干扰载体（共5篇）
干扰载体 篇1
哺乳动物Sirtuin蛋白家族包括7个成员,即Sirt1～Sirt7,它们都具有一个保守的去乙酰基酶的中间区,但有不同的N端和C端,显示不同的亚细胞定位, 发挥不同的生物作用[1]。Sirt2主要定位于细胞质中,它是脂肪细胞中含量最丰富的Sirtuin家族成员[2]。Sirt2可以通过去乙酰化来调节生物体重要的生命过程,还可以通过脱乙酰基α-微管蛋白40位的赖氨酸与微管和HDAC6定位在一起[3]。另外,Sirt2可和14-3-3蛋白的不同亚型β/γ相互作用,以AKT依赖的方式通过Sirt2来增加14-3-3β/γ的脱乙酰基化和下调p53的转录活性[4]。Enxuan J等研究发现,在小鼠3T3-L1脂肪细胞中,高表达Sirt2抑制前体脂肪细胞分化,而干扰Sirt2表达则促进脂肪形成。这两个作用伴随着PPARγ、C/EBPα等成脂基因表达的变化。同时,3T3-L1脂肪细胞中的Sirt2减少使FOXO1乙酰化水平增加。这种相互作用可提高胰岛素刺激的FOXO1磷酸化,反过来调控FOXO1在核质中的定位。另外,Wang F等[5]也发现,Sirt2可通过去乙酰化FOXO1促进FOXO1与PPARγ的结合,进而抑制PPARγ的转录活性,从而抑制脂肪细胞的分化。
RNA 干扰(RNAi)技术是近几年发展起来的分子生物学新技术,被广泛应用于基因功能的研究。与其他载体相比,慢病毒载体具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间较长、不易引发宿主免疫反应等诸多优点。因此,试验构建了猪Sirt2基因shRNA慢病毒干扰载体,通过构建的这种载体可以高效、特异性地抑制Sirt2基因表达,并建立稳定干扰的脂肪细胞克隆,为进一步观察Sirt2基因表达沉默后对脂肪细胞生物学特性的影响奠定了基础,也为研究Sirt2基因在猪脂肪细胞分化中的作用提供了试验基础和技术平台。
1 材料
慢病毒表达载体LentiH1,由西北农林科技大学动物科技学院动物脂肪沉积与肌肉发育实验室保存;293T细胞,购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心;BamH Ⅰ、Xho Ⅰ、T4 DNA连接酶,均购自TaKaRa公司;FBS,购自杭州四季青生物工程材料有限公司;DMEM/F12培养基,购自Gibico公司;Lipofectamine2000,购自Invitrogen公司;质粒小量抽提试剂盒、凝胶回收试剂盒,购自BioFlux公司;细胞总RNA提取试剂盒和反转录试剂盒,购自宝生物工程(大连)有限公司;Sirt2 抗体,购自Santa Cruz公司;大肠杆菌DH5α,由西北农林科技大学动物科技学院动物脂肪沉积与肌肉发育实验室保存;试验所用的引物,均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
2 方法
2.1 Sirt2慢病毒干扰载体的构建
2.1.1 干扰片段的设计与合成
利用Invitrogen在线siRNA设计软件BLOCK-iTM RNAi Designer设计针对猪Sirt2基因的符合干涉片段特征的19 bp RNA序列及相应的脱靶对照序列,根据慢病毒载体LentiH1插入序列要求,设计正义链 5′-GATCC(N19)CTCGAG(19N)TTTTTC-3′,反义链 5′-TCGAG(N19)CTCGAG(19N)G-3′,其中N19是长度为19 bp的干涉序列,19N是反向互补序列。靶向基因的特异性干扰片段见表1。
2.1.2 干扰引物退火合成寡核苷酸双链(ds oligo)退火反应条件:
DNA模板单链各1 μL,Taq DNA mixture 5 μL,ddH2O 43 μL,总体积为50 μL。将上述样品混合均匀,95 ℃ 5 min,70 ℃ 1 h,冷却至室温,即可得到寡核苷酸双链,分装,-20 ℃保存,待用。
2.1.3 LentiH1载体的线性化
