载体构建（共12篇）
载体构建 篇1
耐热DNA聚合酶引入PCR后, 使其操作大大简化, PCR自动化成为现实, 这使PCR技术迅速而广泛地应用于生命科学的诸多领域。其中Taq DNA聚合酶应用最为广泛。但是, 由于其具有非模板依赖型末端转移酶活性, 用该酶进行PCR反应后, 所产生的片段3’末端大部分突出一个A碱基[1,2]。T载体克隆PCR产物的方法[3,4]得到广泛应用。T载体是一种很方便的克隆载体, 因其3’末端带有突出的T碱基, 可直接与PCR扩增产物3’末端突出A碱基配对, 因此大大提高了PCR产物与载体的连接效率[5]。 然而, 常规商业化T载体造价昂贵, 实验成本高。基于构建T载体的原理及方法简单, 且常规实验室均有条件构建, 因此可以实验室自制T载体, 以降低使用成本。本文利用限制性内切酶EcoRV酶切质粒pcDNA3.1/V5-His产生一个平末端, 在Taq DNA聚合酶和dTTP的作用下, 得到3’末端突出一个T碱基的载体, 即T-vector。由于在pcDNA3.1/V5-His的多克隆位点EcoR V上游和下游分别具有BamHI与XhoI酶切位点, 可用这两个限制性内切酶来鉴定改造的T载体的连接效率。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌株与质粒
大肠杆菌菌株E· coli DH5α, 载体pcDNA3.1/V5-His, 均由本实验室保存。
1.1.2 酶与试剂
限制性内切酶EcoR V、Hind III、XhoⅠ, Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、dTTP、胶回收试剂盒均购自宝生物工程公司, 引物自行设计并交由上海生工公司合成。
1.2 实验方法
(1) 用EcoR V酶切质粒pcDNA3.1/V5-His 20 μL酶切体系 (EcoR V 1 μL、Buffer 2 μL、pcDNA3.1/V5-His 5 μL、ddH2O 12 μL) , 在37℃水浴酶切2～4 h。 (2) 胶回收纯化酶切后的线性载体从琼脂糖凝胶中回收DNA片段采用宝生物工程公司胶回收试剂盒进行, 具体方法如试剂盒说明书。 (3) 载体DNA 3’末端T连接。 在酶切的pcDNA3.1/V5-His DNA 3’末端连上T构建反应体系 (50 μL) : 10×PCR buffer 5 μL、MgCl21.5 mM (终浓度) 、dTTP 2mM (终浓度) 、Taq酶1 μL、最后加ddH2O至50 μL, 在72℃反应2 h。 (4) 载体 DNA片段的纯化。加入等体积酚/氯仿混匀, 放置数分钟, 5 000 r·min-1离心5 min, 使液体分层, 吸去酚/氯仿抽提水相至另一1.5 mL离心管中, 加入1/10体积的乙酸钠, 加2倍体积冷无水乙醇, 混匀。-20℃冰箱放置2 h, 15 000 r·min-1离心15 min。倾去乙醇, 加入70%冷乙醇淋洗。倾去乙醇, 滤纸吸干, 真空抽吸2～3 min。加入30 μL ddH2O, 溶解DNA。所得DNA即为改建的T载体。
1.3 改建的T载体连接效率鉴定
以本试验室保存的心肌锚定重复序列蛋白CARP cDNA为模板, PCR扩增基因片段 (约1 kb) , 取3 μLPCR产物和1 μL上述改建的T载体DNA建立10 μL的连接体系, 16℃连接过夜, 连接产物转化感受态DH5α, 涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上, 37℃培养过夜, 长出的菌落中随机挑取7个菌落, 培养后提取质粒后用Hind III 和XhoⅠ进行双酶切鉴定。
2 结果与讨论
以pcDNA3.1/V5-His为骨架载体, 利用限制性内切酶EcoRV得到平端化的线性载体, 在dTTP和Taq聚合酶作用下, 产生3’末端突出一个T碱基的T-载体。PCR 产物直接和T载体连接, 用常规氯化钙法制备的感受态菌转化, 对转化细胞提取质粒进行酶切鉴定。图1为目的基因PCR扩增, 目的基因PCR扩增的片段大小约1 kb, 与我们给定的基因大小相一致。图2为重组质粒双酶切凝胶电泳, 重组质粒DNA经双酶 切得到大、小两个片断, 小DNA片断为扩增的目的基因片段大小与图1PCR产物一致, 大片段即为经质粒pcDNA3.1/V5-His改建后的T克隆载体与试验给定的质粒大小相一致, 因此证明构建的T载体成功克隆了目的基因片断。构建的T-载体对PCR扩增的片段进行克隆, 在转化培养后长出的菌落随机挑取7个, 经酶切鉴定证实有5个为重组子, T-载体连接效率约达71%, 克隆效率较高, 说明此法构建T-载体简单有效。
1:PCR产物, M:Marker DL2000
1～7:质粒双酶切, M:Marker DL2000
TA克隆是一种快速的, 一步到位地把 PCR产物直接插入到质粒载体的方法。本实验进行了一种简单、高效, 可在普通实验室中制备并可反复扩增的T载体制备方法, 并经 PCR产物克隆, 酶切鉴定, 得到了非常理想的结果。
摘要：以pcDNA3.1/V5-His为骨架载体, 利用限制性内切酶EcoR V得到平端化的线性载体, 在dTTP和Taq聚合酶作用下, 产生3’末端突出一个T碱基的T-载体。目的基因与T-载体连接, 大肠杆菌转化, 提取质粒进行酶切鉴定, 结果表明构建的T-载体成功克隆了目的基因片段, T-载体构建成功。
关键词：T-载体,构建,克隆
参考文献
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载体构建 篇2
pSITITIN载体的构建及表达
目的构建能阻断Wistar大鼠肌联蛋白表达的siRNA载体,为研究骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)向心肌细胞分化的过程中肌小节结构蛋白之间的相互关系打下基础.方法针对Wistar大鼠TITIN N2B区设计并构建重组质粒pSITITIN,针对人β-ACTIN设计并构建重组质粒pSIACTIN,利用阳离子脂质体将其分别转染入体外培养1周的新生大鼠心肌细胞和经5-氮杂胞苷(5-azacytidine,5-aza)诱导后2周的`MSCs中,免疫荧光检测肌联蛋白的表达.结果重组质粒pSITITIN转染入正常心肌细胞和经5-aza处理后的MSCs后,肌联蛋白的表达均减弱(P<0.01);而转染pSIACTIN后不影响肌联蛋白的表达.结论 pSITITIN具有确切阻断肌联蛋白表达的效果.
作 者：张小飞 陈沅 田杰 ZHANG Xiao-fei CHEN Yuan TIAN Jie 作者单位：重庆医科大学儿童医院心血管内科,重庆,400014刊 名：第三军医大学学报 ISTIC PKU英文刊名：ACTA ACADEMIAE MEDICINAE MILITARIS TERTIAE年，卷(期)：28(7)分类号：Q782 R394-33 R394.2关键词：骨髓间充质干细胞 RNA干扰 肌联蛋白
载体构建 篇3
一、推行“小先生制”，有利于营造宽松活跃的课堂气氛
“小先生制”的教学模式打破了传统的“教师教，学生听”的教学模式，由他们身边熟悉的同学来当老师教他们，学生感到既新鲜又刺激，从而引起学生们极大的兴趣和关注。据我观察，学生们也更愿意主动地与他们的“小老师”配合交流，探索解决问题的方法，这样更容易营造一个轻松互动的学习氛围。我充分相信学生不仅能学，而且能教，在教学中大胆放手，尽量多地给学生提供当“小先生”的机会。三年级“How are you?”中，学习到How are you?以及回答，Fine，thank you./Not bad，thank you./Not so good，thank you.我同样运用了“小先生”，“Boys and girls，Now let’s play games and revise .Wouldyou liketobealittleteacher?”话音一落，学生纷纷举手，一个个“小先生”争相登台，各显身手，其中有自己表演，请同学起来操练对话的；有拿着句型卡片起来，一本正经地叫学生读：“You，please.Read after me”。还有针对同学的错误发音进行纠正机灵的“小先生”。几名“小先生”过后，全班同学不仅牢固掌握了所学句型，而且锻炼了在实际情景中使用的能力，体会到学英语的无穷乐趣。每位上台“小先生”按达到目标的质量、难易程度加1分或2分，他们也乐坏了，个个都要求争当“星级小先生”。
二、推行“小先生制”，有利于培养“小先生”思维创新能力
1.培养主动观察思考能力
英语是一门语言学科，“小先生”们在教学的过程中，能够养成细致入微的洞察能力以及及时分析、解决问题的能力，正是在解决问题的过程中“小先生”的思维得到激发，才能够积极主动地去观察去思考。传统的“老师讲，学生听”的教学模式，无论教师采用什么教学方法，学生学习的主体地位都未得到很好的体现。但“让学生自己当‘小先生’”，教学双方都是学生，在这样宽松自然的学习氛围下，教的一方会主动去学，学的一方也乐意去学、去问，双方配合默契，都能成为真正的学习主人，发挥学习的主体能动性。
2.培养主动实践创新能力
