载体蛋白（共9篇）
载体蛋白 篇1
木聚糖 (Xylan) 是植物半维素的主要成份, 它是复杂的低分子质量的多糖, 由β-D-木糖残基通过β-1, 4键连接成的主链和携带的各种取代基组成[1]。木聚糖是自然界中主要的可再生有机资源[2], 但长期以来得不到充分的重视和利用, 造成极大的浪费。现在, 借助微生物代谢已成为降解利用木聚糖的重要工具, 木聚糖酶已被应用到造纸工业、食品加工、饲料、生物转化等行业领域。实现木聚糖酶商业化的必要条件是获得大量表达木聚糖酶的微生物菌株。重组DNA技术为蛋白质产量的提高提供了技术手段, 现已有上百种来自细菌和真菌等微生物的木聚糖酶基因被克隆出来并成功地在多种原核和真核表达系统中表达。
已将β-1, 4-内切木聚糖酶xynⅢ基因成功地连接到原核表达载体p ET20b (+) (分子量为3716bp) 和p ET21a (+) (分子量为5443bp) 上, 并转化入大肠杆菌 (Escherichia coli) BL21 (DE3) 。为了确定xynⅢ基因在哪个载体中更能高效表达, 本实验对其作了研究比较。
1材料与方法
1.1材料
(1) 菌株与载体大肠杆菌 (Escherichia coli) BL21 (DE3) 为实验室保藏菌种。p ET20b (+) 和p ET21a (+) 为Novagen公司产品。
(2) 主要试剂胰蛋白胨 (Tryptone) , 酵母抽提物 (Yeast Extract) , 琼脂糖 (Agarose) , 牛血清蛋白, 桦木木聚糖等生化试剂均为Ta Ka Ra产品;氨苄青霉素Amp购自创生公司, DNA分子量Marker (DL2000、λHindⅢ) 购自Ta Ka Ra公司, 蛋白质分子量Marker购自宝赛公司, 氢氧化钠、氯化钠等普通试剂为分析纯。
(3) 主要仪器SK18型高速冷冻离心机, Sectrophotometer ND-1000, JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎机, DYY-5型稳压稳流电泳仪, 衡温振荡培养箱, 紫外透射仪紫外分光光度计。
1.2方法
1.2.1质粒的提取
(1) 挑取含有重组质粒p ET21a (+) -xynⅢ和p ET20b (+) -xynⅢ的单克隆, 分别接种于10 ml含有100mg/m L Amp的LB液体培养基中, 37℃, 220 rpm, 摇床过夜培养。
(2) 用紫外分光光度仪检测菌体浓度显示均为2.2, 剩余菌液用碱裂解法提取质粒DNA, 并用Sectrophotometer ND-1000测其浓度。
1.2.2 PCR扩增xynⅢ, 并通过电泳检测扩增产物的亮度
分别以重组质粒p ET21a (+) -xynⅢ和p ET20b (+) -xynⅢ为模板对xynⅢ进行PCR扩增, PCR体系如下:
PCR程序:94℃3min;94℃30s, 52.8℃30s, 72℃40s, 15个循环;72℃7min。
1.2.3 SDS-PAGE电泳检测外源蛋白表达
(1) 挑取含有重组质粒和含有空质粒p ET21a (+) /p ET20b (+) 的单克隆, 分别接种于3 ml含有50mg/m LAmp的LB液体培养基中, 37℃, 220 rpm, 摇床过夜培养。
(2) 取上述过夜培养物以1/100的比例转接入含50 mg/m L Amp的LB液体培养基中, 37℃, 220rpm, 培养2-3h (OD值达到0.6-0.8) , 加入IPTG于30℃条件下诱导培养6 h。
(3) 分别取IPGT诱导前和诱导后的菌液样品l ml, 收集菌体, 用30 u L的PBS缓冲液 (p H7.2) 重悬细胞沉淀, 再加入6×SDS-PAGE buffer, 混匀后100℃煮沸10 min, 离心取上清, 即可用于SDS-PAGE检测。
1.2.4蛋白含量测定
采用Bradford法测定蛋白浓度[3], 以牛血清蛋白作为标准蛋白。
蛋白浓度C= (91.69Y+2.743) /V
其中:C———蛋白浓度, 单位μg/μl;
Y———A595值;
V———加样体积, 单位μl。
2结果
2.1质粒浓度的测定结果
用Sectrophotometer ND-1000对提取的质粒测浓度。结果如表2。
由此可以看出:在菌体浓度相同的情况下, 分子量小的质粒对菌体细胞造成的负荷较小, 从而在细胞中的扩增倍数较多。
2.2PCR扩增xynⅢ的电泳检测结果
分别以质粒p ET21a (+) -xynⅢ和p ET20b (+) -xynⅢ为模板对xynⅢ进行PCR, 通过电泳检测 (如图1) 可以明显看出以p ET20b (+) -xynⅢ为模板扩增的基因产量高。足以说明在相同体积下p ET20b (+) -xynⅢ质粒浓度大。
2.3 p ET21a (+) -xynⅢ和p ET20b (+) -xynⅢ表达产物检测结果
以大肠杆菌的超声波破碎酶液为对照:将全细胞蛋白和超声波破碎细胞离心后得到的上清酶液进行SDS-PAGE检测, 如图2所示, 有明显的外源蛋白产物条带出现;p ET20b (+) -xynⅢ表达产物的条带明显比p ET21a (+) -xynⅢ表达产物的条带亮。
2.4蛋白含量的测定
在595nm下, 用紫外分光光度仪测两种重组菌的酶液上清的吸光值, 得到表3的数据, 进而带入公式计算出各蛋白的浓度。明显看出p ET20b (+) -xynⅢ表达产物的量多于p ET21a (+) -xynⅢ表达产物的量。
3讨论
外源基因表达产量与细胞浓度和细胞表达产量呈正相关。单个细胞产量取决于:外源基因的拷贝数。本实验所选用的p ET20b (+) 载体因为其分子量小于p ET21a (+) 载体的分子量, 在细胞内进行扩增时对细胞造成的负荷会小一点, 所以p ET20b (+) 载体的拷贝数多于p ET21a (+) 载体的, 进而载体上所连接的外源基因的拷贝数也多, 因此外源基因的表达产量会相对的增多。
参考文献
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[2]何成新, 张厚瑞.木聚糖水解酶的研究进展[J].广西轻工业, 1998, 4:12-15.
[3]Bradford M.A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Proein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding[J].Anal Biochem, 1976, 72:248-254.
载体蛋白 篇2
构建人cyclin G2基因真核表达载体,进一步研究cyclin G2对体外培养细胞增殖的调节作用及可能的.调节机制.以人口腔癌前上皮细胞系POE4总RNA的反转录产物为模板,应用RT-PCR方法克隆cyclin G2基因cDNA,成功构建了真核表达载体pIRES-G2.应用脂质体介导的基因转染技术,以体外培养的肿瘤细胞系HeLa细胞和正常细胞系CV-1细胞作为受体细胞,进行转基因表达研究,发现cyclin G2高表达对体外培养细胞的增殖起明显抑制作用.应用p16INK4a、p21WAF1、p27KIP1三种周期蛋白依赖性激酶抑制因子的单克隆抗体对转基因的HeLa细胞进行免疫细胞化学研究,发现转染pIRES-G2的实验组细胞中,p21WAF1蛋白染色阳性细胞数明显多于转染空载体的对照组,平均光密度值高于对照组,两组间均有显著性差异(p<0.01),提示cyclin G2抑制细胞增殖作用可能是通过诱导p21WAF1的表达而实现.