用BamHⅠ 和XhoⅠ 对LentiH1载体进行双酶切,使环状质粒线性化,并产生1条长约209 bp的双链DNA片段,纯化、回收线性化质粒。
2.1.4 目的基因与载体片段的连接
在T4 DNA连接酶的作用下,将退火形成的双链DNA片段连接到线性化质粒上获得重组质粒。反应条件:线性化质粒1 μL,退火的双链DNA 1 μL,T4 DNA连接酶Buffer 1 μL,T4 DNA 连接酶1 μL,混合,用ddH2O补至10 μL,4 ℃连接过夜,准备转化感受态受体菌DH5α。
2.1.5 阳性克隆的筛选与鉴定
用连接产物转化新鲜制备的DH5α感受态细胞,将转化菌涂布于含氨苄西林 (100 μg/mL) 的LB 琼脂平板上,倒置平皿,37 ℃培养18 h;挑菌,提取质粒,双酶切并初步鉴定阳性克隆,对成功构建的重组质粒进一步测序鉴定,确定插入片段是否正确。
2.2 携带siRNA 的慢病毒重组体的包装、浓缩、效价检测
2.2.1 病毒包装
用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞,当细胞密度为5×105 个/μL 时重新接种于面积为60 cm2 细胞皿中,37 ℃、5%CO2培养箱内培养至细胞密度为70%左右时进行转染;使用慢病毒包装质粒混合物和构建好的慢病毒穿梭质粒共转染293T细胞,转染8～10 h后 用含10% FBS 的DMEM 换液;转染后分别在36小时和48小时收集病毒上清液,3 000 r/min 离心10 min,然后使用0.45 μm的PVDF膜过滤上清液。
2.2.2 病毒浓缩
向病毒上清液中加1/4 体积的病毒浓缩液,混匀后4 ℃过夜;4 000 r/min 离心 30 min,弃1/2 上清液后再次4 000 r/min 离心10 min,可见病毒颗粒沉淀;彻底弃去上清液后加灭菌PBS 50～100 μL,混匀后分装于EP 管中,-80 ℃保存。
2.2.3 病毒载体的效价检测
用GFP 表达量法[6]测定效价。在6孔细胞培养板中分别接种293T 细胞,每孔5×105 个细胞;用含10%小牛血清的DMEM 在37 ℃、5% CO2培养箱中培养过夜,第2天当培养孔底293T细胞达90%左右,用经过滤处理的培养上清液按2-1,2-2,2-4,2-8,2-16,2-32进行梯度稀释;将不同效价的培养上清液缓慢加入孔中,轻轻混匀,37 ℃、5% CO2培养箱中培养过夜;加入聚凝胺(终浓度为8 g/L)于37 ℃吸附30 min,换含2%小牛血清的DMEM 继续培养24 h 后将细胞处理成单细胞悬液;用流式细胞仪计数GFP 阳性细胞数并计算病毒效价。计算公式:病毒效价(tu/mL)=GFP 阳性细胞百分数×感染的细胞总数×细胞的稀释倍数,细胞的稀释倍数取曲线线性范围内的数值,以确保单个拷贝的病毒载体感染单个细胞。
2.3 构建的Sirt2慢病毒干扰载体感染猪脂肪细胞
取冻存的脂肪细胞(均为第3代或4代细胞,由西北农林科技大学动物科技学院动物脂肪沉积与肌肉发育实验室提供)在含10% 胎牛血清的DMEM 中复苏、培养、传代。取5 mol 慢病毒,转导脂肪细胞48 h后收集。试验分2个试验组进行:RNAi 组为2 种Sirt2基因shRNA 慢病毒载体转导的脂肪细胞,感染对照组为携带脱靶对照序列的慢病毒转导的脂肪细胞。
2.4 Western-blot 检测Sirt2蛋白表达
取各组细胞, 用蛋白裂解液充分裂解,测定蛋白浓度;取等量蛋白液,热变性后进行10%SDS-PAGE 凝胶电泳;将蛋白转移到硝酸纤维素膜上,封闭后先用抗Sirt2 抗体(1∶800) 4 ℃孵育过夜,再用相应HRP 标记的二抗(1∶6 000)室温孵育2 h;化学发光、胶片曝光、显影和定影,检测Sirt2基因和内参基因β-actin蛋白表达情况。
3 结果与分析
3.1 干扰引物退火合成寡核苷酸双链(见图1)
1～3.siRNA;M.DL-500 Marker。
3.2 慢病毒载体重组质粒的鉴定