在这种教学模式下，“小先生”逐渐养成了在思考中主动实践的好习惯。主动实践的习惯也有助于培养学生的创新思维和动手能力。如，3B Unit5 Plus and Minus的教学内容是用英语进行20以内的加减运算，所涉及的数字13～19在构词上有一定的规律可循。于是，我在周五布置了一项争当“小先生”作业，让愿意当Unit5“小先生”的学生在周末时完成一份教案。再从教案中挑选两篇写得不错的教案，并让教案作者上台授课。
三、推行“小先生制”，有利于磨砺“小先生”的良好品质
1.耐心和细心品质的训练
三年级下学期是学写英语单词或句子的起始阶段，英语词句的书写要谨记“三要素”，这对低年级学生来说实在太困难了，“小先生”能准确亲授吗？我来到小组中间，疑虑很快打消了，每个“小先生”在完成自己的抄写任务后，拿着红笔，挨着组员的座位依次批改句子。看着“小先生”弯腰在每个组员耳边细声提示：“应该这样……”我相信每一位“小先生”都能耐心讲解，及时与学困生交流并加以指导。整个过程都磨砺了“小先生”的耐心和细心。
2.永不言败的意志力训练
教师一直被视为神圣的职业，同样，“小先生”也会遇到困难和问题，为了帮助同学得到进步，“小先生”牺牲自己的课余休息时间，把大部分时间投入到帮扶同学中。在课余，我每次路过教室总能发现三三两两围坐在一起讨论并解决问题。我相信“小先生”们一定能体会到了意志的力量，他们会逐渐变得坚强，变得富有毅力，变得具有钻研精神。
miR-16表达载体的构建 篇4
1 材料
pSuper质粒由武汉同济医院临床免疫室保存。E.coli DH5α感受态细胞、H e p G 2细胞由华中科技大学微生物系病毒实验室保存。T a q D N A聚合酶购自F e r m e n t a s公司。T r i z o l、Lipofectamine 2000为invitrogen公司产品。SYBR GreenⅠ、ECL试剂盒为Roche公司产品。M-mulv、DNase (RNase free) 为Promega公司产品。T4DNA连接酶、限制性内切酶、质粒抽提试剂盒、凝胶回收试剂盒、基因组DNA提取试剂盒为Takara公司产品。
2 实验
2.1 实验方法
(1) 设计PCR引物扩增hsa-miR-16的编码基因片段:从“The miRNA Registry” (MI0000070) 数据库中获得成熟的miRNA和PremiRNA序列, 通过Pre-miRNA序列获得Pri-miRNA序列, 以及成熟序列两侧约125nt的侧翼序列, 加上保护碱基和酶切位点。产物片段总长度为270bp。依据该序列设计引物, 引入PolyT (TTTTT) 和BamHI, SalI的酶切位点和保护碱基。引物由上海英骏生物公司合成。引物序列如下:上游引物 (命名为M16f1) 5'GCGGATCCAGCACATCATGGTTTACA 3’下游引物 (命名为M16r1) 5’GCGTCGACAAAAAATGTTACCTTAAAGGG 3’。
(2) 重组质粒PmiR-16的构建:使用Takara公司质粒抽提试剂盒提取 (HepG2) 细胞基因组DNA, 利用M16f1、M16r1引物进行PCR扩增, 反应条件:94℃4min, 94℃45s, 50℃45s, 72℃45s×30。将270bp目的片段切胶回收后用BamHI、SalI酶切, 获得目的基因。pSUPER经BglⅡ、SalI双酶切后回收线性化空载体。取1uL线性化载体, 与6uL的目的基因片段, 在T4连接酶作用下, 16℃连接过夜12h, 转化E.coli DH5α感受态细胞, 均匀涂于Amp (氨苄青霉素) +LB平皿上, 37℃培养过夜12h。随机挑取菌落小量培养, 直接用PCR鉴定和抽提质粒后用EcoRⅠ, SalⅠ酶切鉴定。酶切分析正确的克隆送上海英骏生物公司测序进一步证实。
2.2 实验结果
重组质粒PmiR-16的酶切鉴定, 证实重组质粒PmiR-16构建成功。见图1。酶切分析正确的克隆送上海英骏生物公司测序与the miRNA Registry的序列一致。
3 讨论
1993年Lee[3]等首次在线虫中发现, 基因Lin-4[4]通过转录生成的RNA调控虫体的发育过程。2000年研究人员又在线虫中发现Let-7基因[5], 这2种基因编码一类长度约为21nt的小分子RNA, 这种小分子RNA的长度很短而且作用时间也是暂时的, 所以开始被命名为stRNA (Small Temporal RNA) 。随后多个研究小组在线虫、果蝇、人类Hela细胞等多种真核细胞中发现近千个相似的小分子RNA, 并将这些小分子RNA统称为miRNA。miRNA是一种21～25nt的单链小分子RNA。它不编码蛋白质, 本身不具有开放阅读框 (OFR) 。miRNA在各个物种间具有高度的进化保守性。这种高度的物种间保守性可能与其功能有着密切的关系。miRNA作为一种新近发现的小分子RNA, 其在生物体内起着重要的作用。到目前为止, 已明确靶基因及确定功能的miRNA为数不多。研究表明在miRNA慢性淋巴细胞白血病中起到重要的作用[6], 但具体的作用机制还须进一步的试验证实。
目前较为常用的制备miRNAs的方法, 有体外制备miRNAs和以DNA为模板转染到细胞并在体内转录得到miRNAs。本实验采用了后一种方法, 本法简便, 不需要直接操作RNA, 克服了人工合成miRNA容易降解, 成本昂贵的缺点。而且由于含表达载体的菌株可长期保存并大量扩增, 为今后的研究提供了极大的方便。目前在病毒性疾病的治疗研究中, 可设计针对病毒基因组RNA的miRNAs或针对宿主细胞受体的miRNA来抗病毒, 现阶段已经开展了针对HBV、HCV、脊髓灰质炎病毒及HIV-1等研究, 已经取得一定的成果[7]。本试验成功构建了重组质粒PmiR-16, 将为进一步将miR-16作为基因靶向治疗药物打下分子生物学基础。
摘要：目的构建miR-16表达载体, 为研究miR-16对HBV的干扰作用打下基础。方法根据miRNA的成熟序列以及附近约100多碱基共270个碱基序列, 设计PCR引物, PCR扩增, 退火后用T4联接到线性化的pSUPER质粒中, 并对重组质粒 (命名为pmiR-16) 进行酶切及测序鉴定。结果成功构建了重组质粒PmiR-16。结论成功构建miR-16表达载体。
关键词：表达载体,microRNAs,miR-16
参考文献
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载体构建 篇5
推进课堂教学改革 构建素质教育载体
作者：刘丽娟 李建忠
来源：《现代教育科学·小学教师》2013年第01期
推进课堂教学改革，构建符合素质教育要求、有利于提高教学质量，有利于学生发展的课堂教学模式，是磐石市2011年以来的工作重点，现将一些做法和体会总结如下：
一、改革的背景与动因
素质教育国家已经提出了好多年，基础教育课程改革也进行了好多年，但实施素质教育的主阵地——课堂教学却没有发生多大变化，传统的“填鸭式”、“传授型”教学普遍存在，课堂仍然是教师表演的舞台，学生以被动接受为主，这样的课堂教学严重影响了学生的学习积极性，不利于教学质量和学生综合素质的提升。基于这一认识，市教育局把改革传统的课堂教学模式，促进教育内涵发展、构建素质教育的有效载体作为全市教学工作的重点。
二、改革的原则与步骤
1.考察学习，转变观念。2010年下半年，教育局组织全市一把校长分批到上海、江苏、山东等教育先进省市和学校进行考察，回来后召开座谈会谈学习体会，又邀请山东杜郎口中学专家专门为全市副校级以上领导做讲座，全市校级领导充分认识到了我们教育的差距，认识到了改革的必要性和可行性，为改革奠定了思想基础。
2.统一思想，明确方向。课堂教学改革是摸着石头过河，会遇到许多困难和问题，不但要树立信心，更要讲究科学和方法，因此我们在启动大会上首先明确了改革的方向和原则。第一，要坚持方向性原则。要坚持有利于提高教学质量、有利于学生能力培养、有利于提高学生综合素质、符合本校实际、符合素质教育要求；要由“传授型”向“互动型”转变，倡导自主学习、合作探究、因材施教，启发学生学思结合、知行统一，使课堂成为学生主动学习、学会学习的学堂；要关注学生不同特点和个性差异，努力发展不同学生的优势和潜能。
第二，要坚持客观性原则。由于各学校的情况不同，所以改革的着力点也不同。因此，在工作中必须坚持实事求是，一切要从客观实际出发，要排除一切主观偏见。
第三，要坚持科学性原则。从方案的制定到模式的构建，从方法手段到态度作风，都必须科学。要开展课改专题研究和校本研究，要通过对课改中关键问题、重要问题的研究解决，引领课改的方向。
第四，要坚持理论与实践相结合的原则。既要重视科学发展观、素质教育理论、新课程标准等理论对实践的指导作用，又要重视行动研究、教育实践对理论的提升作用，以理论促进实践，以实践提升理论。
第五，要坚持开放原则。要善于总结发现本校的好经验、好方法、好典型，并做好宣传；也要通过各种途径学习外面的好经验，实现资源共享。
3.典型带动，分步推进。2011年以来，各校都在积极地探索与实践。其中呼兰中心学校中学部的“三环六步”模式在2008年就开始了初步探索，中考成绩、学生综合素质大幅度提升，是我市课改的先行者。在加大指导力度、深度完善的基础上，2011年5月18日在呼兰召开了课堂教学模式改革研讨会，与会校长以呼兰为案例进行了深入的研讨，真正起到了把脉和交流的作用。