作 者：田玉楼 刘洁 张学 TIAN Yu-lou LIU Jie ZHANG Xue 作者单位：田玉楼,TIAN Yu-lou(中国医科大学口腔医学院,沈阳,110002)
刘洁,LIU Jie(中国医科大学实验技术中心,沈阳,110001)
张学,ZHANG Xue(中国医科大学卫生部细胞生物学重点实验室,沈阳,110001)
铁蛋白轻链真核表达载体的构建 篇3
铁蛋白轻链(ferritin light chain,FTL)是组成细胞内铁蛋白复合体的重要亚基之一，可加速铁从亚铁氧化酶中心向铁核内的转移，提高铁蛋白结合铁的能力，对长期铁储存非常重要。它大部分位于细胞质中，极少量位于细胞外如血清和脑脊液中[1]。长久以来，人们对于胞质铁蛋白的研究始终围绕其在铁代谢过程中的作用，而对于它的其他功能，却知之甚微。目前，探索铁蛋白的新功能已经成为国际上的研究热点。
最近的研究表明，当细胞内氧化应激增高时，铁蛋白轻链能够与肿瘤抑制基因p53发生相互作用，进而诱导p53的表达[2];肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)能够诱导细胞内FTL蛋白的降解[3]，这些均说明FTL参与调节细胞内应激信号通路[4]。但详细的作用机制还有待进一步探索。本研究利用分子克隆技术构建带有Flag标签的小鼠FTL基因的真核表达载体，为进一步研究FTL在信号通路中的作用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
大肠杆菌DH5α、载体pc DNA3为作者实验室保存;小鼠腹腔巨噬细胞系RAW264.7购自中科院上海细胞库。
1.1.2 试剂
DNA凝胶回收试剂盒和高纯度质粒小提中量试剂盒均购自TIANGEN公司;d NTP、Taq DNA聚合酶、限制性内切酶Bam HⅠ、HindⅢ和T4DNA连接酶均购自Fermentas公司;NC膜购自Millipore公司;LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司;蛋白定量试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司;ECL发光液购自Pierce公司;FTL抗体购自Abcam公司;Flag抗体购自Sigma公司;β-actin抗体和HRP标记的二抗均购自杭州华安生物技术有限公司。
1.1.3 仪器
CO2培养箱(Thermo Fisher公司);酶标仪(Biotechnology)和多功能高速冷冻离心机(Eppendorf);PCR仪(ABI公司);小型垂直电泳转印系统(BIO-RAD公司);制冰机(SANYO公司);全自动数码凝胶成像分析系统(FUJIFILM公司);DYCP-31系列水平电泳仪(北京六一)等。
1.1.4 培养基
DMEM高糖培养基购自GIBCO公司;胎牛血清购自全氏金公司。
1.2 方法
1.2.1 引物设计与基因扩增
登录NCBI主页，在Pub Med的Gen Bank数据库中搜索找到小鼠FTL mRNA的序列(NM＿010240)。根据引物设计原则，设计一对特异性引物进行克隆(引物序列及各部分说明见图1)。按照图2设计的流程进行质粒构建。设计好的引物合成及测序鉴定委托上海生工生物工程技术服务有限公司。
利用Trizol试剂法提取总RNA。用M-MLV反转录试剂盒(Invitrogen)以总RNA为模板逆转录合成c DNA，具体流程参照试剂盒说明书进行。再以合成的c DNA为模板进行PCR扩增，反应按如下条件进行:95℃变性3 min,95℃30 s、57℃30 s、72℃45 s,35个循环，72℃延伸10 min。扩增产物以1.2%琼脂糖凝胶电泳分离并对其割胶纯化。
1.2.2 重组质粒的构建及酶切、测序鉴定
用HindⅢ和Bam HⅠ限制性内切酶分别对FTL基因的PCR产物和空载pc DNA3进行双酶切(37℃，6 h)。将全部30μl酶切产物在1.2%琼脂糖凝胶中电泳，使用DNA凝胶回收试剂盒割胶回收线性片段。将双酶切后回收的PCR产物与载体进行连接(22℃水浴过夜)。将连接产物转化感受态DH5α大肠杆菌，经青霉素筛选取阳性克隆。扩增后利用质粒提取试剂盒提取纯化重组质粒。
用HindⅢ和Bam HⅠ限制性内切酶对重组质粒pc DNA3-FTL-Flag进行双酶切(37℃，6 h)。然后将全部30μl酶切产物在1.2%琼脂糖凝胶中电泳，以PCR产物为对照，观察结果。并将重组质粒送上海生物工程有限公司进行DNA测序鉴定。
1.2.3 重组质粒表达产物的Western Blot鉴定
将处于对数生长期的小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7，以5×105的密度接种于6孔板，使用不含抗生素的培养基培养过夜。待细胞混合度为80%～90%时，利用脂质体LipofectamineTM2000将FTL重组质粒及其对照空质粒pc DNA3转染入RAW264.7细胞。
转染36 h后，裂解细胞，收取蛋白。测定浓度后，各取50μg蛋白进行12%的SDS-PAGE电泳分离。然后将蛋白转印到NC膜上(300 m A,1.5 h)。NC膜于5%脱脂奶粉中室温下封闭1 h。加入特异性的一抗(1∶1 000),4℃摇床轻摇过夜。采用TBST液漂洗膜3次，每次5 min。加入HRP标记的二抗(1∶5 000)，室温孵育1 h。再用TBST液漂洗膜3次，每次10min。加入ECL发光液显色后，用Fujifilm Las-4000观察并扫描图像。β-actin作为内参。
2 结果与分析
2.1 PCR扩增得到FTL基因
以逆转录合成获得的总c DNA为模板，特异性PCR扩增并经1.2%琼脂糖凝胶电泳，结果显示PCR产物片段为600bp左右，与预期的FTL基因外加两个Flag标签的编码大小一致(图3)。
M:DL2000 Marker;1:带有Flag序列的FTL基因片段。
M:DL2000 Marker;1:FTL gene fragment with Flag sequence.
2.2 获得正确重组质粒
用HindⅢ和Bam HⅠ限制性内切酶对重组质粒pc DNA3-FTL-Flag进行双酶切鉴定。结果显示重组质粒经双酶切后释放出条带的大小与PCR产物一致(图4)，说明PCR产物已经成功插入到真核表达载体pc DNA3中。测序分析表明，插入质粒表达载体中的DNA片段与预测相符合。获得FTL重组质粒。
2.3 重组质粒表达出正确大小的FTL蛋白
提取转染了pc DNA3-FTL-Flag质粒及其对照细胞的蛋白后，经免疫印迹检测，发现在转染了pc DNA3-FTL-Flag的细胞中，带有Flag标签的FTL蛋白表达非常明显，并且使用FTL的本抗同样能够检测到Flag-FTL的表达(图5)。说明实验构建的带有Flag标签的FTL基因的真核表达载体pc D-NA3-FTL-Flag转染细胞后，不仅能够表达出FTL蛋白，而且Flag标签也能够表达，达到了预期目的。
3 讨论
铁是细胞生存必需的微量元素之一，铁缺乏导致人体的缺铁性贫血、儿童发育迟缓;但细胞内的铁过多则可诱发自由基增多，进而造成脂质、蛋白质、碳水化合物及核酸等生物大分子的损伤，最终导致细胞死亡[5]。铁蛋白对于保持细胞内的铁平衡至关重要。近些年的许多研究表明，铁蛋白除了具有储存铁的功能之外，还与许多其他疾病的发生密切相关，如肿瘤[6,7,8]、神经退行性疾病[9,10]、炎症[11,12]等。并且能够调节细胞内信号转导通路NF-κB途径[13]。因此，铁蛋白的功能值得进一步探索。
M:DL2000 Marker;1:PCR产物;2:双酶切产物。
M:DL2000 Marker;1:PCR product;2:Double restriction product.
1:转染pcDNA3对照组;2:转染pc DNA3-FTL-Flag组。
1:Control group;2:pc DNA3-FTL-Flag group.
蛋白标签(protein tag)一般是含有8个氨基酸的小肽，与目的蛋白融合表达后用于对目的蛋白表达的检测、示踪和纯化等。目前广泛应用于科研领域的标签包括Flag、His、Myc等。本文中使用的Flag标签具有24个碱基，其编码的氨基酸序列为:DYKDDDDK。本文在构建Flag-FTL真核表达载体时加入促进表达效率的Kozak序列(GCCACC)，使得FTL蛋白在真核表达系统中表达效率更高。我们还进行了过表达FTL蛋白的RAW264.7稳定细胞株的筛选工作，并得到了单克隆细胞株，为进一步研究FTL与细胞内大分子的相互作用奠定了基础。下一步将研究FTL是否通过与细胞内其他蛋白相互作用而发挥功能。
4 结论
在本研究中，我们获得了长度为552bp的FTL基因的c D-NA序列，并成功构建了带有Flag标签的FTL真核表达载体pc DNA3-FTL-Flag，将其转染入细胞后重组质粒能够表达出正确的蛋白。
摘要：目的:为进一步研究铁蛋白轻链(ferritin light chain,FTL)的表达对细胞内信号转导途径的影响提供平台。方法:利用PCR扩增技术得到小鼠552 bp的FTL基因编码序列,并在基因的C端引入Flag标签,将此序列插入到真核表达载体pcDNA3多克隆位点区域中限制性内切酶HindⅢ和BamHⅠ之间,得到带有Flag标签的FTL基因的真核表达载体pcDNA3-FTL-Flag。分别经酶切和测序鉴定。用脂质体lipofectamineTM2000将构建成功的pcDNA3-FTL-Flag及其对照空载体pcDNA3分别转染到RAW264.7细胞中,提取蛋白后利用Western blot方法检测细胞中带有Flag标签的FTL蛋白表达。结果:重组质粒酶切鉴定得到预期片段,测序结果显示所构建的小鼠FTL基因的cDNA序列正确,并在细胞内检测到分子量约为21kDa的蛋白的强烈表达信号。结论:实验成功构建小鼠FTL基因的真核表达载体pcDNA3-FTL-Flag。
载体蛋白 篇4
为了提高腺病毒载体用于基因治疗的靶向性,采用PCR和体外连接的方法构建了柯萨奇病毒-腺病毒受体(Coxsackie virus-Adenovirus Receptor)胞外段sCAR和表皮生长因子(Epidermal growth factor)EGF融合基因,然后将此融合基因插入穿梭质粒pDC315.利用Ad-MAX腺病毒系统,将重组质粒pDC315-sCAR-EGF与腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE13cre共同转染AD-293细胞,成功包装出一种复制缺陷型腺病毒Ad5-CMV-sCAR-EGF.经PCR鉴定该病毒含有sCAR-EGF融合基因片段,Western blotting证实该病毒能表达sCAR-EGF融合蛋白.体外试验证实该病毒感染细胞所产生的融合蛋白能够引导携带报告基因的腺病毒Ad5-CMV-luc高水平感染肿瘤细胞,为高水平表达EGFR的肿瘤的.靶向性基因治疗提供了新的手段.