将3对siRNA干扰片段分别与线性化质粒进行连接,之后将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中,涂板后挑取单克隆摇菌扩繁,抽提质粒,双酶切并对重组质粒进行初步鉴定,发现3个重组质粒双酶切后都产生了长约55 bp的DNA小片段,说明载体连接成功,见图2。
M.DL-2 000 Marker;1～3.重组慢病毒 载体的XhoⅠ/BamHⅠ双酶切鉴定。
3.3 携带目的基因慢病毒重组体的包装及鉴定
将构建好的慢病毒重组质粒与包装质粒混合物△8.9和VSV-g共转染293T细胞,24 h后于荧光显微镜下观察发现,荧光强度强烈,细胞生长良好,表明病毒包装成功。分别在转染后36小时和48小时时收集合成的慢病毒上清液,经浓缩后再感染293T细胞,感染后在荧光显微镜下测定效价,经计算生成的病毒液效价达1×107tu/mL。图3为重组慢病毒载体的构建和鉴定结果。
A～C.转染重组慢病毒质粒前培养的293T细胞; D～F.重组慢病毒质粒转染293T细胞36 h后的EGFP表达; G～I.重组慢病毒质粒转染293T细胞48 h后EGFP表达。
3.4 猪Sirt2基因干扰效率蛋白水平的检测
复苏猪脂肪细胞,当汇合率达70%～80%时感染重组的慢病毒,72 h收集、提取总蛋白,用Western-blot法分别检测Sirt2蛋白的表达,并与感染对照组比较,用针对2个靶点设计的siRNA所构建的载体慢病毒侵染细胞后,Sirt2蛋白的表达显著下调,其中1号病毒载体对Sirt2蛋白表达的干扰效率最高。
1～3.分别为1号、2号、3号干扰序列。
1～3.分别为1号、2号、3号干扰序列。
4 讨论
脂肪组织几乎遍布于动物全身,在整个生命过程中有极强的可塑性。脂肪组织的增长是其基本生物学单位脂肪细胞数量的增加和体积增大的综合表现。从人类健康角度来说,脂肪组织的过度增生会导致肥胖及相关疾病,世界卫生组织已将肥胖定义为全球范围内的流行病,它已成为目前全球最严重的问题之一。从畜牧业的角度来讲,降低畜禽体脂沉积和改善畜禽产品的品质一直是动物科学家们的主要研究目标[7]。因此,研究脂肪细胞增殖、分化机理对于探讨肥胖及相关疾病的预防与治疗,特别是对于在细胞和分子水平上筛选有效药物以及提高畜牧业生产的经济效益等方面具有重要意义[8]。
RNAi 作为新兴的基因阻断技术,理论上可用于治疗任何由于单个基因高表达引起的疾病。这是利用经由小发夹RNA (short hairpin RNA,shRNA) 切割形成的siRNA 来诱导序列特异的目的基因沉默[2],为内源性功能基因研究和基因治疗提供了新的策略。
由于慢病毒载体背景比较清楚,感染效率高,具有较高的靶向性,并能通过基因整合稳定、持久地产生siRNA 而发挥沉默效应[3,4]。应用病毒进行RNAi,可以感染不同细胞类型(如分裂细胞、静止细胞),同时还可以提高siRNA转入细胞效率并进行活体转染。
因此,干扰Sirt2为进一步观察Sirt2基因表达沉默后对脂肪细胞生物学特性的影响奠定了基础,也为研究猪Sirt2基因在脂肪细胞分化及脂解中的作用提供了试验依据。
参考文献
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干扰载体 篇2
腺病毒载体介导的GFP基因在鸭胚成纤维细胞中的表达及RNA干扰
目的:建立在鸭胚成纤维细胞(DEF)中进行RNA干扰(RNAi)的技术平台,为鸭基因组功能的研究提供新的技术手段.方法:以绿色荧光蛋白(GFP)基因为报告基因,脂质体转染化学合成的GFP特异小于扰RNA(GFP-siRNA),用流式细胞仪测定GFP-siRNA对重组腺病毒(Adv-GFP)介导的GFP基因在DEF中表达的干扰效果.结果:200 MOI(感染复数)Adv-GFP介导的GFP基因在DEF中表达效率最高,为31.20%+3.11%,对DEF的`活力无明显影响;GFP-siRNA能有效干扰GFP基因在DEF中的表达,相对抑制率为98.56%.结论:在DEF中进行RNAi是可行的,Adv-GFP是介导外源基因在DEF中表达较为理想的载体;首次建立了在DEF中进行RNAi的技术平台,为鸭基因组的功能等研究提供了新的技术手段.