2011年11月，邀请昌乐二中专家团队就“271”模式从教学管理、课堂评价、小组建设、导学案编制等方面对我市业务校长进行了为期五天的系统培训，专家示范、剖析解读、教师会课、专家点评滚动进行，助跑式地带动了全市中小学课改的进程。
2012年9月，再次在呼兰中心学校召开现场会，跟踪、展示、研讨呼兰中小学课改情况，同时交流研讨其他学校的改革情况，推动了我市课堂教学改革的进一步深入。
三、取得的成果与体会
1.取得的初步成果：两年来，我市的教育教学悄然发生着变化。一是探索课堂教学新模式已成为教学的主旋律、学校的主要工作和教师的自觉行为。二是教师的角色正由课堂教学的主宰者向学生学习的引导者、帮助者转变。三是平等、民主、和谐的师生关系正在形成，自主、探究、合作、交流已成为教学的主要形式。四是校本教研的形式和内容更具有针对性和实效性。
2.获得的几点体会：
（1）深入学习、转变观念是前提。只有通过各层次的培训和学习，让领导和教师认识到改革的必要性和可行性，让他们从内心上认可，内化为自觉行为，这项工作才可能顺利地进行下去，因此转变观念是改革的前提。
（2）精细管理、持之以恒是保障。课堂教学的改革必然要带来管理方法和管理手段的改革，如何做到科学、规范、精细、严密的管理也是新的课题。这项工作如果不能坚持高质量，势必会影响教学质量，最后导致改革半途而废。
（3）坚持方向、务本求实是重点。每一种课堂教学模式都有着它那块土壤的适应性。因此，学校一定要结合本校的实际情况确定改革的方向和目标，进行有益的、可行的教学改革，要不唯模式，唯效果。
载体构建 篇6
关键词：创新教育；创新创业；实践
根据《教育部 财政部关于“十二五”期间实施“高等学校本科教学质量与教学改革工程”的意见》（教高〔2011〕6号）和《教育部关于批准实施“十二五”期间“高等学校本科教学质量与教学改革工程”2012年建设项目的通知》（教高函〔2012〕2号），教育部在“十二五”期间实施国家级大学生创新创业训练计划。几年来，我们在巩固已有的应用性、职业型、开放式人才培养成果的基础上，继续深化教育教学改革，以大学生创新创业项目为载体，构建了创新教育实践体系，创新了人才培养模式，强化了创新创业能力训练，增强了学生的创新能力和在创新基础上的创业能力。
一、制定和完善学生创新教育实践管理制度
一是学部主任和专业主任教授直接参与管理制度的制定，同时征求企业专家的意见，使制度完整规范，符合应用性人才培养方案的要求。二是学部主任和教学副主任直接负责管理创新教育实践教学指导团队的建设，并指定学部实验中心负责人参与管理团队实践项目的实施工作。三是由团总支、学生会和社团牵头组织学生成立科技创新协会，定期考核接纳一些思维敏捷，创新意识强，具备一定动手能力的学生加入到团队当中。根据不同专业要求配备指导教师。四是完善实验室管理制度，在不影响正常实验教学的前提下，为创新教育科技活动提供方便条件，各专业间建立设备共享机制，满足交叉学科之间项目实施的要求。五是加强校企合作，借助国家乳业工程技术研究中心平台，实现与行业、企业之间的资源共享，积极申报参与企业的横向课题研究，建立校企双赢互利的机制，在满足企业研发项目需要的基础上，实现应用性创新人才的培养。
二、构建“三原则、四层次、五阶段”项目带实践人才培养模式
创新教育实践内容必须符合“新颖，实用，高效”的原则，即团队在申报项目时，要本着创新的思维，注重项目的新颖性，为后续的项目实施提供良好的开端。
“四层次”要求学生按照自身的发展情况，逐层上升，每个学生可以自带题目或到创新教育实践指导团队选题目进行系统培训，团队将根据学生的基础知识和科技活动实践经验安排相应难度的项目，进行分层次培训，在规定的时间内完成项目后由指导教师进行考核并确定能否进入下一阶段的培训。其次，分阶段采取不同的措施引导学生逐步培养其创新素质。
“基础型”是指大一期间， 对学生边上基础文化课，边进行科研理论的训练，其内容包括资料的查阅、收集与整理，试验方案设计及实施、疑难分析报告、阶段性小结等提高学生的科技创新素质。“应用型”是指大二期间，通过建立科技创新协会，让学生根据自己的爱好和专业特点自愿参加，并以“科技讲座”“化学实验技能大赛等”为辅助，在教师的引导下逐步培养其创新素质和能力。“综合型”是指大三开始，根据学生的兴趣和某方面发展的潜力，通过科技立项为学生配备指导教师，组建稳定的学生科技创新团队，进行比较系统的指导和培训，全面提高学生的综合能力。“创新型”是通过对学生进行创新创业教育的培训，带领学生积极参加国家各类创新创业大赛，组织同学全程参与项目申报，项目实施和成果总结等环节，充分发挥学生的主观能动性，培养创新思维，积累各项成果，丰富实践经验，提高就业竞争力。
这一环节中我们采取“项目申请——技能培训——项目实施——成果申报——成果应用”五阶段项目带教学的培养方式开展创新教育创新实践活动。
一是积极参与各类大学生创新科技项目的申请工作。二是借助创新项目这一平台，安排专业指导教师对团队学生成员进行集中系统培训。采用交流讨论的方式，广泛的吸收采纳学生的创意和见解，制定切实可行的项目研究方案。三是项目实施过程中要求指导教师全程跟踪指导，及时解决实验过程中出现的各类问题，定期召开阶段性总结会议，参与不同项目研究的团队成员集体交流，分享经验和心得。同时设置中期考核环节，每个项目的负责人（学生）进行汇报，由学部主管领导和主任教授牵头对项目实施进行考查评价，提出改进意见。四是项目完成后，指导教师带领项目组成员总结成果，进行科技论文的撰写以及专利的申报工作。学部每年召开专门会议对已取得的成果进行汇报总结，对获奖的学生团队和指导教师进行表彰。五是重视项目成果的推广和应用。对于能够促进实践教学改革的成果，要求在学部各专业之间交流推广。对于来源于企业的创新项目，通过与企业的合作进行成果的转化和应用。
三、成立大学生创新教育实践指导团队
为了保证项目的顺利实施，学部成立项目指导教师团队，全程负责创新项目的指导、管理和监督工作。指导教师团队成员来自不同专业，各自发挥专业优势，实现专业知识的互补和共享。定期召开研讨会，交叉学科间进行交流，总结经验，讨论项目实施过程中的问题，研究解决方案。与企业技术人员保持相互联系，及时掌握行业企业急须解决的实际问题，开拓思路，为成果的转化奠定基础。建立指导教师团队考核评价制度，将创新教育实践创新成果作为一项重要内容，列入到班主任工作和年终述职考评实施方案中。设置加分政策，充分调动青年教师的参与积极性，促进“双师型”教师队伍的建设。
四、制定创新教育实践教学的保障措施
一是开放学部实验室，在不影响正常实验教学的前提下，最大限度地满足创新教育实践项目的实验要求。各专业实现仪器设备和实验材料的资源共享，为项目实施提供方便条件。二是成立项目指导教师团队，对学生进行全程指导。每个项目配备一名专业对口的主要负责教师，其他团队成员同样承担指导任务，学生可以随时咨询实验中遇到的各类问题。三是依托于专业硕士学位研究生授权点，充分利用联合乳品学院的“双导师”资源，为科技创新提供技术保障。四是鼓励指导教师将创新教育实践项目与自己的科研课题相联系，吸纳学生参与自已科研课题的应用研究。这样既满足了学生创新教育实践教学的需要，也分担了教师科研课题的研究任务。五是通过加强校企合作，借助乳品中心等企事业单位积极申报企业横向课题，申请企业研发项目资金，拓展项目来源。六是依托食品与环境工程学部省级重点学科和省级重点专业，加大对创新教育实践教学体系建设的投入，保证各类科技创新项目的顺利进行。
五、建立创新教育实践教学的评价方法
一是成立创新教育实践教学考核评价小组，由学部主任担任组长，对创新教育实践教学过程进行质量评价。二是设置项目开题，中期考核，项目总结汇报等环节，对科技创新项目进行跟踪检查。三是制定团队学生成员的评价指标，评价指标包括创新教育实践成绩、就业率、考研率和优秀毕业论文比率等。四是由创新教育实践教学考核评价小组对科技创新项目成果进行审核鉴定，根据成果的质量决定奖励的级别和加分权重。
经过探索与总结，我们初步形成较为完善的大学生创新教育实践体系，丰富了实践教学方法和教学手段，实现教学相长，提高了实践教学水平。对原有的“实验教学——生产实习——技能实训——就业实习——毕业设计五点一线”实践教学链进行了补充和延伸，加入了科技创新环节，实现了更加完整的“六点一线”实践教学体系。创新教育实践教学团队的教师通过对科技创新项目的指导，丰富了实践教学经验，对第一课堂的实践教学工作起到了巨大的推动作用。以科技创新项目为平台，启发了设计性实验教学的思路，优化了实践教学内容、丰富了实践教学手段、完善了实践教学考评体系。在项目研究过程中取得的部分成果可以直接应用于日常实践教学中，同时一些对基础实验设备的改进和创新型设计专利提高了实验效率，加速了实验教学仪器的更新。同时，通过科技创新项目的实施，开展与行业企业产学研深度合作，巩固促进了校内外实践基地的建设。
参考文献：
[1]黄宪怀，潘柳燕.浅谈高等学校的创新教育[J].广西高教研究，2001（2）：66～71.
[2]李德平.高校创新人才的培养与实践教学体系的构建[J].辽宁教育研究，2007（4）：75～77.
[3]李录平，张拥华，周健等.高等学校实践教育多维度理念探析[J].中国大学教学，2011（11）：83～86.