作 者：任鹏康 王丰 李惠明 李宗海 黄倩 REN Peng-Kang WANG Feng LI Hui-Ming LI Zong-Hai HUANG Qian 作者单位：任鹏康,REN Peng-Kang(上海市第一人民医院中心实验室,上海,200080)
王丰,李惠明,黄倩,WANG Feng,LI Hui-Ming,HUANG Qian(上海交通大学附属第一人民医院中心实验室,上海,200080)
李宗海,LI Zong-Hai(上海交通大学肿瘤研究所癌基因及相关基因研究国家重点实验室,上海,200032)
载体蛋白 篇5
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质粒载体和细胞株
表达载体pc DNA3.1、大肠杆菌DH5α和BL21，均由本实验室保存。
1.1.2 工具酶及主要试剂
限制性内切酶Bam H I和EcoR I、Taq DNA聚合酶、反转录酶AMV、DNA片段纯化试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、T4连接酶，均购自Ta KaRa公司。其他试剂为进口或国产分析纯产品。
1.2 方法
1.2.1 引物的设计与合成
根据GenBank上发表的猪IP-10基因序列和相关文献报道设计一对引物，两端分别加酶切位点Bam HⅠ和Eco R I，由上海生工生物工程有限公司合成.上游引物：CGGGATCCATGAACCAAAGTGCT，下游引物：GGAATTCCTTATGCTTCTCTCTGTGTT (无终止密码子) 。
1.2.2 总RNA的提取和RT-PCR
使用Trizol试剂采用一步法从猪脾脏中提取总RNA[5]，并且使用特异性引物合成c DNA，采用RT-PCR方法扩增目的基因，反应条件为：95℃预变性7min, 94℃30s, 55℃30s, 72℃40s共30个循环，最后72℃延伸10min。
1.2.3 重组质粒的构建
IP-10基因的PCR产物经PCR产物纯化试剂盒纯化后，和表达载体pc DNA3.1用Bam HⅠ和EcoRⅠ双酶切，纯化回收载体pc DNA3.1与目的基因片段IP-10，然后按一定的比例在T4连接酶作用下，16℃连接反应过夜后，转化感受态大肠杆菌BL21，涂布于含氨苄青霉素LB固体培养基，37℃培养。挑取单克隆菌落扩增培养，提取重组p CDN3.1-IP-1质粒以备作鉴定。
1.2.4 重组质粒鉴定和测序
用上一步提取的重组质粒做模板进行PCR扩增鉴定以及用限制性内切酶Bam HⅠ和Eco RⅠ进行双酶切鉴定。将经鉴定为阳性克隆的重组质粒纯化后，送上海生物工程公司进行DNA序列测定，测序结果在www.ncbi.nlm.nih.gov网站中的GenBank中进行比对。
2 结果分析
2.1 猪IP-10 mRNA的RT-PCR扩增结果
取5µl PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳后，发现有1个300bp左右的条带，与预期的条带大小一致 (图1) 。
2.2 重组质粒p CDN3.1-IP-10的双酶切鉴定结果
重组质粒p CDN3.1-IP-10经Bam H I和Eco R I酶切，可切出5500bp和300bp大小条带，与预期大小一致 (图2) 。
2.3 猪IP-10基因序列比对
猪IP-10基因的序列测定及分析鉴定为阳性的菌株经大连宝生物公司双向测序后，得到猪IP-10基因序列 (图3) 。该基因全长312bp，编码104个氨基酸。将其与已发表猪IP-10基因序列相比，同源性为100%。
1:IP-10pcr产物2:positive control
1:pCDN3.1载体和IP-10片段
3 讨论
IP-10是1985年由Luster等用γ干扰素 (interferonγ，IFN-γ) 刺激淋巴细胞U937后用杂交的方法从cDNA文库中筛选出来的[6]，后来又在小鼠中发现了与IP-10同源性很高的基因，命名为C7/CRG。其N末端含有4个保守的半胱氨酸 (Cys) 残基，前两个半胱氨酸中被1个任意氨基酸分隔，是受体活化的重要区域。IP-10与血小板因子-4 (platelet factor-4, PF-4) 、白细胞介素8 (interleukin-8, IL-8) 具有30%同源性，故可首先预测它在炎症反应中发挥作用。研究表明，IP-10可趋化多种炎性细胞，包括T淋巴细胞、单核细胞和自然杀伤 (NK) 细胞等，而且它在效应T细胞的产生，抗肿瘤，抑制血管新生等方面也具有较强的生物活性，因此，对IP-10结构、功能及其生物活性的研究具有重要意义。
猪IP-10是一个包含104个氨基酸的分泌蛋白，前21个氨基酸构成信号肽，总分子量约为11kD。Yang克隆了编码猪IP-10的c DNA序列，发现它与人类、小鼠、山羊等哺乳动物的IP-10蛋白具有较高的相似性，其核心活性区域具有高度保守性[7]。Liu从不同品种猪的背长肌组织中克隆出IP-10基因并分析了其不同性[8]。本试验旨在研究猪重组IP-10蛋白的活性和趋化功能，目前已经成功扩增出了猪IP-10基因，并构建了猪IP-10蛋白重组真核表达质粒，为进一步研究其生物学活性及其应用奠定了基础。
摘要：根据GenBank上发表的猪IP-10蛋白的核苷酸序列设计并合成1对特异性引物, 采用RT-PCR方法扩增出目的片段, 将扩增产物连接到表达载体pcDNA3.1上, 进行序列测定和分析。结果表明, 所克隆的目的基因的核苷酸长为312bp, 共编码104个氨基酸。该基因片段与已发表的猪IP-10蛋白基因核苷酸序列同源性为100%, 氨基酸同源性为100%。本试验为重组猪IP-10蛋白的生产及功能研究奠定了基础。
关键词：猪IP-10蛋白,重组质粒,表达
参考文献
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载体蛋白 篇6
成纤维细胞灶的形成是IPF关键的病理改变,其主要效应细胞是成肌纤维细胞[6]。目前大多数学者认为,损伤的肺泡上皮细胞通过上皮细胞-间质转分化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)是肌纤维细胞的主要来源[6]。EMT的过程表现为上皮细胞标志物的消失,转而表达间质细胞标志蛋白α平滑肌肌动蛋白(αsmooth muscle actin,α-SMA)[7]。
α-SMA基因表达的异常激活与调控在肺泡上皮细胞向成肌纤维细胞转分化的过程中占有极为重要的地位,在EMT过程中细胞如何启动和调控α-SMA基因的表达尚未明了。为了探讨肺泡上皮α-SMA基因在肺纤维化微环境下的转录激活,本课题组构建了由α-SMA启动子驱动的红色荧光蛋白报告载体,并在肺泡上皮细胞中进行表达和定位。
1 材料与方法
1.1 试剂和仪器
人肺泡上皮细胞A549细胞株、大肠杆菌DH5α、VSMp8质粒(含小鼠α-SMA启动子序列)由本校实验室保存;质粒微量提取试剂盒、凝胶回收试剂盒(优晶公司);红色荧光蛋白报告质粒空载体pDs-Red(Clontech公司);限制性核酸内切酶(宝生物公司);Lipofactine 2000转染试剂(Invitrogen公司);重组人TGF-β1(R&D公司);倒置荧光显微镜(德国Leica公司);凝胶成像系统(美国Kodak公司)。
1.2 实验方法
1.2.1 α-SMA启动子红色荧光报告载体pDs-Red-SMAp的构建
