异、查出问题,引起极大关注。地中海贫血是一种遗传性疾病,本法能查出患者及其家族成员[1],这在理论和实践上都有重要意义。接着又将HRT深化和细分为室温等渗HRT(上述HRT属于此类)、室温低渗HRT、等渗37℃HRT、低渗37℃HRT,灵敏度逐级提升,效果更加明显。笔者利用低渗37℃HRT筛查一些普通外科住院患者的血液,其中有4个胆结石标本,其HRT结果有明显差异,另1例脑梗死后遗症患者,其HRT最明显[2]。由遗传性疾病到普通外科患者,都能进入本项技术的检测范围,它的作用机制如何,这是迫切需要解决的问题。HRT机制研究涉及面很广,本文从它与血液流变学关系角度来探讨HRT的作用机制。
本实验证明,HRT与血液流变学结果有一定的相关性。几种全血黏度值中,低切反应细胞的聚集性、高切反应细胞的变形性,HRT与两者都有关,说明红细胞的变形能力降低,聚集性增强,黏度加大,造成第一次释放后原点残留增多,第二次释放时才离开红细胞,表现为再释放血红蛋白增多。已知与红细胞变形性有关的疾病很多,地中海贫血也是其中之一,血红蛋白H病、重型β地中海贫血等红细胞的变形能力明显降低,而轻型β地中海贫血红细胞的变形能力接近正常[7]。这在总体上与本研究结果相符,但在细节上略有不同,本研究组的研究能够非常清楚地查出轻型β地中海贫血[1],可见,HRT的反应能力更强,其作用机制可能还包括红细胞变形性和聚集性以外的因素,HRT的机制尚待深入研究。
摘要：目的:研究血红蛋白释放试验(HRT)与血液流变学检测结果之间的相关性,探讨有关机制和临床意义。方法:对48例门诊随机标本配对做低渗37℃HRT。将血液流变学测试报告中的3项全血黏度(低切、中切、高切)值与HRT测定值进行比较,分析两者的相关性。结果:HRT与血液流变学结果呈一定的正相关,其与各种黏度值的相关系数分别为:低切r=0.642(P<0.001),中切r=0.636(P<0.001),高切r=0.641(P<0.001)。结论:HRT的反应机制中,至少有一部分与血液黏度增加有关。
关键词：血红蛋白释放试验,HRT,血液流变学,全血黏度,低切,高切
参考文献
[1]秦文斌,高丽君,苏燕,等.血红蛋白释放试验与轻型β-地中海贫血[J].包头医学院学报,2007,23(6):561.
[2]韩丽红,闫斌,高雅琼,等.普通外科患者血红蛋白释放试验的比较研究[J].临床和实验医学杂志,2009,8(6):67-68.
[3]秦任甲.临床血液流变学[M].北京:北京大学医学出版社,2006.
[4]董曼莉,逢淑华,翟关中,等.脑梗塞病人血液流变学的变化[J].中国血液流变学杂志,2004,14(2):221.
[5]高中芳,席向红.老年脑梗塞患者血液流变学指标检测分析[J].中国血液流变学杂志,2005,15(1):73.
[6]丁翊,赵红红.脑梗塞患者血液流变学和血脂指标测定[J].微循环杂志,2004,14(3):88,90.
[7]金永娟.红细胞可变形性与溶血性贫血[J].中华血液学杂志,1987,8(2):85.