GAPB基因原核表达载体的构建 篇7
1 材料与方法
1.1 材料
哥伦比亚型拟南芥、大肠杆菌DH5α和BL21 (DE3) 由本实验室保存。胶回收试剂盒和质粒小量提取试剂盒购于上海华舜生物技术公司。PET28a (+) 质粒载体由四川大学遗传学重点实验室惠赠。所需引物由上海英俊生物技术有限公司合成。限制性内切酶Bam HI和Xho I、高保真酶Pfu以及T4 DNA连接酶购于MBI Ferments公司。
1.2 方法
1.2.1 拟南芥总RNA的提取
利用TRIZOL试剂盒提取哥伦比亚型拟南芥总RNA, 1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA产物。然后用反转录试剂盒将RNA反转合成c DNA, 作为扩增基因的模板。
1.2.2 引物的设计
利用Primer primer5.0根据GAPB的基因序列设计特异性引物, 引物含有Bam HI和Xho I酶切位点, 序列如下:
上游酶切位点为Bam HI, 下游酶切位点为Xho I, 引物由上海英俊公司合成。
1.2.3 PCR扩增和胶回收GAPB基因
以拟南芥c DNA为模板, 用PCR法扩增GAPB基因, 反应体系如下:10×PCR Buffer (含Mg Cl2) 2.5μL, (2.5 m M) d NTP 2μL, 上游引物 (F) 1μL, 下游引物 (R) 1μL, c DNA 0.5μL, Pfu酶0.2μL, dd H2O 17.8μL。PCR反应条件:94℃预变性3 min后进入以下循环, 94℃35 s, 59℃35 s, 72℃1 min30 s, 共进行30个循环, 最后72℃延伸10 min结束PCR反应, 扩增得到GAPB基因的全长。按胶回收试剂盒的说明回收GAPB基因片段。
1.2.4 PET28a (+) 质粒的提取
将PET28a (+) -DH5α菌株划线于含Kan的LB固体培养基中, 37℃培养过夜, 次日挑单菌落于含Kan的LB液体培养基中, 37℃培养过夜, 按照质粒小量抽提试剂盒说明书提取PET28a (+) 质粒。
1.2.5 目的基因和载体的双酶切
采用50μL酶切体系, 分别用Bam HI和Xho I双酶切PET28a (+) 载体和纯化的GAPB基因片段, 用胶回收试剂盒纯化回收酶切后的载体片段和基因片段, 取少量回收产物作1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.6 连接及重组质粒的转化
用T 4连接酶连接酶切纯化后的GA P B基因和PET28a (+) 载体片段, 连接体系为25μL, 16℃连接过夜。然后制备大肠杆菌DH5α感受态细胞, 将连接体系转化大肠杆菌DH5α。在转化时设置阳性和阴性对照, 阳性对照为未酶切的PET28a (+) 质粒, 用以检测转化效率;阴性对照为空的大肠杆菌感受态, 用以检测感受态细胞是否有污染。将转化产物涂布于含Kan的LB固体培养基中, 37℃过夜培养。
1.2.7 重组质粒阳性克隆的鉴定
在含有重组质粒的LB平板上随机挑取多个单菌落, 以其为模板分别作PCR扩增反应, 1%琼脂糖凝胶电泳检测是否有目的条带。同时将挑取的多个单菌落分别摇菌, 按质粒提取试剂盒的说明提取质粒, 并用Bam HI和Xho I双酶切质粒, 电泳检测酶切产物。
1.2.8 表达质粒的构建与鉴定
将双酶切鉴定正确的阳性克隆菌株送上海华大基因测序, 分析克隆基因的序列组成及其阅读框的正确性。测序正确后, 提取PET28a (+) -GAPB/DH5α阳性克隆的质粒, 将该质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3) 感受态细胞, 并挑取多个单菌落作PCR鉴定, 得到含有PET28a (+) -GAPB质粒的BL21 (DE3) 表达菌。
2 结果与分析
2.1 RNA纯度的测定
对提取的拟南芥总RNA进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测, 发现RNA产物条带清晰, 并且28S条带亮度是18S的2倍左右 (图1) 。紫外分光光度计分析显示, A260/A280=1.92, 表明获得的RNA纯度及浓度较高, 可以用于基因全长的扩增。
2.2 GAPB基因的扩增
利用设计的特异性引物作梯度PCR, 寻找扩增GAPB基因的最佳退火温度, 发现在59℃退火温度下, GAPB基因扩增的条带最好。电泳图 (图2) 显示大约在1344 bp左右有一目标条带, 说明已根据设计的引物克隆出所需要的基因片段。
2.3 PET28a (+) -GAPB重组质粒的PCR鉴定
选用PET28a载体上的T7上游引物与GAPB的下游引物配对, 进行菌落PCR筛选阳性克隆。通过1%的琼脂糖凝胶电泳检测, 大多数都得到与GAPB基因大小一致的片段 (图3) , 说明得到了重组质粒的阳性克隆。
2.4 PET28a (+) -GAPB重组质粒的双酶切鉴定
重组质粒经Bam HI和Xho I双酶切后出现2条带, 其中1条带大小约为1344 bp左右 (图4) , 与GAPB基因大小一致, 说明PET28a (+) -GAPB重组质粒构建正确。
2.5 转化BL21 (DE3) 重组质粒的鉴定
将重组质粒PET28a (+) -GAPB转化到大肠杆菌BL21 (DE3) 中, 经抗性筛选, 挑取单菌落, 作菌落PCR鉴定, 经1%的琼脂糖凝胶电泳检测到目的条带 (图5) , 说明转化成功。
3 讨论
在植物的糖酵解和糖异生途径中, 三磷酸-甘油醛脱氢酶 (GAPDH) 是关键酶, 参与糖酵解过程中第一个ATP的形成。由于GAPDH具有高度的保守性, 人们通过比较不同物种的该基因核酸序列和蛋白序列的异同, 对物种进行分类, 建立物种之间的系统发育关系[5]。在外界胁迫如热胁迫、渗透胁迫、缺氧胁迫或营养缺失条件下, 一些糖酵解相关基因的m RNA大量积累表达[6]。近年来, 有许多研究表明GAPDH基因的表达可能增强了植物抵抗胁迫的能力。Pillai等[7]将水稻幼苗进行干旱、淹没和脱落酸 (ABA) 处理, 结果表明GAPDH基因的转录水平显著提高。在植物中, 经H2O2诱导GAPDH的转录水平也可显著增加。Baek等[8]将GAPDH基因转化到拟南芥原生质体中, 发现该基因能强烈抑制热击时H2O2的产生和细胞的死亡。本研究以拟南芥c DNA为模板, 克隆出GAPB基因的全长, 并构建了原核表达载体PET28a (+) -GAPB, 为后续研究GAPB的功能提供了理论基础。
摘要：以拟南芥cDNA为模板, 用PCR扩增出GAPB的基因全长, 然后将GAPB基因片段连接到PET28a (+) 载体上, 构建重组质粒并转化大肠杆菌DH5α, 经菌落PCR和酶切鉴定筛选出阳性克隆, 测序正确后, 再将阳性克隆的质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3) 。结果表明:成功构建了原核表达载体PET28a (+) -GAPB, 为后续的GAPB融合蛋白的表达以及纯化奠定了基础。
关键词：GAPB,大肠杆菌BL21,PET28a (+) ,融合蛋白
参考文献
[1]李晓泽, 刘关君, 杨传平.西伯利亚蓼甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的cDNA克隆与序列分析[J].植物生理学通讯, 2007, 43 (1) :41-48.
[2]鲁国东, 郑学勤, 谢联辉.稻瘟病菌3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆及序列分析[J].热带作物学报, 1998, 19 (4) :83-89.
[3]朱华, 李珅, 赵瑞强, 等.三七植物GAPDH基因克隆及序列分析[J].西北植物学报, 2006, 26 (7) :1316-1319.
[4]刘志华, 杨谦.球毛壳菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因克隆及特性分析[J].微生物学报, 2005, 45 (6) :885-889.
[5]于丽丽, 高彩球, 王玉成, 等.柽柳甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的克隆和表达分析[J].东北林业大学学报, 20010, 38 (7) :105-108.
[6]Yin L.P., Sun T., Li W., et al.Analysis of iron deficiency-induced transcriptome and proteome in the rice roots and vesicular transport[J].Progress in Natural Science, 2004, 14 (5) :522-527.
[7]Pillai M A, Lihuang Z, Akiyama T.Molecular cloning, characterization, exp ression and chromosomal location of OsGAPDH, a submergence responsive gene in rice (Oryza sativa L.) [J].Theor Appl Genet, 2002, 105 (1) :34-42.
