干扰表达载体（精选12篇）
干扰表达载体 篇1
血管的形成在许许多多的病理和生理过程中都具有非常重要的意义[1]。血管的生成是指由原有血管出芽生长形成新生血管的过程,血管生成参与许多病理和生理过程,比如机体的再生、发育、炎症以及肿瘤的生长和转移等等[2,3]。Tie2是血管内皮细胞上特异的酪氨酸激酶型受体,为促血管生成素Ang1和Ang2的共同受体。它们与血管的形成有着密切的关系,在血管的发生发展、成熟和稳定中发挥着非常重要的作用[4,5,6,7]。Tie2在人类肿瘤的血管系统结构中广泛存在,不过主要存在于血管内皮细胞中[8,9],而在正常组织中非常有限制的表达,因此Tie2基因将在抗血管生成的癌症治疗中发挥重要的作用[10]。
RNA干扰是由双链RNA(dsRNA)转化成小分子干扰RNA(si RNA)所介导的一种基因沉默的过程[11],在生物进化的过程中发挥着相当重要的作用,是1998年由FIRE首次发现并命名的转录后水平的基因沉默[12]现象,是目前基因治疗研究和基因的功能研究的热点之一[13]。RNA干扰技术出现以后,由于其具有高效性和严格的序列特异性,因此常常被人们应用于基因治疗和基因功能分析中[14]。由于质粒介导RNA干扰技术具有一定的局限性,即转染细胞的效率较低,抑制基因的表达作用弱,而且持续时间短,因而目前已经较少作为介导RNAi的载体。慢病毒载体是一种常见的复制缺陷型逆转录病毒载体,其具有许多优点,如其能够转染分裂期细胞甚至非分裂期细胞,将其应用于肿瘤的基因治疗中,可显著提高细胞的转染效率以及RNAi的抑制效率,为肿瘤的基因治疗研究开辟新的思路。
1 材料与方法
1.1 菌株、质粒和主要试剂
293T细胞、大肠杆菌DH5a,三质粒慢病毒系统pNL-EGFP,pVSVG,p Helper由福建师范大学生命科学院发育生物学研究室惠赠,pSilencer1.0-U6-Tie2-si RNA重组质粒由本实验室保存,所有DNA限制性内切酶,RNase A,去磷酸化酶CIAP,T4DNA连接酶均为Fermentas公司和Ta Ka Ra公司产品,质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自上海天根公司。其他为国产分析纯试剂。
1.2 实验方法
1.2.1 pNL-EGFP-U6-Tie2-si R NA慢病毒转移质粒的构建
用GeneTool软件通过质粒图谱的分析确定我们前期构建的质粒载体pSilencer1.0-U6-Tie2-si RNA[15]和pNL-EGFP质粒的酶切位点为XbaI,将经过Xba I酶切后的含有U6启动子的Tie2-si RNA片段与经过XbaI酶切回收好的pNL-EGFP连接载体进行连接(可以通过末端去磷酸化减少载体的自连反应,减轻克隆筛选的工作量),将连接产物转化大肠杆菌Top10,涂布Amp+的LB平板,37℃过夜培养,挑取阳性菌落接种于3~5 m L Amp+的LB液体培养基中,37℃振荡过夜(200 r/min),使用QIAGEN-tip100质粒抽提试剂盒提取质粒,通过XbaⅠ酶切及测序鉴定(上海英俊公司及大连宝生公司),检测连接产物的正确性。正确产物分别命名为p NL-EGFP-U6-Tie2-si RNA-1和pNL-EGFP-U6-Tie2-si RNA-2。
1.2.2 慢病毒的包装(磷酸钙法)
取10×XμL(10μg)pNL-EGFP、10×YμL(7μg)pHelper、10×ZμL(6μg)pVSVG加入50 m L离心管混匀,再加入10×45μL 2.5M Ca Cl2,用TE补加到10×625μL,再一滴一滴加入10×625μL HEPES,室温下静置25 min,配成混合液。将10 cm的293T细胞每盘加入10μL氯喹,培养1 h后换液,再一滴一滴加入1250μL静置25 min的混合液,轻轻摇匀,放置培养箱培养观察,12 h后加入新的含血清的DMEM终止转染,放置培养箱培养观察,收集病毒上清液保存备用。
1.2.3 病毒滴度的测定
将病毒原液倍比稀释制备病毒浓度梯度感染293T细胞,测定病毒原液滴度。
2 结果
2.1 p NL-EGFP-U6-Tie2-siRNA载体的鉴定
由质粒pNL—EGFP图谱(图1)和pSilencer1.0-U6-Tie2-si RNA重组质粒的图谱(图2)可知它们都有XbaⅠ酶切位点。pSilencer1.0-U6-Tie2-si RNA重组质粒上有两个XbaⅠ酶切位点,恰好能将我们所需要的目的片段完整的切下,将其分成一条3 kb和一条415 bp左右的片段。将经过XbaI酶酶切的pNL-EGFP载体和U6-Tie2-si RNA片段以摩尔比1∶10混和进行连接反应,转化感受态细菌,最后将筛选的阳性克隆进行XbaI酶切鉴定,若是连接成功的pNL-EGFP-U6-Tie2-si RNA质粒,将切下415 bp的U6-Tie2-si RNA片段(图3)。筛选结果:图4中的泳道4、5、7、12-20为连接成功的pNL-EGFP-U6-Tie2-si RNA质粒,电泳时跑出2条带,泳道2、3、6、8-11为未连接成功的pNL-EGFP-U6-Tie2-si RNA质粒。为确定连接的序列与所设计的完全相符,利用pSilencer 1.0-U6上的T3位点进行测序(上海生工),测序结果(图5、6)表明连接成功,即筛选到含pNL-EGFP-U6-Tie2-si RNA质粒的菌株。
2.2 慢病毒的包装及滴度测定
筛选出的阳性重组质粒与慢病毒包装质粒、包膜质粒共转染293T细胞(图7),产生的病毒原液倍比稀释后分别感染293T细胞,在荧光显微镜下观察各孔中GFP的表达量(图8),病毒滴度值=(4个大方格内发绿色荧光的细胞总数/4)X 104 X病毒稀释倍数/3 000μL(3 000μL表示感染293T细胞时用的病毒体积量3 000μL)=病毒颗粒数/μL。本实验最终测得病毒原液滴度值为9×103/μL。
3 讨论
近年来Ang2/Tie2体系已成为恶性肿瘤中肿瘤血管生成领域的研究热点之一,Tie2基因在肿瘤的血管生成过程中发挥着重要的调节作用。利用各种技术沉默Tie2基因的表达来研究其与血管生成的关系,进而研究其与肿瘤生长的关系,是目前研究的热点。我们的前期实验研究结果表面Tie2-si RNA重组质粒能够抑制血管生成[16]。
该实验首先选用增强的绿色荧光蛋白(EGFP)作为慢病毒的标记基因,然后利用前期已经构建好的重组质粒载体p Silencer1.0-U6-Tie2-si RNA[15]来构建pEGFP-Tie2-Si RNA慢病毒转移质粒,通过电泳、测序鉴定正确后再用其构建Tie2-Si RNA慢病毒表达载体。该实验选用的EGFP荧光非常稳定、且清晰可见,在荧光显微镜下可以对活细胞定时、定位的观察,这样就可以随时的去观察三质粒转染293T细胞生成病毒的情况,使得实验更加直观、准确。
在生产慢病毒载体时,我们发现当293T细胞生长到培养皿全盘的70%时转染效率要比生长至培养皿全盘的75%以上的转染效率高;当293T细胞呈蓬松状成簇生长且有许多触角时,细胞的转染效率最高;然而当293T细胞且呈多克隆状生长时,细胞的转染效率低,所以调节好293T细胞的生长状态在转染的的过程中发挥着重要的作用。收集到的慢病毒原液应分装成小包装独立保存,因为慢病毒被反复冻融后其感染效率会被大大降低。该实验构建了针对Tie2基因的RNAi慢病毒表达载体,最终目的在于能够确认通过RNAi技术沉默Tie2基因的功能能够抑制肿瘤的血管生成以致抑制肿瘤的生长,为后期进行肿瘤细胞的体外干预实验及进行体内抗肿瘤血管生成的动物实验研究提供基础,为肿瘤的基因治疗提供实验依据。
干扰表达载体 篇2
RNA干扰载体活体内耳转染的可行性
目的:初步探讨RNAi技术应用于活体动物内耳的.可行性.方法:实验分为2组,左耳为手术耳,右耳为内部对照耳.手术中将阳离子聚合物混合的RNAi质粒载体通过手术于圆窗注入,测量手术前及术后1、3、7 d载体表达及畸变产物耳声发射和听性脑干反应以判别载体的表达特点及对听力的影响.结果:载体在内耳术后存在表达,对听力的影响为一过性.结论:RNAi质粒载体在内耳可以无害表达,将来可以应用于负性调节基因治疗.