已知α-SMA启动子区是插入在质粒VSMp8多克隆位点BamHⅠ和sphⅠ之间,用BamHⅠ和sphⅠ内切酶酶切VSMp8得到启动子序列,将其插入pGEM-7Zf质粒的BamHⅠ和sphⅠ位点之间;然后用BamHⅠ和ApaⅠ内切酶酶切再次得到α-SMA启动子序列;继而将启动子序列亚克隆于pDs-Red的BamHⅠ和ApaⅠ位点之间;最终得到重组质粒pDsRed-SMAp。重组子经BamHⅠ和ApaⅠ双酶切鉴定、测序鉴定无误后,扩增备用。
1.2.2 细胞培养
A549细胞株培养在含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基中,常规培养于5%的CO2、37℃人工培养箱。
1.2.3质粒转染
转染前1天,将A549细胞以1.5×104/mL细胞密度接种于24孔板,待24孔培养板中细胞融合至70%～80%时,依照Lipofectine 2000转染试剂的操作指南进行转染。
1.2.4 实验分组和TGF-β1刺激
实验分为4组,A组:转染对照空载体质粒pDsRed组;B组:转染对照空载体质粒pDsRed+TGF-β1组;C组:转染重组质粒pDsRed-SMAp组;D组:转染重组质粒pDsRed-SMAp+TGF-β1组。需用TGF-β1刺激的组,分别于转染后12 h加入终浓度为10μg/L的TGF-β1刺激4 h,在荧光显微镜下观察细胞内红色荧光蛋白表达。上述实验重复3次。
2 结果
2.1 pDsRed-SMAp重组载体的酶切鉴定
pDsRed-SMAp重组载体经BamHⅠ和ApaⅠ双酶切,凝胶电泳可见切出约4.1 kb和3.7 kb的两个片段,所得酶切片段与设计相符(图1)。
2.2 pDsRed-SMAp重组载体的测序鉴定
经上海生工生物工程有限公司T7通用引物测序,结果与预期序列完全一致,DNA序列和读码框完全正确。
2.3 pDsRed-SMAp红色荧光报告载体在上皮细胞中的表达
A组细胞转染红色荧光蛋白表达空载体质粒pDsRed,在荧光显微镜下该组肺泡细胞中未观察到红色荧光蛋白(图2A)。B组为转染了空载体质粒pDs-Red的细胞在TGF-β1刺激4 h以后,依然不能在荧光显微镜下观察到红色荧光(图2B)。C组细胞是转染α-SMA启动子驱动的红色荧光蛋白报告质粒pDsRed-SMAp,在镜下后可见到少量而微弱的红色荧光,但是表达荧光的细胞数量少,细胞呈颗粒状,缺少正常细胞形态(图2C)。D细胞在转染α-SMA启动子红色荧光报告载体12 h后加TGF-β1刺激4 h,在荧光显微镜下则可观察到细胞发出高亮度的红色荧光,表达红色荧光的细胞数量较多,细胞形态呈铺路石状贴壁生长,与正常的肺泡上皮细胞形态一致(图2D)。上述实验共重复3次,结果一致。
3 讨论
传统的观点认为特发性肺纤维化是由慢性炎症引起的,因此予以皮质激素和细胞毒性药物治疗IPF,可以抑制炎症造成的肺组织损伤,从而减轻和治疗肺纤维化[8,9]。但是临床治疗表明,使用糖皮质激素和细胞毒性抗炎治疗对于IPF无明确的疗效,并且许多确诊为IPF的病例中发现其病理组织炎性反应较轻微。近年来的研究表明,IPF的病理改变是由肺泡上皮细胞的损伤造成,反复的损伤刺激导致肺泡上皮细胞转分化为表达α-SMA的成肌纤维细胞,发生EMT。成肌纤维细胞由于其表达间质细胞标志物α-SMA,从而具有了收缩性,并且可以分泌大量的细胞外基质(ECM)沉积在肺组织中,成为IPF的主要效应细胞[10]。
TGF-β被认为是诱导器官纤维化(包括肺纤维化)的“总开关”,是促EMT作用最强的细胞因子,可以启动并完成整个EMT过程[10]。无论是离体实验或在体实验均证实,过表达的TGF-β能促进肺泡上皮细胞转分化,表达间质细胞标志蛋白α-SMA,加重肺纤维化[11,12,13]。因此,深入研究TGF-β诱导作用下上皮细胞α-SMA的分子调控机制对阐明IPF过程中肺泡上皮细胞发生EMT的病理机制非常重要。
红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)是海葵中分离出来的一种生物发光蛋白,能够在紫外线激发下发出红色荧光[14]。而本研究所采用的DsRed是Clontech公司商业化的一种低毒、低寡聚化及成熟快的红色荧光蛋白突变体[15]。由于荧光蛋白基因可以在未受任何损坏的活体细胞中检测其表达,DsRed被广泛地应用于报告基因的研究。报告基因技术是将一段顺式调控序列插入报告基因上游以控制报告基因的表达,从而直观地“报道”该顺式调控序列的表达调控以及与其相关信号转导通路的活动[16]。DsReD具有很高的消光系数和荧光量子产量,用作报告基因具有荧光亮度高的优势;DsReD发射荧光的强度要比罗丹明B等染料和最好的GFP突变体高得多;DsReD具有较强的抵御光漂白的能力;另外,DsReD对pH值不敏感,pH范围4.5～12时仍保持稳定,这使其使用范围更加广泛。同时,DsReD除了可在活体细胞连续观察的优点,较少受到外来荧光干扰,灵敏度与信噪比高[17]。
本研究构建的α-SMA启动子红色荧光报告载体pDsRed-SMAp是将α-SMA启动子序列插入红色荧光报告基因上游,通过紫外线激发检测红色荧光的强弱,从而示踪α-SMA启动子在活体细胞中的活化情况,对启动子的表达调控进行评估。本研究将成功构建的pDsRedSMAp重组质粒在人肺泡上皮细胞内进行转染后发现,在静息的上皮细胞可见到少量而微弱的红色荧光,但是表达荧光的细胞数量少,细胞呈颗粒状,缺少正常细胞形态,因此可以推测这些微弱的荧光并非由活体的上皮细胞发出,有可能是死亡细胞产生的非特异性荧光。说明在肺泡上皮细胞中缺乏α-SMA的表达,与既往研究结果一致。而在1 0 μg/L的TGF-β1刺激4 h后,可在荧光显微镜下观察到由α-SMA启动子驱动的红色荧光蛋白基因高水平表达,发出高亮度的红色荧光,表达红色荧光的细胞数量较多,细胞形态呈铺路石状贴壁生长,与正常的肺泡上皮细胞形态一致。表明在TGF-β1的刺激下诱导了α-SMA启动子活化,所构建的α-SMA启动子驱动的红色荧光报告基因系统具有完整的细胞内功能。
综上所述,本研究成功构建了α-SMA启动子红色荧光报告载体pDsRed-SMAp,具有稳定性好、荧光持续时间长、不破坏细胞结构及直接观察等优点,为研究肺纤维化EMT病理过程中α-SMA的基因调控提供了有效的工具。
摘要：目的 构建α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,为研究细胞内α-SMA的基因表达调控提供重要工具。方法 克隆并构建含α-SMA启动子区的红色荧光报告质粒pDsRed-SMAp;用脂质体瞬时转染上皮细胞A549,观察α-SMA启动子对转化生长因子(TGF-β1)刺激的反应。结果 酶切和DNA测序证明所构建的红色荧光蛋白报告基因载体是pDsRed-SMAp重组载体;该表达载体在上皮细胞静息状态下表达水平很低,经TGF-β1刺激后,在荧光显微镜下可看到高亮度的红色荧光。结论 成功构建了α-SMA启动子驱动的红色荧光蛋白报告质粒pDsRed-SMAp,对生理相关刺激有很好的反应,可有效地用于α-SMA基因表达调控机制的研究。
载体蛋白 篇7
面对越来越严重的水污染, 人们开始关注使用植物处理和改善污染水体, 其具有低成本、高环保等优点, 已成为研究重点[1,2]。研究表明, 植物在水质改善、对污水中氮磷吸收效果显著[3]。漂浮植物由于其具有生长迅速、易于收获、同时可收获生物资源、处理系统设计简单等优点, 近年来得到广泛研究和应用[4]。水花生具有很强的适应性[5], 它能生长在浅水中, 也能浮于水面。水花生对氮磷有较高的去除率, 对藻类也有明显的抑制作用[6,7]。但是, 严重污染水体中氧气的含量问题成为制约植物正常生长的一个环境因素, 如何解决这一问题? 获得在污染水体中生长的良好转基因植物是首选途径。
