融合表达载体

融合表达载体（通用9篇）

融合表达载体 篇1

钙网蛋白(Calreticulin,CRT)是属于热休克蛋白家族的一类高度保守内质网可溶性蛋白,分子量为46 kD,主要存在于内质网腔[1,2]。研究显示,应用蒽环类药物和γ-射线能诱导肿瘤细胞发生凋亡时,CRT从胞内向膜表面快速转位并在细胞膜上簇集,出现在凋亡细胞膜上的CRT能被吞噬细胞膜上的相应受体识别,由此活化吞噬细胞并启动对凋亡细胞的吞噬作用,这类凋亡的肿瘤细胞具有良好的免疫原性,应用这些细胞免疫小鼠,能在小鼠体内诱导出强大的抗肿瘤免疫活性[3,4,5]。

程序性死亡因子1 (programmed cell death 1,PD-1) 及其配体PD-L1 (programmed cell death 1 ligand 1)是B7-CD28蛋白家族的两个新成员,属于Ⅰ型跨膜分子。作为一种免疫共刺激分子,PD-1主要表达于活化的淋巴细胞膜表面,PD-L1与PD-1结合产生负向免疫调节作用,在机体的免疫稳定与耐受方面发挥正常的调节功能[6]。新近的体内外实验发现,肿瘤细胞膜上高表达PD-L1分子,它与淋巴细胞上的PD-1结合后,将抑制效应性T细胞活性,同时降低后者IL-2和IFN-γ的表达和分泌,形成肿瘤细胞免疫逃逸的微环境,促进肿瘤的生长[7,8]。而可溶性PD1与PD-L1的结合可以阻断PD-L1的活性,促进淋巴细胞的活性,在抗肿瘤和抗病毒中具有摘要作用。

鉴于CRT在肿瘤抗原提呈和sPD-1在促进免疫杀伤中具有重要作用,本研究通过构建表达CRT与PD1胞外区的融合蛋白,这将为肿瘤免疫防治提供新的思路、方法和途径,同时也为研究肿瘤的免疫原性死亡奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料:

原核菌株E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)及质粒pET28a(+)-His为作者实验室所有;基因扩增引物均由上海生工生物公司合成。

1.1.2 试剂:

TaqDNA聚合酶、限制性内切酶及T4连接酶都是Fermentas公司产品;鼠源的CRT单抗、PD1单抗均由本实验组自行完成;羊抗鼠IgG-HRP抗体是北京中杉金桥生物技术有限公司产品;ECL显色液(A、B液)购买于GE Healthcare 公司;其他化学试剂由Sigma等公司提供。

1.1.3 仪器:

DYCP-31DN型水平式琼脂糖电泳槽购买于北京市六一仪器厂;Gel Logic-200 凝胶成像系统是美国Kodak公司产品;Mini型垂直式蛋白质电泳系统、蛋白质转印系统都是美国Bio-Rad公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计

根据基因库中小鼠CRT和PD-1 基因序列,设计2对特异性引物,以小鼠淋巴细胞CDNA为模板PCR克隆获得mCRT、mPD1目的片段。引物由上海生工生物公司合成。其中在mCRT上、下游引物分别引入NcotⅠ和BamHⅠ限制性内切酶位点,mPD1上、下游引物分别引入BamHⅠ和XholⅠ限制性内切酶位点。PCR引物设计如下:

CRT:

上游引物:CAAGCCATGG TCCAAA CATAAG TCCGAT

下游引物:CAAGGGATCCACCTCCACCTTCTGGGTGTATCCAGGTAC

sPD1:

上游引物:CAAGGGATCCGGTGGAGGTGGAGAGGTCCCCAATGGGCCCTG

下游引物:CAAG CTCGAG GCTGGGATAT CTTGTTGA

PCR 扩增上述基因片段后经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析鉴定。

1.2.2 CRT-PD-1融合产物与克隆的鉴定

PCR扩增CRT和PD-1产物,引物如下:

上游引物:CAAGCCATGG TCCAAA CATAAG TCCGAT

下游引物:CAAG CTCGAG GCTGGGATAT CTTGTTGA

经PCR 扩增后用1%琼脂糖凝胶电泳分析鉴定。

1,2.PD-1PCR产物; 3,4.CRT PCR产物。

1,2 Products of PD-1 gene fragment by PCR; 3,4 Products of CRT gene fragment by PCR.