载体构建 篇8
关键词：银杏,CONSTANS基因,表达载体构建,转化
CONSTANS (CO) 基因属于光周期途径基因[1], 光周期是影响植物花发育的重要环境因[2], 在植物营养生长阶段, CO在叶和茎顶端开始表达, 它转录的mRNA呈渐进方式积累, 当达到一定域值时, 通过激活其下游靶基因使植物由营养生长向生殖发育转变, 开始植物花的发育[3]。CO影响植物的成花过程, 对花发育有直接和间接促进作用, 成花的早晚主要由CO基因所控制[4]。CO基因可以将光信号转换为开花信号传递给FLOWERING LOCUST (FT) 基因, 它和FT基因都是光周期途径中的关键基因[5,6,7]。
银杏 (Ginkgo biloba) 又名“公孙树”, 为我国独存的珍稀名贵树种, 广泛应用于园林景观、医药、食品、保健等领域;是一种童期特别长的中生代孑遗裸子植物。一般实生苗种植15-20年后才能开花结果, 这给银杏优良品种的选种带来了严重的障碍。
近年来, 通过植物基因工程技术对开花相关基因的遗传改造, 在缩短木本植物的童期研究中已经取得了一定成效。但有关CO基因在木本植物中遗传改造的研究较少。本研究构建了GbCO正义链和反义链的植物表达载体pCAMBIA 1304-GbCOs和pCAMBIA 1304-GbCOa, 可用于GbCO基因的转基因功能研究, 为利用CO基因进行银杏等木本植物的遗传转化创造条件。
1 材料和方法
1.1 材料
植物表达载体pCAMBIA 1304、大肠杆菌 (Escherichia coli) TOP10、农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens) LBA4404, 为作者实验室保存。
限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ, T4 DNA连接酶均购自New England BioLabs (NEB) 公司。PCR体系包括 (Taq酶) 及PCR耗材购自Promega公司。胶回收试剂盒为AxyGen Biosciences产品;pMD-18T Vector 购自TaKaRa 生物工程 (大连) 有限公司;卡那霉素、氨苄青霉素钠盐等购自上海生工有限公司;引物由上海生工有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 GbCO基因酶切位点的引进
以含有GbCO的载体pMD-18T-GbCO菌液为模板 (前期实验获得) , 用加上保护碱基和酶切位点的引物进行PCR扩增 (正义链引物GbCOS-FP 5′-GGAATTCATGAGTATGCCAAAGCTATGTGAT-3′;GbCOS-RP 5′-CGGGATCCTTAAAAAGATGGAACAATCCCATA-3′。反义链引物GbCOA-FP 5′-GGAATTCTTAAAAAGATGGAACAATCCCATA-3′;GbCOA-RP 5′-CGGGATCCATGAGTATGCCAAAGCTATGTGAT-3′) , PCR反应程序:94℃ 3 min, 94℃ 1 min, 62℃ 30 s, 35 cycles, 72℃ 3 min, 72℃ 10 min, 电泳检测扩增目的条带, 分别切胶回收富集正义链和反义链。
1.2.2 GbCO基因植物表达载体的构建及鉴定
植物表达载体pCAMBIA 1304, 正义链和反义链的双酶切反应按照试剂公司提供的酶切体系进行, 37℃水浴保温16h, 取2μL电泳检测酶切效果。
酶切后的正义链和反义链分别与植物表达载体pCAMBIA 1304酶切后的直链进行连接反应, 体系为 (总体积10μL) :pCAMBIA 1304直链1μL, 酶切后正义链/反义链3μL (视片段浓度而定) , 10×Ligation Buffer 1μL, T4 DNA Ligase 1μL, 双蒸水4μL, 16℃水浴连接过夜。
将带有正义链和反义链的植物表达载体pCAMBIA 1304转化到大肠杆菌中, 接种于含有Kan (50 μg/mL) 的LB固体培养基上, 平板倒置于37℃恒温培养箱中培养12～18 h。挑取单菌落检测。
参照《分子克隆实验指南 (第3版) 》质粒提取方法提取pCAMBIA1304-GbCO质粒DNA[8]。
1.2.3 GbCO基因植物表达载体转化农杆菌
参照朱锦辉、权军利等人[9]方法, 挑取根癌农杆菌LBA4404单菌落于YEP液体培养基 (含Rif 40μg/mL) 中, 28℃振荡培养至OD600为0.5左右, 制备农杆菌感受态细胞, 把pCAMBIA1304-GbCO质粒DNA转化到农杆菌感受态细胞, 接种于含有50μg/mL Kan和40μg/mL Rif的YEP固体平板上, 28℃培养约48h, 挑单菌落, 接种于YEP液体培养基中, 28℃振荡培养过夜。以GbCO基因特异性引物进行PCR扩增, 进行菌落PCR检测, 电泳检测目的条带。同时提取pCAMBIA1304-GbCO质粒DNA, 进行BamHⅠ和HindⅢ双酶切, 37℃反应过夜, 电泳检测酶切结果, 进一步进行酶切鉴定。
2 结果与分析
2.1 GbCO基因植物表达载体的构建策略
GbCO基因ORF上没有的限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ两个酶切位点, 而植物表达载体pCAMBIA 1304上有这两个酶切位点, 通过设计引入酶切位点及保护碱基引物, 扩增GbCO基因正义链和反义链, 使其两端含有BamHⅠ和HindⅢ两个酶切位点。利用双酶切和连接重组技术, 把GbCO基因正义链和反义链通过酶切位点BamHⅠ和HindⅢ插入植物表达载体pCAMBIA 1304, 从而构建正义表达载体pCAMBIA 1304-GbCOs和反义表达载体pCAMBIA 1304-GbCOa。
2.2 GbCO基因植物表达载体的构建及鉴定
以含有GbCO的载体pMD-18T-GbCO菌液为模板, 使用引入BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的正义引物、反义引物扩增得到了基因两端带有相应双酶切位点的GbCO基因片段, 测序结果表明正确引入了BamHⅠ和HindⅢ酶切位点。
对植物表达质粒pCAMBIA 1304和克隆扩增得到的带有BamHⅠ和HindⅢ双酶切位点的目的基因片段双酶切。酶切电泳结果如图2, 图2 (a) 显示植物表达质粒pCAMBIA 1304经过酶切后, 由原来的环形或超螺旋结构变成了单一的线性结构, 酶切完全;由图2 (b) 可见GbCO基因酶切后基因条带大小与酶切前的一致, 说明基因未被酶切弥散, 可以进行载体构建连接反应。
将分别酶切后的载体和片段进行连接反应, 转化TOP10感受态细胞, 在含有卡那霉素 (50mg/L) 的LB培养基上筛选转化菌落, 挑取单菌落进行菌落PCR鉴定。PCR产物电泳可见大小约1 200bp的特异条带 (图3, a) , 与预期大小一致, 初步说明pCAMBIA 1304-GbCO植物表达载体构建成功。对PCR为阳性的单菌落进行摇菌培养后提取质粒, 用BamHⅠ和HindⅢ双酶切再次鉴定, 电泳可见两条大小约1.2kb和3.0kb的目的条带 (图3, b) , 证明pCAMBIA 1304-GbCO植物表达载体构建准确。构建的表达载体送往上海生工测序, 结果表明克隆的重组质粒是研究所需的植物表达载体pCAMBIA 1304-GbCO。
(a) 为pCAMBIA 1304载体双酶切图 (ck为双酶切前的载体, 1、2、3为双酶切后的载体) 。 (b) 为GbCO基因正义和反义ORF片段的双酶切图 (M为DNA marker DL2000, 1、2为酶切后, 3、4为酶切前;1、3为正义链, 2、4为反义链) 。
a为菌落PCR结果电泳, b为pCAMBIA 1304-GbCO质粒酶切。
2.3 GbCO基因植物表达载体转化农杆菌
pCAMBIA 1304-GbCO重组质粒转化农杆菌LBA4404感受态细胞, 涂布YEP平板上培养长菌后, 挑取单菌落进行PCR鉴定。选择GbCOS-FP和GbCOA-FP为单菌落检测的上游引物, 通用引物M13 pM4:GTTTT CCCAG TCACG AC为下游引物。得到约1 200bp的特异条带 (图4) , 证明pCAMBIA 1304-GbCO重组质粒已经被成功转入农杆菌LBA4404感受态细胞中, 命名pCAMBIA 1304-GbCO/LBA4404菌落, 可以作为转基因等后续研究之用。
其中, M为DL2000分子量标记;+1为正义链阳性菌落;+2为正义链阴性对照;-1～-3为反义链阴性对照;-4为反义链阳性菌落。
3 讨论
近年来, 关于光周期的研究已有大量报道[10]。光合周期变化是一种诱导植物开花的环境因子之一。在拟南芥光合周期途径中, 现已证明FT、CO和SOC1等基因的表达均受到光合周期节律的调节[11,12,13]。Koornneef M等人通过光周期失活的拟南芥突变体首先筛选得到CO基因[14], 进而对其结构研究证明, CO基因编码一个转录因子调控植物对光合周期的响应, CO是植物光周期途径中的关键基因。
依托研学载体,构建有效课堂 篇9
关键词：有效课堂,研学导航,研学备战
提高教育教学质量的关键在课堂教学,要切实地开展有效教学,努力构建有效课堂是现实的要求。有效课堂的实施需要从教师、学生以及师生活动三个维度实施,才更具有针对性、行动性和实效性。三个维度有机结合,需要依托的是研学载体———《研学案》。实践证明,只有依托《研学案》,才能构建“教学合一”的有效课堂; 才能实现课上与课下、教师与学生、学生与学生的有效互动; 才能使学生的基础性、发展性和创造性学习力得到很好发展。
一、集体智慧,是研学的基础与支撑
为了构建有效课堂的有形载体,依托校本研修,聚焦课堂教学,群策群力开发的《研学案》,在探索中实践,在实践中完善,在完善中提升。彰显了教师集体智慧; 诠释了学生主体地位; 引领了学生有效研学; 提升了学生自学能力。每一课时的设计与编写,都是集体备课完成的,绝不是教学内容的直接拷贝,更不是教学过程的简单罗列。在设计的过程中,不仅根据教材、教参、课程标准、中考说明、历年来的中考试题,而且依据学生的认知水平、知识经验的前端分析。精心设计的“研学导航、研学探究、研学备战、研学梳理”四大板块,诠释了“教与学相与为一”的教学理念,体现了“学思结合、知行统一、研学一体”的教学思想。对于教师来说是“教本”,是执教艺术的科学呈现,诠释了教师不仅是课堂教学活动的组织者、引导者、参与者,而且是课程创造者与开发者。对于学生来说是“学本”,是学生学习流程的系统展示,是学生自主学习的路线图、方向盘、指南针。实现了“为了每一个学生的发展”这一新课程理念,在尊重学生的基础上,引领学生自主、合作、探究的学习。
二、研学导航,是研学的航标与方向
研学导航,是研学的航标与方向,呈现的是“学习目标”和“学习重点”,为学生的研学活动起到了引领与导航作用。“学习目标”是学生通过学习要达到的预期结果和标准,是由教师通过集体备课,在深入钻研课标、教材、中考说明的基础上结合教学经验,面向全体学生而设置的。不仅是学生预习的航向标,而且是师生和谐互动的有效追求。“学习目标”和“教学目标”有机结合,诠释了新课程关于“知识与技能、过程与方法、情感态度价值观”三维目标的要求。
在研学导航中设置的“学习重点”栏目,不仅明确了“学习重点”,而且说明了“学习难点”。便于学生在预习的时候有所侧重。有利于学生在学习过程中投入更多精力来学习、研究与探索,促进学生更好地掌握所学内容,提升自我研学能力。
三、研学探究,是研学的主体与核心