作 者：李伟 孔维佳 乐建新 LI Wei KONG Weijia YUE Jianxin 作者单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院耳鼻咽喉科,武汉,430022 刊 名：临床耳鼻咽喉科杂志 ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF CLINICAL OTORHINOLARYNGOLOGY 年，卷(期)： 20(22) 分类号：Q343.1 关键词：RNA干扰 基因转换 内耳干扰表达载体 篇3
象征符号 升旗仪式 朴素情感
少年先锋队是中国少年儿童特有的组织，由中国共产党委托中国共产主义青年团直接领导。少年儿童的思想意识能够彰显中华民族的向心力和凝聚力，增强少年儿童的思想文化意识是一项重要的政治任务。
处在具体形象思维阶段的少年儿童需要通过符号的表达来养成良好的道德行为习惯，增强国家意识、科学意识、劳动意识、审美意识，还要锻炼强健的体魄，养成良好心理素质，培养朴素情感。一些符号因素是组织价值理念和文化意义的载体和象征，这些符号能把少年儿童连接融合为一个有效的整体系统。在少先队组织中，具备象征意义的符号有国旗国徽，少先队礼仪中的队旗队徽、红领巾、仪式等等，这些具有象征意蕴的符号识别性很高，可以成为“培养少年儿童对党和社会主义祖国的朴素感情”的载体。学校少先队可以以升旗仪式为载体，结合学校的办学特色，创新培养少年儿童对党和社会主义祖国的朴素感情。
一、升旗仪式
学校应重视升旗仪式，以培养少年儿童对国旗的热爱，进而表达对祖国的热爱和尊重。
1.升旗仪式具备情感表达的条件
（1） 升旗仪式能通过营造氛围增强教育性。少年儿童的爱国情感是一种高层次的情感，需要由外在高层次的情感转化为个人内在的独特情感。这一内化过程也决定了只有凭借具有象征意义的符号才能实现。主席台下整齐划一的队列，统一的着装，雄壮的《义勇军进行曲》，鲜艳的五星红旗，铿锵有力的国歌声，这样浓郁的环境氛围，自然地会将参加升旗仪式的队员带入一个富有教育内涵、庄严激情的特殊空间。
（2）升旗仪式能够提高少年儿童的思想情感。情境与情境中的主体相互依存，在这种情境里，队员从最初的直觉感受不由自主地进入了一种体验的境界，随着仪式的继续渲染，队员的思想情感也在升华，这种体验会让外在的情感渗透到队员的内心世界，内化为队员比较稳定的情感态度和价值观。蕴含教育意义的升旗仪式在提高队员思想情感的同时，也实现了仪式教育的目标。
2.升旗仪式的设计者
少先队组织的主要教育内容是政治社会化，而升旗仪式是政治社会化在学校中的一个突出体现，同时也需要一个载体来营造庄重、严肃的教育氛围[1]。因此，升旗仪式的设计者需要制定相关的制度作为保障。例如，在举行升旗仪式时，对相关的人员就有具体的规定：中队辅导员必须带领队员到操场指定区域，任课教师及学校领导必须站在指定位置上，仪式开始后不要随意走动、交头接耳，升国旗时要肃立、行注目礼等等。教师的表率作用也能向队员灌输对党和社会主义祖国的朴素感情。
3.升旗仪式的参与者
作为升旗仪式参与者之一的仪式设计者、辅导员、任课教师、校长、校外辅导员等等，更多扮演的是维护秩序的角色，尽量让现场进度控制在预期的范围内，而不考虑内容设计的效果及仪式结束后队员的感想，也就意味着对升旗仪式的主要参与者——队员在仪式中的体验感受关注不够，最终造成了“重仪式，轻内涵”的后果。
二、升旗仪式忽视儿童的体验
1.忽视儿童在仪式中的主体性
在教育的组织形式中，少先队的孩子们通过在自己的组织里接受集体生活的教育和锻炼，发挥主动性、积极性和创造性，形成自我管理、自我教育的能力。在教育方法上，则多根据少年儿童的特点，通过辅导员及教师指导，少先队员自己设计组织丰富多彩的活动来进行教育。通过少先队活动让少年儿童“参与实践”是少先队教育的重要特征[2] 。2015年9月30日，某市Y小学为了迎接国庆、庆祝抗日战争胜利70周年而举行了“升国旗、唱国歌，千人宣誓报效祖国大会”，当代表中华五千年传统文化的圣火第一次没有被点燃、相关人员想办法弥补失误时，主席台下的队员们不是安静地等待着火光的出现，而是不耐烦地扭动着身躯在交头接耳；当队员举着圣火绕场一周时，主席台上的《少年中国说》的诵读也在进行着，主席台下的队员们却没有跟着一起朗读《少年中国说》，而是看着手举圣火奔跑的队员，发出一阵阵的欢呼声，他们的目光随着圣火移动着，直到圣火再次回到主席台才捧起手中的台本齐声朗读着催人奋进的《少年中国说》。
在这场活动中，队员与设计者预想不一样的表现提醒设计者需要在活动前进行指导。设计者需要在活动举办前利用一次队会课向队员们传达一些关于仪式的“认知”层面的礼仪，通过形象化的比喻来说明哪种行为方式更符合场景。
2.无视队员的认知水平差异
《少年中国说》中“鹰隼试翼，风尘翕张，奇花初胎，矞矞皇皇。干将发硎，有作其芒。”这些语句对于低年级队员来说有一定的理解困难，虽然下发了白话文的解释，可是笔者通过对队员以及相关任课教师的了解发现，他们之前没有集中学习过《少年中国说》。如果队员对《少年中国说》比较了解，那么下面的对话也许就会转变为符合仪式设计者初衷的对话。
笔者：今天你们要参加什么活动呀？
队员1：要参加一个活动。
笔者：什么活动呢？
队员1：转头没理我。
队员2 ：升国旗、唱国歌，千人宣誓报效祖国大会。（队员2 拿着稿纸读的）
队员3：我知道，《少年中国说》。中国强则中国强，少年富则中国富……
队员4：不对，是少年富则中国富，中国强则中国强…
笔者：你们可明白这段话的意思啊？
队员3和队员4笑着摇摇头。
这样的千人宣誓报效祖国大会将仪式教育关注的重点放在最后的标志性阶段，如场景的规模、 仪式的影响力（社会效益）、 场面的隆重程度、 程序的完整性，甚至仪式的奢华程度，以至于仪式教育重“式”轻“仪”，重“结果”轻“过程”，重“形式”轻“效果”，重“瞬时表现”轻“潜移默化”，重领导“意图展示”轻师生“精神养成”，重个体“口号呼吁”轻群体“躬身践行”[3]，当然也就无法让设计者注意到参与主体的认知水平差异。
3.仪式缺乏创新性
在升旗仪式中，每周一个主题的“国旗下讲话”、表彰优秀中队、讲解优秀队员事迹以及特殊仪式活动等等，都是一本鲜活的爱国主义教材，这种多样化的仪式内容，经过几个学期的提炼，在潜移默化中能对少先队员进行润物无声的教育。比如，Y小学这次活动中的“集体诵读少年中国说”环节，就可创新性修改为高年级领读环节、高年级向低年级队员解读少年中国说环节、低年级队员谈谈自己的理解以及队员家长谈谈倾听感想等。各个中队因分工不一样，可以把承担升旗仪式的机会当作展示中队风采的平台，少先队员在其中的表现也会使升旗仪式的教育内涵在不断地自我回顾与反思中得到升华。创新性的升旗仪式不但不会减少升旗仪式的庄重感，还会增加升旗仪式的深刻性与有趣性，进而营造一个宽松自由的氛围，实现意蕴丰富的教育意义。
三、升旗仪式的情感诉求
1.尊重儿童的体验
虽然仪式设计的框架很完美，但设计内容只有真正触动队员的内心、符合队员的兴趣、激发队员的好奇心，能快速与队员产生情感上的共鸣，才能将外在高层次的爱国情感转化为内在的个人情感，从而以自己的实际行动去表达爱国热情，潜移默化地养成良好的行为习惯。升旗仪式只有在形象生动的表层设计上更关注仪式前的细致指导、仪式中的真实体验、仪式后的丰富感想，才能揭示设计者设计活动的用心所在。
2.注重仪式的创新性
将升旗仪式与中国比较隆重的节日相结合是仪式中的创新设计。节日是具有中国文化意蕴的象征符号，象征着中华民族的文化和思想，凝结着民族精神和民族情感，因此学校的仪式教育必须具有创新性。例如每周一的升旗仪式，如果仪式设计者不注重形式的创新性、内容的丰富性、主题的时代性，那么全体参加人员就会觉得枯燥乏味，将一项本来庄严肃穆的升旗仪式看成不得不完成的任务，固定的程序、相同的讲话，必然难以在学生心中留下记忆。社会心理学的研究表明，重复率与态度改变呈倒U型曲线相关[4] 。因此，在小学阶段，学校如果能够将仪式教育很好地融入儿童的思想意识里，那么他们走向社会后在任何一个组织里都会有积极向上的态度。
3.深化仪式的文化内涵
仪式是学校文化的载体，将仪式所蕴含的文化意蕴形象地传达给学生，有助于学生自觉地产生自我身份认同感和对于组织的深层理解，在情境中感受仪式的符号体验与对于组织的记忆。学校仪式活动的本然目的是通过种种感性手段，设置具有强烈的情绪唤起和渲染作用的仪式情境，让学生个体感知并接受各种象征符号所传达的理念文化、情感态度以及生命体验等正向的教育内容，潜移默化间实现学生的成长进步[5] 。学校要重视仪式主题的选择，根据主题设计贴切的活动形式，让富有文化内涵及新颖外观的仪式活动传承学校的文化精神。
参考文献
[1] 张文博.浅谈主题升旗仪式的思想性和教育性[J].教学实践，2004（9）.
[2] 陈德杰.谈新时期少先队文化建设[J].教育教学研究，2013（12）.