(2a)PCR鉴定pET-28a(+)-CRT-PD-1:1,2.阴性克隆 ;3,4.阳性克隆。 (2b)双酶切鉴定pET-28a(+)-CRT-PD-1:1,3.阳性克隆;2,4.阳性克隆酶切后。

(2a)PCR results of pET-28a (+)-CRT-PD-1.1,2 Negative clones;3,4 Positive clones. (2b) Identification of pET-28a (+)-CRT-PD-1 by double enzyme digestion.1,3 Positive clones;2,4 Positive clones after by double enzyme digestion.

凝胶电泳分离纯化 PCR 产物,目的基因用胶回收试剂盒回收,CRT-PD-1回收产物用NotⅠ/ XholⅠ酶切,同时用NotⅠ和XholⅠ对 pET28a(+)载体双酶切,纯化后两者等体积混合用T4连接酶16 ℃连接16h～20h。连接产物转化至预先制备好的大肠杆菌感受态细胞 DH5α(DE3),离心后弃300μl上清,重悬剩余菌液涂于已预热的卡那霉素的 LB 平板上,细菌培养箱培养过夜。次日挑克隆接种于含有卡那霉素的 LB 培养液中37℃摇床振荡过夜。然 后 提 取 质 粒,命 名 为pET28a(+)-CRT-PD-1,经PCR及酶切鉴定后,将阳性质粒送至上海生工生物公司进行测序。

1.2.3 小鼠CRT-PD-1融合蛋白的表达与鉴定

将测序正确的克隆转化入BL21感受态细菌,同上挑克隆培养。次日以 1∶ 50 的比例转接震荡培养至OD600nm在 0.6～0.8之间后加入 IPTG 至终浓度为 1 mmol/L,37℃ 诱导 4h,收集菌液制样。用10%的SDS-PAGE电泳分析。

1.2.4 融合蛋白CRT-PD-1的纯化

扩大培养200 mL菌液用于蛋白纯化,同上加入IPTG诱导后收集菌液12 000 r / min,离心10min用20ml PBS混匀后,冰浴中超声裂解30min至液体变清亮,12 000 r / min、10min离心收集上清,杂交后加入含有 2 mL Ni平衡柱,分别用不同浓度咪唑洗脱液洗涤后(20 mmol/L、50mmol/L、100mmol/L、200mmol/L、500mmol/L)收集洗脱液进行 SDS-PAGE 分析。

2 结果与分析

2.1 CRT-PD-1质粒构建及鉴定

应用小鼠淋巴细胞cDNA为模板,PCR 扩增后用1.5% 琼脂糖电泳可看到 在大约500bp和750bp处分别有一条带( 图 1a,1b)。 第二次PCR后得到大小为1 200bp的目的片段,并且目的片段切胶回收,将其克隆入 pET28a(+) 空载,用mCRT、mPD1 的上下游引物PCR和双酶切鉴定无特异性的条带(图 2a,2b),经测序比对后基因序列完全正确。

2.2 CRT-PD-1 融合蛋白的表达、纯化与 SDS-PAGE 分析鉴定

pET28a-CRT-PD-1 重组质粒转入大肠杆菌 BL21( DE3),经 IPTG 37℃ 经诱导4 h后收集菌液。SDS-PAGE 胶电泳可以看出在诱导后的泳道45kDa处有明显条带(然而诱导前的菌液中并无表达),符合预期大小,并且以可溶性的形式存在 ( 图 3) 。

1.IPTG诱导前重组质粒在BL21中的表达;2.IPTG诱导后重组质粒在BL21中的表达;3、4.纯化后的CRT-PD-1融合蛋白。

1 Expression of recombinant vector before induced by IPTG in BL21;2 Expression of recombinant vector after induced by IPTG in BL21;3,4 CRT-PD-1 fusion protein after purified.