作 者：孟宇航 汤承 杨发龙 邓书 岳华 于学辉 MENG Yu-Hang TANG Cheng YANG Fa-Long DENG Shu YUE Hun YU Xue-Hui 作者单位：西南民族大学,生命科学与技术学院,四川,成都,610041刊 名：生物技术通讯 ISTIC英文刊名：LETTERS IN BIOTECHNOLOGY年，卷(期)：19(3)分类号：Q78 R394关键词：鸭胚成纤维细胞 RNA干扰 腺病毒载体 绿色荧光蛋白 鸭
干扰载体 篇3
关键词：慢病毒,载体,RNA干扰
慢病毒 (Lentivirus, LV) 是逆转录病毒科的病毒成员。慢病毒感染细胞后, 在自身逆转录酶的作用下以病毒基因组RNA为模板逆转录形成双链DNA中间体, 然后整合到宿主细胞染色体DNA上, 作为细胞基因组的一部分, 随着细胞基因组的复制和细胞分裂传递下去, 并且在宿主RNA聚合酶的作用下转录形成新的子代病毒。慢病毒载体较逆转录病毒载体有更广的宿主范围, 慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒作为siRNA的携带者, 不但具备特异的使基因表达沉默的能力, 而且还能充分发挥慢病毒载体自身所具备的优势, 为基因功能的研究提供强而有力的工具。
1 慢病毒载体的特点、构建及产量
慢病毒载体是以人类免疫缺陷Ⅰ型病毒 (HIV-1) 为基础发展起来的基因治疗载体, 对分裂期细胞和非分裂期细胞均具有感染能力。
1.1 慢病毒载体的特点
慢病毒经过改造成为慢病毒载体, 改造的目的主要是提高生物安全性及增加外源基因的表达效率。各种慢病毒载体的结构和作用机制基本相同。
慢病毒载体的最大特点是在感染分裂期细胞的同时, 还可以感染非分裂期细胞, 并可在宿主体内长期表达, 且不易诱发宿主免疫反应, 安全性好。此外, 由于慢病毒有强大的包装能力, 一般认为可达8~10 kb, 因此适用于多基因表达系统。慢病毒在整合时并不倾向于转录的起始位点, 而是在基因的整个转录区域都可以整合, 整合的慢病毒对启动子的激活机会会更低。因此, 与其他致癌逆转录病毒载体相比, 慢病毒载体更不易引起插入突变。
1.2 慢病毒载体的构建及产量
慢病毒基因组结构复杂, 除了含有gag、pol、env 3个逆转录病毒共同具备的结构基因及5′端和3′端LTR结构外, 还包括4个辅助基因vif、vpr、nef、vpu和2个调节基因tat和rev。质粒一携带了gag/ pol编码序列及RRE;质粒二包含了编码rev的序列;质粒三是载体质粒;质粒四表达env。4个质粒系统包装的病毒大部分转录失活, 即使在病毒基因组发生重组的情况下, 病毒基因组的复制也会受到限制, 从而其安全性显著提高并且对细胞转导效率无影响。慢病毒载体的构建要尽可能除去反式功能基因序列, 并以外源基因来代之, 同时保留或部分保留病毒本身的LTR及病毒的包装信号ψ。包装细胞可以为缺陷型病毒提供所需要的各种蛋白, 带有目的基因的重组慢病毒载体转染包装细胞虽然自身不能表达所必需的病毒蛋白, 但此载体含有完整的包装信号, 在包装细胞提供包装蛋白的情况下可以包装成缺少病毒gag、pol、env蛋白编码基因的重组病毒颗粒, 该病毒颗粒只能感染并整合宿主细胞, 不能在宿主细胞内再产生子代病毒, 这样增强了安全性, 但载体与包装前病毒DNA的简单重组可能会产生野生型病毒。基于以上的不足, 将gag、pol及env基因分别组装在两个质粒之中, 即一个表达gag和pol, 另一个表达env, 其基因组都不含包装信号ψ、LTR等。
目前, 慢病毒载体生产体系产量偏低, 为了适应规模化应用的需求, 利用并改造Moss发明的VV/T7瞬时表达系统, 以获得高拷贝数的慢病毒载体。该系统蛋白质表达迅速, 产量高, 原因在于T7RNA聚合酶由痘苗病毒指导合成, 慢病毒载体的RNA由T7RNA聚合酶指导合成, 使得慢病毒载体的生产不依赖慢病毒天然复制途径, 充分发挥痘苗病毒表达系统瞬时高效的特点, 避开细胞障碍的限制, 提高慢病毒载体效价。此外, 痘苗病毒表达不依赖于宿主细胞, 不涉及RNA从胞核到胞质的转运, 这样可以完全去除rev蛋白编码序列和RRE元件, 只保留HIV-1来源的gag-pol蛋白编码序列, 最大限度地减少了病毒源性序列, 使系统表达效率提高, 进而有利于产量的提高。
2 慢病毒介导的RNA干扰
2.1 RNA干扰的作用机制