[3] 王秋芳.小学仪式教育的异化和重构[J].教学与管理，2014（12）.
[4] 郭毅然.重复率与学校德育实效性的社会心理分析[J].教育导刊，2011（1）.
[5] 张家军，陈玲.学校仪式教育的价值迷失与回归[J].中国教育学刊，2016（2）.
干扰表达载体 篇4
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 质粒与菌株。
大肠杆菌BL21、Rossta和毕赤酵母KM71均购自北京全式金生物技术有限公司;p MD-18T克隆载体为Promega公司产品;表达载体p ET-28a和PGAPZαA由山东农业大学畜牧兽医学院馈赠。
1.1.2 酶和试剂。
T4 DNA连接酶为Ta Ka Ra公司产品;限制性内切酶Eco R I、Not I和AVRⅡ为宝生物公司产品;普通DNA聚合酶、蛋白质Marker 2000和BCA蛋白定量测定试剂盒、高纯度质粒小提试剂盒和U-NIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒为上海生工生物工程技术服务有限公司产品;PCR产物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 干扰素基因的获得及密码子优化。参照NCBI中已发表的鸡α干扰素基因序列 (AB021154) , 根据大肠杆菌密码子偏好性对去除信号肽基因序列的干扰素基因的进行密码优化。
1.2.2引物设计。根据密码子优化后的干扰素基因, 利用Primer 5.0软件设计1对引物。IFN-α-F1:5-AATGAATTCTGTAACCACCTGC-3 (Eco RⅠ) ;IFN-α-R1:5-ATTGCGGC-CGCTTAAG TACGA-3 (NotⅠ) ;真核通用型引物:p GAP-F:GTCCCTATTT-CAATCAATT-GAA;AO-X1:GCAAATGG-CATTCTGACATCC引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.2.3 克隆质粒p MD-18T-IFN-α的构建。鸡α干扰素全基因的PCR扩增、克隆与序列测定参照《分子克隆试验指南》, 以人工合成的干扰素基因为模板, 采用引物IFN-α-F1和IFN-α-R1进行PCR扩增。反应程序为94℃预变性3 min;94℃30s, 55℃45 s, 72℃1 min进行35个循环;最后72℃延伸10 min。PCR产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳, 参照DNA凝胶回收试剂盒说明书回收489 bp处DNA带, 回收的PCR产物与PMT-18T载体连接, 转化E.coil DH5α感受态细胞。挑选多个菌落接种含Kan的LB液体培养基, 37℃过夜培养, 提取质粒进行PCR、双酶切和测序鉴定。
1.2.4 原核表达载体PET-28a-IFN-α的构建。将鉴定为阳性的干扰素基因克隆质粒和PET-28a分别进行Eco RⅠ和NotⅠ双酶切, 回收酶切产物后连接, 转化至Rossta菌感受态细胞中, 挑选数个单个菌种进行PCR、双酶切和测序鉴定。
1.2.5 真核表达载体p GAPZαA-IFN-α的构建。将鉴定为阳性的干扰素基因克隆质粒和p GAPZαA分别进行Eco RⅠ和NotⅠ双酶切, 回收酶切产物后连接, 经AVRⅡ线性化后, 与p GAPZαA连接转化至毕赤酵母KM71感受态细胞中, 在含博莱霉素平板中挑选数个单菌落进行PCR、双酶切和测序鉴定。
2 结果
2.1 干扰素基因密码子优化
根据原核表达受体菌大肠杆菌Rossta和毕赤酵母对密码子的偏好性, 对Genebank中收录的鸡干扰素基因序列进行密码子优化, 结果如图1所示, 对原基因序列91个碱基位点进行了改变, 干扰素蛋白序列保持不变, 大肠杆菌和毕赤酵母对其偏好性增强。
2.2 干扰素基因克隆质粒p MD-18T-IFN-α的构建
将合成的干扰素基因片段与克隆质粒p MD-18T进行连接、转化, 对提取的质粒进行PCR、双酶切和测序鉴定, 显示转入大肠杆菌DH5α中的质粒为阳性质粒, 成功构建了干扰素基因的克隆质粒p MD-18T-IFN-α。
2.3 干扰素基因原核表达载体p ET-28a-IFN-α的构建
将鉴定为阳性的重组克隆质粒和原核表达载体p ET-28a分别进行双酶切、回收、连接转化大肠杆菌Rossta中, PCR和双酶切鉴定 (见图2和图3) 及测序结果显示成功构建了干扰素基因的克隆质粒p ET-28a-IFN-α。
2.4 干扰素基因真核表达载体p GAPZαA-IFN-α的构建
将鉴定为阳性的重组克隆质粒和真核表达载体p GAPZαA分别进行双酶切、回收、目的片段与表达载体连接后, 用AVRⅡ进行线性化, 进行1.5%琼脂糖凝胶电泳, 结果如图4所示, 线性化后的重组质粒大小要高于为空质粒大小, 未线性化质粒出现两种存在形式, 在此基础上完成了重组质粒的转染。转染后对筛选的阳性克隆子进行特异性引物扩增, 成功获得鸡IFN-α基因的目的片段;通用型引物成功扩增出目的片段, 大小在1000bp处, 如图5所示;而双酶切结果同样获得了预期结果, 如图6所示。
注:M1:DNA Marker 2000; (1) 重组质粒p GAPZαA-IFN-αAVRⅡ线性化结果; (2) IFN-α基因回收结果; (3) 质粒p GAPZαA回收结果; (4) 重组质粒p GAPZαA-IFN-α未线性化结果;M2:DNA Marker 15000
注:1:阴性对照;2-3:特异性引物PCR扩增结果;4:通用型引物PCR扩增结果;M:DL2000。
注:M1:DL15000;1-3:阳性转染子双酶切结果;4阴性对照;M2:DL2000
3 讨论
目前, 随着我国养鸡规模的逐渐加大和集约化程度的不断提高, 疾病的发生、发展、流行、预防一直是行业内关注的问题, 重大流行性疾病, 尤其是原发性的病毒病, 如新城疫、禽流感, 鸡传染性支气管炎等所带来的危害越来越严重, 给养鸡业造成了重大经济损失, 所以对病毒病的防治不容忽视, 寻求一种好的治疗型制剂显得尤为必要。近年来, 干扰素因其作用机理的独特性而具有广谱的抗病毒活性和免疫增强作用 (Richard E R和Stephen G, 2008;Jennifer Z等, 2009) , 一直是病毒学、细胞学、分子生物学、临床医学、免疫学、肿瘤学等相关领域的研究热点。研究表明, 重组干扰素与天然干扰素具有同样的抗病毒和免疫调节活性, 因此重组干扰素的研究和应用将成为家禽养殖中增强鸡的免疫, 减少发病, 降低鸡的死亡率的重要方向 (周海龙等, 2007) 。但重组干扰素与天然干扰素相比又有着诸多不同, 天然干扰素活性很好, 但获得手段相对单一, 且产量不高, 一定程度上影响了干扰素制品的开发与应用;重组干扰素则是利用基因工程手段, 选择不同的表达系统, 可以获得较高产量的干扰素。
本研究根据Genebank中发表的及α干扰素基因序列和大肠杆菌密码子偏好性, 对干扰素基因进行了密码子优化后人工合成编码干扰素成熟蛋白的基因序列, 在此基础上完成了干扰素重组质粒原核和真核表达载体的构建。在整个实验设计过程中, 考虑到要在原核生物中表达真核基因, 信号肽由于缺少相应的受体而无法发挥作用, 所以我们在人工合成基因片段的过程中, 人为的去掉了干扰素信号肽序列。此外, 考虑到工业化生产的需要, 采用了不用诱导即可表达的真核表达载体p GAPZαA, 以期获得较好的表达效果, 为干扰素便捷化工业生产提供技术支持。
干扰表达载体 篇5
采用大肠杆菌表达体系来获得C-反应蛋白(CRP)融合蛋白.以pDNR-CRP质粒为模板,用PCR方法扩增获得全长的.CRP基因,将其克隆入表达载体pET28a(+)中,再转化到宿主菌BL21(DE3)中,加入IPTG诱导表达,表达产物做SDS-PAGE电泳分析,最后做免疫原性检测.成功地构建了CRP基因原核表达载体pET28a(+)-CRP,经IPTG诱导SDS-PAGE电泳分析表明C-反应蛋白能在大肠杆菌中获得表达,但免疫原性检测初步结果为阴性.结果证明CRP能以融合蛋白的形式在宿主菌BL21(DE3)中得到大量表达,表达产物缺乏免疫原性,其机理还有待进一步试验探讨.