2.3 CRT-PD-1 融合蛋白的Western blotting鉴定

将收集的融合蛋白菌液裂解经SDS-PAGE胶转至PVDF膜,150mA 2h后用5%的牛奶封闭过夜,第2d分别用抗CRT的单抗(1:5 000)和抗PD-1的单抗(1:3 000)室温孵育1h后用TBST洗3次,每次10min再用羊抗鼠IgG(1:3 000)室温孵育1h,同上洗3次后,加入等体积A/B液暗室显影(图4)。通过图4a/b可以看出用CRT单抗和PD-1单抗都可以鉴定出融合蛋白CRT-PD-1能很好地表达,说明我们已成功构建、制备获得CRT-PD-1融合蛋白。

3 讨论

CRT是进化中高度保守的内质网常驻蛋白,广泛表达于多类物种及不同组织中[9]。生理状态下CRT的表达有维持机体内钙平衡、增强抗原递呈及抑制血管生成等多种生物学功能。PD-1为主要表达于活化的淋巴细胞膜表面的一类共刺激分子,PD-L1与PD-1的结合是作为一种机体负向免疫调节作用,对维持机体正常的调节功能发挥着重要作用。

本实验采用常规 PCR、酶切、连接等技术,利用原核表达载体 pET28a(+) 成功构建了 CRT-PD-1融合基因的表达载体pET28a(+)- CRT-PD-1,在两个基因之间引入GGGGsGGGG柔性linker,从而获得两个蛋白正确的空间构象。并通过诱导、表达以及纯化获得了浓度较高的CRT-PD-1融合蛋白,为后续对于该蛋白的研究奠定了良好的基础。

CRT-sPD-1融合蛋白中的sPD-1在肿瘤免疫治疗中有两方面的作用:封闭PD-L1和作为载体将CRT特异簇集到肿瘤细胞表面,从而将免疫杀伤和抗原提呈功能联合起来作用于同一个肿瘤细胞,肿瘤细胞被杀伤同时将抗原提呈给DC细胞,作为内源性疫苗产生特异性抗肿瘤免疫应答,这是一种全新的免疫调节设计策略,也是真正意义上的肿瘤生物治疗。

(a)应用CRT抗体测定CRT-PD-1融合蛋白。1.IPTG诱导前重组质粒在BL21中的表达;2.IPTG诱导后重组质粒在BL21中的表达;3.纯化后的CRT-PD-1融合蛋白。(b)应用PD1抗体测定CRT-PD-1融合蛋白。1.IPTG诱导前重组质粒在BL21中的表达;2.IPTG诱导后重组质粒在BL21中的表达;3.纯化后的CRT-PD-1融合蛋白。

(a)Determination of CRT-PD-1 fusion protein by anti-CRT antibody.1 Expression of recombinant vector before induced by IPTG in BL21;2 Expression of recombinant vector after induced by IPTG in BL21;3 CRT-PD-1 fusion protein after purified.(b)Determination of CRT-PD-1 fusion protein by anti-PD-1 antibody.1 Expression of recombinant vector before induced by IPTG in BL21;2 Expression of recombinant vector after induced by IPTG in BL21;3 CRT-PD-1 fusion protein after purified.

参考文献

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[7]Wei S,Shreiner AB,Takeshita N,et al.Tumor-induced immune sup-pression of in vivo effector T-cell priming is mediated by the B7-H1/PD-1axis and transforming growth factor beta[J].Cancer Res,2008,68(13):5432-5438.

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融合表达载体 篇2

为了提高腺病毒载体用于基因治疗的靶向性,采用PCR和体外连接的方法构建了柯萨奇病毒-腺病毒受体(Coxsackie virus-Adenovirus Receptor)胞外段sCAR和表皮生长因子(Epidermal growth factor)EGF融合基因,然后将此融合基因插入穿梭质粒pDC315.利用Ad-MAX腺病毒系统,将重组质粒pDC315-sCAR-EGF与腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE13cre共同转染AD-293细胞,成功包装出一种复制缺陷型腺病毒Ad5-CMV-sCAR-EGF.经PCR鉴定该病毒含有sCAR-EGF融合基因片段,Western blotting证实该病毒能表达sCAR-EGF融合蛋白.体外试验证实该病毒感染细胞所产生的融合蛋白能够引导携带报告基因的腺病毒Ad5-CMV-luc高水平感染肿瘤细胞,为高水平表达EGFR的肿瘤的.靶向性基因治疗提供了新的手段.