血红蛋白释放 篇2
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 主要仪器
Olympus倒置显微镜(日本Olympus公司),二氧化碳培养箱(Fisher Scientific Headquarters公司),低温高速离心机2-16K(美国Sigma公司),SW-CJ-IF净化工作台(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司),荧光分光光度计(日本岛津公司),紫外分光光度计(上海精密仪器仪表有限公司)。
1.1.2 主要试剂
磷酸二组胺(上海生化研究所),邻苯二甲醛(美国Sigma公司),类胰蛋白酶(美国Sigma公司),Percoll分离液(瑞典Pharmacia公司),1640培养液(美国Gibol公司),胎牛血清(天津市生化制品厂),BAPNA(美国Sigma公司),Fluo-3/AM(美国Sigma公司),Scoparone(德国Merck公司)
1.1.3 实验动物
健康豚鼠,体重200-250 g,雌雄兼用,由中国医科大学实验动物部提供。
1.1.4 试剂配制
PBS液:(1)分别精确称取NaCl8.00g、KCl 0.20 g、Na2HPO4·12H2O 3.49 g和KH3PO4,0.24 g于烧杯中,加蒸馏水约800 m L,用磁力搅拌器搅拌溶解,调整溶液pH值至7.2~7.4,加水定容至1L,分装于灭菌瓶中,高压灭菌20 min,冰箱保存;(2)Percoll分离液:将10×PBS与percoll贮存液按照1∶9的比例混合,制成100%percoll悬液。将1×PBS与100%percoll悬液分别按照7∶3和2∶8的比例混合,制成30%percoll分离液和80%percoll分离液。此使用液不宜长期储存,应现用现配;(3)胎盘蓝染液:称取胎盘蓝4 g,加少量蒸馏水研磨,再用去蒸馏水定容至100 m L,滤纸过滤得母液,4℃保存。使前以PBS液稀释10倍至0.4%;(4)甲苯胺蓝染色液:称取甲苯胺蓝1 g,硼砂1 g,加蒸馏水100m L,用搅拌器混匀,滤纸过滤,室温保存。
1.2 实验方法
1.2.1 豚鼠腹腔MCs的分离和培养
(1)豚鼠腹腔MCs的分离:将健康豚鼠击头处死,浸入75%乙醇中消毒,消毒后固定于超净台内消毒木板上,剔除胸腹部毛,用75%酒精棉球消毒腹部皮肤。腹腔注射预冷的RPMI1640培养液15 m L,轻轻按摩腹部2、3min,小心打开腹腔,吸取腹腔冲洗液置于干净的离心管中,用吸管吹打混匀;(2)豚鼠腹腔MCs的纯化4℃,1 500 r/min,离心5 min弃上清,将细胞悬液缓慢加入等体积比的30%∶80%的Percoll梯度分离液中,4℃,2 500 r/min离心15 min,将收集交界处的细胞置于干净的离心管中,吸管吹打混匀,PBS工作液洗两次4℃,1 500 r/min,离心5 min,镜下计数,调整细胞浓度至1×105个细胞/m L。台盼蓝染色,活力大于95%,甲苯胺蓝染色,纯度大于90%,置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中悬浮备用[5]。
1.2.2 豚鼠MCs的致敏
(1)致敏血清的制备[6,7]:取健康豚鼠10只,体重200~250 g,雌雄兼用。实验第1天以10%鸡卵白蛋白(ovalbumin,OVA)生理盐水0.5 m L肌肉注射于豚鼠两后腿内侧,同时腹腔注射0.5 m L卵蛋白氢氧化铝(g/mL),第4天加强1次,第14天立即颈动脉取血收集血液,室温放置,4℃冰箱过夜,待血液充分析出后离心收集上清4℃,3 000r/min,10 min,过滤除菌后-70℃冰箱中保存备用;(2)体外致敏的MCs模型:将MCs悬液与含IgE血清按1∶1的比例混合,然后置入37℃,5%二氧化碳孵箱中孵育2 h,每管约含MCs 1×105个,用含1%FBS的PBS轻轻洗涤2次,去除未结合的血清。