作 者：余云芳 姚伟 张昌菊 鲁林 何正权 乐超银 梁宏伟 YU Yun-fang YAO Wei ZHANG Chang-ju LU Lin HE Zheng-quan YUE Chao-yin LIANG Hong-wei 作者单位：余云芳,YU Yun-fang(三峡大学生物技术研究中心,宜昌,443002;三峡大学医学院,宜昌,443002)姚伟,YAO Wei(三峡大学生物技术研究中心,宜昌,443002;福建农林大学,农业部甘蔗生理生态与遗传改良重点开放实验室,福州,350002)
张昌菊,ZHANG Chang-ju(三峡大学医学院,宜昌,443002)
例析以诗词为载体的语言表达题 篇6
电影脚本和电影剧本不一样，通俗一点说，电影脚本是镜头组接，如同连环画，而电影剧本则是小小说，只是提供给你一个故事梗概，是提供给导演和演员以及编剧看的。电影脚本一般会列出镜头的长度、景别、构图、配乐等很详细的信息。
【典型题例】（2008年高考湖北卷第21题）下面这首诗的每一句都可以想象成一个电影镜头，前两个镜头的脚本已写出，请续写后两个。
要求：① 按照诗意来设计场景和人物的神态动作；② 想象合理；③ 每个镜头脚本的字数不超过40个。
采莲子
（唐）皇甫松
船动湖光滟滟秋，贪看年少信船流。
无端隔水抛莲子，遥被人知半日羞。
［场景］湖边。采莲船上。
［人物］采莲女，小伙子，女伴。
镜头一：秋日湖上，波光粼粼。一位美丽的姑娘驾着采莲船从荷花丛中划出，左顾右盼。
镜头二：忽见岸上有位英俊少年。姑娘悄然心动，痴痴地看着他，竟忘记了摇桨，任凭船儿飘荡。
镜头三：_______________________
镜头四：_______________________
解析本题极富创意，既考查扩展、仿句能力，又考查语言简明、连贯、得体。要写好电影脚本镜头，就要领悟诗意，体会诗歌的意境，写出的句子要形象生动，既有镜头感，又富有动作性。
参考答案
镜头三：湖水滟滟起波，姑娘心里也荡起层层波澜。突然，姑娘抓起一把莲子，向那岸上的小伙子抛掷过去。
镜头四：没想到抛莲子的逗情举动远远被人看见了，多难为情啊！姑娘红着脸，低着头，羞惭了大半天。
二、 改编微型短剧
微型短剧（独幕剧）是指剧情在一幕内完成的小型戏剧，它可以有一个场景，也可以有两个以上的场景。在独幕剧中，一般人物较少，情节线索单纯，从一个生活侧面反映社会现实或矛盾，构成一个独立完整的戏剧故事。将小诗改成微型短剧能反映出考生的综合素养。
【典型题例】（2008年泰州市高三第二次调研试卷第5题）将下面的一首诗改为剧本，要求不得增删字句（标点除外）。
清明
杜牧
清明时节雨纷纷，路上行人欲断魂。
借问酒家何处有，牧童遥指杏花村。
答：_______________________
解析本题关键是要明了剧本的格式，剧本要有人物对白（台词），要有舞台说明（动作、神态等，放在括号里）。1957年，《羊城晚报》刊出以“世界上最短的剧”为题的剧本，就是用杜牧《清明》诗改写的：“时间：清明节。地点：路上。人物、情节：行人欲断魂，借问酒家何处有？牧童遥指杏花村。”
其实本诗可改成各种体裁，吟诵起来饶有兴趣。如改写为六字诗：清明节雨纷纷，路上人欲断魂。问酒家何处有，牧童指杏花村。可改写为词：清明时节雨，纷纷路上行人，欲断魂。借问酒家何处？有牧童，遥指杏花村。还可改写为散文小品：清明时节，雨纷纷。路上，行人欲断魂：“借问酒家何处？”“有！”牧童遥指，“杏花村！”
参考答案
［清明时节。雨纷纷。路上。］
行人（欲断魂）：借问酒家何处有？
牧童（遥指）：杏花村。
三、 揣摩画面意境
“诗中有画，画中有诗”，诗画合璧，展现着我国民族传统的造型艺术与语言艺术两者妙合无垠、浑然天成所特有的魅力。正缘于此，高考命题人有时提供一幅名家名作，要求考生揣摩与画境相符的诗作。
【典型题例】（2007年台湾高考国文科第11题） 1959 年，潘天寿画了一幅“诚斋诗意”（如附图）。诚斋是南宋诗人杨万里的别号，下列杨万里所作七绝符合画境的选项是：
（A） 《诚斋》：浯溪见了紫岩回，独笑春风尽放怀。谩向世人谈昨梦，便来唤我作诚斋。
（B） 《小池》：泉眼无声惜细流，树阴照水爱晴柔。小荷才露尖尖角，早有蜻蜓立上头。
（C） 《晓坐荷桥》：四叶青苹点绿池，千重翠盖护红衣。蜻蜓空里元无见，只见波间仰面飞。
（D） 《秋凉晚步》：秋气堪悲未必然，轻寒政是可人天。绿池落尽红蕖却，荷叶犹开最小钱。
解析台湾高考注重古典文学素养的培养和提高，直接把语文课堂上的知识运用于生活之中，让学生觉得学语文有用。2007年台湾高考落幕后，央视《海峡两岸》为此专门制作了一期栏目，对相关考题进行评点，本题是极富创意并获一致好评的特色题型之一，值得内地高考命题人借鉴。
绘画是瞬间的艺术，杨万里的诗极富生活气息，善于以小观大，从细节的美丽中咀嚼出自然与人生的哲理，正所谓“一粒沙中见世界”。画面上一只红蜻蜓立在新抽出的荷叶上，几枝苇草迎风摇曳。水面上聚散有致地点缀着浮荷。这幅画空白处即是无边浩渺的水面，在这水面的小角落里却藏着勃勃生机，而且静谧、安详、纯洁。流逝的时间随着飞动的蜻蜓的驻足而凝固了，诗意却悄然从心头涌起……画家在画面上用隶书写下“诚斋诗意”四个字，这是“谜面”，“谜底”应是宋代诗人杨万里的诗句：“小荷才露尖尖角，早有蜻蜓立上头”。A项未涉及画面内容，C项“蜻蜓波间仰面飞”与画面不符，D是残荷的特征。
参考答案B
四、 扩写小诗意蕴
1998年高考上海卷曾经要求考生就冰心的小诗“墙角的花，你孤芳自赏时，天地便小了”进行想象，扩写成文。该题成为当年上海卷的亮点之一，其后各地高考模拟试卷受其启发，出笼了许多以诗词为载体的新颖题型。
【典型题例】 （2008年北京市西城区高三第二次综合练习卷第20题）根据下面这首小诗，展开想象，将该诗改为一篇短文。
古池
（日）松尾芭蕉
古池畔 / 青蛙一轻跃 / 水丁冬
要求：① 改写要充分尊重原文的意境的情趣；② 写成一个画面或镜头，不要再另行假想故事；③ 150字左右。
解析诗歌题名为“古池”，改写就应该体现“古”字来，或用古树、古亭作陪衬，或用池岸的古朴来显示，或通过写平静荒凉来暗示。原诗只是选出一个场景展示古池由静而动，由死而活的意境，美感是通过意境的描绘显示出来的，故扩展时重点应放在第二句“青蛙一轻跃”上。
参考答案
一个夏日的正午，太阳炙烤着大地。没有一丝风，也没有一丁点声响。一个废弃的池塘里，水平如镜，没有半点涟漪，几茎荷花独自开着，池畔生长着齐膝深的杂草。杂草丛里，一只青蛙圆瞪着双眼，盯着水面。突然，青蛙似乎发现了食物，纵身一跃，越过池边杂草，在空中划了一道优美的弧线，落入水中，丁冬一声，水花四溅，荷花荷叶便随着水波一齐跳起舞来。
五、 仿写古典诗词
仿写，犹如飞机的滑翔，它是放开手脚让学生自由翱翔的前奏和必经过程。宋代教育家朱熹认为，仿写是古人的有效学习的方法，古人的作文写诗，大多也是模仿前人的。近年来的高考，仿写成了常见的题型，其例句往往诗意浓郁。
【典型题例】（2008年南京市高三第一学期期末调研卷第5题） 刘禹锡的《陋室铭》是脍炙人口的名篇，请借用《陋室铭》的格式、句式和韵脚，仿写一篇新的《××铭》，针砭时弊，讽刺社会上某种丑恶现象。
陋室铭
山不在高，有仙则名。水不在深，有龙则灵。斯是陋室，惟吾德馨。苔痕上阶绿，草色入帘青。谈笑有鸿儒，往来无白丁。可以调素琴，阅金经。无丝竹之乱耳，无案牍之劳形。南阳诸葛庐，西蜀子云亭。孔子云：何陋之有？
解析仿写古典诗词必须对古诗词结构、韵律有一定的了解。题目要求针砭时弊，讽刺社会上某种丑恶现象，这就要求考生平时要关注生活，关注时事，并对各种社会现象有自己独到的、深刻的见解，不能“两耳不闻窗外事，一心只读圣贤书”。仿写古典诗词对考生来说要求较高，一般只要形似则可。
参考答案
科室铭
才不在高，应付则行；学不在深，奉承则灵。斯是科室，唯吾聪明。庸俗皆有趣，流言作新闻。谈笑无边际，往来有后门。可以打毛线，练气功。无读书之刺耳，无国事之劳神。调资不落后，级别一样升。古人曰：乐在其中。
会议铭
会不在听，到场则行；意不在会，坐完则灵。斯是会场，尔吾闲情。谈谈处世道，话话山海经，可以拉家常，眯眼睛；无群言之乱耳，无公务之劳神，虽非麻将场，堪比跳舞厅。今人曰：成何体统！
做官铭
干扰表达载体 篇7
关键词：慢病毒,载体,RNA干扰
慢病毒 (Lentivirus, LV) 是逆转录病毒科的病毒成员。慢病毒感染细胞后, 在自身逆转录酶的作用下以病毒基因组RNA为模板逆转录形成双链DNA中间体, 然后整合到宿主细胞染色体DNA上, 作为细胞基因组的一部分, 随着细胞基因组的复制和细胞分裂传递下去, 并且在宿主RNA聚合酶的作用下转录形成新的子代病毒。慢病毒载体较逆转录病毒载体有更广的宿主范围, 慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒作为siRNA的携带者, 不但具备特异的使基因表达沉默的能力, 而且还能充分发挥慢病毒载体自身所具备的优势, 为基因功能的研究提供强而有力的工具。
1 慢病毒载体的特点、构建及产量
慢病毒载体是以人类免疫缺陷Ⅰ型病毒 (HIV-1) 为基础发展起来的基因治疗载体, 对分裂期细胞和非分裂期细胞均具有感染能力。
1.1 慢病毒载体的特点
慢病毒经过改造成为慢病毒载体, 改造的目的主要是提高生物安全性及增加外源基因的表达效率。各种慢病毒载体的结构和作用机制基本相同。
慢病毒载体的最大特点是在感染分裂期细胞的同时, 还可以感染非分裂期细胞, 并可在宿主体内长期表达, 且不易诱发宿主免疫反应, 安全性好。此外, 由于慢病毒有强大的包装能力, 一般认为可达8~10 kb, 因此适用于多基因表达系统。慢病毒在整合时并不倾向于转录的起始位点, 而是在基因的整个转录区域都可以整合, 整合的慢病毒对启动子的激活机会会更低。因此, 与其他致癌逆转录病毒载体相比, 慢病毒载体更不易引起插入突变。