作 者：任鹏康 王丰 李惠明 李宗海 黄倩 REN Peng-Kang WANG Feng LI Hui-Ming LI Zong-Hai HUANG Qian 作者单位：任鹏康,REN Peng-Kang(上海市第一人民医院中心实验室,上海,200080)

王丰,李惠明,黄倩,WANG Feng,LI Hui-Ming,HUANG Qian(上海交通大学附属第一人民医院中心实验室,上海,200080)

李宗海,LI Zong-Hai(上海交通大学肿瘤研究所癌基因及相关基因研究国家重点实验室,上海,200032)

融合表达载体 篇3

作者实验室根据植物偏爱的密码子，按照透明颤菌血红蛋白(VHb)的氨基酸序列，对透明颤菌血红基因(vgb)进行优化改造，人工合成了全长的450bp的透明颤菌血红蛋白基因(以下称之为vgb M)[6]。

本研究把vgb M和融合杀虫基因(GFMCry IA与Cp TI)构建成双价基因植物表达载体，导入烟草。期望通过分子育种培育探索高产、多抗虫谱的转基因植物，探索一条分子植物育种新途径。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

大肠杆菌DH5α感受态细胞购自北京天为时代公司，根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404(作者实验室保存);质粒p GBI4FABC、p GSVHB、p G4AB均由作者实验室构建;烟草(Nicotiana tabacum)Nc89无菌苗叶片作为转化用外植体;转基因烟草叶片杀棉铃虫实验采用3日龄棉铃虫(Heliothisarmigera)。

1.1.2 试剂

DNA限制性核酸内切酶，T4DNA连接酶购自MBI公司，DNA Marker和蛋白质Marker系鼎国公司和MBI生产，酶切片段的回收试剂盒购自鼎国公司试剂盒，探针标记采用Promega公司试剂盒。

1.1.3 引物

检测融合杀虫基因的引物

引物1:5′-CCATACAACTGCTTGAGTAACCCA-3′

引物2:5′-CTCA TCA TCTTCA TCCCTGG-3′

检测vgb M基因的引物

引物3:5′-CATGCCATGGGCCTTGATCAACAGACTATC-3′

引物4:5′-CCCAAGCTTACTCAACAGCTTGAGC-3′

1.2 方法

载体构建过程中的的DNA操作技术，如质粒DNA的提取、酶切、酶切产物连接、转化及重组子的筛选参照文献[7];烟草基因组DNA的提取参照文献[5];植物表达载体转化农杆菌及对烟草的转化参照文献[8];转基因烟草的分子检测PCR及Southern blot检测方法参照文献[8]，转基因烟草植株叶片杀棉铃虫试验见文献(Cui HZ,et al.，1998)。转基因烟草实验组方案设计参见文献[6]。

2 结果与分析

2.1 含vgb M基因的中间载体(p G4ASVHB)的构建

PstⅠ和SacⅠ酶切p GSVHB，得到vgb M基因片段并将vgb M克隆到p G4AB上以替换Bt基因，这样利用Bt基因表达盒的启动子和终止子以及增强表达的调控元件，构建了质粒p G4ASVHB。HindⅢ酶切鉴定质粒p G4ASVHB，出现2.82kb和1.58kb的片段(见图1)。

Lane 1:1kb DNA ladder;Lane 2:p G4ASVHB/HindⅢ+Eco RⅠ.

2.2 植物高效表达载体(p GBIF4ABCVHB)的构建

p G4ASVHB上有两个HindⅢ位点，故先用Eco RⅠ完全酶切质粒p G4ASVHB，然后再用HindⅢ酶切，回收1.58kb大小的vgb M基因表达盒片段。HindⅢ酶切p GBIF4ABC，回收13.5kb载体片段，然后将vgb M基因表达盒克隆至载体p G-BIF4ABC上，即可获得含vgb M基因表达盒和融合杀虫基因的植物表达载体p GBIF4ABCVHB，该质粒的酶切鉴定结果与理论相符。p GBIF4ABCVHB的酶切鉴定图谱见图2，其质粒图谱见图3。

1:p GBIF4ABC/HindⅢ;2:pG4ASVHB/HindⅢ;3:pGBIF4ABCVHB/HindⅢ;M:marker.

