整合蛋白

整合蛋白（通用4篇）

整合蛋白 篇1

妊娠蛋白尿是妊娠过程中出现的一类临床综合征, 它的病因可能来自妊高征、子痫前期、子痫以及各种原、继发性肾小球疾病合并妊娠, 部分产妇随妊娠进展可出现高血压危象、心功能衰竭、急性肾损伤等严重并发症, 而这些并发症是导致孕产妇和围产儿发病率和死亡率升高的重要原因[1]。

肾损伤的主要表现是尿异常, 由此可以通过检测尿液中的异常成分来判断肾损伤[2], 而肾活检被认为是诊断肾脏疾病的金标准, 但这一有创检查难以被孕产妇接受。因此, 寻找到一种简单易行的无创性检查方法来对患者肾损伤及病情的严重程度做出评估, 这一课题临床意义重大。有研究发现, 尿沉渣谱可反映肾小球增殖性、非增殖性病变和小管间质病变[3]。Lyall[4]等报道, 子痫前期及子痫患者外周血中血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor, VEGF) 水平明显降低, 且随病情加重进一步下降, 故外周血中VEGF水平对判断子痫前期及子痫的发病及病情轻重有重要意义。该研究拟通过对妊娠蛋白尿患者尿沉渣及血清中VEGF的检测, 探讨尿沉渣成分谱分类作为判断妊娠蛋白尿患者病情的严重程度及预后的可行性。现分析2009年—2011年1月间在该院住院的妊高征患者87例的临床资料, 报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择在该院住院的妊高征患者87例作为实验对象, 尿蛋白量>0.5 g/d, 年龄19~41岁, 平均 (27.36±4.25) 岁;孕周28~41周, 平均 (36.36±3.72) 周。每位患者入院后避免活动, 充分休息后, 卧位测量右上臂收缩压和舒张压, 算出平均动脉压。

1.2 血生化指标及尿检查

留取血、尿等标本进行肝肾功能、24 h尿蛋白定量检查。肝肾功能采用全自动生化分析仪常规方法检测;24 h尿蛋白定量采用双缩脲法测定, 共检测3次, 取平均值。根据肌酐清除率Cockcroft公式:Ccr=[ (140-年龄) ×体重 (kg) ]/[0.818×Scr (umol/L) ] (女性计算结果×0.85) , Ccr<60 m L/min/1.73m2定义为肾功能不全。

1.3 尿沉渣检查

充分搅拌后取新鲜晨尿标本10 m L, 以1 500 r/min离心5 min, 弃去上清液, 留下尿沉渣0.2 m L, 混匀, 取20μL于载玻片上、18 mm×18 mm盖玻片, 置于位相差显微镜 (奥林巴斯BX53相差显微镜) 下辨认细胞、管型、晶体及微生物等。尿沉渣位相差显微镜检查由一位固定的技术人员进行检查, 每份标本低倍镜观察全片, 计数管型 (个/LP) , 高倍镜观察10个视野, 计数细胞 (个/HP) 。妊娠蛋白尿患者尿沉渣镜检通常可见以下成分: (1) 细胞:正型及变型红细胞、白细胞、肾小管上皮细胞、移行上皮细胞、鳞状上皮细胞等; (2) 管型:透明管型、透明管型中嵌入少量有核细胞、颗粒管型、细胞管型等; (3) 其他:结晶、微生物等。

1.4 尿沉渣谱整合分类

参考Fogazzi等[5]的研究结果改良, 在蛋白尿基础上, 根据尿沉渣的以下特征谱, 将患者分为3类, Ⅰ类:尿沉渣多细胞 (变形/混合型红细胞≥10/HP、中性粒细胞、单核细胞、上皮细胞, 不包括鳞状上皮细胞和移行上皮细胞) , 多管型 (红细胞管型、白细胞管型、颗粒管型等) 。Ⅱ类:尿沉渣少细胞 (红细胞<10/HP、无或偶见有核细胞、管型) 。Ⅲ类:少量尿蛋白 (尿蛋白<1.5 g/d) , 沉渣有或无肾小管上皮细胞及透明或颗粒管型。其中Ⅰ类、Ⅱ类患者尿蛋白量多少不定, 尿蛋白<1.5 g/d的患者根据尿沉渣情况可能分入上述3组中任何一组。

1.5 血清血管内皮生长因子 (VEGF) 检测

妊娠蛋白尿住院患者抽取静脉血3 m L, 分离血清, -20°冰箱保存, 待检。采用酶联免疫法, 对三类患者血清血管内皮生长因子 (VEGF) 进行浓度定量检测。ELISA试剂盒由美国Signosis公司提供。

1.6 三类妊娠蛋白尿患者临床指标的比较

根据检查结果, 3组患者的24 h尿蛋白定量、血浆白蛋白、肌酐清除率、平均动脉压及VEGF值进行对比。

1.7 随访

产后3个月三类患者尿蛋白持续阴性的比率。

1.8 统计方法

采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析, 计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 两组之间采用独立样本t检验进行比较, 计数资料采用χ2检验。

2 结果

2.1 根据尿沉渣整合分类患者分布情况

根据尿沉渣镜检, 87例患者中Ⅰ类、Ⅱ类、Ⅲ类患者分别有23例 (26.4%) , 14例 (16.1%) 及50例 (57.5%) 。

2.2 三类妊娠蛋白尿患者临床指标的比较

Ⅰ类妊娠蛋白尿患者24 h尿蛋白水平、平均动脉压较Ⅱ类、Ⅲ类增高, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 而血浆白蛋白、肌酐清除率 (ccr) 和VEGF水平均降低, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;Ⅲ类与Ⅱ类相比, 除血浆白蛋白水平外, 其余结果差异有统计学意义, 见表1。

2.3 随访结果

产后3个月, 23例Ⅰ类患者中有17列尿蛋白完全转阴, 14例Ⅱ类患者12例转阴, 50例Ⅲ类患者有48例转阴, 转阴率分别是73.9%、85.7%、96%, 两组间转阴率, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 提示Ⅰ类、Ⅱ类及Ⅲ类患者肾损害依次加重。