研学探究,是研学的主体与核心,设置了“课前研学、课中研讨、课后研练”三个模块,呈现的是在目标引领下学生自我研学、师生合作探究、课上实战演练的具体实施。引领学生在自我预习的基础上,在教师的点拨下,进行探究与研讨、探索与发现、实践与论证,是培养学生自我研学能力的有效载体。
课前研学,就是学生在学习之前应该自主完成的课前预习内容,可以是复习相关知识的习题,也可以是引入与所学内容有密切联系知识链接。目的在于扫清学习新知识的障碍,为新知识学习做好铺垫,有利于学生顺利进入学习新知识、新内容的最佳状态。
课中研讨,这是研学探究的核心部分,也就是课堂教学的整体设计与流程。包括“新知导入、自主学习、知识探究、互动研学、学法指导”等内容。在实施中尽可能提出具有挑战性、趣味性的问题,激发学生兴趣,激发学生的思考和探究。在教师引领下,通过教师讲授、学生个体研学、师生互动研学和生生互动研学等环节的有效实施,借助现代教育技术手段,充分体现“研中学、研中思、研中练、研中悟”的研学提升功能,真正实现“目标学习知识化、知识呈现问题化、问题解决探究化、研学探究能力化、能力提升个性化”的有效追求。在课中研讨过程中,教师运用点拨、引领、启发、案例等多种教学手段,在师生研学探究中传递知识、发现规律、提供学法,有助于学生在借鉴学法的感悟中,开拓思路、发展思维、提升能力。
课后研练,这是研学探究的重要部分,教师对照学习目标编写具有针对性、时效性和典型性的达标检测题。题型要求多样,数量、难度适中,梯度、效度和可信度科学,面向全体、关注差异、规定时限。由小组进行展示,突出四大原则,即问题性、互动性、规律性、创生性,绝不是对课后研练问题的简单解答。
针对研练效果进行客观评价后,学生按知识点之间的内在联系画出本节课知识树,拓展延伸相关知识的联系,并对学习方法进行梳理。针对所有学生编写层次分明、梯度合理的推荐作业,难度由低到高满足不同学生的学习需要,让所有学生都得到适合自己的发展。
四、研学备战,是研学的延伸与提升
研学备战,是研学的延伸与提升,呈现的是直击中考的链接。有针对性地强化训练,是对学生应考能力的培养。教师紧紧依靠中考说明、历年来的中考试题等资源,结合自身的教学经验与智慧,精心设计对接中考的训练试题,也可以是精选的中考原题。让学生在研学中把握中考题型,提升分析问题、解决问题的能力。
五、研学梳理,是研学的反思与体会
《研学案》的每一页专门设置了“研学梳理”板块。一是为教师进行教学反馈提供了空间。教师可以及时将教学反思与感悟记录下来,并进行有效整改。二是为学生记录学习体会与心得提供了平台。要求学生在课前研学做疑难呈现笔记; 在课中研学做知识梳理笔记; 在课后研练做反思提升笔记。有助于学生养成良好的学习习惯,有助于学生学会学习、学会感悟、学会反思、学会提升。“研学梳理”不仅是师生在研学过程中生成的知识和感悟,而且记载了每一个青春生命智慧绽放的历程。
载体构建 篇10
1 材料和方法
1.1 材料:
表达带有GST标签pGEX-4T-1载体。基因工程菌E.coli DH5α和BL21 (DE3)(由厦门大学附属中山医院消化实验室赠送)。EcoRⅠ、SalⅠ限制性内切酶,T4DNA连接酶,Taq酶,以及PCR反应试剂盒为TaKaRa产品。DL15000 Marker、DNA Markerl,质粒提取试剂盒、DNA小量胶回收纯化试剂盒。异丙基硫代β-D半乳糖苷(IPTG)以及氨苄西林均为大连宝生物工程有限公司产品。逆转入试剂盒(MBI),Mouse anti-TSLP单克隆抗体(R&D公司),HRP标记Goat anti-Mouse IgG,ECL为杭州联科生物技术有限公司。其它试剂为进口或国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 引物合成:
参考GenBanK中TSLP全长基因的序列,应用primer primier5.0设计一对可扩增TSLP基因开放读码框区域的引物:上游引物PF:5'-CCGGAATTCCGGGTGTCCACGTATGT-TC-3 (画线部分为EcoRⅠ的酶切位点),下游引物PR:5'-CCGGTCGACGATGGTTACTGTTGTTTCAG-3'(画线部分为的SalⅠ酶切位点),(由上海英骏生物工程有限公司合成)。
1.2.2 目的基因的扩增:
人鼻黏膜上皮细胞总RNA的提取:按Trizol试剂盒所述方法提取人鼻黏膜RNA。-80℃,保存备用。以Oligo (dT)18为引物,遵循cDNA Synthesis System操作步骤合成cDNA。以cDNA为模板,以人TSLP基因的引物进行PCR扩增,扩增反应的条件为:95℃预变性2min,以95℃变性30 s,57℃退火30 s,72℃延伸1 min,35个循环后,再于72℃延伸10min。同时设立无模板的阴性对照。反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳鉴定,目的DNA片段的胶条用胶回收试剂盒回收。
1.2.3 重组质粒pGEX-4T-1/TSLP的构建与鉴定:
将纯化的PCR产物和载体pGEX-4T-1用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后,分别回收酶切产物,在T4 DNA连接酶作用下定向将TSLP基因片段与pGEX-4T-1连接,将连接产物转化入DH5α感受态细菌,在LB (Amp+)培养基中筛选培养。挑取克隆,培养后小量提取质粒,用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切鉴定筛选阳性重组质粒并送上海英骏生物技术有限公司测序。
1.2.4 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达及鉴定:
(1)重组质粒的诱导表达及SDS-PAGE分析:将鉴定成功的重组质粒DNA转化感受态细菌E.coli BL21,在LB (Amp+)培养基中筛选培养。将含有重组表达质粒的E.coli BL21在LB (Amp+)培养液中,37℃振荡培养过夜。以1%接种于LB (Amp+)培养液中,于37℃培养至A600nm约为0.6时,加入1mmol/L IPTG,于30℃继续诱导培养4 h。离心收集菌体,经超声碎菌后,提取菌体全蛋白,将菌体全蛋白进行SDS-PAGE (浓缩胶浓度为4%,分离胶浓度为12%)分析后,用考马斯亮蓝R250染色30min,用甲醇-冰醋酸脱色液脱色后观察结果。另外,取诱导前和诱导后2、4、6h的裂解菌液及超声裂解菌离心后的上清和沉淀,分别进行12%SDS-PAGE,分析目的蛋白的表达与诱导时间的关系,以及目的蛋白的表达形式。(2) Western blot分析:将表达产物经SDS-PAGE后,电转移至聚偏氟乙烯(PVDF)上,用封闭液(含5%脱脂奶粉的TBST)室温振荡封闭2 h。依次滴加Mouse antiTSLP单克隆抗体(室温反应1.5 h)及HRP标记Goat antiMouse IgG (室温反应1 h),用ECL化学发光试剂盒底物液显色后,观察结果。
2 结果
2.1 TSLP基因的扩增与鉴定结果:
人鼻黏膜上皮细胞TSLP基因进行PCR扩增,所获产物在2g/L琼脂糖凝胶中电泳,经EB染色,在紫外灯下观察到1条约500bp的带,同预期的目的片段的大小相符(图1)。
[M:DNA marker;1.2:PCR产物;3:阴性对照(without TSLP tem-plate)]。
(1.pGEX-4T-1/TSLP/EcoRⅠ、SalⅠ;2.pGEX-4T-1/TSLP/EcoRⅠ;3.pGEX-4T-1/TSLP/SalⅠM:MAKER)
2.2 重组质粒的构建与鉴定结果:
重组质粒pGEX-4T-1/TSLP的构建图略。将重组质粒pGEX-4T-1/TSLP用EcoRⅠ、SalⅠ分别进行单酶切及双酶切,pGEX-4T-1的大小约为4.9kb,扩增产物TSLP基因的大小约为509bp,线状重组质粒的大小为5.4kb,说明重组质粒大小正确。pGEX-4T-1/TSLP经EcoRⅠ、SalⅠ双酶切后,分成4.9 kb和0.5 kb两个片段,同预期值相符,表明目的基因已正确插入pGEX-4T-1载体中(图2)。阳性重组质粒测序结果在NCBI网进行BLAST分析比对,与GenBank登入的基因的序列完全一致(图3)
2.3 GST-TSLP融合蛋白的表达与鉴定结果:
以重组质粒转化感受态E.coli BL21,挑取阳性克隆后进行酶切鉴定将经IPTG诱导表达的产物用SDS-PAGE分析。结果表明,在Mr为40KD处有1条明亮带,同预期的目的蛋白的Mr相符,Mr 26KD处条带为融合蛋白GST-TSLP受细菌内蛋白酶的作用而降解产生的GST蛋白。表达时间分析表明,目的蛋白在诱导4 h时表达量最高(图4)。表达形式分析表明,目的蛋白大多以可溶性非包涵体形式存在于胞质中。将融合蛋白GST-TSLP经SDS-PAGE后,电转移至PDVF膜上,用抗TSLP抗体检测显示,在Mr为40 KD处有1条明显的带,预计TSLP的大小约14KD (图5)。
3 讨论
变应性疾病是一个多因素、多环节、多阶段的复杂疾病,随着对鼻息肉和过敏性鼻炎的基础研究日益深入,我们认识到其发病和转归有许多复杂的细胞、细胞因子、细胞间信号转导通路和大量免疫活性物质参与。TSLP基因是1994年Friend等首次从胸腺基质细胞中鉴定出来,由A、B、C、D4个螺旋束组成短链的I型细胞因子,研究表明,TSLP对淋巴细胞的发育、分化,尤其对树突状细胞的活化、分化起着重要的调控作用[3,4],研究显示受TSLP作用而被激活的CD11C+DC,可促进幼稚CD4+T细胞增殖,分泌大量IL-4,IL-5及TNF-α。同时,CD8+T细胞在TSLP激活DC的作用下,可产生大量INF-γ,IL-5和IL-13。INF-γ,IL-5和IL-13水平的升高,可导致炎性反应的加剧以及组织损伤,表明TSLP可能是炎症发生过程中一个重要的启动因子。鉴于TSLP具有的重要的免疫学功能及生理、病理学意义,探究TSLP在变应性疾病中的发生机制,因此寻找新的治疗方案及将多种治疗方法联合应用是变应性疾病治疗研究的热点。
选择有效的表达系统是进行外源基因高效表达的重要前提,本研究中利用分子克隆技术研究TSLP在原核基因的表达,明确诱导表达条件和目的蛋白的大小,因表达量是随着诱导剂量的增高而增高,但诱导剂对宿主菌有一定的毒害作用。我们将诱导时间定为2～6h,分别用9个不同终浓度的IPTG诱导。电泳分析,确定1mmol/L为最佳浓度。本实验采用1 mmol/L IPTG诱导浓度,分别诱导2～6h,电泳分析,确定4h为最佳诱导时间。外源基因表达为融合蛋白,分子量约为40 kD,在SDS-PAGE胶上的表观分子量基本符合此值,其中表达产物的N末端有一段含有GST标签的融合蛋白,大约为26 kD,此标签有利于目的蛋白的纯化。表达的GST-TSLP融合蛋白可用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析的方法纯化,GST序列后有一个可被凝血酶和Xa因子识别的蛋白酶切位点,通过蛋白酶的切割可产生天然的TSLP蛋白,为研究其抗原性提供了必要的条件。
本试验成功构建表达了含有TSLP的原核重组载体,并在大肠杆菌中表达,通过本试验所摸索的培养条件,我们可获得足够的融合蛋白,为进一步研究TSLP的抗原性和其抗体的免疫保护性奠定基础,为TSLP在变态反应性疾病的发病机制和临床应用等方面的研究提供了一定的理论和实验依据。
参考文献
[1]Wang Y H,Liu Y J.Thymic stromal lymphopoietin,OX40-ligand,and interleukin-25 in allergic responses[J].Clinical and Experimental Allergy,2009,86:236.