新构建的植物表达载体p GBIF4ABCVHB中含有融合杀虫基因和vgb M基因表达盒。vgb M基因表达盒中包含有2个增强子的35S启动子、Ω前导序列、Kozak序列、多联终止密码子及Nos终止子;融合杀虫基因表达盒中，除含有以上提高转录和翻译的调控元件外，还包含有正确切割、加工序列、Poly(A)信号序列。融合杀虫基因和vgb M基因各带有自己的能增强转录和翻译的调控元件，这些顺式作用元件将有利于外源基因在受体植物中的高效表达(见图3)。

2.3 融合杀虫基因和VHb基因导入烟草的初步研究

2.3.1 vgb M基因的Western blot检测

通过根癌农杆菌介导的叶盘法转化烟草，获得了卡那霉素抗性植株。将PCR和Southern blot检测的阳性植株作为待测对象。Western blot检测表明在这些转基因烟草中，vgb M基因全部表达出了目的蛋白，图4是部分转基因烟草蛋白提取物的Western blot结果。

2.3.2 杀虫基因表达产物的生物学检测

转基因烟草植株的叶片杀棉铃虫实验结果表明，在32株转基因烟草中，15株具有极高或高抗性，16株具有中等抗性，4株低抗性。

3 讨论

转基因中外源基因的表达受顺式作用元件和细胞内的反式作用因子调控[9,11]，本实验的基因的表达盒中含有如下的表达调控元件:5′端Ca MV35S启动子及增强子加倍元件、5′端Ω序列和Kozak序列、3′端的多腺苷酸序列poly(A)、切割序列和加工序列、3′端多联终止密码子序列及Nos终止子，这些元件有利于外源基因在受体植物中高效表达。融合杀虫基因不但可以减少由于同源性造成的反式失活现象，而且可以使不同基因同时等量表达，一旦融合基因插入植物基因组中有利于转基因高效表达的位点，几个基因就可以同时发挥作用，从而减缓昆虫对转基因产生抗性的进程，也扩大了抗虫基因的杀虫谱[4,11]。

1,positive control;2,nontransgenic group;3-7,the transgenic tobacco plants;M,marker.

邓肯新复极差测验:*,差异显著水平(P<0.05);,极显著水平(P<0.001)。

Duncan's test(LSR):*,significance at P<0.05 lever;,extreme significance at P<0.001 level.

透明颤菌能合成血红蛋白以适应在贫氧的环境生活，它具有结合氧的特性，具有增强光合作用，可大幅提高植物生物量[6]，本实验首次将VHb基因和融合杀虫基因，构建成双价基因植物表达载体，导入烟草中的研究表明:可通过分子育种培育作物抗虫，稳产新品种，该双价基因表达载体在生产应用中具有潜在的应用价值，也为本实验室通过分子育种培育高产，稳产抗虫棉花新品种奠定了技术基础。

参考文献

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[2]Dikshit K L,Dikshit R P and Webster D A.Study of Vitreoscilla globin(vgb)gene expression and promoter activity in E.coli through transcriptional fusion[J].Nucleic Acids Research,1990,18(14):4149-4155.

[3]闫新甫.转基因植物[M].北京:科学出版社,2003:1-240.

[4]王友如,崔洪志,郭三堆.含VHb基因和GFMcryIA基因的双价基因植物高效表达载体的构建[J].武汉植物学研究,2007,25(02):118-122.

[5]王丽冰,刘立军,颜亨梅.转Bt抗虫基因水稻的研究进展和生物安全性及其对策[J].生命科学研究,2009,13(02):16-20.

[6]Wu Q W,Cui H Z and Guo S D.The synthesis of the vgbM gene with plant preferential codon and its function identification in E.coli[J].Scientia Agricultura Sinica,2004a,37(10):1439-1443.

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[8]王关林,方宏筠.植物基因工程[M].2版.北京:科学出版社,2002.

[9]陈红梅,李昆志,陈丽梅.植物来源抗虫基因的研究进展[J].中国生物工程杂志,2008,28(11):16-20.

[10]王丽冰,刘立军,颜亨梅.转Bt抗虫基因水稻的研究进展和生物安全性及其对策[J].生命科学研究,2009,13(02):48-55.