注:*P<0.05vsⅠ类;b P<0.05vsⅡ类;△P>0.05vsⅡ类。

3 讨论

泌尿系统是单向开放的管状结构, 生理或病理状态下, 肾小球滤过屏障脱落的细胞及滤过的物质, 肾小管脱落的细胞及分泌物、管道中形成的各种有形成分必然随尿液排出体外, 故有可能通过检测尿液的成分来研究肾损伤[6]。Waugh等研究报道蛋白尿的严重程度以24 h尿蛋白定量>0.5 g为标准, 能更好预测重度高血压、胎儿生长受限及早产[7]。蛋白尿、血肌酐水平升高、高血压被认为是肾脏病预后不良的危险因素, 其中尤以蛋白尿最为重要。VEGF是来源于胎盘的一类强大的促血管生长因子, 可以致内皮有丝分裂, 维持血管的正常状态和完整性。Lyall等[4]的报道子痫前期及子痫患者外周血中VEGF水平明显降低且随病情加重血VEGF有进一步下降的趋势, 说明血VEGF从一定程度上反映了病情的轻重, 对于临床检测子痫前期及子痫发病有一定实际意义。

从患者分布看, Ⅲ类患者最多, 与我们日常工作体会一致。从表中可以看出, 与Ⅱ类、Ⅲ类患者比较, 具有Ⅰ类尿沉渣特征的患者尿蛋白排出量大, 平均动脉压高, 其相应的血浆白蛋白、肌酐清除率及VEGF水平更低 (P<0.05) , 提示尿沉渣多细胞、多管型肾脏病变性质严重;与Ⅲ类患者比较, 具有Ⅱ类尿沉渣特征的患者除血浆白蛋白水平外 (P>0.05) , 其余检测值均有显著性差异 (P<0.05) , 提示当尿蛋白定量<1.5 g/d, 尿沉渣少时, 肾脏病变轻。与文献报道关于非妊娠患者尿沉渣的研究结果一致[8], 数量较多的畸形红细胞血尿和 (或) 管型尿, 意味着病变部位在肾小球, 反之则提示病变部位在肾间质小管。李惊子等研究结果[9], 非妊娠蛋白尿患者有22%左右的病例尿检未能反映肾脏病变的性质和程度, 这组病例主要是Ig A肾病;此结果可能部分解释患者产后3个月尿蛋白仍然不能完全转阴, 因该研究并没有排除肾小球疾病合并妊娠的情况。结合随访结果我们不难看出, Ⅰ类患者病情重, 预后差, 而Ⅱ类、Ⅲ类患者病情依次较轻, 预后较好。

尿沉渣成分是肾损伤过程中产生的各种脱落物及脱落物与尿中蛋白质融合的结果, 理论上讲肾脏不同部位损伤其脱落物不一样, 从而能从脱落物间接反映肾损伤部位, 其数量也能反映肾损伤程度。VEGF水平降低, 内皮细胞及血管的正常形态和完整性不能维持, 肾小球毛细血管内皮细胞肿胀, 肿胀导致的缺血缺氧改变, 改变严重时可能引起系膜细胞增生、基底膜断裂, 原尿中出现变形红细胞, 在引起子痫前期的免疫炎症等因素共同作用下, 可能导致足细胞损伤脱落[10]。理论上讲, 细胞脱落越多, 肾小球滤过屏障的损伤就越重, 尿中沉渣成分及蛋白量也应该越多[11,12]。由此, 观察尿中沉渣成分可以成为了解子痫前期患者肾损害的窗口。

该研究结果表明, 尿沉渣镜检所见的细胞和管型成分, 可反映妊娠期间肾损害。在妊娠合并蛋白尿患者中, 尿沉渣中出现多细胞, 多管型预示着病情严重及预后不良, 而少细胞少管型则标志着病情稳定。临床上可以通过最简单的显微镜镜检这一项无创性措施来判断妊娠蛋白尿患者病情轻重及预后。常规尿检沉渣分类方法只是初步的研究, 供临床医师参考。

参考文献

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[3]李惊子, 钱璐, 王芳, 等.50例急性肾衰竭患者尿沉渣镜检与肾活检病理对比分析[J].中华肾脏病杂志, 2007, 23 (7) :422-424.

[4]Lyall F, Greer IA, Boswell F, et al.Suppression of serum vascular endothelial growth factor immunoreactivity in normal pregnancy and in pre-eclampsia[J].Br J Obstet Gynaecol, 1997, 104 (2) :223-228.

[5]Fogazzi GB, Pirovano B.Urinalysis.In:Feehally J, Floege J, Johnson RJ.Comprehensive clinical nephrology[M].3rd ed.Philadelphia:Mosby, 2007:35-50.

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[7]Waugh J, Bell SC, Kilby MD, et al.Urine protein estimation in hypertensive:which thresholds and laboratory assay best predict clinical outcome[J].Hypertens Pregnancy, 2005, 24 (3) :291-302.

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[9]李惊子, 陈育青, 王素霞, 等.常规尿检整合分类作为肾病理损伤的标志物[J].北京大学学报:医学版, 2010, 42 (2) :169-172.