1.2 慢病毒载体的构建及产量
慢病毒基因组结构复杂, 除了含有gag、pol、env 3个逆转录病毒共同具备的结构基因及5′端和3′端LTR结构外, 还包括4个辅助基因vif、vpr、nef、vpu和2个调节基因tat和rev。质粒一携带了gag/ pol编码序列及RRE;质粒二包含了编码rev的序列;质粒三是载体质粒;质粒四表达env。4个质粒系统包装的病毒大部分转录失活, 即使在病毒基因组发生重组的情况下, 病毒基因组的复制也会受到限制, 从而其安全性显著提高并且对细胞转导效率无影响。慢病毒载体的构建要尽可能除去反式功能基因序列, 并以外源基因来代之, 同时保留或部分保留病毒本身的LTR及病毒的包装信号ψ。包装细胞可以为缺陷型病毒提供所需要的各种蛋白, 带有目的基因的重组慢病毒载体转染包装细胞虽然自身不能表达所必需的病毒蛋白, 但此载体含有完整的包装信号, 在包装细胞提供包装蛋白的情况下可以包装成缺少病毒gag、pol、env蛋白编码基因的重组病毒颗粒, 该病毒颗粒只能感染并整合宿主细胞, 不能在宿主细胞内再产生子代病毒, 这样增强了安全性, 但载体与包装前病毒DNA的简单重组可能会产生野生型病毒。基于以上的不足, 将gag、pol及env基因分别组装在两个质粒之中, 即一个表达gag和pol, 另一个表达env, 其基因组都不含包装信号ψ、LTR等。
目前, 慢病毒载体生产体系产量偏低, 为了适应规模化应用的需求, 利用并改造Moss发明的VV/T7瞬时表达系统, 以获得高拷贝数的慢病毒载体。该系统蛋白质表达迅速, 产量高, 原因在于T7RNA聚合酶由痘苗病毒指导合成, 慢病毒载体的RNA由T7RNA聚合酶指导合成, 使得慢病毒载体的生产不依赖慢病毒天然复制途径, 充分发挥痘苗病毒表达系统瞬时高效的特点, 避开细胞障碍的限制, 提高慢病毒载体效价。此外, 痘苗病毒表达不依赖于宿主细胞, 不涉及RNA从胞核到胞质的转运, 这样可以完全去除rev蛋白编码序列和RRE元件, 只保留HIV-1来源的gag-pol蛋白编码序列, 最大限度地减少了病毒源性序列, 使系统表达效率提高, 进而有利于产量的提高。
2 慢病毒介导的RNA干扰
2.1 RNA干扰的作用机制
RNAi (RNA interference) 即RNA干扰, 也称RNA干涉, 是由外源或内源性的双链RNA (dsRNA) 导入细胞而引起的与dsRNA同源的mRNA降解, 进而抑制其相应的基因表达。RNAi是一种序列特异性的转录后基因沉默 (PTGS) 机制, 它通过一段dsRNA导致同源mRNA降解从而使目的基因失去表达。现已阐明RNAi发生机制的大致模型: ①启动阶段。 由RNA病毒入侵, 转座子转录, 基因组中反向重复序列转录等所产生的dsRNA分子在细胞内被Dicer核酸酶剪切成21~23 nt siRNA。②效应阶段。RNAi特异性的核酸外切酶、核酸内切酶、解旋酶、辅助识别同源序列蛋白和其他一些蛋白与siRNA结合形成RNA诱导沉默复合体——RISC (RNA inducing silence complex) , 识别靶mRNA, 其中反义链与靶mRNA互补结合, 正义链则被置换出来, 然后RISC中的RNaseⅢ (可能是Dicer) 在靶mRNA与siRNA结合区域的中间将其切断。③级联放大阶段。在RNA依赖性RNA聚合酶 (RdRP) 的作用下, 以mRNA为模板、siRNA为引物扩增产生足够数量的dsRNA, 并将dsRNA作为底物提供给Dicer酶产生更多的siRNA, 从而使效应阶段反复发生。
2.2 慢病毒RNA干扰的表达载体
目前, 慢病毒被广泛应用于表达RNAi的研究中。采用事先在体外构建并能表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA, 从而使脂质体有效转染的细胞种类增加, 其对基因表达的抑制效果不逊于体外合成siRNA, 在长期稳定表达载体的细胞中甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA表达载体中, 是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的, 这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列, 并且合成的RNA不会带polyA尾。
慢病毒载体介导的RNA干扰, 就是将慢病毒载体高效感染和整合的特性与RNA 干扰特异性抑制同源基因表达的作用结合起来。慢病毒RNA干扰的表达载体有两类:一类分别转录有义RNA和反义RNA, 两条链在细胞内互补结合生成siRNA;另一类则转录短发卡RNA (shRNA) 。后者较常用, 其结构主要由慢病毒载体骨架和shRNA表达框组成。shRNA表达框主要包括:RNA聚合酶Ⅲ (PolⅢ) 依赖的启动子、shRNA结构序列及终止子。慢病毒感染细胞后, 将此shRNA表达框整合到宿主细胞基因组中。shRNA在宿主细胞被转录后, 两段互补序列碱基配对结合, 中间序列则成为茎环结构。茎环结构可被Dicer酶识别并切除, 产生的siRNA将执行RNA干扰。
2.3 慢病毒介导的RNA干扰特点
RNA干扰技术相对于传统的基因敲除技术具有投入少、周期短、操作简单等优点。 已被广泛应用于基因功能、信号转导和基因治疗等方面的研究中, 慢病毒载体介导的外源RNA干扰序列进入宿主细胞具有很多优势: (1) 相对于质粒载体介导的RNA干扰其产生的剔降作用持续而稳定; (2) 可感染分裂期细胞或非分裂期细胞; (3) 可感染啮齿类动物的受精卵并将其基因组整合到宿主染色体中, 从而获得特异性的剔降相关基因的转基因动物模型。
2.4 慢病毒介导的RNA干扰在动物病毒学中的应用
慢病毒载体与siRNA技术结合抑制特异基因的表达或敲除可能会成为制备抗病毒动物的有效方法。预计使用这种小的RNA不会影响动物的生理功能, 并且siRNA能在动物体内高效表达抑制致病病毒转录产物产生或表达。慢病毒与siRNA结合使用对于改良动物生长性状、提高饲料利用率和抗病能力都具有重要意义。特别是禽类受精卵产于体外时已经处于桑椹胚阶段, 采用慢病毒作为基因转移的载体具有很大的优越性。慢病毒载体法具有转染率高和转基因高表达的特点, 已成为转基因动物方法学上的一个新突破。
干扰表达载体 篇8
Stathmin基因定位于人染色体1p35～36.1上,这个区域是肿瘤细胞基因组DNA杂合性缺失或丢失频率非常高的位点。stathmin蛋白含有149个氨基酸,分子量为19kD,是一种微管不稳定蛋白,通过自身的磷酸化和去磷酸化调节细胞微管系统的动态平衡[1],在多种恶性肿瘤中异常高表达。RNAi技术是通过19-31nt的小分子干扰RNA与特异性mRNA结合,达到特定基因沉默的目的,具有高效性和特异性的特点,避免了传统基因敲除的致死性,在基因治疗及基因功能研究上应用广泛[2,3]。本实验通过构建stathmin基因SiRNA质粒表达载体,探讨特异性沉默鼻咽癌5-8F细胞系stathmin基因对鼻咽癌细胞stathmin基因表达的影响,为鼻咽癌的基因治疗提供实验基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
鼻咽癌5-8F细胞株(中南大学湘雅医学院提供);JM109大肠杆菌株(桂林医学院科学实验中心保藏);质粒表达载体pGenesil1.1(武汉晶赛公司)。
1.1.2 实验试剂
限制性内切酶EcoRⅠ、MluⅠ和SalⅠ为Promega公司产品;DL2000 DNA、DL1000 Marker、T4 DNA连接酶和RT-PCR试剂盒为Takara公司产品;质粒提取试剂盒为天根公司产品;1640培养基购自GIBCO公司;小牛血清购自四季青公司;脂质体购自QIAGEN公司;兔抗人stathmin抗体为Bioworld公司产品;小鼠抗人β-actin抗体、辣根过氧化物酶山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG二抗和BCA蛋白定量试剂盒为碧云天公司产品。
1.1.3 引物合成
GAPDH上游引物:5’-TCAGCCGCATCTTCTTTTG-3’;
下游引物:5’-GATGGCATGGACTGTGGTC-3’,产物594bp。
Stathmin上游引物:5’-ATGGCTTCTTCTGATATCCAGG-3’;
下游引物:5’-TTAGTCAGCTTCAGTCTCGTCA-3’,产物449bp。
引物由Invitrogen公司合成。
1.1.4 仪器
多功能高速冷冻离心机(德国Eppendorf);UV-2401紫外可见分光光度计(日本岛津公司);PCR扩增仪(德国BIOMETRA);小型垂直电泳转印系统(美国伯乐);全自动数码成像分析系统(英国SYNGENE);制冰机(日本);DYCP-31系列水平电泳仪;CO2培养箱。
1.2 方法
1.2.1 用于Stathmin沉默的目标DNA片段的设计与合成
根据GeneBank Stathmin基因序列及SiRNA设计原则,设计、合成用于Stathmin 特异性干扰DNA片段(目的基因SiRNA干扰序列为粗斜体字部分)命名为STM,该序列经过BLAST比较,与人基因库其它基因均无同源性。
STM正义链:5’-CACCGCGAGAGAAGGATAAGCACATTTCAAGACGATGTGCTTATCCTTCTCTCGCTTTTTTG-3’;
STM反义链:5’-TCAAAAAAGCGAGAGAAGGATAAGCACATCGTCTTGAAATGTGCTTATCCTTCTCTCGC-3’。
1.2.2 Stathmin基因SiRNA质粒表达载体的构建