透明颤菌 ( V itreoscilla sp. ) 血红蛋白 ( VHb) 于20 世纪70年代在透明颤菌中发现, 是原核生物中发现的唯一的一种血红蛋白[8]。透明颤菌血红蛋白是一种氧调节、氧结合蛋白, 它在缺氧条件下能大量合成[9], 与氧结合力强。将透明颤菌血红蛋白应用于植物中, 不但能改善植物自身在水中的生长状况, 而且能使植物更好地发挥吸收污染物的作用, 进而提高改善水体的效果。
1 材料和方法
1. 1 材料
1. 1. 1 实验材料
透明颤菌 ( V itreoscilla sp. ) 血红蛋白菌株, 作者实验室保存; 大肠杆菌DH5α, 作者实验室保存; p3300 - super promoter- Tnos载体质粒, 由北京大学蛋白质工程与植物基因工程国家重点实验室提供。
1. 1. 2 试剂
Taq酶购自上海Sangon公司; DNA回收试剂盒购自博迈德生物公司; DNA提取试剂盒, 购自大连宝生物有限公司, 限制性内切酶XbaⅠ、限制性内切酶SacⅠ、T4DNA连接酶、buffer、Wide Range DNA Marker ( DL500 ~ 15000) 、琼脂糖、EB、购自大连宝生物有限公司; 其他试剂均为国产分析纯。
1. 1. 3 仪器
智能振荡培养箱BS - 1E, 金坛市文华科技实验仪器厂;恒温培养箱HPX -9082MBE, 上海博迅实业有限公司; 超净工作台SW - CJ -1D, 上海市青峰仪器设备有限公司; 立式离心机A14, Thermo; 低温高速离心机Z323K, HERMLE; PCR仪TC- 96, BIOER; 凝胶成像系统JY04S - 3C, 君意东方; 蒸汽灭菌锅BXM -30R, 上海博迅实业有限公司。
1. 2 方法
1. 2. 1 PCR克隆VHb
①PCR引物设计: 以透明颤菌血红蛋白基因组总DNA为模板, 根据毛自朝的VHb基因序列设计PCR引物[10], 为了便于下一步克隆试验, 在设计引物时, 插入XbaⅠ和SacⅠ酶切位点, 由上海生工生物技术服务有限公司合成:
P1: ACTCTAGACCATGGTAGACCAGCAA;
P2: AGGAGCTCTTATTCAACCGCTTG。
②PCR反应体系: 反应总体积为50μl, 模板DNA 5μl, 引物P1、P2 各2μl, 10 × 共用buffer 5μl, 20mmol/L dNTP 0. 5μl, Taq聚合酶0. 5μl, ddH2O 35μl补足。
③PCR扩增: 95℃, 6min; 95℃, 45s; 56℃, 45s; 72℃, 1min;35 个循环。
④PCR扩增产物测序: 将PCR产物送至北京三博远志测序部进行测序, 测序结果与NCBI上公布的VHb序列进行比对。
1. 2. 2 片断回收、质粒转化提取
①制备大肠杆菌DH5α 感受态、质粒转化和电泳按文献[11]方法进行。
②回收PCR产物和质粒, 按照DNA回收试剂盒提供的方法进行。
③按DNA提取试剂盒提供的方法进行质粒提取。
1. 2. 3 VHb鉴定
PCR反应结束后, 用1% 琼脂糖凝胶检测基因片段, 利用DNA胶回收试剂盒回收VHb基因片段, 送交北京三博远志测序部进行基因序列测定。测序结果在NCBI上进行BLAST比对。
1. 2. 4 水花生植物表达载体的构建
通过碱裂解法提取p3300 - super promoter - Tnos质粒, 并进行双酶切反应。双酶切反应体系: p3300 - super promoter -Tnos载体或VHb基因20μl, XbaⅠ和SacⅠ各0. 5μl, 10 × 共用buffer 5μl, 加ddH2O补足至50μl。30℃ 水浴锅中酶切2. 5h, 酶切后的产物用琼脂糖凝胶电泳进行分离和检测, 用回收试剂盒进行目的片断的回收。
然后进行p3300 - super promoter - Tnos与目的片段的连接反应。连接反应体系: 载体片段2μl, 基因片段6μl, T4DNA ligation buffer 1μl, T4DNA连接酶1μl, 16℃ 反应12h, 连接产物进行大肠杆菌转化实验。
分别进行XbaⅠ和SacⅠ、XbaⅠ和EcoRⅠ、HindⅢ和EcoRⅠ三组双酶切验证, 用琼脂糖凝胶电泳检测, 放于紫外凝胶成像仪中观察DNA条带。
2 结果与分析
2. 1 透明颤菌血红蛋白 ( VHb) 基因克隆
按照PCR扩增方法, 通过琼脂糖凝胶电泳检测, 基因组PCR扩增产物的大小约为0. 5kb, 结果如图1 所示, 与预期结果相符。
2. 2透明颤菌血红蛋白 ( VHb) 基因鉴定
将PCR产物测序, 测定出的序列结果在NCBI上利用BLAST进行比对, 与公布的VHb基因序列最大同源性达99% , 结果如图2所示。
M : DNA Marker DL2000; 1 : PCR 扩增 VHb 基因片段。M : DNA Marker DL2000; 1 : PCR amplification of VHb gene fragment.
2. 3 水花生植物表达载体的构建
通过对质粒p3300 - super promoter - Tnos与目的基因VHb片段的连接, 构建p3300 - vhb - super promoter - Tnos植物表达载体, 进行3 组双酶切验证, 结果如图3 所示。以重组载体为模板进行PCR验证, 其电泳结果如图4 所示, 获得长度约0. 5kb的片段, 与VHb基因片段长度一致。通过检测, 成功构建植物表达载体p3300 - vhb - super promoter - Tnos。
3 讨论
在生物工程菌构建中, 透明颤菌血红蛋白基因可以用来解决高密度培养的溶氧问题。人们已将其成功地应用在 α -淀粉酶、青霉素酰化酶、放线紫红菌素和酵母工程微生物工业生产中[12]。在转基因植物试验中, 转基因烟草种子在萌发速度和生长速度上, 明显快于对照组, 说明VHb在促进植物生长方面有重要作用[13]。对转基因矮牵牛进行持续淹水胁迫, 其耐淹水能力也优于对照组, 说明转基因植物表现出较强的低氧耐受能力[10]。
利用植物治理水体污染亦有不少报道, 菖蒲能够有效吸收水体中的Cd[14], 凤眼莲、槐叶萍在污染水体治理中多次应用[15], 菹草处理富营养化水体是比较合适的[16], 水花生在对氮磷的吸收要明显优于其他沉水植物, 本研究采用水花生作为植物材料, 通过生物技术手段可增大其净水能力[17]。
在本实验中, 应用super pomoter启动子, 能使VHb基因在植物中更加高效表达, 与35S启动子相比, 具有高效、快速表达的优点。同时, 引物两端插入酶切位点, 能高效、迅速、精准的构建植物表达载体[18]。
4 结论
M: DNA Marker DL15000; 1: XbaⅠ和 SacⅠ双酶切; 2: XbaⅠ和 EcoRⅠ 双酶切; 3: HindⅢ和 EcoRⅠ双酶切。M : DNA Marker DL15000; 1: XbaⅠand SacⅠdouble enzyme digestion; 2: XbaⅠand EcoRⅠdouble enzyme digestion; 3: HindⅢ and EcoRⅠdouble enzyme digestion.