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整合蛋白 篇2

1 材料

APP血清1,7型,由Donahule教授惠赠;APP基因组文库,由杨建德等[2]构建;大肠杆菌(E.coli)感受态细胞DH5α、BL21(DE3)和 pET15b载体,购于Novagen生物工程公司;培养大肠杆菌的液体或固体LB培养基、培养APP的TSA及NAD培养基,购自普博欣公司; 用来拯救质粒的大肠杆菌XL-1 MRF’、SOLR和Helper phage,购自Stragene公司;Xhol Ⅰ、BamH Ⅰ、PvuⅡ、T4 DNA 连接酶、Taq酶,均购自上海生工生物工程技术服务有限公司; 4-氯-1-奈酚与邻苯二胺,购自Promega生物工程公司;猪APP康复期血清,由天津农学院预防兽医学实验室制备并保存;醋酸纤维膜、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔和兔抗猪IgG,购自普博欣公司;Talon试剂盒,购自Clonetech 公司。健康新西兰纯系白兔,购于天津实验动物中心。

2 方法

2.1 阳性克隆的筛选及纯化

参照Verma A等[3]的方法进行。具体方法如下:将滴定好的APP基因组文库在一个大的平皿上过夜;将0.025 mol/L的醋酸纤维膜贴在平皿表面,37 ℃作用2～4 h,使噬菌体表达的整合膜蛋白吸附到醋酸纤维膜上;取下醋酸纤维膜,用TBST洗3遍,每次10 min,加入4%脱脂奶粉封闭30 min;之后向该膜依次加入APP康复血清(1∶200)和辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG (1∶4 000)分别作用2 h,每步之间用TBST洗3遍;最后加入新配制的并用过氧化氢处理的4-氯-1-奈酚显色,根据膜上显色斑点选择平皿上的阳性噬菌体克隆;将每个噬菌体克隆纯化,重新用XL-1 MRF’按上述方法进一步纯化,直至醋酸纤维膜上的斑点出现的颜色一致,选择其中一个用于拯救质粒。

2.2 阳性克隆质粒的拯救

拯救方法按Helper phage试剂盒提供的方法及参照Verma A等[3]的方法进行。

2.3 质粒的酶切鉴定及测序

将获得的质粒用Pvu Ⅱ酶切鉴定,确定插入片段的大小,测序分析序列确定开放阅读框架(ORF)。

2.4 PCR扩增

以P1(5′- CACCTCGAGTCTTTAAGTGTCGGTATC -3)为5′引物、P2(5′- TATGGATCCTTAAGCCGTCATTTTTTT–3′)为3′引物(下划线部位分别为Xhol Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点),以拯救质粒为模板进行PCR扩增。反应条件:94 ℃预变性3 min;92 ℃变性1 min,57 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,共30个循环;72 ℃延伸10 min。

2.5 整合膜蛋白(IM)基因PCR产物的连接转化

由于PCR产物的两端含有酶切位点,将PCR产物及pET15b用XholⅠ和BamH Ⅰ酶切后回收,按载体与片段比为1∶3的比例进行连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。

2.6 重组质粒的筛选与鉴定

挑取若干个转化子,在3 mL LB液体培养基中培养12～16 h,质粒小量抽提后经1%琼脂糖凝胶电泳,根据DNA分子质量的大小初步筛选阳性质粒;取初步筛选的阳性质粒进行Xhol Ⅰ和BamH Ⅰ酶切,经1%琼脂糖凝胶电泳分析,进一步筛选阳性质粒;对重组质粒进行PCR,比较PCR产物与酶切产物的大小。

2.7 整合膜蛋白的表达

将鉴定为阳性的重组质粒载体转化至BL21 (DE3),在1 mmoL/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的诱导下表达,收集菌体。

2.8 表达蛋白的纯化

采用Talon试剂盒提纯融合蛋白。纯化的蛋白加等量1倍上样缓冲液于100 ℃煮5 min, SDS-PAGE电泳后染色观察。

2.9 Western-blot检测

取纯化的蛋白进行SDS-PAGE分析,将琼脂糖凝胶上的蛋白转印至醋酸纤维膜上,其余方法见2.1。

2.10 整合膜蛋白免疫血清的制备

取健康新西兰纯系白兔2只,以100 μg 重组IM并辅以完全佐剂皮下接种免疫,接种后第14,28天各加强免疫1次,第35天采血分离血清。

3 结果

3.1 整合膜蛋白基因的序列特征

筛选APP基因组文库,其中有2个克隆表达分子质量约为48 ku的蛋白。对拯救质粒进行测序发现,这2个克隆含有相同的开放阅读框,含有1 518个核苷酸,共编码506个氨基酸,序列见图1。经序列分析发现,该蛋白含有49个氨基酸的信号肽,分析结果见图2,预计成熟的蛋白分子质量为48.431 ku。

注:标有下划线的序列为信号肽。

3.2 整合膜蛋白基因的扩增

根据获得的整合膜蛋白基因序列设计PCR扩增引物P1和P2并进行PCR扩增,结果表明扩增的片段大小与预期(预期为1 365 bp)相符,见图3。

a, c. 蛋白质量标准;b. 纯化IM的 Western-blot 结果;d.SDS- PAGE结果; e.1 kb DNA Marker;f.IM 基因扩增产物;g. Xhol Ⅰ和 BamH Ⅰ酶切的重组质粒pET15b- IM。

3.3 重组表达质粒pET15b-IM构建及鉴定

将上一步获得的PCR产物及pET15b用限制性内切酶Xhol Ⅰ和BamH Ⅰ进行酶切,37 ℃ 4 h;经胶回收试剂盒回收后用T4 DNA连接酶连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞;挑取生长的部分菌落加到20 μL的去离子水中煮10 min,4 000 r/min离心5 min,取上清液用P1和P2进行PCR扩增重组质粒中的插入片段;挑取PCR阳性的菌落,摇菌过夜提取质粒,用Xhol Ⅰ和BamH Ⅰ进行酶切鉴定,得到大小约为1.3 kb的片段,见图3。将得到的含有目的片段的重组质粒命名为pET15b-IM。

3.4 表达产物的SDS-PAGE及Western-blot分析

用pET15b-IM质粒转化表达载体,再用1 mmol/L IPTG诱导,表达产物经Talon试剂盒纯化后得到特定的目的蛋白条带,SDS-PAGE分析显示其大小约48 ku,与预测的分子质量相符;Western-blot分析证实该蛋白与阳性血清反应,见图3。