RNAi (RNA interference) 即RNA干扰, 也称RNA干涉, 是由外源或内源性的双链RNA (dsRNA) 导入细胞而引起的与dsRNA同源的mRNA降解, 进而抑制其相应的基因表达。RNAi是一种序列特异性的转录后基因沉默 (PTGS) 机制, 它通过一段dsRNA导致同源mRNA降解从而使目的基因失去表达。现已阐明RNAi发生机制的大致模型: ①启动阶段。 由RNA病毒入侵, 转座子转录, 基因组中反向重复序列转录等所产生的dsRNA分子在细胞内被Dicer核酸酶剪切成21~23 nt siRNA。②效应阶段。RNAi特异性的核酸外切酶、核酸内切酶、解旋酶、辅助识别同源序列蛋白和其他一些蛋白与siRNA结合形成RNA诱导沉默复合体——RISC (RNA inducing silence complex) , 识别靶mRNA, 其中反义链与靶mRNA互补结合, 正义链则被置换出来, 然后RISC中的RNaseⅢ (可能是Dicer) 在靶mRNA与siRNA结合区域的中间将其切断。③级联放大阶段。在RNA依赖性RNA聚合酶 (RdRP) 的作用下, 以mRNA为模板、siRNA为引物扩增产生足够数量的dsRNA, 并将dsRNA作为底物提供给Dicer酶产生更多的siRNA, 从而使效应阶段反复发生。
2.2 慢病毒RNA干扰的表达载体
目前, 慢病毒被广泛应用于表达RNAi的研究中。采用事先在体外构建并能表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA, 从而使脂质体有效转染的细胞种类增加, 其对基因表达的抑制效果不逊于体外合成siRNA, 在长期稳定表达载体的细胞中甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA表达载体中, 是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的, 这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列, 并且合成的RNA不会带polyA尾。
慢病毒载体介导的RNA干扰, 就是将慢病毒载体高效感染和整合的特性与RNA 干扰特异性抑制同源基因表达的作用结合起来。慢病毒RNA干扰的表达载体有两类:一类分别转录有义RNA和反义RNA, 两条链在细胞内互补结合生成siRNA;另一类则转录短发卡RNA (shRNA) 。后者较常用, 其结构主要由慢病毒载体骨架和shRNA表达框组成。shRNA表达框主要包括:RNA聚合酶Ⅲ (PolⅢ) 依赖的启动子、shRNA结构序列及终止子。慢病毒感染细胞后, 将此shRNA表达框整合到宿主细胞基因组中。shRNA在宿主细胞被转录后, 两段互补序列碱基配对结合, 中间序列则成为茎环结构。茎环结构可被Dicer酶识别并切除, 产生的siRNA将执行RNA干扰。
2.3 慢病毒介导的RNA干扰特点
RNA干扰技术相对于传统的基因敲除技术具有投入少、周期短、操作简单等优点。 已被广泛应用于基因功能、信号转导和基因治疗等方面的研究中, 慢病毒载体介导的外源RNA干扰序列进入宿主细胞具有很多优势: (1) 相对于质粒载体介导的RNA干扰其产生的剔降作用持续而稳定; (2) 可感染分裂期细胞或非分裂期细胞; (3) 可感染啮齿类动物的受精卵并将其基因组整合到宿主染色体中, 从而获得特异性的剔降相关基因的转基因动物模型。
2.4 慢病毒介导的RNA干扰在动物病毒学中的应用
慢病毒载体与siRNA技术结合抑制特异基因的表达或敲除可能会成为制备抗病毒动物的有效方法。预计使用这种小的RNA不会影响动物的生理功能, 并且siRNA能在动物体内高效表达抑制致病病毒转录产物产生或表达。慢病毒与siRNA结合使用对于改良动物生长性状、提高饲料利用率和抗病能力都具有重要意义。特别是禽类受精卵产于体外时已经处于桑椹胚阶段, 采用慢病毒作为基因转移的载体具有很大的优越性。慢病毒载体法具有转染率高和转基因高表达的特点, 已成为转基因动物方法学上的一个新突破。
干扰载体 篇4
在前期工作中,我们构建和筛选了针对Survivin基因的shRNA重组质粒载体,制备了能够高效转染的基因载体——壳聚糖-聚乙二醇纳米颗粒,并制备出壳聚糖-聚乙二醇纳米粒介导的Survivin RNAi基因纳米复合物。初步实验结果表明本实验所制备出的CS-PEG是低细胞毒性的,纳米颗粒的大小适合用作基因递送,具有良好的基因保护功能、长循环能力和较高的载药量、包封率(另文报道)。本实验探讨了该纳米基因载体介导RNA干扰沉默Survivin基因对大肠癌细胞增殖和凋亡的影响,为寻找大肠癌基因靶向治疗提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