以透明颤菌血红蛋白基因组DNA为模板, 克隆得到长度约为0. 5kb的VHb基因片段, 与NCBI上公布的VHb基因序列最大同源性达99%, 并成功构建植物表达载体p3300 - vhb -super promoter - Tnos。
摘要：透明颤菌血红蛋白是一种专性好氧的氧结合蛋白。目的:以VHb基因构建植物表达载体, 并在大肠杆菌中实现表达。方法:使利用试剂盒提取透明颤菌血红蛋白的总DNA, 以其为模板通过PCR克隆VHb基因。结果:克隆得到VHb基因片段的长度约为0.5kb, 与NCBI上公布的VHb基因序列最大同源性达99%。结论:通过酶切鉴定及PCR检测, 成功构建重组植物表达载体p3300-vhb-super promoter-Tnos。
载体蛋白 篇8
关键词：黄粉甲,抗冻蛋白,克隆,序列分析
抗冻蛋白 (AFP) 是一种能够降低溶液冰点而不影响其熔点的多肽, 其作用机制是抑制冰晶形成和冰的重结晶[1]。目前, 已经在鱼、昆虫、植物体、细菌和真菌体内发现多种抗冻蛋白[2]。在自然选择和平行进化作用下, 这些蛋白质结构呈现多样性[3,4]。
黄粉甲 (Tenebrio molitor ) 抗冻蛋白序列具有高度同源性, 都是由7, 8或10个氨基酸组成的重复单元 (TCTXSXXCXXAX) 构成的, 富含二硫键, 并且具有保守的TXT基序, 这在cDNA水平上也能得到证实[5]。昆虫抗冻蛋白一般在脂肪体内合成, 然后释放到血淋巴中通过氢键与冰晶连接, 阻止冰晶的进一步增长。由于抗冻蛋白具有阻碍冰晶生长而不破坏细胞的特点, 因而利用抗冻蛋白在低温条件下长期保存各种细胞、组织和器官, 特别在器官移植中可能具有很好的应用前景[6]。
目前, 国内对抗冻蛋白的研究相对较少, 尤其是基因工程研究。研究利用分子生物学的方法和技术, 克隆出了1个黄粉甲抗冻蛋白基因afp84b, 并且构建了表达重组质粒pMAL-c2X-afp84b, 为该基因的表达和蛋白结构的研究奠定了基础。该基因的发现也对研究该类系基因的进化和其家族的特征具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 黄粉甲
黄粉甲购自中国河南省南阳市。
1.1.2 菌株和质粒
大肠杆菌菌株JM109, 新乡医学院生命科学技术系实验室保存;TBI、表达载体pMAL-c2X, 均购自纽英纶 (北京) 生物技术有限公司;克隆载体pUCm-T载体, 购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
1.1.3 酶及主要试剂
RNA提取试剂盒、反转录酶M-MuLV、胶回收试剂盒、限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ、Taq DNA 聚合酶、T4DNA连接酶、DNA Ladder, 均购自上海生工生物工程技术服务有限公司;其他试剂均为国产或进口分析纯。
1.2 方法
1.2.1 黄粉甲总RNA的提取
挑取4 ℃低温诱导的幼虫, 参照上海生工生物工程技术服务有限公司总RNA提取试剂盒说明书进行黄粉甲脂肪体总RNA的提取。
1.2.2 目的基因的获得
根据GenBank中公布的黄粉甲抗冻蛋白的cDNA序列 (GenBank注册号分别是AF160494、AF159114、AF159115) 和相关引物设计原则设计1对引物:上游引物5′-TCGAATTCCAATGCACTGGTGGTGCTGATTGTA-3′;下游引物5′-GTGTCGACTTAATGTCCGGGACATCCTGTTG-3′。根据表达载体上的信息, 在上游引物和下游引物分别加上EcoRⅠ酶切位点和SalⅠ酶切位点基因的终止密码子TAA的互补碱基TTA。为了便于后续对该基因在大肠杆菌中表达的研究, 以及大肠杆菌稀有、高频密码子的利用, 把上游引物中的GGG改为GGT。
按照M-MuLV说明书进行cDNA第1条链的合成, 反转录反应条件为取总RNA 10 μL, Oligo (dT) 36 (A/G/C) 3 μL, 混合后70 ℃ 5 min;然后置于冰上, 依次加入5×Buffer 4 μL, 10 mmol/L dNTPs 1 μL, 37 ℃ 5 min;加入反转录酶 M-MulV 1 μL, 42 ℃ 1 h;终止反应 70 ℃ 10 min。然后进行PCR扩增, 反应条件:94 ℃预变性10 min;94 ℃变性60 s, 59 ℃退火60 s, 72 ℃延伸60 s, 共30个循环;72 ℃延伸10 min, 4 ℃保存。反应产物进行电泳检测。按胶回收试剂盒说明书回收目的片段。
1.2.3 克隆重组质粒pUCm-T-afp84b的构建
所用载体为上海生工生物工程技术服务有限公司的pUCm-T载体, 该载体专为PCR产物的克隆而设计, 具有氨苄西林抗性标记, 可以进行蓝白斑筛选, 便于进行酶切鉴定和测序。连接反应体系pUCm-T载体1 μL, 目的片段7 μL, 10×ligase Buffer 1 μL, T4 DNA连接酶1 μL, 16 ℃连接2 h, 用连接产物转化大肠杆菌JM109进行蓝白斑筛选。大肠杆菌感受态细胞的制备、连接产物的转化、质粒的提取及重组质粒的鉴定均按有关文献进行。
1.2.4 测序
吸取经PCR、双酶切等初步鉴定后的克隆菌1 mL, 送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。
1.2.5 多重序列的比对分析
用DNAMAN软件将该基因序列与GenBank注册号分别是AF160494、AF159114、AF159115的抗冻蛋白基因序列和氨基酸序列进行比对。
1.2.6 表达重组质粒pMAL-c2X-afp84b的构建
将克隆重组质粒pUCm-T-afp84b用EcoRⅠ 和SalⅠ双酶切, 与经同样双酶切的表达载体pMAL-c2X进行体外连接, 连接产物转化大肠杆菌TBI, 在氨苄西林的LB平板上筛选阳性重组子。
2 结果
2.1 RT-PCR检测
以反转录后的cDNA为模板进行PCR扩增。取PCR产物10 μL进行电泳检测, 结果可分辨出几条条带 (见图1) , 对比Ladder显示的分子质量可初步判断目的条带的大小, 在200～300 bp之间回收特异性亮带。
1.RT-PCR 产物; 2.100 bp DNA Ladder。
2.2 克隆重组质粒pUCm-T-afp84b的鉴定
用EcoRⅠ和SalⅠ限制性内切酶双酶切克隆重组质粒pUCm-T-afp84b与以克隆重组质粒pUCm-T-afp84b为模板进行PCR的产物及单酶切克隆重组质粒pUCm-T-afp84b, 同时进行电泳检测, 电泳结果见图2, PCR的产物与双酶切下的目的片段处于靠近300 bp的同一位置上, 并且单酶切后的质粒的分子质量与理论值一致, 且稍大于双酶切质粒的分子质量, 表明目的片段已连入克隆载体中, 克隆重组质粒的构建是成功的, 见图2。
1.1 000 bp DNA Ladder;2.经双酶切的克隆重组质粒;3.经EcoRⅠ单酶切的克隆重组质粒;4.克隆重组质粒PCR鉴定;5.100 bp DNA Ladder。
2.3 afp84b多重序列比对分析
2.3.1 核酸序列比对
用DNAMAN软件比对分析目的序列afp84b的测序序列和GenBank中已公布的编码84个氨基酸 (注册号分别是AF160494、AF159114、AF159115) 的黄粉甲afp基因序列, 见图3。
注:图中黑色部分表示同源性为100%, 灰色和下划线部分分别表示同源性为75%和50%。
AF159116、AF160494、AF159115是GenBank中已公布的编码84个氨基酸的黄粉甲抗冻蛋白基因序列, 图3中显示的黄粉甲抗冻蛋白基因afp84b序列与上述基因序列的同源性高达95.92%, 不同的碱基也处在序列的高变区, 与该类系基因同源性的特征相一致。
2.3.2 基因afp84b翻译的氨基酸序列比对分析
运用软件Primers 5.0, 由afp84b的核苷酸序列推测出该蛋白氨基酸序列, afp84b是编码72个成熟氨基酸的小肽, 其理论分子质量是9.2 ku, 将该氨基酸序列与其他几种抗冻蛋白序列进行比对分析, 见图4。
注:1, 2, 3, 4分别表示GenBank注册号为AF159114、AF160494、AF159115和DQ234056 (afp84b) 的抗冻蛋白cDNA编码的氨基酸序列。
由图4可知:这些抗冻蛋白氨基酸保守性非常高, 均含有由12个氨基酸组成的串联重复的TCTXSXXCXXAX序列, 而且都有多个Thr-Cys-Thr保守单元, 并且富含Cys, 图中该重复序列分别用下划线表示, 重复序列中高度保守的氨基酸由阴影标出。
2.4 表达重组质粒pMAL-c2X-afp84b的鉴定
用EcoRⅠ和SalⅠ限制性内切酶双酶切表达重组质粒pMAL-c2X-afp84b与以表达重组质粒pMAL-c2X-afp84b为模板进行PCR扩增的产物及单酶切表达重组质粒pMAL-c2X-afp84b, 同时进行电泳检测 (见图5) , 单酶切后的重组质粒分子质量大小与理论值相符且与双酶切后的质粒相比位置稍微靠后, 说明表达载体中含有外源片段。同时, PCR产物与双酶切下的目的片段处于靠近300 bp的同一位置上, 说明表达重组质粒的构建是成功的。
1.100 bp DNA Ladder; 2.表达重组质粒的PCR鉴定; 3.经双酶切的表达重组质粒; 4.经单酶切的重组表达质粒; 5.1 000 bp DNA Ladder。
3 讨论
黄粉甲抗冻蛋白的表达受时序和环境双重调控。末龄幼虫抗冻蛋白和mRNA的含量都很丰富;同时, 低温、缺水、饥饿等都能诱导抗冻蛋白基因的转录和表达[7]。通过对末龄幼虫4周的低温诱导, 提取抗冻蛋白mRNA含量丰富的总RNA, 从而保证了反转录PCR的成功, 进而为目的基因的克隆奠定基础。
目前, 报道的黄粉甲抗冻蛋白具有高度的同源性, 尤其是在编码成熟多肽基因序列的前端和末端保守性更强。并且编码的蛋白质富含Ser、Thr和 Cys, 试验根据黄粉甲抗冻蛋白高度同源性等特征并考虑到后续原核表达的需要, 根据大肠杆菌对密码子的偏爱性, 在设计引物时, 把1个稀有密码子GGG改为高频密码子GGT, 这对后续原核表达是很有利的。根据该类基因高度同源性的特征, 设计1对引物扩增出4条片段, 根据Ladder初步判断片段的大小, 进一步测序得到目的基因。
为了进一步对抗冻蛋白表达和结构进行研究, 又构建了表达重组质粒, 表达载体对外源基因的表达有着十分重要的影响, 所用表达载体pMAL-c2X呈中等大小, 有较高的拷贝数以确保得到很高的基因含量, 而且还能在宿主菌内稳定存在。另外, 该质粒对于表达含Cys且占总氨基酸1/6的抗冻蛋白来说是非常有利的, 这为后续的研究奠定了基础。
试验以地方品种为材料, 中国地方黄粉甲与报道的黄粉甲处于不同的生态环境中, 其抗冻蛋白保持了很高的种内同源性 (95.92%) , 但又有一定的异质性, 特别是与其中1个序列 (GenBank注册号为AF159114) 的同源性高达98.78%, 体现了生物的多样性, 符合分类学和遗传学规律。7个核苷酸变异造成的4个氨基酸的差异会对AFP抗冻活性造成多大影响, 主要取决于发生变异的氨基酸在AFP中的特定位置;根据目前对黄粉甲AFPs结构与功能的研究成果, 这4个氨基酸位于非保守位置, 不会对AFP抗冻活性造成本质的影响。但究竟会使抗冻活性上升还是下降, 将在后续试验中阐明。
参考文献
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[2] JACK A, HILL P G, DODD C E, et al. Demonstration of antifreeze protein activity in antarctic lake bacteria[J ]. Microbiology, 2004, 150:171-180.