3.5 整合膜蛋白的免疫原性分析

用不同浓度纯化的整合膜蛋白包被ELISA 板, 以制备的兔阳性血清为一抗(1∶100)、HRP标记的羊抗兔IgG (1∶4 000)为二抗分析该蛋白的免疫原性。ELISA结果显示:纯化的整合膜蛋白与兔阳性血清反应明显,当包被蛋白浓度为6 μg/mL时, OD490值达1.2, 随着包被蛋白浓度的降低,OD490 值逐渐下降;当包被蛋白浓度为0.5 μg/mL时, OD490值约为0.7,经分析适合的包被蛋白浓度为2 μg/mL;该蛋白与兔的阴性血清及空白对照反应时OD490值则均在0.3以下,表明该蛋白具有一定的免疫学活性,见图4。

4 讨论

(1)PCP是猪的主要呼吸道传染病之一,对养猪业危害极大[1] ,而其病原APP对许多抗生素易产生耐药性,因而预防该病主要依赖疫苗免疫。近年来,有关APP的研究集中在主要毒力因子的克隆与表达上,这些研究加深了人们对其主要毒力因子的了解。有学者分析了APP血清3型的基因组序列,为进一步研究APP致病的分子机制奠定了基础。

(2)研究筛选出蛋白的经过序列分析比较确定为整合膜蛋白,该蛋白可能是与细胞膜结合的一个膜蛋白,据推测可能为跨膜蛋白。跨膜蛋白与外膜蛋白可能有些不同,外膜蛋白在细胞的外侧,首先接触免疫系统,而整合膜蛋白可能只有细胞外部分接触免疫系统。在试验中发现,用整合膜蛋白免疫动物制备的血清ELISA效价要低于外膜蛋白[4],很可能暗示整合膜蛋白的免疫原性比外膜蛋白要弱。试验结果显示,整合膜蛋白具有一定的免疫原性,推测其可能介导部分保护性免疫反应,因此它具有发展成疫苗成分的可能性。研究首次克隆表达了APP的整合膜蛋白,为进一步研究APP的发病机理和其毒力因子的遗传演化关系及有效的免疫制剂提供了参考依据。

参考文献

[1]思汗,林旭埜,郝永清.猪传染性胸膜肺炎的研究进展[J].广东畜牧兽医科技,2007,32(3):6-9.

[2]杨建德,刘燕霏,徐军.猪胸膜肺炎放线杆菌基因组文库的构建[J].天津农学院学报,2008,15(3):1-3.

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整合蛋白 篇3

1 材料

pEGFP - N1 质粒、N1 - p Kap - 2s质粒,内蒙古生物制造重点实验室提供; att B基因、引物,生工生物工程( 上海) 股份有限公司生产。

限制性内切酶( AgeⅠ、NotⅠ、StuⅠ、Eco O109Ⅰ、AatⅡ、Ase Ⅰ、Bam H Ⅰ、Xho Ⅰ) ,宝生物工程( 大连)有限公司提供; 连接酶( Ligation High) ,Fermentas公司提供; 抗生素( 卡那霉素) ,北京华越洋生物科技有限公司提供; 感受态细胞( DH5α) ,北京全式金生物技术有限公司提供; 琼脂糖、核酸染料、质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒,天根生化科技( 北京) 有限公司提供。

恒温培养箱、低温冰箱、普通PCR仪( AB 2720) 、超微量紫外分光光度计,购自Thermo公司; 电热恒温水浴锅,购自Poly Science公司; 普通台式离心机,购自Sigma公司; 微量移液器,购自Eppendorf公司。

2 方法

2. 1 主要试剂和培养基的配制

LB液体培养基( 200 m L) : 酵母1 g ,蛋白胨2 g,氯化钠2 g,加纯化水定容至200 m L,调p H值为7. 0,灭菌,4 ℃保存。

LB固体培养基( 200 m L) : 酵母1 g ,蛋白胨2 g,氯化钠2 g,调p H值至7. 0,加琼脂3. 0 g,再加纯化水定容至200 m L,灭菌,4 ℃保存。

10 × TAE电泳缓冲液: Tris碱54 g,硼酸27. 5 g,二水合乙二胺四乙酸二钠3. 72 g,用纯水( 用焦碳酸二乙酯处理过) 定容至500 m L,室温保存。

2. 2 引物的设计( 序列见表1)

注: 方框部分为酶切位点,下画线部分为添加的Loxp序列。

2. 3 目的基因的体外扩增

2. 3. 1EGFP片段的扩增利用引物PF - G和PR - G,以p EGFP - N1 质粒为模板,采用PCR扩增EGFP片段,扩增后的EGFP片段上游含有Loxp序列,胶回收测定浓度,- 20 ℃保存,备用。

PCR反应体系: 模板p EGFP - N1 0. 3 μL( 788 ng /μL) ,10 mmol/L PF - G 2. 5 μL,10 mmol/L PR - G 2. 5 μL,5 × Buffer 10 μL,d NTP 5 μL,GXL DNA聚合酶0. 5 μL,用去离子水补至50 μL。

反应条件: 94 ℃ 5 min; 94 ℃ 1 min,60 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,共35 个循环; 72 ℃ 10 min。

2. 3. 2 Neo - HSV - TK - Poly A片段的扩增利用引物PF - K和PR - K,以p EGFP - N1 质粒为模板,PCR扩增Neo - HSV - TK - Poly A片段,扩增后的Neo - HSV - TK - Poly A片段下游含有与EGFP片段上游同向的Loxp序列,胶回收测定浓度,- 20 ℃ 保存,备用。

PCR反应体系: 模板p EGFP - N1 0. 3 μL( 788 ng /μL) ,10 mmol/L PF - K 2. 5 μL,10 mmol/L PR - K 2. 5 μL,5 × Buffer 10 μL,d NTP 5 μL,GXL DNA聚合酶0. 5 μL,用去离子水补至50 μL。

反应条件: 94 ℃ 5 min; 94 ℃ 1 min,60 ℃ 45 s,72 ℃ 90s,共35 个循环; 72 ℃ 10 min。

2. 3. 3CMV片段的扩增利用引物PF - CMV和PR - CMV,以p EGFP - N1 质粒为模板,PCR扩增CMV,胶回收测定浓度,- 20 ℃ 保存,备用。