融合表达载体 篇4

sBLyS突变体酵母表达载体的构建

目的构建人BLyS胞外区(soluble BLyS)突变体毕赤酵母分泌型表达载体, 为深入探讨BLyS的功能和机制创造条件.方法以构建的人pUC19/sBLyS及其突变体重组质粒为模板,利用PCR扩增出6×his/sBLyS及其突变体的cDNA,克隆入酵母表达载体pPIC9K;行序列测定后电转化入毕赤酵母GS115,并进行表型筛选和G418抗性筛选;对高拷贝整合的重组酵母表达菌株进行PCR鉴定.结果构建得到酵母融合重组表达载体pPIC9K/6×his/sBLyS及其突变体;经G418浓度梯度筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母表达菌株.结论成功构建了人sBLyS及其突变体的.真核表达载体,为获得人sBLyS及其突变体蛋白,进一步研究BLyS的生物学功能奠定了基础.

作 者：黄刚 何凤田 连继勤 李蓉芬 胡颖  作者单位：第三军医大学生物化学与分子生物学教研室,重庆,400038 刊 名：重庆医学  ISTIC PKU英文刊名：CHONGQING MEDICAL JOURNAL 年，卷(期)： 35(7) 分类号：Q26 R392.12 关键词：B淋巴细胞刺激因子(BLyS)   毕赤酵母   突变体  

融合表达载体 篇5

1 材料与方法

1.1 质粒和菌株

大肠杆菌DH5a(为本室保存),质粒p CLXSN-h TERT(含全长的hTERT c DNA序列)由东京大学TAISUKE MORI教授惠赠,通过测序证实与GenBank提供的h TERT全长c DNA序列完全一致,酵母菌株L40 ura3(已经引入了pHyblex/Zeo2MS2质粒),酵母三杂交质粒pYestrp3由湘雅医学院何淑雅教授惠赠,阳性对照质粒pAD-IRP由美国WISCON教授惠赠。

1.2 主要试剂

高保真Taq聚合酶、T4 DNA连接酶、EcoRⅠ、HindⅢ限制性内切酶购自NEB公司,质粒小量提取试剂盒、DNA切胶回收试剂盒购自Axygen公司。

1.3 P CR扩增目的基因

参照GenBank h TERT序列,应用Primer Pre-mier 5.00引物分析软件分析hTERT的基因(基因编号:7015)序列设计4对引物,见表1,在引物5'端加HindⅢ和EcoR I酶切位点,以质粒pCLXSN-hTERT为模板,PCR扩增4段目的片断,PCR产物电泳鉴定后用Axy PrepDNA凝胶回收试剂盒纯化后备用。

注:1、2、3、4扩增的h TERT目的片段分别为49～1 903 bp、924～1 903 bp、105～1 850 bp、924～2 924 bp;翻译蛋白对应片段1～608aa、292～608 aa、17～593 aa、292～952 aa

1.4 重组载体的构建与鉴定

分别用HindⅢ和EcoRⅠ双酶切载体和4段hTERT基因片段,T4连接酶连接,转化大肠杆菌DH5a,菌落PCR鉴定转化产物,提取质粒DNA双酶切分析,阳性克隆送Invirtrogen公司测序鉴定,测序结果进行BLAST同源性比较和分析。

1.5 酵母自激活检测和毒性鉴定

按酵母电转化法(电压1.5 kV;电容25μF;电阻200Ω;电击时间为4 ms),含hTERT不同片段重组质粒pYESTrp-hTERT分别转化酵母,取转化产物分别涂布于YC、YC-W、YC-UW、YC-H和YC-UWH(含氨基三唑3-AT 10 mmol/L:酵母His3蛋白的竞争性抑制剂,可抑制某些报告株中低水平的His渗漏表达)缺陷培养板,30℃培养3 d观察结果。

2 结果

2.1 P CR扩增产物鉴定结果

PCR扩增得到的DNA经琼脂糖凝胶电泳鉴定,证实扩增产物与预期结果一致,见图1。

1～4分别是1 854 bp、2 000 bp、1 745 bp、979 bp的h TERT基因片段;M:DNA Marker D515A

2.2 含重组质粒pYES Trp3-hTERT的菌落P CR鉴定结果

目的基因h TERT片段与p YESTrp3成功连接,构建重组质粒,转化大肠杆菌,分别用相应的引物对转化后的单克隆细菌进行菌落鉴定:为便于记忆,重组质粒按翻译蛋白片段重新命名为p YESTrp3-h TERT(1～608)、pYESTrp3-hTERT(17～593)、p YESTrp3-h TERT(292～608)和p YESTrp3-h TERT(292～952),见图2。

1～4分别是重组质粒p YESTrp3-hTERT(1～608)、pYESTrp3-hTERT(17～593)、p YESTrp3-h TERT(292～608)、pYESTrp3-hTERT(292～952)