大肠癌HT-29细胞株购自中南大学细胞生物学教研室。Metafectene pro转染脂质体(德国Biontex公司);RPMI-1640培养基,杭州吉诺生物医疗技术有限公司;胎牛血清,天津T13D公司;胰蛋白酶,Gibco公司;Trizol试剂,美国Invitrogen公司;DNA Marker ladder 2000,大连宝生物工程公司;Western Blot检测试剂盒,美国Promega公司;碱性磷酸酶标记的羊抗兔二抗,美国Promega公司;RT-PCR试剂盒,大连宝生物工程公司;细胞凋亡检测试剂盒,武汉博士德生物工程有限公司;Survivin si RNA靶序列的设计则根据Genebank提供的基因序列,利用从Genbank中寻找Survinvin基因的m RNA序列,参照si RNA设计原则,设计针对Survivin的si RNA序列,再利用BLAST(http//www.ncbi.nih.gov/blast/Blast.cgi)分析所设计序列的特异性。以与人类基因无同源性的无关序列HK作为阴性对照。将设计的序列交上海吉凯生物公司体外合成靶向Survivin基因的si RNA(GGACCACCGCATCTCTACA)和1条阴性对照si RNA(GACTTCATAAGGCGCATGC)。
1.2 方法
1.2.1 细胞的复苏和培养
将装有人结肠癌细胞株HT-29的冻存管从液氮罐容器中取出后迅速在37℃水浴缸中摇动融化,移入无菌离心管,加入4m L含10%小牛血清的RPMI-1640培养基,37℃1000 r/min离心10 min,除去上清以除去冻存液中的二甲基亚矾(DMSO);加入含血清的培养基5 m L,混匀置入25 cm的培养瓶中,用含100 m L/L胎牛血清的RPMI-1640进行常规培养,待细胞融合度达80%,消化收集细胞。
1.2.2 RT PCR检测转染前后HT-29细胞Sur-vivin mRNA的表达
将HT-29细胞接种于培养瓶中,分为A组(转染壳聚糖-聚乙二醇纳米粒介导的Survivin shRNA的基因-纳米复合物)、B组(转染结合相同Survivin shRNA的脂质体)和C组(阴性对照shRNA)。各组细胞在不同时间用Trizol提取细胞RNA,进行RT PCR检测。
1.2.3 细胞凋亡率和细胞周期分布的检测
实验分为A组、B组和C组,每组设3个复孔,细胞培养及转染方法同前。转染后72 h,将细胞用0.25%胰酶常规消化,轻轻吹打,制成单个细胞悬液。PBS漂洗3次(离心1 000 r/min,5 min),弃上清,加入预冷的70%冰乙醇1 m L振荡混匀,-20℃内固定24 h后使用。取固定好的细胞,1 000 r/min离心5 min,去上清,PBS洗涤2遍。加入50μg/m L的RNAse,室温避光30 min,去除细胞的RNA。加入60μg/m L的碘化丙啶(PI),溶液避光染色30 min后待用。采用Beckon/Dickinson Facssort型流式细胞仪,在480 nm波长处检测,进行细胞凋亡率检测及细胞周期分析。应用相应程序软件进行资料的处理和分析;细胞增殖指数(PI)=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%。
1.2.4 MTT法检测细胞死亡率
将HT-29细胞按1×10/孔接种于96孔板,常规培养;分别于转染后第24、48和96小时弃去各孔培养基,加入MTT及无酚红RPMI-1640;继续孵育4 h后加入DMSO,振荡10min使结晶充分溶解;在酶联免疫仪上,570 nm处测定光吸收值,记录结果;按下列公式计算细胞死亡率:细胞死亡率=(1-实验组平均D值/对照组平均D值)×100%
1.3 统计学分析
采用SPSS 13.0统计软件包进行统计学处理。计数资料以均数±标准差描述,成组的计量资料采用方差分析,比较采用t检验或者最小显著差法(LSD),以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 HT-29细胞中S urvivin mRNA的表达
从图中见GAPDH的m RNA在基因转染前后的含量大致相等,说明制备的纳米载体及重组质粒均不影响GAPDH的表达,以Survivin/GAPDH比值作为Survivin m RNA的相对含量方法具有可靠性。在C对照组和B组均可见明显的Survivin目的DNA条带,B组的Survivin m RNA的表达丰度较C组有所下降,但并不明显。A组的Survivin基因m RNA水平较B、C组明显下调(附图),组间差异有统计学意义(P<0.01)。
2.2 HT-29细胞凋亡率和细胞周期分布的检测
各组细胞的凋亡率和增殖指数如表1,结果显示:A组细胞凋亡率显著高于其他各组,细胞的增殖指数明显低于其他各组;C组细胞死亡率最低,增殖指数最高。
注:1)与阳性对照组和阴性对照组比较,P<0.001;
2)与阴性对照组比较,P<0.05
2.3 CS-PEG介导RNA干扰沉默Survivin基因对HT-29细胞死亡率的影响
利用MTT法进行检测,在转染后24、48和96h,实验各组细胞死亡率如表2,用平方根反正弦转换数据进行完全随机设计方差分析,通过两两比较结果提示:转染后第24、48和96小时,A组细胞死亡率显著高于其他各组,C组细胞死亡率最低(见表2)。
3 讨论