PCR反应体系: 模板p EGFP - N1 0. 3 μL( 788 ng /μL) ,10 mmol/L PF - CMV 2. 5 μL,10 mmol / L PR - CMV 2. 5 μL,5 × Buffer 10 μL,d NTP5 μL,GXL DNA聚合酶0. 5 μL,用去离子水补至50 μL。

反应条件: 94 ℃ 5 min; 94 ℃ 1 min,59 ℃ 45 s,72 ℃ 45 s,共35 个循环; 72 ℃ 10 min。

2. 3. 4 Kap - 2s - Poly A片段的扩增利用PF - 2s和PR - 2s,以N1 - p Kap - 2s质粒为模板,PCR扩增Kap - 2s - Poly A片段,胶回收测浓度,- 20 ℃ 保存,备用。

PCR反应体系: 模板N1 - p Kap - 2s 0. 4 μL( 512 ng /μL) ,10 mmol/L PF - 2s 2. 5 μL,10 mmol/L PR - 2s 2. 5 μL,2 × GC Buffer 25 μL,d NTP 5 μL,LATaq DNA聚合酶0. 5 μL,用去离子水补至50 μL。

反应条件: 94 ℃ 5 min; 94 ℃ 1 min,56 ℃1 min,72 ℃ 150 s,共35 个循环; 72 ℃ 10 min。

2. 3. 5att B片段的合成att B( 301 bp) 基因由生工生物工程( 上海) 股份有限公司合成,合成时两端已添加AseⅠ酶切位点。

2. 4 p EGFP - N1 - 2s重组质粒的构建

2. 4. 1含有Loxp序列的EGFP基因片段与p EGFP -N1 质粒的连接EGFP基因片段经AgeⅠ和NotⅠ双酶切( 37 ℃ 1 h) ,琼脂糖凝胶电泳胶回收; p EGFP -N1 经AgeⅠ和NotⅠ37 ℃ 双酶切1 h,琼脂糖凝胶电泳胶回收,测定胶回收EGFP和p EGFP - N1 的浓度,16 ℃ 过夜连接。 连接体系: 34. 1 ng / μL EGFP4. 5 μL,20. 7 ng / μL p EGFP - N1 1. 5 μL,Solution Ⅰ6 μL。

转化: 连接产物转化感受态细胞( DH5α) ,冰浴30 min; 42 ℃ 热激45 s,再冰浴2 min; 加入500 m L室温的LB液体培养基,37 ℃、220 r/min摇床振荡1 h;将菌液4 000 r/min离心1 min; 弃上清液,留200 μL,然后混匀菌液,取100 μL涂在LB( 已加入卡那霉素)平板上,37 ℃倒置培养过夜。如果转化成功,次日平板上会长出菌落。挑取单菌落于LB( 已加入卡那霉素) 液体培养基中,37 ℃、220 r/min摇床振荡14 ~16 h,提取质粒并酶切鉴定,选择结果阳性的质粒送生工生物工程( 上海) 股份有限公司测序,测序正确的重组质粒命名为p EGFP - N1 - G。

2. 4. 2含有同向Loxp序列的Neo - HSV - TK -Poly A片段与p EGFP - N1 - G质粒的连接Neo -HSV - TK - Poly A片段经StuⅠ和Eco O109 Ⅰ双酶切( 37 ℃ 30 min) ,琼脂糖凝胶电泳胶回收; p EGFP -N1 - G经StuⅠ和Eco O109Ⅰ双酶切( 37 ℃ 30 min) ,琼脂糖凝胶电泳胶回收,分别测定浓度后,16 ℃ 过夜连接。连接体系: 30. 6 ng /μL Neo - HSV - TK -Poly A 5 μL,23. 2 ng / μL p EGFP - N1 1 μL,SolutionⅠ6 μL。

用同样方法进行转化,摇菌,提取质粒,酶切鉴定,结果阳性的送生工生物工程( 上海) 股份有限公司测序,测序正确的重组质粒命名为p EGFP -N1 - GK。

2. 4. 3p EGFP - N1 - GK质粒中启动子CMV的破坏和att B的连接将重组质粒p EGFP - N1 - GK进行AatⅡ单酶切( 37 ℃ 30 min) ,破坏原CMV片段,胶回收后测定浓度,16 ℃ 过夜连接。连接体系:56. 3 ng / μL p EGFP - N1 - GK 5 μL,去离子水1 μL,SolutionⅠ 6 μL。

用同样方法进行转化,并对破坏CMV后的重组质粒进行菌落PCR鉴定。

att B片段经AseⅠ单酶切( 37 ℃ 1 h) ,琼脂糖凝胶电泳胶回收; 将破坏CMV的重组质粒进行AseⅠ单酶切( 37 ℃ 1 h) ,琼脂糖凝胶电泳胶回收,分别测定浓度后,16 ℃ 过夜连接。连接体系: 2. 4 ng /μL att B 5 μL,46. 3 ng / μL重组质粒1 μL,Solution Ⅰ6 μL。

用同样方法进行转化、摇菌,提取质粒进行酶切鉴定,结果为阳性的重组质粒命名为p EGFP - N1 -att B。

2. 4. 4CMV片段与p EGFP - N1 - att B质粒的连接CMV片段经Bam HⅠ和AgeⅠ双酶切( 37 ℃ 1 h) ,琼脂糖凝胶电泳胶回收; 将上一步的重组质粒p EGFP - N1 - att B进行Bam H Ⅰ 和Age Ⅰ 双酶切( 37 ℃1 h) ,琼脂糖凝胶电泳胶回收,分别测定浓度后,16 ℃ 过夜连接。 连接体系: 18. 5 ng / μL CMV4. 5 μL,33. 6 ng / μL p EGFP - N1 - att B 1. 5 μL,SolutionⅠ 6 μL。