[2]Harada M,Hirota T,Jodo AI,et al.Functional analysis of the thymic stromal lymphopoietin variants in human bronchial epithelialcells[J].Am J Respir Cell Mol Biol.2009,71:236.
[3]Yong-Jun-Liu.Thymic stromal lymphopoietin:master switch for allergic infl animation[J].The Journal of Experimental Medicine,2006,122:310.
载体构建 篇11
关键词： 大学英语 英语演讲训练 听说能力
1.引言
在国内的许多大学，开设英语演讲课已经逐渐形成一种趋势。英语演讲课不仅顺应了《大学英语课程教学要求》提出的“大学英语的教学目标是培养学生的英语综合应用能力，特别是听说能力”的要求，还有效地提高了沟通能力和拓宽知识面。然而非英语专业的大学生由于课时量的限制，不可能在短期内在全校普及英语演讲课。因此，如何将英语演讲训练融入日常大学英语听说课中，使大学生参与主动练习与实践提高英语听说能力，成为本文研究的目的。
2.将英语演讲训练融入大学英语听说课的可行性分析
2.1英语演讲教学的主要理论依据与听说训练的理念和目标一致。
英语演讲教学的其中一个主要的理论依据是输入和输出理论。克拉申提出的“可理解的语言输入”的提出，只有当习得者接触到略高于他现有语言技能水平的第二语言输入，而他又把注意力集中于对意义或对信息的理解时，才能产生习得。学习者需要接触大量的可理解性输入，才能自然产生语言复用能力。在听说课堂环境中，有问答、复述、对话、讨论、辩论、演讲、角色扮演等输出方式。演讲训练中对演讲比赛的观摩、向成功英语演讲者的模仿这些都是对听说能力的一种输入，而后阶段的演讲，作为听说课中一种更高要求的输出方式，使学生对英语演讲技巧的认识经历一个由感性到理性、从抽象到具体的过程，为培养输出能力、提高输出质量打下坚实的基础。由此可见，英语演讲教学的主要理论依据与听说训练的理念和目标是一致的。
2.2英语演讲训练能帮助大学生克服心理障碍，改变口语僵化现象。
某些大学生在使用外语时会具有明显的语言休克现象，最常见的是在进行回答问题、口语操练等课堂活动时会出现紧张、胆怯，以至于伴随冒汗、握拳、讲话结巴等现象，在使用目标语进行交际时无法做到像使用母语一样自然。而英语演讲中的训练，无疑为帮助大学生走出僵化的困境，摆脱不利的心理因素，提出一种很好的解决方案。在演讲训练中，教师要让学生认识到在公众场合，害怕乃人之常情。要学会自我放松的方法，试着深呼吸几次，在心中不断重复一些激励的话语，战胜恐惧感，注意保持与听众的眼神接触。当学生克服心理障碍后，再通过观摩、模仿、演讲这一系列循序渐进的演讲训练，再适当运用具体的技术手段，比如对着摄像机镜头，在公众场合，进行实地演练，实践、实践、再实践，不断体会演讲的奥秘和诀窍，学生的口语僵化现象必定能得到很好的改善。
2.3演讲的交流特性能促进听力水平的提高。
演讲就是演讲者在一定的时间和场合，把自己的信息以特定的方式向听众传达的一种交流活动。演讲者是信息的来源，在发表演讲时需要把这些信息用自己的方式进行编码，传达给接受者听众。在信息传递的过程中，演讲者必须以听众为中心，而听众需要把演讲者的信息解码之后，才能有效接受信息。在传达信息和接受信息的过程中，在某种程度上促进双方听力的提高。
3.英语演讲融入听说课的组织形式
英语演讲不同于一般的口语训练，它必须有一定的阶梯性和顺序的不可逆性，随意性小，演讲训练既是对口语训练的一种拓展，又是对听力训练的一种突破。笔者在所教授的4个班级中，利用听说课的部分时间，进行英语演讲训练。
3.1观察。
美国新行为主义心理学家A.Bandura等人（1962）提出了社会学习论，又称模型模仿论。这一理论讲述了在社会环境中人是如何学习的。它主张人类应通过观察别人的熟练反应，并在此基础上进行模仿，完成学习行为。观察有两个目的：一是可以激发学生对英语演讲的兴趣;二是消除学生在语言和心理方面的隔膜和恐惧感。观察的资料搜集来源可以是双方面的，课堂上的资料主要来自教师，课后的来自学生。观摩的视频材料可以选用一些比较经典的演讲音像资料，音像资料的选择在内容上不能太难，否则会挫伤学生的积极性。在结构上不能一味求新，要尽量选择那些内容清晰有条理性的视频，比如马丁·路德金的演讲、乔布斯在斯坦福大学的演讲及“外教社杯”英语演讲比赛全国优秀获奖选手的演讲，这样的演讲资料可以起到很好的示范作用。示范作用引起的观察学习更有效。教师可以自行制作一些微课视频，进一步提高学生的学习兴趣。课后，教师可以督促学生利用网络资源寻找一些他们自认为好的演讲视频，在课堂上或是微信群中一起分享，调动他们参与课堂活动的积极性。观察的训练可以分为两个不同的阶段进行。在观察的初期，教师仅仅起到一个视频提供者和播放者的作用，只让学生观看，不做任何的干预。在观察的后期，教师就要起到引导者的作用，引导学生注意演讲技巧的使用，体会重音、强弱读、断句、停顿等用声特点;引导学生细心观察演讲者是怎样利用手势、面部表情这些体态语表达自身的情感;引导学生用心体会演讲者是怎样立意构思、谋篇布局打动听众的。
3.2模仿。
在进行了一段时间的观察之后，就可以进入演讲训练的第二阶段：模仿。模仿可以从不同的方面进行。首先，是对演讲者用声技巧的模仿。把握以发音到位为基础的所有重要因素的有机协调、变化有致，感受演讲中的高亢激昂，感受演讲的低沉深厚，感受语速快时的流畅清晰，感受语速慢时的有声有色，感受停顿所引发的听众思考。可以将学生分成不同的小组，借助录音设备，小组的组员间互相帮助检查对方是否模仿到位，小组组员互相评分，教师可以在课堂上来回走动，观察各组的声音模仿方式。其次，学会模仿演讲者的“肢体语言”。模仿的形式可以在传统模式的基础上加上创新模式。所谓的传统模式，就是单纯模仿经典视频资料里演讲者的肢体语言，不管是手势、表情都要尽量到位。这一阶段可以让学生变成“演员”再现演讲者的“形态”，可以让学生主动上台模仿，台下的学生和老师一起作为评判。所谓的创新模式，就是教师给出学生一段演讲稿，要求学生分小组自己揣摩该如何配上适当的肢体语言更好地给听众传递信息。随后各小组可以推荐表现力好的组员在全体同学中表演，选出最佳的表演之星。最后，就是更高层次的要求，学会模仿演讲者的遣词造句、谋篇布局的技巧;体验怎样在演讲中利用引人入胜的开头和令人回味的结尾吸引听众;把握怎样合理地确立中心论点、收集有效素材展开论证，从而说服台下的听众。教师可以指定两篇演讲稿的撰写，然后让学生先自己打分评价，然后交由教师打分评价，再选出优秀的演讲稿在课堂上宣读。在对演讲者的模仿训练中，组织观察、分析和讨论，使教师、演讲者和听众都积极参与课堂，不仅逐步培养自信心，而且提高他们的演讲技能。
3.3命题演讲与即兴演讲相结合。
观察和模仿的训练，已经逐步消除学生对演讲的恐惧心理、树立自信心。这些都为真正的上台演讲做好了一定的铺垫和过渡。这部分的训练可以先从比较容易的命题演讲入手，再转向高要求的即兴演讲。命题演讲可以改变以往由教师命题的形式，由学生自己自行选择一些他们感兴趣、热点的话题，然后集中汇总，形成两个命题，准备充分后，在课堂上每个学生都有演讲的展示机会。在演讲者进行演讲的同时，其他学生的角色就变成了观察者，学会欣赏别人的优点及找出不足，也间接得到提高。即兴演讲相对来说是演讲中难度较大、比较富有挑战性的环节，训练的安排可以放在最后的两次课上。在即兴演讲比赛的前两周，可以适当地让学生针对特定的演讲题目，进行头脑风暴法的训练，帮助学生拓展思路及培养一定的思辨能力。即兴演讲时，教师可以模拟正式比赛的现场，把学生分为两组，一组进入准备室抽签准备，另一组在比赛现场和教师一起，作为现场的评判。然后再下一场换题目后已经做过评判的学生再变成演讲者进行演讲。每个学生的即兴演讲的得分就是每个学生打分的分数和教师打分分数的平均分，最后评出最优秀的前三名演讲者。
4.英语演讲训练融入听说课的实践效果
通过在英语听说课融入英语演讲训练，在期末教师对四个班级的学生进行调查。其中69%的学生认为自己的听说水平有了一定的进步，60.5%的学生把口语进步的功劳归因于英语演讲训练。学生参与英语演讲训练，提高心理素质，树立自信心。在观察、模仿和演讲中，不仅激发了学习的兴趣和求知欲，还促进了口语表达能力和交流能力的提高。学生在训练的过程中始终具有主体地位，演讲资料的收集，使学生进一步提高他们的审美能力和利用现代化信息手段进行自主学习的能力。教师的传统听说课教学模式也得到改良，在一种半开放式的教学中，教师充当导演和演员的双重角色。实践证明，把英语演讲训练融入听说课堂具有一定的实用性，是实现大学英语教学目标的一种有效途径。
英语演讲作为听说课额外训练的一种，也可以纳入评价体系。在大学英语课中，某些学生要进行口试的考核，有了演讲训练，就可以把它作为口试考核的一部分。考核的内容分别是模仿、命题演讲和即兴演讲三个循序渐进的步骤。考核的评价者是学生自身和同学间的互评还有教师的评价，这是一个更合理客观的评价体系。这样能激发学生的参与热情，对英语演讲有更深刻的认识，学生也从中树立竞争意识和团队合作的精神。
5.结语
通过在听说课中引入英语演讲训练，可以打破传统的听说教学模式，探索一套科学有效的听说教学模式。英语演讲训练的目的不是培养演说家，而是以演讲的方式提高大学生的英语口语能力，间接带动听力水平的提高，在一系列过程中培养学生的英语综合、交流能力和逻辑思维能力。通过一种新的教学模式促进大学英语听说课的改革，使它发挥更好的教学效果。
参考文献：
[1]Stephen E.Lucas.The art of Public Speaking[M].北京：外语教学与研究出版社，2011.6.