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载体蛋白 篇9
1 材料
pEGFP - N1 质粒、N1 - p Kap - 2s质粒,内蒙古生物制造重点实验室提供; att B基因、引物,生工生物工程( 上海) 股份有限公司生产。
限制性内切酶( AgeⅠ、NotⅠ、StuⅠ、Eco O109Ⅰ、AatⅡ、Ase Ⅰ、Bam H Ⅰ、Xho Ⅰ) ,宝生物工程( 大连)有限公司提供; 连接酶( Ligation High) ,Fermentas公司提供; 抗生素( 卡那霉素) ,北京华越洋生物科技有限公司提供; 感受态细胞( DH5α) ,北京全式金生物技术有限公司提供; 琼脂糖、核酸染料、质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒,天根生化科技( 北京) 有限公司提供。
恒温培养箱、低温冰箱、普通PCR仪( AB 2720) 、超微量紫外分光光度计,购自Thermo公司; 电热恒温水浴锅,购自Poly Science公司; 普通台式离心机,购自Sigma公司; 微量移液器,购自Eppendorf公司。
2 方法
2. 1 主要试剂和培养基的配制
LB液体培养基( 200 m L) : 酵母1 g ,蛋白胨2 g,氯化钠2 g,加纯化水定容至200 m L,调p H值为7. 0,灭菌,4 ℃保存。
LB固体培养基( 200 m L) : 酵母1 g ,蛋白胨2 g,氯化钠2 g,调p H值至7. 0,加琼脂3. 0 g,再加纯化水定容至200 m L,灭菌,4 ℃保存。
10 × TAE电泳缓冲液: Tris碱54 g,硼酸27. 5 g,二水合乙二胺四乙酸二钠3. 72 g,用纯水( 用焦碳酸二乙酯处理过) 定容至500 m L,室温保存。
2. 2 引物的设计( 序列见表1)
注: 方框部分为酶切位点,下画线部分为添加的Loxp序列。
2. 3 目的基因的体外扩增
2. 3. 1EGFP片段的扩增利用引物PF - G和PR - G,以p EGFP - N1 质粒为模板,采用PCR扩增EGFP片段,扩增后的EGFP片段上游含有Loxp序列,胶回收测定浓度,- 20 ℃保存,备用。
PCR反应体系: 模板p EGFP - N1 0. 3 μL( 788 ng /μL) ,10 mmol/L PF - G 2. 5 μL,10 mmol/L PR - G 2. 5 μL,5 × Buffer 10 μL,d NTP 5 μL,GXL DNA聚合酶0. 5 μL,用去离子水补至50 μL。
反应条件: 94 ℃ 5 min; 94 ℃ 1 min,60 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,共35 个循环; 72 ℃ 10 min。
2. 3. 2 Neo - HSV - TK - Poly A片段的扩增利用引物PF - K和PR - K,以p EGFP - N1 质粒为模板,PCR扩增Neo - HSV - TK - Poly A片段,扩增后的Neo - HSV - TK - Poly A片段下游含有与EGFP片段上游同向的Loxp序列,胶回收测定浓度,- 20 ℃ 保存,备用。
PCR反应体系: 模板p EGFP - N1 0. 3 μL( 788 ng /μL) ,10 mmol/L PF - K 2. 5 μL,10 mmol/L PR - K 2. 5 μL,5 × Buffer 10 μL,d NTP 5 μL,GXL DNA聚合酶0. 5 μL,用去离子水补至50 μL。
反应条件: 94 ℃ 5 min; 94 ℃ 1 min,60 ℃ 45 s,72 ℃ 90s,共35 个循环; 72 ℃ 10 min。
2. 3. 3CMV片段的扩增利用引物PF - CMV和PR - CMV,以p EGFP - N1 质粒为模板,PCR扩增CMV,胶回收测定浓度,- 20 ℃ 保存,备用。
PCR反应体系: 模板p EGFP - N1 0. 3 μL( 788 ng /μL) ,10 mmol/L PF - CMV 2. 5 μL,10 mmol / L PR - CMV 2. 5 μL,5 × Buffer 10 μL,d NTP5 μL,GXL DNA聚合酶0. 5 μL,用去离子水补至50 μL。
反应条件: 94 ℃ 5 min; 94 ℃ 1 min,59 ℃ 45 s,72 ℃ 45 s,共35 个循环; 72 ℃ 10 min。
2. 3. 4 Kap - 2s - Poly A片段的扩增利用PF - 2s和PR - 2s,以N1 - p Kap - 2s质粒为模板,PCR扩增Kap - 2s - Poly A片段,胶回收测浓度,- 20 ℃ 保存,备用。
PCR反应体系: 模板N1 - p Kap - 2s 0. 4 μL( 512 ng /μL) ,10 mmol/L PF - 2s 2. 5 μL,10 mmol/L PR - 2s 2. 5 μL,2 × GC Buffer 25 μL,d NTP 5 μL,LATaq DNA聚合酶0. 5 μL,用去离子水补至50 μL。
反应条件: 94 ℃ 5 min; 94 ℃ 1 min,56 ℃1 min,72 ℃ 150 s,共35 个循环; 72 ℃ 10 min。
2. 3. 5att B片段的合成att B( 301 bp) 基因由生工生物工程( 上海) 股份有限公司合成,合成时两端已添加AseⅠ酶切位点。
2. 4 p EGFP - N1 - 2s重组质粒的构建
2. 4. 1含有Loxp序列的EGFP基因片段与p EGFP -N1 质粒的连接EGFP基因片段经AgeⅠ和NotⅠ双酶切( 37 ℃ 1 h) ,琼脂糖凝胶电泳胶回收; p EGFP -N1 经AgeⅠ和NotⅠ37 ℃ 双酶切1 h,琼脂糖凝胶电泳胶回收,测定胶回收EGFP和p EGFP - N1 的浓度,16 ℃ 过夜连接。 连接体系: 34. 1 ng / μL EGFP4. 5 μL,20. 7 ng / μL p EGFP - N1 1. 5 μL,Solution Ⅰ6 μL。
转化: 连接产物转化感受态细胞( DH5α) ,冰浴30 min; 42 ℃ 热激45 s,再冰浴2 min; 加入500 m L室温的LB液体培养基,37 ℃、220 r/min摇床振荡1 h;将菌液4 000 r/min离心1 min; 弃上清液,留200 μL,然后混匀菌液,取100 μL涂在LB( 已加入卡那霉素)平板上,37 ℃倒置培养过夜。如果转化成功,次日平板上会长出菌落。挑取单菌落于LB( 已加入卡那霉素) 液体培养基中,37 ℃、220 r/min摇床振荡14 ~16 h,提取质粒并酶切鉴定,选择结果阳性的质粒送生工生物工程( 上海) 股份有限公司测序,测序正确的重组质粒命名为p EGFP - N1 - G。
2. 4. 2含有同向Loxp序列的Neo - HSV - TK -Poly A片段与p EGFP - N1 - G质粒的连接Neo -HSV - TK - Poly A片段经StuⅠ和Eco O109 Ⅰ双酶切( 37 ℃ 30 min) ,琼脂糖凝胶电泳胶回收; p EGFP -N1 - G经StuⅠ和Eco O109Ⅰ双酶切( 37 ℃ 30 min) ,琼脂糖凝胶电泳胶回收,分别测定浓度后,16 ℃ 过夜连接。连接体系: 30. 6 ng /μL Neo - HSV - TK -Poly A 5 μL,23. 2 ng / μL p EGFP - N1 1 μL,SolutionⅠ6 μL。
用同样方法进行转化,摇菌,提取质粒,酶切鉴定,结果阳性的送生工生物工程( 上海) 股份有限公司测序,测序正确的重组质粒命名为p EGFP -N1 - GK。
2. 4. 3p EGFP - N1 - GK质粒中启动子CMV的破坏和att B的连接将重组质粒p EGFP - N1 - GK进行AatⅡ单酶切( 37 ℃ 30 min) ,破坏原CMV片段,胶回收后测定浓度,16 ℃ 过夜连接。连接体系:56. 3 ng / μL p EGFP - N1 - GK 5 μL,去离子水1 μL,SolutionⅠ 6 μL。
用同样方法进行转化,并对破坏CMV后的重组质粒进行菌落PCR鉴定。