用同样方法进行转化,摇菌,提取质粒,送生工生物工程( 上海) 股份有限公司测序,测序结果正确的命名为p EGFP - N1 - att B - C。

2. 4. 5 Kap - 2s - Poly A片段与p EGFP - N1 - att B -C质粒的连接p EGFP - N1 - att B - C质粒进行XhoⅠ单酶切( 37 ℃ 30 min) ,琼脂糖凝胶电泳胶回收,测定浓度,采用无缝克隆法与Kap - 2s - Poly A片段50 ℃ 连接15 min。连接体系: 线性40 ng / μL p EGFP- N1 - att B - C 2 μL,80 ng / μL Kap - 2s - Poly A1 μL,5 × In - Fusion HD Enzyone Premix 2 μL,用去离子水补至10 μL。

用同样方法进行转化,摇菌,提取质粒,送生工生物工程( 上海) 股份有限公司测序,测序结果正确即为重组质粒p EGFP - N1 - 2s。

3 结果与分析

3. 1 目的基因的体外扩增

3. 1. 1 EGFP片段和Neo - HSV - TK - Poly A片段扩增结果将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,分别获得1,2 泳道1 300 bp左右的条带和3,4 泳道的770 bp左右的条带,均与Neo - HSV - TK - Poly A片段和EGFP片段大小相符( 见图1) ,表明目的基因的体外扩增成功。

M.DL-2 000 Marker;1~4.PCR产物。

3. 1. 2 CMV片段扩增结果将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,获得1,2 泳道600 bp左右的条带,与CMV片段大小相符( 见图2 ) ,表明目的基因的体外扩增成功。

3. 1. 3 Kap - 2s - Poly A片段扩增结果将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,获得1 泳道的2 300 bp左右的条带,与Kap - 2s - Poly A片段大小相符( 见图3) ,表明目的基因的体外扩增成功。

M． DL － 2 000 Marker; 1，2． PCＲ 产物。

M.DL-5 000 Marker;1.PCR产物。

3. 2 重组质粒的鉴定

3. 2. 1 p EGFP - N1 - G和p EGFP - N1 - GK质粒酶切鉴定将重组质粒p EGFP - N1 - G进行AgeⅠ和NotⅠ双酶切电泳,获得1 泳道770 bp左右的条带,大小与EGFP片段相符。将重组质粒p EGFP - N1 -GK进行StuⅠ和Eco O109Ⅰ双酶切电泳,获得2 泳道1 300 bp左右的条带,与Neo - HSV - TK - Poly A片段大小相符( 见图4) 。初步证明EGFP片段和Neo -HSV - TK - Poly A片段连接成功。

3. 2. 2 p EGFP - N1 - GK质粒测序鉴定重组质粒p EGFP - N1 - GK由生工生物工程( 上海) 股份有限公司测序,结果表明在EGFP起始密码子ATG上游和Neo - HSV - TK - Poly A下游均有Loxp的正确序列ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT。综上所述,两段同向的Loxp序列连接成功。

3. 2. 3 p EGFP - N1 - att B质粒酶切鉴定将重组质粒p EGFP - N1 - att B进行AseⅠ单酶切电泳,获得3,7 泳道的300 bp左右的条带,与att B片段大小吻合( 见图5) ,初步证明att B片段连接成功。

3. 2. 4p EGFP - N1 - att B - C质粒酶切鉴定将重组质粒p EGFP - N1 - att B - C进行Bam HⅠ和AgeⅠ双酶切电泳,获得1,2 泳道600 bp左右的条带,与目的片段CMV大小吻合( 见图6) ,初步证明CMV片段连接成功。

M． DL － 5 000 Marker; 1，2． 酶切产物。

M.DL-5 000 Marker;1~7.酶切产物。

M.DL-5 000 Marker;1,2.酶切产物。

3. 2. 5 p EGFP - N1 - att B - C质粒测序鉴定将重组质粒p EGFP - N1 - att B - C送至生工生物工程( 上海) 股份有限公司测序,测序结果证明att B和CMV连接成功。

3. 2. 6p EGFP - N1 - 2s质粒酶切鉴定将重组质粒p EGFP - N1 - 2s进行Xho Ⅰ 单酶切电泳,获得2 300 bp左右的条带,与目的片段大小吻合( 见图7) ,初步证明Kap - 2s - Poly A片段连接成功。

M.DL-5 000 Marker;1.酶切产物。

3. 2. 7 p EGFP - N1 - 2s质粒测序鉴定将重组质粒p EGFP - N1 - 2s送至生工生物工程( 上海) 股份有限公司测序,测序结果正确,证明p EGFP - N1 - 2s片段连接成功,可定点整合的无筛选标记拟蛛丝蛋白基因表达载体p EGFP - N1 - 2s构建成功,见286 页彩图8。

4 讨论

试验以Cre /Loxp［7］系统为基础去除筛选标记基因,在需要切除的基因两端分别添加同向的Loxp序列,转染细胞后,Cre穿肽膜可以识别Loxp序列并且切除其中间的标记基因,达到去除筛选标记的作用。

为了能够实现目的基因在细胞内的定点整合,试验采用了phi C31 整合酶系统,在构建的载体中添加att B位点,与phi C31 整合酶［8］共转染细胞,phi C31 整合酶可以介导att B［9］位点整合到细胞中的假attp位点上,从而达到了目的基因的定点整合。

试验还采用了无缝克隆［10］的技术连蛛丝蛋白基因与载体,无缝克隆( seamless cloning /in - fusion cloning)［11］区别于传统的PCR产物克隆,唯一的差异在于载体末端和引物末端具有15 ~ 20 个同源碱基,由此得到的PCR产物两端便分别带上了15 ~ 20 个与载体序列同源的碱基,依靠碱基间作用力互补配对成环,无需酶连即可直接用于转化宿主菌,进入宿主菌中的线性质粒( 环状) 依靠自身酶系将缺口修复。突破传统的双酶切再加上连接,只需要一步重组法,即可得到高效率克隆的重组载体。

此外,本研究旨在建立无筛选标记的转拟蛛丝蛋白基因的绵羊细胞系,为后续核移植生产无标记的转基因动物奠定基础［12］,所以前期需构建无筛选标记的拟蛛丝蛋白基因表达载体。