2.3 重组质粒双酶切分析

含不同hTERT片段重组质粒分别用EcoRⅠ和HindⅢ进行双酶切,鉴定结果见图3。

1～4分别是重组质粒p YESTrp3-hTERT(1～608)、pYESTrp3-hTERT(292～952)、pYESTrp3-hTERT(17～593)和pYESTrp3-h TERT(292～608);M:DNA Marker D515A

2.4 pYES Trp3-hTERT序列分析结果

DNA测序证实,p YESTrp3-hTERT内4个插入片段与Geneabank公布hTERT序列同源性都在99%以上,目的基因氨基酸读码框架完全正确,见图4。

2.5 重组质粒pYES Trp3-hTERT转化酵母自激活检测和毒性鉴定结果

重组质粒电转化酵母后,分别涂板于下列缺陷培养板上培养3～5 d,在10 cm的YC-W平板上肉眼可见菌落,菌落大小在2 mm左右,菌落数均>100个,形态饱满,而在YC-H和YC-UWH培养基上无菌落生长,说明转化成功,表达产物无酵母毒性和自激活性。

注:+生长,○不生长;pADIRP阳性对照,PMD18-T阴性对照。YC-H和YC-UWH平板上含3-AT 10 mmol/L

3 讨论

酵母RNA三杂交技术是目前公认研究RNA和蛋白质相互作用效率较高、价廉的技术,属于体内实验,能保持蛋白结构的本原及完整性和避免RNA体外降解[5]。由于RNA三杂交系统中目的蛋白的长度范围为70～963 aa[6],并且系统的灵敏性和特异性随着表达蛋白分子量的增加而下降,因此,需要找到与hTR相互作用的有效hTERT片段,这是本研究解决的关键问题。为研究hTERT与hTR的结合部位,有人将全长的hTERT切成不同片段[7,8],用免疫沉淀法和电泳迁移率实验(EMSA)检测这些片断与hTR的结合能力。除证实逆转录区不是hTR的结合部位外,其他段都和hTR有结合能力,1～600 aa的结合力和全长的hTERT基本一样,还有人报道的与hTR结合的最小片断301～927 aa[9,10],这显然不是最小结合部位,最小结合部位可能在200～500 aa之间。因为:(1)最近研究表明人hTERT的RID2区(325～536aa)和hTR保守的CR4-CR5区表现很高的亲和力,hTERT的RID1(1～230 aa)/NGQ和hTR也有较低亲和力,而这两个区域主要跟端粒重复序列持续合能力和酶的稳定性有关,NGQ缺失的hTERT和hTR结合能力跟全长的hTERT一样强[11,12,13]。(2)200～500 aa区是富含精氨酸、脯氨酸区域,这一特征往往表明其结合特性。因此,本课题组除了构建文献报道的hTERT和hTR结合阳性片断pYESTrp3-hTERT(1～608 aa)和pYESTrp3-hTERT(292～952 aa)外,还构建了包含hTERT RID1和RID2区的小片断p YESTrp3-hTERT(17～593 aa)和单独包含RID2区的片断pYESTrp3-hTERT(292～608 aa)。

融合表达载体 篇6

Stathmin基因定位于人染色体1p35～36.1上,这个区域是肿瘤细胞基因组DNA杂合性缺失或丢失频率非常高的位点。stathmin蛋白含有149个氨基酸,分子量为19kD,是一种微管不稳定蛋白,通过自身的磷酸化和去磷酸化调节细胞微管系统的动态平衡[1],在多种恶性肿瘤中异常高表达。RNAi技术是通过19-31nt的小分子干扰RNA与特异性mRNA结合,达到特定基因沉默的目的,具有高效性和特异性的特点,避免了传统基因敲除的致死性,在基因治疗及基因功能研究上应用广泛[2,3]。本实验通过构建stathmin基因SiRNA质粒表达载体,探讨特异性沉默鼻咽癌5-8F细胞系stathmin基因对鼻咽癌细胞stathmin基因表达的影响,为鼻咽癌的基因治疗提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