Survivin是近年来发现的一种凋亡抑制因子,属于凋亡抑制蛋白(IAP)家族的新成员。Survivin能抑制Fas、bax及Caspase-7诱导的细胞凋亡,而在已凋亡的细胞中,Survivin m RNA的表达显著下调。癌细胞由于Survivin对凋亡的抑制,细胞得以继续分裂,使肿瘤邻近和远隔部位转移灶形成[9]。近年来研究证明Survivin不仅抑制肿瘤细胞凋亡,还与肿瘤细胞的增殖有关,肿瘤组织中过度表达Survivin会促使肿瘤细胞不断分裂增殖,加快肿瘤生长。作为IAP家族中目前发现的唯一同时参与细胞凋亡与周期调控的分子,Survivin对维持细胞快速增殖及肿瘤细胞的“正常生理功能”具有非常重要的作用。其异常表达可能与直肠癌的恶性生物学行为有关,Survivin表达阳性的直肠癌更倾向于出现转移、血管浸润等恶性行为[10]。更重要的是,Survivin具有高度选择性地表达于胚胎发育组织和大多数肿瘤组织,而在正常成熟组织中不表达[10,12]。基于以上特性,Survivin可作为肿瘤治疗的理想靶基因,阻断其表达有特异性地防治癌症的发生发展和转移的作用。因此,应用RNAi技术沉默Survivin诱导大肠癌细胞凋亡及抑制其生长增殖,是一个新的研究热点。但是RNA干扰仍存在一个关键问题,即如何使尽量多的shRNA分子到达目的细胞并持续发挥干扰作用,目前多采用脂质体直接包裹人工合成的改性si RNA或包裹携在宿主细胞中表达si RNA的前体分子(即shRNA)进行转染。但以上两种方法的缺陷在于:基因表达时间短,表达量低,无法达到满意的效果。为了解决这一问题,本研究在前期制备出了壳聚糖-聚乙二醇纳米粒作为基因载体,并由其介导针对人Survivin的shRNA,形成基因纳米复合物。初步实验结果表明本实验所制备出的CS-PEG是低细胞毒性的,纳米颗粒的大小适合用作基因递送,具有良好的基因保护功能、长循环能力和较高的载药量、包封率。
本实验证明壳聚糖-聚乙二醇纳米粒作为基因载体介导RNA干扰沉默Survivin基因能高效转染结肠癌细胞株HT-29并使其携带的外源性基因有效表达,同时,研究结果也表明:其能够长期、高效地抑制结肠癌细胞(HT-29)中Survivin蛋白的表达,诱导癌细胞凋亡并抑制其增殖。另外,壳聚糖-聚乙二醇纳米基因载体的特性,使得该纳米粒介导的Survivin RNAi基因纳米复合物,能较长时间地抑制结肠癌细胞HT-29中的Survivin基因,且能够克服RNA干扰在肿瘤的基因治疗中作用短暂和不能持久作用的不足。
参考文献
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干扰载体 篇5
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 质粒与菌株。
大肠杆菌BL21、Rossta和毕赤酵母KM71均购自北京全式金生物技术有限公司;p MD-18T克隆载体为Promega公司产品;表达载体p ET-28a和PGAPZαA由山东农业大学畜牧兽医学院馈赠。
1.1.2 酶和试剂。
T4 DNA连接酶为Ta Ka Ra公司产品;限制性内切酶Eco R I、Not I和AVRⅡ为宝生物公司产品;普通DNA聚合酶、蛋白质Marker 2000和BCA蛋白定量测定试剂盒、高纯度质粒小提试剂盒和U-NIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒为上海生工生物工程技术服务有限公司产品;PCR产物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 干扰素基因的获得及密码子优化。参照NCBI中已发表的鸡α干扰素基因序列 (AB021154) , 根据大肠杆菌密码子偏好性对去除信号肽基因序列的干扰素基因的进行密码优化。
1.2.2引物设计。根据密码子优化后的干扰素基因, 利用Primer 5.0软件设计1对引物。IFN-α-F1:5-AATGAATTCTGTAACCACCTGC-3 (Eco RⅠ) ;IFN-α-R1:5-ATTGCGGC-CGCTTAAG TACGA-3 (NotⅠ) ;真核通用型引物:p GAP-F:GTCCCTATTT-CAATCAATT-GAA;AO-X1:GCAAATGG-CATTCTGACATCC引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.2.3 克隆质粒p MD-18T-IFN-α的构建。鸡α干扰素全基因的PCR扩增、克隆与序列测定参照《分子克隆试验指南》, 以人工合成的干扰素基因为模板, 采用引物IFN-α-F1和IFN-α-R1进行PCR扩增。反应程序为94℃预变性3 min;94℃30s, 55℃45 s, 72℃1 min进行35个循环;最后72℃延伸10 min。PCR产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳, 参照DNA凝胶回收试剂盒说明书回收489 bp处DNA带, 回收的PCR产物与PMT-18T载体连接, 转化E.coil DH5α感受态细胞。挑选多个菌落接种含Kan的LB液体培养基, 37℃过夜培养, 提取质粒进行PCR、双酶切和测序鉴定。