将合成的单链DNA片段进行退火,形成双链DNA片段;采用EcoRⅠ酶切质粒表达载体pGenesil1.1,用1%琼脂糖凝胶电泳回收线性化质粒载体;采用T4连接酶将目标双链DNA片段与线性化的质粒载体连接,命名为:pGenesil1.1-STM;连接产物转染感受态JM109大肠杆菌,用卡那霉素抗性LB平板进行筛选,挑取单个菌落进行扩增。采用质粒提取试剂盒提取质粒;用MluⅠ和SalⅠ双酶切和测序对质粒进行鉴定。
1.2.3 通用阴性对照质粒表达载体
通用阴性对照质粒表达载体pGenesil-1.1HK为武汉晶赛生物公司产品,其编码的siRNA为GACTTCATAAGGCGCATGC,该序列与人基因库的基因无同源性。鉴定方法同上。
1.2.4 质粒表达载体转入鼻咽癌5-8F细胞的效率分析
取对数生长期5-8F细胞,按10×105细胞/孔接种于6孔板。第2d细胞培养至约50%融合时进行质粒表达载体转染。设:1)对照组(脂质体试剂);2)阴性对照组(转染pGenesil 1.1-HK);3)Stathmin特异性组(转染pGenesil 1.1-STM)。操作按照GIAGEN公司脂质体Effectene使用说明书进行。载体转染细胞24h后换液,48h后在荧光显微镜下观察转染效率并拍照。
1.2.5 RT-PCR检测stathmin基因的表达
转染48h后收集细胞,采用Trizol法提取总RNA,测定浓度,各组取0.77μg总RNA,以GAPDH为内参,按一步法RT-PCR试剂盒使用说明书进行操作;RT-PCR反应条件如下:50℃ 30min,94℃ 3min,94℃ 30s,62℃ 30s,72℃ 1min,30个循环,最后72℃、5min。反应完成后,取5μl产物于2%琼脂糖凝胶中进行电泳分析。
1.2.6 Western Blot检测stathmin蛋白表达
细胞转染48h后,去上清,用PBS洗2次,加入蛋白裂解液,置冰上15min,收集裂解液,超声波处理,12 000r/min、30min,取上清,测定蛋白浓度。取蛋白50μg加入点样buffer,转入制好的15%SDS-PAGE凝胶点样孔中,点入预染蛋白Marker作参照;电泳分离后,采用电转法将蛋白转移到PVDF膜上(100V,300mA,1.5h)。采用5%的脱脂奶粉封闭PVDF膜2h后,加入一抗(30℃、50r/min,孵育2h),用TBST洗3次,每次5min;加入辣根过氧化物酶标记的二抗(30℃、50r/min,孵育2h),TBST洗3次,每次5min;在暗室中加入发光剂,压片、洗片。
2 结果与分析
2.1 Stathmin基因SiRNA质粒表达载体的鉴定与分析
MluⅠ和SalⅠ双酶切通用阴性对照pGenesil-1.1HK质粒表达载体和目标基因pGenesil1.1-STM质粒表达载体,有约316bp大小的酶切片段,其结果与预测相符合(见图1)。测序结果表明,构建的质粒载体序列与设计序列完全一致,插入方式与位点正确(见图2),表明构建质粒表达载体可靠。
M:DNA Marker;1:p Genesil1.1-HK;2:p Genesil1.1-STM.
A:阴性对照pGenesil1.1-HK;B:stathmin基因pGenesil1.1-STM。
A:Negative control group pGenesil1.1-HK;B:stathmin pGenesil1.1-STM.
2.2 构建的质粒表达载体转染效率分析
质粒载体pGenesil1.1能表达绿色荧光蛋白,质粒转入细胞后能进行转染效率分析,转染效率为78.8±6.8%。
2.3 Stathmin基因SiRNA质粒表达载体抑制stathmin的mRNA表达
与脂质体组和阴性对照pGenesil1.1-HK组比较,stathmin基因特异性pGenesil1.1-STM组stathmin表达明显降低;脂质体组和阴性对照pGenesil1.1-HK组比较,stathmin表达无明显差别(见图3)。
2.4 Stathmin基因SiRNA质粒表达载体抑制stathmin的蛋白表达
与脂质体组和阴性对照pGenesil1.1-HK组比较,stathmin基因特异性pGenesil1.1-STM组stathmin蛋白表达明显降低;脂质体组和阴性对照pGenesil1.1-HK组比较,stathmin蛋白表达无明显差别(见图4)。
3 讨论
载体对外源蛋白表达的影响 篇9
已将β-1, 4-内切木聚糖酶xynⅢ基因成功地连接到原核表达载体p ET20b (+) (分子量为3716bp) 和p ET21a (+) (分子量为5443bp) 上, 并转化入大肠杆菌 (Escherichia coli) BL21 (DE3) 。为了确定xynⅢ基因在哪个载体中更能高效表达, 本实验对其作了研究比较。
1材料与方法
1.1材料
(1) 菌株与载体大肠杆菌 (Escherichia coli) BL21 (DE3) 为实验室保藏菌种。p ET20b (+) 和p ET21a (+) 为Novagen公司产品。
(2) 主要试剂胰蛋白胨 (Tryptone) , 酵母抽提物 (Yeast Extract) , 琼脂糖 (Agarose) , 牛血清蛋白, 桦木木聚糖等生化试剂均为Ta Ka Ra产品;氨苄青霉素Amp购自创生公司, DNA分子量Marker (DL2000、λHindⅢ) 购自Ta Ka Ra公司, 蛋白质分子量Marker购自宝赛公司, 氢氧化钠、氯化钠等普通试剂为分析纯。
(3) 主要仪器SK18型高速冷冻离心机, Sectrophotometer ND-1000, JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎机, DYY-5型稳压稳流电泳仪, 衡温振荡培养箱, 紫外透射仪紫外分光光度计。
1.2方法
1.2.1质粒的提取
(1) 挑取含有重组质粒p ET21a (+) -xynⅢ和p ET20b (+) -xynⅢ的单克隆, 分别接种于10 ml含有100mg/m L Amp的LB液体培养基中, 37℃, 220 rpm, 摇床过夜培养。
(2) 用紫外分光光度仪检测菌体浓度显示均为2.2, 剩余菌液用碱裂解法提取质粒DNA, 并用Sectrophotometer ND-1000测其浓度。
1.2.2 PCR扩增xynⅢ, 并通过电泳检测扩增产物的亮度
分别以重组质粒p ET21a (+) -xynⅢ和p ET20b (+) -xynⅢ为模板对xynⅢ进行PCR扩增, PCR体系如下:
PCR程序:94℃3min;94℃30s, 52.8℃30s, 72℃40s, 15个循环;72℃7min。
1.2.3 SDS-PAGE电泳检测外源蛋白表达
(1) 挑取含有重组质粒和含有空质粒p ET21a (+) /p ET20b (+) 的单克隆, 分别接种于3 ml含有50mg/m LAmp的LB液体培养基中, 37℃, 220 rpm, 摇床过夜培养。
(2) 取上述过夜培养物以1/100的比例转接入含50 mg/m L Amp的LB液体培养基中, 37℃, 220rpm, 培养2-3h (OD值达到0.6-0.8) , 加入IPTG于30℃条件下诱导培养6 h。
(3) 分别取IPGT诱导前和诱导后的菌液样品l ml, 收集菌体, 用30 u L的PBS缓冲液 (p H7.2) 重悬细胞沉淀, 再加入6×SDS-PAGE buffer, 混匀后100℃煮沸10 min, 离心取上清, 即可用于SDS-PAGE检测。
1.2.4蛋白含量测定
采用Bradford法测定蛋白浓度[3], 以牛血清蛋白作为标准蛋白。
蛋白浓度C= (91.69Y+2.743) /V
其中:C———蛋白浓度, 单位μg/μl;
Y———A595值;
V———加样体积, 单位μl。
2结果
2.1质粒浓度的测定结果
用Sectrophotometer ND-1000对提取的质粒测浓度。结果如表2。
由此可以看出:在菌体浓度相同的情况下, 分子量小的质粒对菌体细胞造成的负荷较小, 从而在细胞中的扩增倍数较多。
2.2PCR扩增xynⅢ的电泳检测结果
分别以质粒p ET21a (+) -xynⅢ和p ET20b (+) -xynⅢ为模板对xynⅢ进行PCR, 通过电泳检测 (如图1) 可以明显看出以p ET20b (+) -xynⅢ为模板扩增的基因产量高。足以说明在相同体积下p ET20b (+) -xynⅢ质粒浓度大。
2.3 p ET21a (+) -xynⅢ和p ET20b (+) -xynⅢ表达产物检测结果
以大肠杆菌的超声波破碎酶液为对照:将全细胞蛋白和超声波破碎细胞离心后得到的上清酶液进行SDS-PAGE检测, 如图2所示, 有明显的外源蛋白产物条带出现;p ET20b (+) -xynⅢ表达产物的条带明显比p ET21a (+) -xynⅢ表达产物的条带亮。
2.4蛋白含量的测定
在595nm下, 用紫外分光光度仪测两种重组菌的酶液上清的吸光值, 得到表3的数据, 进而带入公式计算出各蛋白的浓度。明显看出p ET20b (+) -xynⅢ表达产物的量多于p ET21a (+) -xynⅢ表达产物的量。
3讨论
外源基因表达产量与细胞浓度和细胞表达产量呈正相关。单个细胞产量取决于:外源基因的拷贝数。本实验所选用的p ET20b (+) 载体因为其分子量小于p ET21a (+) 载体的分子量, 在细胞内进行扩增时对细胞造成的负荷会小一点, 所以p ET20b (+) 载体的拷贝数多于p ET21a (+) 载体的, 进而载体上所连接的外源基因的拷贝数也多, 因此外源基因的表达产量会相对的增多。
参考文献
[1]张世敏, 刘寅, 刘新育, 等.木聚糖酶基因研究进展[J].微生物学杂志, 2006, 7, 26 (4) :61-67
[2]何成新, 张厚瑞.木聚糖水解酶的研究进展[J].广西轻工业, 1998, 4:12-15.