用PBS重悬后,Sco.组MCs分别加入1×10-5mol/LSco.、1×10-6mol/L Sco.和1×10-7mol/L Sco.,在培养箱中孵育10 min,10 min后加入OVA(0.2 mg/m L)反应8 min,然后置于冰浴中5 min以终止反应。哮喘组(asthma)即致敏MCs,在培养箱中孵育10 min后立即加入OVA(0.2 mg/m L)反应8 min,然后置于冰浴中5 min终止反应。空白对照组(control)即正常MCs,以生理盐水代替药物。显微镜下观察MCs激活后状态,并拍照。
1.2.3 豚鼠MCs脱颗粒
将各组MCs(表1)试管离心,4℃,400 g,10 min,于显微镜下观察,每组选择10个MCs相对集中的视野,镜下计算每100个MCs脱颗粒程度。
1.2.4 组胺的测定
(1)组胺标准液的制备[8]:将磷酸二组胺置棕色瓶中干燥3 h,称取2.763 mg溶于0.1N HCl稀释至100 m L,分装后冰箱保存,用前取0.1m L稀释至10 m L;(2)组胺测定:分别取各组细胞,加入HClO4(终浓度0.4 mol/L),离心(4℃,4 000 r/min,10 min),取上清。取上清液1.6 m L,置于已加1.5 g的NaCl的10 m L带塞试管中,加4.0 m L正丁醇和0.2 m L NaOH(2.5 mol/L),立即混匀,置振荡器中震荡5 min。然后取出3.6 m L正丁醇相加到已加1.2m L HCl(0.1 mol/L)和2 m L正庚烷的带塞试管中。震荡5 min,弃去有机相,取1 m L HCl相置入10m L带塞试管中。加入1 m L NaOH(0.4 mol/L),然后立即加入0.1%邻苯二甲醛(OPT)0.2 m L,振荡混匀,37℃孵育10 min,加入1.0 m L,0.5 mol/L的HCl终止反应。对应的细胞用PBS重悬后经细胞破碎仪彻底破碎,其他处理方式同上清处理。荧光分光光度计比色,检测组胺含量,激发波长330 nm,发射波长440 nm。根据制定的组胺标准曲线分别计算细胞上清中组胺含量和细胞中组胺含量,组胺释放率=上清组胺/(上清组胺+胞内组胺)×100%。
1.2.5 类胰蛋白酶活力的测定
酶活力的测定采用专用底物BAPNA(a-N-苯甲酰-D L-精氨酸-P-硝基苯胺)。BAPNA以20 mg/m L溶于二甲基亚砜,混匀后取40μL加入含待测液的0.1 mol/L反应缓冲液1.5 m L中,反应缓冲液为Tris-HCl(pH 7.4),30℃反应20 min后,加入0.5 m L 30%(v/v)乙酸终止反应,在405 nm测光吸收值。以反应缓冲液做参比调零[9]。
1.2.6 MCs[Ca2+]i的测定
(1)体外致敏的MCs模型:将MCs悬液与含lg E血清按1∶1的比例混合,然后置入37℃,5%二氧化碳孵箱中孵育2 h,每管约含MCs 1×105个,用含1%FBS的PBS轻轻洗涤2次,去除为未结合的血清。用PBS重悬后,加入OVA(0.2 mg/m L)反应8 min以激活MCs,然后置于冰浴中5 min以终止反应;(2)MCs[Ca2+]i的测定:将1mol/L Fluo-3/AM按1∶200体积比用无钙液液稀释为终浓度为5μmol/L,将悬浮培养的MCs加入已预先覆盖多聚赖氨酸的培养皿中负载。在37℃、通气(95%氧气和5%二氧化碳)的条件下避光负载45min,而后用PBS冲洗两次,稳定15 min,以确保Fluo-3/AM细胞内溶解为Fluo-3,再用倒置荧光显微镜采集细胞荧光图像,激发波长488 nm,发射波长528 nm。图像分辨率为640×480像素,每侦采集时间为1 s。在应用Metafluo分析软件进行图像处理时,采用套锁的方式选取细胞,对单个细胞进行分析;(3)[Ca2+]i的变化表示方法:[Ca2+]i的变化用ΔF/F0的比值来表示,F0为基础荧光密度值,F为给予不同工具药后细胞的荧光密度值,ΔF/F0=(F-F0)/F0代表给药后Ca2+的变化程度。