1.2.4 原核表达载体PET-28a-IFN-α的构建。将鉴定为阳性的干扰素基因克隆质粒和PET-28a分别进行Eco RⅠ和NotⅠ双酶切, 回收酶切产物后连接, 转化至Rossta菌感受态细胞中, 挑选数个单个菌种进行PCR、双酶切和测序鉴定。
1.2.5 真核表达载体p GAPZαA-IFN-α的构建。将鉴定为阳性的干扰素基因克隆质粒和p GAPZαA分别进行Eco RⅠ和NotⅠ双酶切, 回收酶切产物后连接, 经AVRⅡ线性化后, 与p GAPZαA连接转化至毕赤酵母KM71感受态细胞中, 在含博莱霉素平板中挑选数个单菌落进行PCR、双酶切和测序鉴定。
2 结果
2.1 干扰素基因密码子优化
根据原核表达受体菌大肠杆菌Rossta和毕赤酵母对密码子的偏好性, 对Genebank中收录的鸡干扰素基因序列进行密码子优化, 结果如图1所示, 对原基因序列91个碱基位点进行了改变, 干扰素蛋白序列保持不变, 大肠杆菌和毕赤酵母对其偏好性增强。
2.2 干扰素基因克隆质粒p MD-18T-IFN-α的构建
将合成的干扰素基因片段与克隆质粒p MD-18T进行连接、转化, 对提取的质粒进行PCR、双酶切和测序鉴定, 显示转入大肠杆菌DH5α中的质粒为阳性质粒, 成功构建了干扰素基因的克隆质粒p MD-18T-IFN-α。
2.3 干扰素基因原核表达载体p ET-28a-IFN-α的构建
将鉴定为阳性的重组克隆质粒和原核表达载体p ET-28a分别进行双酶切、回收、连接转化大肠杆菌Rossta中, PCR和双酶切鉴定 (见图2和图3) 及测序结果显示成功构建了干扰素基因的克隆质粒p ET-28a-IFN-α。
2.4 干扰素基因真核表达载体p GAPZαA-IFN-α的构建
将鉴定为阳性的重组克隆质粒和真核表达载体p GAPZαA分别进行双酶切、回收、目的片段与表达载体连接后, 用AVRⅡ进行线性化, 进行1.5%琼脂糖凝胶电泳, 结果如图4所示, 线性化后的重组质粒大小要高于为空质粒大小, 未线性化质粒出现两种存在形式, 在此基础上完成了重组质粒的转染。转染后对筛选的阳性克隆子进行特异性引物扩增, 成功获得鸡IFN-α基因的目的片段;通用型引物成功扩增出目的片段, 大小在1000bp处, 如图5所示;而双酶切结果同样获得了预期结果, 如图6所示。
注:M1:DNA Marker 2000; (1) 重组质粒p GAPZαA-IFN-αAVRⅡ线性化结果; (2) IFN-α基因回收结果; (3) 质粒p GAPZαA回收结果; (4) 重组质粒p GAPZαA-IFN-α未线性化结果;M2:DNA Marker 15000
注:1:阴性对照;2-3:特异性引物PCR扩增结果;4:通用型引物PCR扩增结果;M:DL2000。
注:M1:DL15000;1-3:阳性转染子双酶切结果;4阴性对照;M2:DL2000
3 讨论
目前, 随着我国养鸡规模的逐渐加大和集约化程度的不断提高, 疾病的发生、发展、流行、预防一直是行业内关注的问题, 重大流行性疾病, 尤其是原发性的病毒病, 如新城疫、禽流感, 鸡传染性支气管炎等所带来的危害越来越严重, 给养鸡业造成了重大经济损失, 所以对病毒病的防治不容忽视, 寻求一种好的治疗型制剂显得尤为必要。近年来, 干扰素因其作用机理的独特性而具有广谱的抗病毒活性和免疫增强作用 (Richard E R和Stephen G, 2008;Jennifer Z等, 2009) , 一直是病毒学、细胞学、分子生物学、临床医学、免疫学、肿瘤学等相关领域的研究热点。研究表明, 重组干扰素与天然干扰素具有同样的抗病毒和免疫调节活性, 因此重组干扰素的研究和应用将成为家禽养殖中增强鸡的免疫, 减少发病, 降低鸡的死亡率的重要方向 (周海龙等, 2007) 。但重组干扰素与天然干扰素相比又有着诸多不同, 天然干扰素活性很好, 但获得手段相对单一, 且产量不高, 一定程度上影响了干扰素制品的开发与应用;重组干扰素则是利用基因工程手段, 选择不同的表达系统, 可以获得较高产量的干扰素。
本研究根据Genebank中发表的及α干扰素基因序列和大肠杆菌密码子偏好性, 对干扰素基因进行了密码子优化后人工合成编码干扰素成熟蛋白的基因序列, 在此基础上完成了干扰素重组质粒原核和真核表达载体的构建。在整个实验设计过程中, 考虑到要在原核生物中表达真核基因, 信号肽由于缺少相应的受体而无法发挥作用, 所以我们在人工合成基因片段的过程中, 人为的去掉了干扰素信号肽序列。此外, 考虑到工业化生产的需要, 采用了不用诱导即可表达的真核表达载体p GAPZαA, 以期获得较好的表达效果, 为干扰素便捷化工业生产提供技术支持。