5 结论

试验构建的含Loxp序列、att B位点和拟蛛丝蛋白基因( 2s) 的p EGFP - N1 - 2s表达载体经PCR、酶切检测为阳性,测序正确,可以用于后续培养无筛选标记的转拟蛛丝蛋白基因的绵羊细胞系,为核移植提供安全的供体细胞。

摘要：为了构建可定点整合的无筛选标记的拟蛛丝蛋白基因表达载体,试验以p EGFP-N1为骨架载体,并采用PCR技术分别添加Loxp和att B片段,利用无缝克隆法将拟蛛丝蛋白基因(2s)连入质粒,经过转化、阳性克隆筛选、酶切及DNA测序鉴定。结果表明:PCR产物及酶切片段大小符合预期结果,测序结果与相应寡核苷酸序列一致。说明试验成功构建了可定点整合的无筛选标记拟蛛丝蛋白基因表达载体p EGFP-N1-2s,可用于无筛选标记的转基因供体细胞的构建。

整合蛋白 篇4

O PN是子宫-胎盘微环境的重要组成部分, 可能的作用如下: (1) 整个妊娠期子宫-胎盘表面黏附和信号转导的必需组成之一; (2) 由子宫基质产生促成子宫基质产生促成子宫内膜发生与孕体侵袭有关的蜕膜样转变; (3) 子宫和胎盘免疫细胞的产物, 可调节它们的活动和细胞因子的生成[4,11]。

新近发现, 胚胎上的整合素αvβ3通过R G D位点与子宫内膜上已被M M Ps水解的骨桥蛋白结合, 两者相互协调, 相互作用, 共同介导胚胎的植入[5]。另外, 骨桥蛋白与整合素β2同时表达于滋养细胞上, 在胚胎着床时, 它们与内膜上的整合素β3和骨桥蛋白起到相互补充的作用[6]。为进一步探讨骨桥蛋白 (O PN) 和整合素 (αvβ3) 在胚泡着床的机制, 我们在已建立的小鼠受孕模型基础上, 采用抗体中和技术, 将抗骨桥蛋白 (O PN) 抗体、抗整合素 (αvβ3) 抗体注射至妊娠小鼠子宫, 中和骨桥蛋白 (O PN) 和整合素 (αvβ3) , 探讨其对小鼠胚泡着床的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物

成年昆明小鼠20只, 4~6周年, 体重30 g, 雌、雄各半, 由中南大学实验动物中心提供。颗粒饲料喂养, 随意饮水, 室温22℃。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠PM SG和H C G处理和抗体注射

取成年昆明雌鼠10只, 体重约30 g, 腹腔注射PM SG 10u, 48 h后注射10 u H CG, 随后雌:雄小鼠1∶1合笼, 次日检查阴栓。发现阴栓计为1 d。将妊娠小鼠随机分成4个组:O PN抗体组、整合素β3组、生理盐水组, 正常妊娠对照组。于妊娠4 d, 在全身麻醉下实行子宫双侧手术, 分离小鼠子宫和输卵管, 从小鼠输卵管与子宫交界处方向分别注射抗骨桥蛋白 (O PN) 单克隆抗体、抗整合素 (β3) 单克隆抗体或生理盐水, 每只5μg。空白对照组未做任何处理。于手术后的8 d, 将用颈椎脱臼法处死, 迅速解剖, 检查子宫, 记录所有孕鼠数及每只孕鼠的胚泡数。

1.2.2 观察子宫内膜的形态结构

取3只小鼠, 在着床胚泡间取一段子宫标本。一部分用4%的福尔马林固定, 石蜡包埋切片, H E染色, 制组组织片, 光镜观察子宫内膜膜上皮细胞、间质的变化。

1.2.3 观察卵巢的形态结构

取3只小鼠, 将卵巢标准本4%福尔马林固定, 石蜡包埋, H E染色, 制作组织切片, 光镜观察卵巢黄体的变化。

1.2.4 反向免疫组化检测A b-O PN、A b-β3与子宫内膜O PN、β3结合

已脱蜡用于免疫组化检测的组织切片, 加数滴过氧化酶阻断剂, 完全覆盖组织点, 室温下孵育10 m in, PBS液冲洗3次, 每次3m in, 加数滴非免疫性动物血清, 室温下孵育10m in, 甩干, 依次加抗兔抗体 (1∶500) , 完全覆盖组织点, PBS液代替一抗作为阴性对照, PBS液冲洗3次, 每次3 m in, 依次加数滴生物素标记的驴抗兔二抗 (1∶1 000) 及数滴链亲和素一过氧化物酶, 完全覆盖组织点, 室温下孵育10 m in, PBS液冲洗3次, 每次3 m in, 加数滴新鲜配制的D A B液, 完全覆盖组织点, 镜下观察染色, 终止反应, 自来水冲洗, 苏木素浅染, 冲洗返蓝, 脱水透明封片。

1.3 统计学处理

全部统计学分析均采用SPSS 11.5统计软件进行分析。计量资料全部用均数±标准差 (x±s) 表示。计量资料的比较采用t检验。临床病理资料等计数资料分析采用χ2检验或Fisher精确概率法。免疫组化结果与临床病理资料的相关性分析采用Spearm an’s correlation coefficient分析。用K aplan-M eier法进行生存分析并绘制生存曲线。生存时间采用均数±标准差 (x±s) 表示。采用Log-rank检验比较生存率的差别。以α=0.05为检验水准 (双侧) , P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 Ab-OPN、Ab-β3对小鼠受孕胚泡着床数的影响

A b-O N P组10只小鼠有6只受孕, 受孕率为60%, 胚泡着床数在1~3间, 平均胚泡着床数为1.6±1.19, A b-β3组10只小鼠有7只受孕, 受孕率为70%, 胚泡着床数在1~3间, 平均胚泡着床数为1.7±1.28, 均低于生理盐水组 (10±1.63) 和正常对照组 (10.5±1.58) , P值均<0.05。表明注射A b-O PN和A b-β3严重影响小鼠卵泡的着床, O PN和整合素β3在小鼠受孕率和胚泡着床起重要作用。