1.2.7 统计学处理
所有数据均以表示,应用SPSS16.0软件进行单因数方差分析和t检验,P<0.05表示差异有显著性。
2 结果
2.1 MCs的激活
MCs染色用特异性染色剂甲苯胺蓝,可见胞浆内充满颗粒,颗粒形态比较清晰,见图1。部分细胞胞浆内呈空泡状,提示有部分颗粒自然脱出。致敏MCs经抗原激活可以看到细胞体积变大,表面有颗粒样凸起,见图2。
2.2 Sco.对豚鼠体外致敏的MCs脱颗粒的影响
注:1)与对照组比较,P<0.05;2)与哮喘组比较,P<0.05;3)与哮喘组比较,P>0.05
哮喘组豚鼠腹腔MCs脱颗粒百分数与对照组相比差异显著(P<0.05)。1×10-5mol/L Sco.和1×10-6mol/L-1 Sco.组与哮喘组相比较,有抑制MCs脱颗粒的作用(P<0.05),其中1×10-5mol/L Sco.组抑制作用最明显;1×10-7mol/L Sco.组与哮喘组相比无明显差异(P>0.05)。
2.3 不同浓度Sco.对豚鼠MCs释放组胺和类胰蛋白酶的影响
豚鼠MCs经抗原激活后,哮喘组与对照组比较组胺和类胰蛋白酶释放量显著增加(P<0.05);1×10-5mol/L Sco.和1×10-6mol/L Sco.组与哮喘组相比较,组胺和类胰蛋白酶的释放得到了有效的抑制(P<0.05),其中1×10-5mol/L Sco.组最明显,1×10-7mol/L Sco.组与哮喘组相比无明显作用(P>0.05)。
注:1)与对照组比较,P<0.05,2)与哮喘组比较,P<0.05,3)与哮喘组比较,P>0.05
2.4 不同浓度Sco.对正常及致敏MCs[Ca2+]i的影响
[Ca2+]i改变用ΔF/F0表示,在无钙液中,应用不同浓度的Sco.(即10-5mol/L、10-6mol/L和10-7mol/L)作用于正常MCs,测定MCs[Ca2+]i的变化,变化的幅度分别为(-12.1±2.2)%、(-6.1±2.4)%和(-2.1±0.7)%;应用不同浓度的Sco.(即10-5、10-6和10-7mol/L)作用于致敏MCs,测定MCs内[Ca2+]i的变化,变化的幅度分别为(-75.6±2.2)%、(-33.9±2.5)%和(-4.0±0.02)%,可见[Ca2+]i下降的程度与Sco.呈剂量依赖性,Sco.各剂量组对致敏MCs[Ca2+]i的抑制均高于其相对应的正常MCs[Ca2+]i(P<0.05),其中10-5mol/L Sco.组对致敏MCs[Ca2+]i的抑制作用更加显著。见图3。
3 讨论
哮喘的发病机制十分复杂,可能与抑制炎症作用有关。目前认为哮喘发病机制主要为I型变态反应学说,而肥大细胞(mast cell)是引发变态反应的主要效应细胞之一,它所分泌的活性物质能引起气道平滑肌的增殖和收缩。MCs所引起变态反应主要由高亲性IgE受体FcεRI的交联所触发,它只有激活后才能起作用,如抗原、抗IgE抗体等等,激活后所释放的颗粒介质能够广泛地调节其他细胞及其功能[10]。机体接触到过敏原以后,过敏原被抗原提呈细胞(APC)所识别,首先诱导B细胞产生特异性抗体IgE,IgE通过与MCs表面的受体FcεRI结合而处于致敏状态。当过敏原再次进入机体时,APC细胞吞饮这些过敏原,激活信号转导系统并进行脱颗粒。MCs活化后以胞吐的方式释放预先形成的和新产生的炎症介质,参与平滑肌收缩、黏液的产生等过程,最终引起炎症反应[11]。炎症状态下的MCs能够高水平的表达FcεRI使其更多的结合抗体IgE。因此,抑制MCs脱颗粒的产生及增强MCs的稳定性,成为控制哮喘的关键环节之一。本研究证明Sco.可剂量依赖性抑制豚鼠MCs脱颗粒,且对致敏的MCs脱颗粒抑制作用更显著,这也提示Sco是否可更广泛应用于抗过敏的治疗。