att B片段经AseⅠ单酶切( 37 ℃ 1 h) ,琼脂糖凝胶电泳胶回收; 将破坏CMV的重组质粒进行AseⅠ单酶切( 37 ℃ 1 h) ,琼脂糖凝胶电泳胶回收,分别测定浓度后,16 ℃ 过夜连接。连接体系: 2. 4 ng /μL att B 5 μL,46. 3 ng / μL重组质粒1 μL,Solution Ⅰ6 μL。
用同样方法进行转化、摇菌,提取质粒进行酶切鉴定,结果为阳性的重组质粒命名为p EGFP - N1 -att B。
2. 4. 4CMV片段与p EGFP - N1 - att B质粒的连接CMV片段经Bam HⅠ和AgeⅠ双酶切( 37 ℃ 1 h) ,琼脂糖凝胶电泳胶回收; 将上一步的重组质粒p EGFP - N1 - att B进行Bam H Ⅰ 和Age Ⅰ 双酶切( 37 ℃1 h) ,琼脂糖凝胶电泳胶回收,分别测定浓度后,16 ℃ 过夜连接。 连接体系: 18. 5 ng / μL CMV4. 5 μL,33. 6 ng / μL p EGFP - N1 - att B 1. 5 μL,SolutionⅠ 6 μL。
用同样方法进行转化,摇菌,提取质粒,送生工生物工程( 上海) 股份有限公司测序,测序结果正确的命名为p EGFP - N1 - att B - C。
2. 4. 5 Kap - 2s - Poly A片段与p EGFP - N1 - att B -C质粒的连接p EGFP - N1 - att B - C质粒进行XhoⅠ单酶切( 37 ℃ 30 min) ,琼脂糖凝胶电泳胶回收,测定浓度,采用无缝克隆法与Kap - 2s - Poly A片段50 ℃ 连接15 min。连接体系: 线性40 ng / μL p EGFP- N1 - att B - C 2 μL,80 ng / μL Kap - 2s - Poly A1 μL,5 × In - Fusion HD Enzyone Premix 2 μL,用去离子水补至10 μL。
用同样方法进行转化,摇菌,提取质粒,送生工生物工程( 上海) 股份有限公司测序,测序结果正确即为重组质粒p EGFP - N1 - 2s。
3 结果与分析
3. 1 目的基因的体外扩增
3. 1. 1 EGFP片段和Neo - HSV - TK - Poly A片段扩增结果将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,分别获得1,2 泳道1 300 bp左右的条带和3,4 泳道的770 bp左右的条带,均与Neo - HSV - TK - Poly A片段和EGFP片段大小相符( 见图1) ,表明目的基因的体外扩增成功。
M.DL-2 000 Marker;1~4.PCR产物。
3. 1. 2 CMV片段扩增结果将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,获得1,2 泳道600 bp左右的条带,与CMV片段大小相符( 见图2 ) ,表明目的基因的体外扩增成功。
3. 1. 3 Kap - 2s - Poly A片段扩增结果将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,获得1 泳道的2 300 bp左右的条带,与Kap - 2s - Poly A片段大小相符( 见图3) ,表明目的基因的体外扩增成功。
M． DL － 2 000 Marker; 1，2． PCＲ 产物。
M.DL-5 000 Marker;1.PCR产物。
3. 2 重组质粒的鉴定
3. 2. 1 p EGFP - N1 - G和p EGFP - N1 - GK质粒酶切鉴定将重组质粒p EGFP - N1 - G进行AgeⅠ和NotⅠ双酶切电泳,获得1 泳道770 bp左右的条带,大小与EGFP片段相符。将重组质粒p EGFP - N1 -GK进行StuⅠ和Eco O109Ⅰ双酶切电泳,获得2 泳道1 300 bp左右的条带,与Neo - HSV - TK - Poly A片段大小相符( 见图4) 。初步证明EGFP片段和Neo -HSV - TK - Poly A片段连接成功。
3. 2. 2 p EGFP - N1 - GK质粒测序鉴定重组质粒p EGFP - N1 - GK由生工生物工程( 上海) 股份有限公司测序,结果表明在EGFP起始密码子ATG上游和Neo - HSV - TK - Poly A下游均有Loxp的正确序列ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT。综上所述,两段同向的Loxp序列连接成功。
3. 2. 3 p EGFP - N1 - att B质粒酶切鉴定将重组质粒p EGFP - N1 - att B进行AseⅠ单酶切电泳,获得3,7 泳道的300 bp左右的条带,与att B片段大小吻合( 见图5) ,初步证明att B片段连接成功。
3. 2. 4p EGFP - N1 - att B - C质粒酶切鉴定将重组质粒p EGFP - N1 - att B - C进行Bam HⅠ和AgeⅠ双酶切电泳,获得1,2 泳道600 bp左右的条带,与目的片段CMV大小吻合( 见图6) ,初步证明CMV片段连接成功。
M． DL － 5 000 Marker; 1，2． 酶切产物。
M.DL-5 000 Marker;1~7.酶切产物。
M.DL-5 000 Marker;1,2.酶切产物。
3. 2. 5 p EGFP - N1 - att B - C质粒测序鉴定将重组质粒p EGFP - N1 - att B - C送至生工生物工程( 上海) 股份有限公司测序,测序结果证明att B和CMV连接成功。
3. 2. 6p EGFP - N1 - 2s质粒酶切鉴定将重组质粒p EGFP - N1 - 2s进行Xho Ⅰ 单酶切电泳,获得2 300 bp左右的条带,与目的片段大小吻合( 见图7) ,初步证明Kap - 2s - Poly A片段连接成功。
M.DL-5 000 Marker;1.酶切产物。
3. 2. 7 p EGFP - N1 - 2s质粒测序鉴定将重组质粒p EGFP - N1 - 2s送至生工生物工程( 上海) 股份有限公司测序,测序结果正确,证明p EGFP - N1 - 2s片段连接成功,可定点整合的无筛选标记拟蛛丝蛋白基因表达载体p EGFP - N1 - 2s构建成功,见286 页彩图8。
4 讨论
试验以Cre /Loxp［7］系统为基础去除筛选标记基因,在需要切除的基因两端分别添加同向的Loxp序列,转染细胞后,Cre穿肽膜可以识别Loxp序列并且切除其中间的标记基因,达到去除筛选标记的作用。
为了能够实现目的基因在细胞内的定点整合,试验采用了phi C31 整合酶系统,在构建的载体中添加att B位点,与phi C31 整合酶［8］共转染细胞,phi C31 整合酶可以介导att B［9］位点整合到细胞中的假attp位点上,从而达到了目的基因的定点整合。
试验还采用了无缝克隆［10］的技术连蛛丝蛋白基因与载体,无缝克隆( seamless cloning /in - fusion cloning)［11］区别于传统的PCR产物克隆,唯一的差异在于载体末端和引物末端具有15 ~ 20 个同源碱基,由此得到的PCR产物两端便分别带上了15 ~ 20 个与载体序列同源的碱基,依靠碱基间作用力互补配对成环,无需酶连即可直接用于转化宿主菌,进入宿主菌中的线性质粒( 环状) 依靠自身酶系将缺口修复。突破传统的双酶切再加上连接,只需要一步重组法,即可得到高效率克隆的重组载体。
此外,本研究旨在建立无筛选标记的转拟蛛丝蛋白基因的绵羊细胞系,为后续核移植生产无标记的转基因动物奠定基础［12］,所以前期需构建无筛选标记的拟蛛丝蛋白基因表达载体。
5 结论
试验构建的含Loxp序列、att B位点和拟蛛丝蛋白基因( 2s) 的p EGFP - N1 - 2s表达载体经PCR、酶切检测为阳性,测序正确,可以用于后续培养无筛选标记的转拟蛛丝蛋白基因的绵羊细胞系,为核移植提供安全的供体细胞。
摘要：为了构建可定点整合的无筛选标记的拟蛛丝蛋白基因表达载体,试验以p EGFP-N1为骨架载体,并采用PCR技术分别添加Loxp和att B片段,利用无缝克隆法将拟蛛丝蛋白基因(2s)连入质粒,经过转化、阳性克隆筛选、酶切及DNA测序鉴定。结果表明:PCR产物及酶切片段大小符合预期结果,测序结果与相应寡核苷酸序列一致。说明试验成功构建了可定点整合的无筛选标记拟蛛丝蛋白基因表达载体p EGFP-N1-2s,可用于无筛选标记的转基因供体细胞的构建。