miR-16表达载体的构建 篇10
1 材料
pSuper质粒由武汉同济医院临床免疫室保存。E.coli DH5α感受态细胞、H e p G 2细胞由华中科技大学微生物系病毒实验室保存。T a q D N A聚合酶购自F e r m e n t a s公司。T r i z o l、Lipofectamine 2000为invitrogen公司产品。SYBR GreenⅠ、ECL试剂盒为Roche公司产品。M-mulv、DNase (RNase free) 为Promega公司产品。T4DNA连接酶、限制性内切酶、质粒抽提试剂盒、凝胶回收试剂盒、基因组DNA提取试剂盒为Takara公司产品。
2 实验
2.1 实验方法
(1) 设计PCR引物扩增hsa-miR-16的编码基因片段:从“The miRNA Registry” (MI0000070) 数据库中获得成熟的miRNA和PremiRNA序列, 通过Pre-miRNA序列获得Pri-miRNA序列, 以及成熟序列两侧约125nt的侧翼序列, 加上保护碱基和酶切位点。产物片段总长度为270bp。依据该序列设计引物, 引入PolyT (TTTTT) 和BamHI, SalI的酶切位点和保护碱基。引物由上海英骏生物公司合成。引物序列如下:上游引物 (命名为M16f1) 5'GCGGATCCAGCACATCATGGTTTACA 3’下游引物 (命名为M16r1) 5’GCGTCGACAAAAAATGTTACCTTAAAGGG 3’。
(2) 重组质粒PmiR-16的构建:使用Takara公司质粒抽提试剂盒提取 (HepG2) 细胞基因组DNA, 利用M16f1、M16r1引物进行PCR扩增, 反应条件:94℃4min, 94℃45s, 50℃45s, 72℃45s×30。将270bp目的片段切胶回收后用BamHI、SalI酶切, 获得目的基因。pSUPER经BglⅡ、SalI双酶切后回收线性化空载体。取1uL线性化载体, 与6uL的目的基因片段, 在T4连接酶作用下, 16℃连接过夜12h, 转化E.coli DH5α感受态细胞, 均匀涂于Amp (氨苄青霉素) +LB平皿上, 37℃培养过夜12h。随机挑取菌落小量培养, 直接用PCR鉴定和抽提质粒后用EcoRⅠ, SalⅠ酶切鉴定。酶切分析正确的克隆送上海英骏生物公司测序进一步证实。
2.2 实验结果
重组质粒PmiR-16的酶切鉴定, 证实重组质粒PmiR-16构建成功。见图1。酶切分析正确的克隆送上海英骏生物公司测序与the miRNA Registry的序列一致。
3 讨论
1993年Lee[3]等首次在线虫中发现, 基因Lin-4[4]通过转录生成的RNA调控虫体的发育过程。2000年研究人员又在线虫中发现Let-7基因[5], 这2种基因编码一类长度约为21nt的小分子RNA, 这种小分子RNA的长度很短而且作用时间也是暂时的, 所以开始被命名为stRNA (Small Temporal RNA) 。随后多个研究小组在线虫、果蝇、人类Hela细胞等多种真核细胞中发现近千个相似的小分子RNA, 并将这些小分子RNA统称为miRNA。miRNA是一种21～25nt的单链小分子RNA。它不编码蛋白质, 本身不具有开放阅读框 (OFR) 。miRNA在各个物种间具有高度的进化保守性。这种高度的物种间保守性可能与其功能有着密切的关系。miRNA作为一种新近发现的小分子RNA, 其在生物体内起着重要的作用。到目前为止, 已明确靶基因及确定功能的miRNA为数不多。研究表明在miRNA慢性淋巴细胞白血病中起到重要的作用[6], 但具体的作用机制还须进一步的试验证实。
目前较为常用的制备miRNAs的方法, 有体外制备miRNAs和以DNA为模板转染到细胞并在体内转录得到miRNAs。本实验采用了后一种方法, 本法简便, 不需要直接操作RNA, 克服了人工合成miRNA容易降解, 成本昂贵的缺点。而且由于含表达载体的菌株可长期保存并大量扩增, 为今后的研究提供了极大的方便。目前在病毒性疾病的治疗研究中, 可设计针对病毒基因组RNA的miRNAs或针对宿主细胞受体的miRNA来抗病毒, 现阶段已经开展了针对HBV、HCV、脊髓灰质炎病毒及HIV-1等研究, 已经取得一定的成果[7]。本试验成功构建了重组质粒PmiR-16, 将为进一步将miR-16作为基因靶向治疗药物打下分子生物学基础。
摘要：目的构建miR-16表达载体, 为研究miR-16对HBV的干扰作用打下基础。方法根据miRNA的成熟序列以及附近约100多碱基共270个碱基序列, 设计PCR引物, PCR扩增, 退火后用T4联接到线性化的pSUPER质粒中, 并对重组质粒 (命名为pmiR-16) 进行酶切及测序鉴定。结果成功构建了重组质粒PmiR-16。结论成功构建miR-16表达载体。
关键词：表达载体,microRNAs,miR-16
参考文献
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干扰表达载体 篇11
关键词：基因表达 载体构件 绘制应用
中图分类号：G633.91文献标识码：A文章编号：1673-9795（2012）09（c）-0024-01
1 载体的含义与分类
载体是指将外源DNA运载进入受体细胞内的工具。外源DNA与载体在体结合形成重组DNA分子，然后进入受体形成复制子，即在细胞内形成能独自自我复制的遗传因子。作为一个载体须满足：（1）有多种限制性内切酶的切点，但每一种酶最好只有一个酶切位点；（2）外源DNA进入后载体能自我复制；（3）有便于选择的标记基因；（4）具有促进外源DNA表达的调控区。根据载体的用途，将载体分成三类，即克隆载体，主要用于扩增或保存DNA片段，是最简单的载体；穿梭载体是指具有多个复制子能在两个以上的不同宿主细胞复制和繁殖的载体；表达载体是指能将目的基因在人工控制下置于生物宿主中大量生产的载体。根据所在生物体的不同，分为原核表达载体和真核表达载体。
2 表达载体的构件与作用
表达载体是由目的基因﹢启动子﹢标记基因﹢终止子等组成。其系统包括DNA复制及质粒DNA的筛选、目的基因的转录和蛋白质的翻译三个部分。其中，DNA复制及质粒DNA的筛选有DNA复制起点ori、Amp和Tet抗性基因；目的基因的转录包括启动子，抑制物基因和转录终止子，启动子位于目的基因的上游，常用的如Placz等；蛋白质的翻译包括核糖体识别位点SD，翻译起始密码子和终止密码子。启动子是一段具有DNA片段的特殊结构，位于其首端，作用是识别和结合RNA聚合酶，并驱动基因转录出mRNA，通过翻译得到所需蛋白质。终止子位于基因尾端，是具有DNA短片段的特殊结构，其作用是使转录停止下来。标记基因通常是一些抗生素基因，其作用是为了鉴别是否含有目的基因，从而筛选含有目的基因的细胞或者菌株。
3 构建表达载体
基因表达载体的构建是基因工程的第二步，也是其核心。将我们所需的目的基因与特殊的运载体结合的过程，简单来说，也就是将不同来源的DNA重新组合的过程。假如以质粒作为载体，首先要用特定的酶切割质粒，露出黏性末端，然后再用同种酶切切割目的基因，使其产生同样的黏性末端。将目的基因切下的片段插入质粒的切口，使碱基互补配对，两个黏性末端结合在一起形成氢键，然后加入适量DNA连接酶，使两条DNA链形成磷酸二酯键，从连接相邻的脱氧核糖核酸形成重组DNA。如人的胰岛素基因就是通过这种方式与大肠杆菌中的质粒DNA分子结合，形成重组DNA分子（也叫重组质粒）。
4 如何利用分子生物学软件绘制基因表达载体图
无论是制作幻灯片，还是发表文章，常常需要质粒图。基因表达载体质粒图谱的绘制软件很多，这里用DNAMAN软件对基因表达载体质粒作图过程进行说明。DNAMAN是一种常用的核酸序列分析软件，其功能强大，使用方便，已成为一种普遍使用的DNA序列分析工具。它所提供强大的绘质粒图功能，能满足需要。绘制方法如下。
打开DNAMAN软件，点击Draw a new map进入质粒绘图，双击图形区创建图谱，在General状态下选择线条粗细和直径，双击质粒图修改字体和字号，添加元素（Add element）进行色彩和元素类型的选择即可。
5 表达载体的运用