细胞内钙离子(calcium,Ca2+)的参与在MCs脱颗粒的过程中是必不可少的,Ca2+作为细胞内重要的信号转导元件,在生物学上的重要性早在多年前就已被人们所认识到,它参与一些重要的生理过程,如肌细胞收缩、神经递质的释放、细胞存活、凋亡过程等。哮喘气道的病理过程与Ca2+改变密切相关。现在普遍认为Ca2+浓度升高主要有外钙内流和内钙释放两种方式。能够引起细胞内Ca2+浓度升高的除钙通道以外,还有内质网或肌浆网上的IP3和Raynodine受体,Ryanodine(RyRs),他们能被IP3或Ca2+直接激活而释放内钙[12]。本实验发现Sco.能够抑制豚鼠正常MCs以及致敏MCs[Ca2+]i释放并呈剂量依赖性,这与其在豚鼠平滑肌细胞的降钙作用相似[13],但Sco是否仅通过抑制MCs[Ca2+]i的释放而影响其脱颗粒作用还需要进一步研究证明。
总之,本实验比较对照组、哮喘组、不同剂量Sco.组豚鼠MCs所释放组胺和类胰蛋白酶的差异,证实了Sco.能够抑制MCs体外脱颗粒,进而减少了组胺和类胰蛋白酶的释放同时降低MCs[Ca2+]i并呈剂量依赖性,有效地减轻哮喘的炎症症状。
摘要：目的 滨蒿内酯(Soparone,Sco.)通过松弛气道平滑肌、清除气道氧自由基、抑制气道炎症等多种途径起到抗炎平喘作用,该实验基于前期所做的研究工作,进一步探讨了Sco对肥大细胞(mast cells,MCs)脱颗粒及其炎症介质的释放作用的影响及可能的调控途径。方法 不同浓度的Sco(10-5、10-6和10-7mol/L)分别作用于正常及致敏MCs,并设立正常及致敏MCs的溶剂对照组(control,asthma),比较各组MCs脱颗粒百分数、类胰蛋白酶活力、组胺释放率及MCs细胞内钙([Ca2+])i的变化。结果 1×10-5和1×10-6mol/L Sco.组MCs脱颗粒百分数分别为(39.10±2.81)%和(11.40±2.37)%,明显低于asthma组的(78.90±4.12)%(P<0.05),且以上Sco.组MCs的组胺和类胰蛋白酶释放亦较asthma组显著减少(P<0.05);在无细胞外钙条件下,不同浓度的Sco(10-5、10-6和10-7mol/L)对正常MCs[Ca2+]i的影响分别为(-12.1±2.2)%、(-6.1±2.4)%和(-2.1±0.7)%,对致敏MCs[Ca2+]i的影响分别为(-75.6±2.2)%、(-33.9±2.5)%和(-4.0±0.02)%,相同浓度Sco.对正常组和致敏组MCs[Ca2+]i的降低作用的组间差异有显著性(P<0.05)。结论 Sco.可剂量依赖性抑制豚鼠MCs脱颗粒从而抑制MCs组胺及类胰蛋白酶的释放;Sco.能够抑制豚鼠正常MCs以及致敏MCs[Ca2+]i水平。
血红蛋白释放 篇3
过氧化氢酶是一种重要的功能性食品酶, 在酸、碱或酶的作用下易失活;体内广泛存在的蛋白酶可降解游离CAT, 缩短其体内半衰期。以大豆卵磷脂和甘三酯为载体的SLN具有运载和防止CAT蛋白酶解的潜力。本研究室最近以富含PC的大豆卵磷脂制备了CAT-SLN, 本研究旨在探讨这种包埋技术对PC结构的影响及防止CAT被蛋白酶酶解的性能。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
CAT购自上海楷洋生物技术有限公司, CAT测试盒购自南京建成生物工程研究所, 三棕榈酸甘三酯 (TG) 和大豆磷脂酰胆碱 (PC) 为本试验室自制, 考马斯亮蓝G-250、丙酮和购自国药集团化学试剂有限公司, Poloxmer 188购自沈阳药大集琦药业有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 两步乳化法W/O/W制备过氧化氢酶固体脂质纳米粒