[2]崔琳琳，林立.大学英语演讲教程[M].北京：外文出版社，2004.
[3]李彦文，等.英语演说词精粹[M].西安：世界图书出版社，1999.
[4]祁寿华.英语演讲艺术[M].上海：上海外语教育出版社，2005，4.
骨骼肌特异表达载体的构建与验证 篇12
随着我国经济的发展,居民对肉类的需求已逐渐由量向质的方式进行转变,传统的杂交育种技术尽管能提高肌肉品质,但进展缓慢,这就使得将运用转基因技术培育新品种,从而改善肌肉品质成为可供选择的可能。
ω-3多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFAs) 是大脑、视网膜和神经系统发育所必需的一种不饱和脂肪酸,并且能预防和治疗神经性疾病[1],而人类不能自身合成该类脂肪酸,这就需要从外界摄入。ω-3 脂肪酸去饱和酶(ω-3 Fatty Acid Desaturase,ω-3 FAD)是一类以ω-6 PUFAs为底物催化生成相应ω-3 PUFAs的去饱和酶。Kang JX和朱贵明分别获得了表达线虫ω-3 FAD基因的转基因小鼠,体内各种ω-3 PUFAs含量较未转基因小鼠有大幅度的提升[2,3]。赖良学等获得了转线虫ω-3 FAD基因的转基因克隆猪,检测主要组织(肌肉、肝脏、心脏、肾脏等)的脂肪酸含量,发现α-亚麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸等ω-3不饱和脂肪酸含量及ω-3/ω-6 PUFAs比值显著上升[4]。潘登科等同样利用核移植法获取了转线虫ω-3 FAD的转基因猪,RT-PCR检测发现ω-3 FAD cDNA得到有效转录[5]。在ω-3 FAD组织特异性表达方面,Pohlmeier WE等和Ji S等分别获得了乳腺和脂肪细胞特异性表达C.elegansω-3 FAD的转基因小鼠[6,7]。目前未见在家畜中肌肉特异性表达ω-3 FAD的转基因研究的同类报道。
为了能在肌肉中特异性地表达ω-3 FAD,本研究采用化学合成的骨骼肌特异性启动子,构建了携带线虫ω-3 FAD cDNA的肌肉特异性表达载体,并进行体外验证其转录的有效性,目的为后续获得转基因细胞,进而获取肌肉中特异性表达ω-3 FAD的转基因动物奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
真核表达载体pcDNA3.1和大肠杆菌E.coli DH5α为作者实验室保存;密码子优化的线虫ω-3 FAD cDNA由作者研究室张立春老师提供。
1.1.2 试剂
DNA聚合酶、限制性内切酶(MluⅠ、NheⅠ、HindⅢ)、T4 DNA 连接酶、DL 2000、凝胶DNA 回收试剂盒、dNTP、质粒提取试剂盒购自Tiangen Biotech,氯化钠、琼脂粉、酵母提取物等试剂均为国产分析纯。
1.1.3 仪器
离心机( Sigma 3K30);凝胶成像系统(北京六一);PCR仪(Bio- Rad );恒温摇床( Forma,Scientific)。
1.2 方法
1.2.1 肌肉特异启动子的合成
参考文献[8],将肌肉特异性控制单元近血清反应单元(serum response element,SRE)、肌细胞增强因子1(Myocyte enhancer factor -1,MEF-1)结合位点、肌细胞增强因子2(MEF2)位点、转录增强因子1(transcriptional enhancer factor-1,TGF-1)单元、SP1转录因子结合单元、TATA盒等元件按图1的顺序进行连接成合成的启动子SP,由上海捷瑞生物工程有限公司进行合成。
1.2.2 肌肉特异性表达载体pcDNA3.1-SF的构建
利用MluⅠ+NheⅠ分别双酶切真核表达载体pcDNA3.1和携带合成片段的载体pGHm,分别回收后进行连接,获得重组载体pcDNA3.1-S。利用限制性内切酶HindⅢ+NheⅠ酶切pcDNA3.1-S和化学合成的线虫ω-3 FAD cDNA,分别回收后连接,获得重组载体pcDNA3.1-SF,利用PCR对重组质粒进行鉴定,所用引物P1:5’TTGTGGACGACGGACGGCGCTC 3’,P2:5’AGGGCAAAGTACAGGATGGTC 3’,预期片段481 bp,引物在载体中的位置见图2。
1.2.3 肌肉特异性表达验证
利用去内毒素质粒提取试剂盒提取质粒,100μl无菌PBS稀释100μg pcDNA3.1-SF,混合均匀,麻醉4周龄C57BL/6小鼠,将混合物快速注射到股四头肌内,对照组注射100μl无菌PBS,继续饲养小鼠72 h,采集股四头肌,提取RNA,去除DNA后反转录,利用PCR检测ω-3 FAD是否转录,以重组质粒pcDNA3.1-SF为阳性对照,注射无质粒灭菌PBS侧为阴性对照,所用引物P3:5’ATGGTGGCCCACAGCTCCGA 3’,P4:5’TCACTTGGCCTTGGCCTTCTC 3’,预期片段1 209 bp,引物位置如图2所示。
2 结果与分析
2.1 肌肉特异启动子的合成
对合成的片段进行测序,结果如图2所示,与预期设计一致,含有SRM、MEF-1、MEF-2、TGF-1、SP1转录因子结合单元、TATA盒等元件。
2.2 肌肉特异性表达载体的构建
将表达载体内切酶切除CMV启动子序列,依次接入合成的启动子序列、密码子优化的线虫ω-3 FAD cDNA,利用分别位于SP和FAD cDNA上的引物进行质粒鉴定,结果如图4所示,说明SP正确接入到FAD cDNA的上游。
2.3 重组载体的体外验证
将无菌PBS稀释的去内毒素的重组表达载体、不含载体无菌PBS的快速注射到小鼠股四头肌肉中,72h后提取注射处肌肉总RNA,利用RT-PCR检测ω-3 FAD 是否转录,电泳结果显示注射质粒的肌肉中ω-3 FAD得到转录,而只注射PBS的阴性对照肌肉内检测不到ω-3 FAD mRNA的存在(图5)。
M:Marker;1:重组载体;2:空白质粒对照。
M:Marker;1:Recombinant vector;2:Blank vector control.
M:Marker;1:质粒阳性对照;2、3:注射组;4、5:阴性对照。
M:Marker;1:Positive control;2,3:Injection group;4,5:Negative control.
3 讨论
启动基因特异性表达的调控序列是组织特异性表达的必要条件,也是进行外源基因特异性表达转基因动物研究的基础。有研究发现SRE、MEF位点、TEF-1位点等在骨骼肌启动子序列中多次重复出现,实验证明它们是肌肉特异转录控制元件[9],另外SP1转录因子结合单元与SRE有协同作用[10]。本研究综合上述研究,参考Li XY的研究结果,化学合成了带有上述结合位点序列和TATA box的DNA序列,取代了真核表达载体pcDNA3.1中的CMV启动子,进而在其下游插入线虫ω-3 FAD cDNA,构建得到肌肉特异性表达ω-3 FAD 的重组载体,目的是为后续的体外验证和转基因动物生产奠定基础,目前未见国内外采用该路线进行肌肉特异表达ω-3 FAD重组载体构建的报道。
肌肉内DNA直接注射是目前基因治疗领域的一项非病毒型基因转移技术,该方法简单、廉价、安全,尽管注射DNA不能进行染色体基因整合,但在骨骼肌内可检测到外源DNA的表达[11]。Hu S等将携带肌肉生长抑制素前肽的重组质粒注射到经过盐酸布比卡因处理的4w龄小鼠股四头肌内,5d后利用RT-PCR检测,发现目的基因在注射肌肉内得到有效转录,生长性能检测发现小鼠骨骼肌重量显著增加[12];Khan AS等将表达生长激素释放激素基因的重组质粒直接注射到猪骨骼肌中,与对照组相比,注射组猪生长速度显著增加[13]。为了验证构建的重组质粒的表达有效性,将重组质粒快速注射到小鼠股四头肌内,72h后,处死小鼠,采集注射侧和对侧的股四头肌,提取总RNA,消化DNA后,RT-PCR检测到ω-3 FAD mRNA的存在,表明了构建载体的有效性,这与其他研究者在多个实验中证明的合成的肌肉启动子可特异性地在肌肉组织启动外源基因转录的结果相一致[14,15]。目前质粒肌肉注射技术已有发展,多辅以电穿孔,这大大提高了基因转移的效率[16],本试验受试验条件的限制,仍采用了原始的肌肉注射,可能基因转移效率不高,但所表达的基因来源于线虫并进行密码子优化,所以仍可达到预期目的(验证表达的有效性)。