特定的基因表达载体构建成功以后，将我们所需的目的基因导入受体细胞，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、花粉管通道法和基因枪法等；进入动物细胞的方法有显微注射技术，此方法的受体细胞多是受精卵。重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。最后是目的基因的检测和表达，用DNA分子杂交技术检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因。用标记的目的基因作探针与mRNA 杂交检测目的基因是否转录出了mRNA。最后检测目的基因是否翻译成蛋白质。有时还需进行个体生物学水平的鉴定。
参考文献
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GAPB基因原核表达载体的构建 篇12
1 材料与方法
1.1 材料
哥伦比亚型拟南芥、大肠杆菌DH5α和BL21 (DE3) 由本实验室保存。胶回收试剂盒和质粒小量提取试剂盒购于上海华舜生物技术公司。PET28a (+) 质粒载体由四川大学遗传学重点实验室惠赠。所需引物由上海英俊生物技术有限公司合成。限制性内切酶Bam HI和Xho I、高保真酶Pfu以及T4 DNA连接酶购于MBI Ferments公司。
1.2 方法
1.2.1 拟南芥总RNA的提取
利用TRIZOL试剂盒提取哥伦比亚型拟南芥总RNA, 1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA产物。然后用反转录试剂盒将RNA反转合成c DNA, 作为扩增基因的模板。
1.2.2 引物的设计
利用Primer primer5.0根据GAPB的基因序列设计特异性引物, 引物含有Bam HI和Xho I酶切位点, 序列如下:
上游酶切位点为Bam HI, 下游酶切位点为Xho I, 引物由上海英俊公司合成。
1.2.3 PCR扩增和胶回收GAPB基因
以拟南芥c DNA为模板, 用PCR法扩增GAPB基因, 反应体系如下:10×PCR Buffer (含Mg Cl2) 2.5μL, (2.5 m M) d NTP 2μL, 上游引物 (F) 1μL, 下游引物 (R) 1μL, c DNA 0.5μL, Pfu酶0.2μL, dd H2O 17.8μL。PCR反应条件:94℃预变性3 min后进入以下循环, 94℃35 s, 59℃35 s, 72℃1 min30 s, 共进行30个循环, 最后72℃延伸10 min结束PCR反应, 扩增得到GAPB基因的全长。按胶回收试剂盒的说明回收GAPB基因片段。
1.2.4 PET28a (+) 质粒的提取
将PET28a (+) -DH5α菌株划线于含Kan的LB固体培养基中, 37℃培养过夜, 次日挑单菌落于含Kan的LB液体培养基中, 37℃培养过夜, 按照质粒小量抽提试剂盒说明书提取PET28a (+) 质粒。
1.2.5 目的基因和载体的双酶切
采用50μL酶切体系, 分别用Bam HI和Xho I双酶切PET28a (+) 载体和纯化的GAPB基因片段, 用胶回收试剂盒纯化回收酶切后的载体片段和基因片段, 取少量回收产物作1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.6 连接及重组质粒的转化
用T 4连接酶连接酶切纯化后的GA P B基因和PET28a (+) 载体片段, 连接体系为25μL, 16℃连接过夜。然后制备大肠杆菌DH5α感受态细胞, 将连接体系转化大肠杆菌DH5α。在转化时设置阳性和阴性对照, 阳性对照为未酶切的PET28a (+) 质粒, 用以检测转化效率;阴性对照为空的大肠杆菌感受态, 用以检测感受态细胞是否有污染。将转化产物涂布于含Kan的LB固体培养基中, 37℃过夜培养。
1.2.7 重组质粒阳性克隆的鉴定
在含有重组质粒的LB平板上随机挑取多个单菌落, 以其为模板分别作PCR扩增反应, 1%琼脂糖凝胶电泳检测是否有目的条带。同时将挑取的多个单菌落分别摇菌, 按质粒提取试剂盒的说明提取质粒, 并用Bam HI和Xho I双酶切质粒, 电泳检测酶切产物。
1.2.8 表达质粒的构建与鉴定
将双酶切鉴定正确的阳性克隆菌株送上海华大基因测序, 分析克隆基因的序列组成及其阅读框的正确性。测序正确后, 提取PET28a (+) -GAPB/DH5α阳性克隆的质粒, 将该质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3) 感受态细胞, 并挑取多个单菌落作PCR鉴定, 得到含有PET28a (+) -GAPB质粒的BL21 (DE3) 表达菌。
2 结果与分析
2.1 RNA纯度的测定
对提取的拟南芥总RNA进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测, 发现RNA产物条带清晰, 并且28S条带亮度是18S的2倍左右 (图1) 。紫外分光光度计分析显示, A260/A280=1.92, 表明获得的RNA纯度及浓度较高, 可以用于基因全长的扩增。
2.2 GAPB基因的扩增
利用设计的特异性引物作梯度PCR, 寻找扩增GAPB基因的最佳退火温度, 发现在59℃退火温度下, GAPB基因扩增的条带最好。电泳图 (图2) 显示大约在1344 bp左右有一目标条带, 说明已根据设计的引物克隆出所需要的基因片段。
2.3 PET28a (+) -GAPB重组质粒的PCR鉴定
选用PET28a载体上的T7上游引物与GAPB的下游引物配对, 进行菌落PCR筛选阳性克隆。通过1%的琼脂糖凝胶电泳检测, 大多数都得到与GAPB基因大小一致的片段 (图3) , 说明得到了重组质粒的阳性克隆。
2.4 PET28a (+) -GAPB重组质粒的双酶切鉴定
重组质粒经Bam HI和Xho I双酶切后出现2条带, 其中1条带大小约为1344 bp左右 (图4) , 与GAPB基因大小一致, 说明PET28a (+) -GAPB重组质粒构建正确。
2.5 转化BL21 (DE3) 重组质粒的鉴定
将重组质粒PET28a (+) -GAPB转化到大肠杆菌BL21 (DE3) 中, 经抗性筛选, 挑取单菌落, 作菌落PCR鉴定, 经1%的琼脂糖凝胶电泳检测到目的条带 (图5) , 说明转化成功。
3 讨论
在植物的糖酵解和糖异生途径中, 三磷酸-甘油醛脱氢酶 (GAPDH) 是关键酶, 参与糖酵解过程中第一个ATP的形成。由于GAPDH具有高度的保守性, 人们通过比较不同物种的该基因核酸序列和蛋白序列的异同, 对物种进行分类, 建立物种之间的系统发育关系[5]。在外界胁迫如热胁迫、渗透胁迫、缺氧胁迫或营养缺失条件下, 一些糖酵解相关基因的m RNA大量积累表达[6]。近年来, 有许多研究表明GAPDH基因的表达可能增强了植物抵抗胁迫的能力。Pillai等[7]将水稻幼苗进行干旱、淹没和脱落酸 (ABA) 处理, 结果表明GAPDH基因的转录水平显著提高。在植物中, 经H2O2诱导GAPDH的转录水平也可显著增加。Baek等[8]将GAPDH基因转化到拟南芥原生质体中, 发现该基因能强烈抑制热击时H2O2的产生和细胞的死亡。本研究以拟南芥c DNA为模板, 克隆出GAPB基因的全长, 并构建了原核表达载体PET28a (+) -GAPB, 为后续研究GAPB的功能提供了理论基础。
摘要：以拟南芥cDNA为模板, 用PCR扩增出GAPB的基因全长, 然后将GAPB基因片段连接到PET28a (+) 载体上, 构建重组质粒并转化大肠杆菌DH5α, 经菌落PCR和酶切鉴定筛选出阳性克隆, 测序正确后, 再将阳性克隆的质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3) 。结果表明:成功构建了原核表达载体PET28a (+) -GAPB, 为后续的GAPB融合蛋白的表达以及纯化奠定了基础。
关键词：GAPB,大肠杆菌BL21,PET28a (+) ,融合蛋白
参考文献
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