按照图1所示流程, 利用双乳化和溶剂蒸发技术制备过氧化氢酶固体脂质纳米粒 (CAT-SLN) , 合成工艺条件为:将浓度为2% (w/v) 的酶溶液 (内水相) 加入至含TG和PC (最佳PC∶TG=15.24%) 的二氯甲烷/丙酮 (1/1) (油相) , 油相∶内水相=5, 超声作用20s乳化形成W/O乳状液, 加入1.5%Poloxmer188水溶液 (第二相) 中, W/O乳状液∶第二相=1∶4, 超声作用30s乳化形成W/O/W型乳状液。所得双乳液抽真空旋转蒸发、冷冻离心 (15 000 r/min, 60 min, 4℃) 得到纳米粒。
1.2.2 CAT酶活测定
加入钼酸铵而迅速终止过氧化氢酶 (CAT) 分解H2O2的反应, 剩余的H2O2与钼酸铵作用产生一种淡黄色的络合物, 在405nm处测定其生成量。定义每毫克酶每秒钟分解1μmol H2O2的量为一个活力单位。
1.2.3 过氧化氢酶包载在SLN中位置的测定
据文献报道, 荧光可以用来检测蛋白质包载在SLN中的位置。将制备得到的样品置于1cm直径的比色杯固定激发波长280nm, 发射波长300~750nm范围扫描样品, 测定样品的荧光发射峰强度。
1.2.4 体外释放检测
将冷冻离心得到的纳米粒置于离心管中, 加入pH值6.8的PBS1.0mL作为释放介质, 于恒温摇床中, 在37℃、100r/min进行释放试验。定时取样0.2mL离心, 并补加等量的新鲜PBS液, 继续振荡。所取上清液用考马斯亮蓝法测定其蛋白含量, 以PBS液为空白对照, 根据标准曲线计算释药量和累积释放率。
1.2.5 远紫外-圆二色光谱
将制备得到的酶溶液置于1cm直径的比色杯, 放入远紫外-圆二色光谱中, 在190~250nm的波长下扫描, 以PBS缓冲液作为空白, 测定其二级结构。
1.2.6 蛋白酶敏感性测定
使过氧化氢酶或CAT-SLN与0.2% (w/v) 蛋白酶K (溶于PBS, pH值7.3) 在37℃共孵育, 在不同时间点测定CAT酶活。
1.2.7 数据处理
用SPSS 10.0进行单因素方差分析, 用Tukey法进行多种比较。结果用平均值±SD表示。
2 结果与讨论
2.1 固体脂质纳米粒的体外释放
如图2所示, 在过氧化氢酶从纳米粒释放的初期, 有突释现象产生, 这种突释与脂质基质中PC∶TG有关, PC∶TG为5时最弱, PC∶TG为1时最明显。CAT在12h以后呈现持续的缓慢释放。外层没有包被Poloxmer188的W/O乳粒CAT释放最快。因此, SLN适合于作为延迟释药的给药系统, 可以通过改变脂类骨架结构、表面活性剂浓度和生产工艺参数 (如温度) 来修正释药曲线, 释药曲线可被调整为延迟释放而完全无突释现象, 也可以有部分突释, 随后是延迟释药, 在这些情况下突释药物可作为首剂量给予。
表面活性剂既可加速脂质降解 (如胆酸钠盐) , 也可延缓脂质降解 (如poloxamer407) , 通过选择合适的表面活性剂可获得适宜释药速率。过氧化氢具有高渗透性, CAT-SLN具有低释放速率也可发挥良好作用。因此本研究中用poloxamer118做为表面活性剂是适宜的。如选用其他poloxamer系列表面活性剂可能进一步降低释放速率, 还待进一步研究。
2.2 过氧化氢酶包载在SLN中的位置
药物在SLN中的分布主要由药物性质 (熔点、极性等) 、脂质材料性质、表面活性剂浓度和工艺参数 (制备温度等) 决定其分布模式, 有固体溶液型 (药物以分子形式分散于脂质材料中, SLN的基材是固体溶液) 、内核-外层型 (药物浓集于外层) 和内核-外层型 (药物浓集于内核) (图3) 。