2.2 受孕小鼠子宫内膜形态结构

子宫内膜形态结构表现为子宫内膜脱膜化。光镜下可见:间质脱膜化, 可见大片脱膜组织, 脱膜细胞核仁明显, 核分裂像多见。腺上皮细胞微绒毛密集, 胞质内含丰富的粗面内质网, 腺腔内含有丰富的分泌颗粒;间质疏松, 有散在的不规则排列的胶原纤维, 脱膜细胞散在排列, 形态不规则, 核清洗, 核仁明显, 核大, 染色疏松、均匀, 内质网扩张, 血管扩张, 充血。

2.3 反向免疫组化检测Ab-OPN、Ab-β3与子宫内膜OPN、β3结合

A b-O PN组和A b-β3组子宫组织切片免疫组化染色显示, 子宫内膜细胞上有明显棕色颗粒沉淀物, 而注射生理盐水组和正常对照组未见棕色颗粒沉淀物。这些棕色颗粒沉淀物可能就是实验注射A b-O PN、A b-β3, 这些抗体已于子宫内膜细胞上的骨桥蛋白O PN和整合素β3结合。提示通过手术注射入小鼠子宫的A b-O PN、A b-β3有效地干预了小鼠胚泡的着床。

3 讨论

妊娠的建立需要子宫内膜与胚胎细胞的相互识别, 在胚胎的着床过程中, 子宫内膜腺体分泌特定的多肽, 有助于建立和维持妊娠, 其中包括O PN和αvβ3。人类月经周期第19天内膜上皮细胞开始表达整合素, 与胚泡着床期相对应, 同时O PN由内膜腺上皮分泌到宫腔[13], 滋养层和种植前的胚泡上皮表面都表达αvβ3和O PN。αvβ3识别并结合R G D序列 (O PN及其他配体) , 参与细胞间的相互作用[12]。O PN有2个R G D依赖的结合位点, 故认为O PN是内膜与滋养层间的桥接分子[6]。容受性子宫内膜的一个形态特征就是胞饮突 (pinopode) 的出现。胞饮突的出现时间与“植入窗期”出现的时间相吻合。而且αvβ3特异的出现于胞饮突[7]。胞饮突作为子宫内膜容受性的形态学标志, 特异性表达αvβ3支持αvβ3作为子宫内膜容受性分子一说。

为进一步证实O PN和αvβ3在受孕过程的重要性, 明确其对受孕的影响。本课题在前期建立小鼠受孕模型以及明确O PN和αvβ3在妊娠过程表达规律, 采用手术的方式, 将O PN和αvβ3单克隆课题注入小鼠子宫角, 中和小鼠子宫腔内O PN和αvβ3, 观察小鼠受孕的情况。由于没有现成的抗αvβ3抗体, 实验人员采用了抗β3抗体来替代αvβ3抗体。结果发明, 注射O PN抗体和β3抗体组小鼠胚泡着床数都低于对照组。在此基础上, 进一步明确注射入子宫的O PN抗体和β3抗体是否与宫腔内的O PN和β3结合, 实验人员采用抗O PN抗体和β3抗体的抗抗体进行免疫组化验证。免疫组化的结果表明, O PN抗体和β3抗体与O PN和β3有效地结合。这提示O PN抗体和β3抗体与宫腔内的O PN和β3结合, 从而导致小鼠胚泡的有效着床。李英等[15]体外研究整合素α5对小鼠胚泡着床的影响, 发现A b-α5在体外有效阻断小鼠胚泡的着床。梁虹等[16]将A b-α5直接注射到小鼠子宫, 发现A b-α5在体内中和α5有效阻断小鼠胚泡的着床。这表明O PN和αvβ3在受孕过程中起重要作用。

αvβ3整合素识别含三种氨基酸序列 (R G D) 的细胞外基质配体, 该序列在滋养细胞附着和生长中起作用[8]。研究发现, 大鼠阻断整合素或 (和) 配体结合可减少着床, 可能的作用包括胚胎携带信号通过纤粘连蛋白 (FN) 启动或刺激胚胎或胎盘滋养细胞的侵袭性显型[9]。在多各细胞类型中, O PN通过结合αvβ3调节细胞黏附[9,10]。人子宫内膜和滋养细胞类型中, O PN可能通过与多种整合素结合调节细胞粘附。而细胞的增殖只有通过O PN与αvβ3的结合[9,10]。

有研究表明, 骨桥蛋白和整合素β3共表达于狒狒、小鼠、免等的围种植窗内膜腺上皮、蜕膜化的基质细胞以及下在入侵内膜的胚泡细胞滋养层中[4], 骨桥蛋白是内膜上皮细胞中黏附分子的作用底物, 这种上皮细胞中表达整合素β3, 它以一种依赖R G D序列的作用方式怀骨桥蛋白结合, 将细胞外部信息传递到细胞内部, 引起细胞内部结构变化, 同时还可以激发细胞内部第二信使钙离子的升高, 激活蛋白酶和磷酸酶等, 启动细胞外信号传导, 将信息传递到细胞核以调控基因表达, 从而影响细胞的增殖、分化及细胞行为[14]。此外, 胚泡表面的整合素β3也可通过认别R G D结构与内膜的骨桥蛋白特异性结合。两者的协调作用在胚泡着床过程中扮演了重要的角色[4]。

胚泡表面和子宫内膜表面的整合素作为O PN有受体, 与O PN结合, 从而使胚泡向子宫膜黏附。在“植入窗期”, 子宫内膜表面整合素因为得到甾体激素和一系列细胞因子、生长因子的调控, 表达增加, 亲和力提高, 使子宫内膜达到最大容受状态。同时, 胚泡滋养层细胞表面同样表达整合素分子。两者都与O PN结合。这样就形成了一个识别复合物:O PN处于两整合素分子之间, 介导了胚泡与子宫内膜的交互对话, 要达到这种条件, 子宫内膜处于最大容受性状态与胚泡发育的同步是成功妊娠的必要条件。

参考文献