当荧光的激发波长在280nm时, 过氧化氢酶在其最大发射波长560nm处将会有一个强烈的荧光发射峰。因此, 利用重金属盐使CAT变性, 从而影响其荧光强度可以判断过氧化氢酶在SLN中的具体位置。在这部分试验中, 硫酸铜被选取作为过氧化氢酶的变性剂。我们首先按照包载药物的制备顺序利用双乳液法制备出包载过氧化氢酶的SLN, 然后平行地将相同数量的过氧化氢酶加入到空白SLN的外水相当中。最后, 我们将不同浓度的硫酸铜溶液作为淬灭剂加入到SLN的外水相当中, 进而测定溶液的荧光强度。最后通过荧光强度的变化, 推测其在SLN中的位置。
由图4可知:当硫酸铜加入后, 处于外水相的CAT将在重金属Cu2+的作用下发生变性从而导致荧光淬灭。当过氧化氢酶在制备过程中加入到SLN中时, 随着硫酸铜浓度的增加, 荧光强度并没有发生明显的降低, 由此可证明, 在外水相中并没有大量的过氧化氢酶分子, 且处于SLN内部的过氧化氢酶在脂质的保护下没有发生淬灭。在对照试验中, 当过氧化氢酶在SLN制备完成后加入到外水相中时, 随着硫酸铜浓度的逐渐增大, 过氧化氢酶的荧光强度发生明显降低, 可见在外水相当中, 确实存在大量的过氧化氢酶分子, 与本身过氧化氢酶加入在外水相当中的试验过程相吻合。这组试验数据说明, 当采用复配乳化剂时, 过氧化氢酶分子在制备过程中被包载进脂质核的内部当中, 并且在W/O型乳状液向外水相分散制备成SLN的过程中, 过氧化氢酶没有从中释放出来。由此推测, 添加到SLN内部当中的过氧化氢酶分子可能大部分存在于固体脂质和内水相之间, 一部分过氧化氢酶可能从中释放出来。
研究表明:如药物熔点高于脂质材料, 冷却时会先结晶凝固形成药物核心, 表现出缓释行为;若药物熔点低于脂质材料, 则脂质先重结晶, 药物分布于外层, 表现出突释行为。此外药物亲脂性越高, 包封率相应越高。本研究结果按时CAT的熔点应该高于PC∶TG为5的脂质材料。而从图2可以推测, 当PC∶TG大于或小于5时, CAT相对于脂质材料的熔点可能较高。
2.3 释放后过氧化氢酶与原过氧化氢酶的远紫外-圆二色光谱
由于纳米粒子会产生严重的光散射现象, 严重干扰测量结果, 所以在SLN相中的蛋白质的二级结构用圆二色的方法测定较为困难。故本节将释放后的过氧化氢酶与原样对比, 考察其在制备过程中二级结构的变化。
在图5中208nm和218nm处为α-螺旋的特征峰;215nm是β-折叠的特征峰。表1分别列出了过氧化氢酶原样和释放出来的过氧化氢酶的二级结构形式的百分比。通过对比发现, 过氧化氢酶中α-螺旋的含量基本不变;而β-折叠的含量有所差别, 释放出来的β-折叠含量明显比在原样含量低;而且释放出来的β-转角含量比原样含量高。由于β-折叠和β-转角都是由氢键构成, 这里可能存在着β-折叠向β-转角转变的过程, 因而导致β-折叠的含量降低。由此可见, 过氧化氢酶的二级结构仅仅是受到轻微的扰动, 并没有遭到破坏, 其二级结构仍然较好地保持着。
2.4 CAT-SLN的抗蛋白酶性质
如图6所示, 与蛋白酶K孵育后, 游离过氧化氢酶在1h内活性下降了近70%, 5h后活性检测不到, CAT-SLN在5h时还保留48%活性, 近24h时抑制保持30%左右活性, 蛋白酶处理后CAT-SLN活性的降低可能主要归因于表面结合及释放的CAT。由于CAT的作用对象H2O2具有强扩散性, CAT-SLN脂质核心中的CAT可以高效将其降解。
3 结论
脂质载体中PC和TG比例对CAT-SLN缓释效果有显著影响, 使用Poloxmer 188作为外相乳化剂可显著提高缓释效果, 当脂质载体PC∶TG为5时CAT累计释放率最低。CAT主要存在于SLN脂质核心。包埋对CAT的结构没有显著影响。CAT-SLN具有显著的抗蛋白酶酶解作用。
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