鼻咽癌5-8F细胞株(中南大学湘雅医学院提供);JM109大肠杆菌株(桂林医学院科学实验中心保藏);质粒表达载体pGenesil1.1(武汉晶赛公司)。

1.1.2 实验试剂

限制性内切酶EcoRⅠ、MluⅠ和SalⅠ为Promega公司产品;DL2000 DNA、DL1000 Marker、T4 DNA连接酶和RT-PCR试剂盒为Takara公司产品;质粒提取试剂盒为天根公司产品;1640培养基购自GIBCO公司;小牛血清购自四季青公司;脂质体购自QIAGEN公司;兔抗人stathmin抗体为Bioworld公司产品;小鼠抗人β-actin抗体、辣根过氧化物酶山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG二抗和BCA蛋白定量试剂盒为碧云天公司产品。

1.1.3 引物合成

GAPDH上游引物:5’-TCAGCCGCATCTTCTTTTG-3’;

下游引物:5’-GATGGCATGGACTGTGGTC-3’,产物594bp。

Stathmin上游引物:5’-ATGGCTTCTTCTGATATCCAGG-3’;

下游引物:5’-TTAGTCAGCTTCAGTCTCGTCA-3’,产物449bp。

引物由Invitrogen公司合成。

1.1.4 仪器

多功能高速冷冻离心机(德国Eppendorf);UV-2401紫外可见分光光度计(日本岛津公司);PCR扩增仪(德国BIOMETRA);小型垂直电泳转印系统(美国伯乐);全自动数码成像分析系统(英国SYNGENE);制冰机(日本);DYCP-31系列水平电泳仪;CO2培养箱。

1.2 方法

1.2.1 用于Stathmin沉默的目标DNA片段的设计与合成

根据GeneBank Stathmin基因序列及SiRNA设计原则,设计、合成用于Stathmin 特异性干扰DNA片段(目的基因SiRNA干扰序列为粗斜体字部分)命名为STM,该序列经过BLAST比较,与人基因库其它基因均无同源性。

STM正义链:5’-CACCGCGAGAGAAGGATAAGCACATTTCAAGACGATGTGCTTATCCTTCTCTCGCTTTTTTG-3’;

STM反义链:5’-TCAAAAAAGCGAGAGAAGGATAAGCACATCGTCTTGAAATGTGCTTATCCTTCTCTCGC-3’。

1.2.2 Stathmin基因SiRNA质粒表达载体的构建

将合成的单链DNA片段进行退火,形成双链DNA片段;采用EcoRⅠ酶切质粒表达载体pGenesil1.1,用1%琼脂糖凝胶电泳回收线性化质粒载体;采用T4连接酶将目标双链DNA片段与线性化的质粒载体连接,命名为:pGenesil1.1-STM;连接产物转染感受态JM109大肠杆菌,用卡那霉素抗性LB平板进行筛选,挑取单个菌落进行扩增。采用质粒提取试剂盒提取质粒;用MluⅠ和SalⅠ双酶切和测序对质粒进行鉴定。

1.2.3 通用阴性对照质粒表达载体

通用阴性对照质粒表达载体pGenesil-1.1HK为武汉晶赛生物公司产品,其编码的siRNA为GACTTCATAAGGCGCATGC,该序列与人基因库的基因无同源性。鉴定方法同上。

1.2.4 质粒表达载体转入鼻咽癌5-8F细胞的效率分析

取对数生长期5-8F细胞,按10×105细胞/孔接种于6孔板。第2d细胞培养至约50%融合时进行质粒表达载体转染。设:1)对照组(脂质体试剂);2)阴性对照组(转染pGenesil 1.1-HK);3)Stathmin特异性组(转染pGenesil 1.1-STM)。操作按照GIAGEN公司脂质体Effectene使用说明书进行。载体转染细胞24h后换液,48h后在荧光显微镜下观察转染效率并拍照。

1.2.5 RT-PCR检测stathmin基因的表达

转染48h后收集细胞,采用Trizol法提取总RNA,测定浓度,各组取0.77μg总RNA,以GAPDH为内参,按一步法RT-PCR试剂盒使用说明书进行操作;RT-PCR反应条件如下:50℃ 30min,94℃ 3min,94℃ 30s,62℃ 30s,72℃ 1min,30个循环,最后72℃、5min。反应完成后,取5μl产物于2%琼脂糖凝胶中进行电泳分析。

1.2.6 Western Blot检测stathmin蛋白表达

细胞转染48h后,去上清,用PBS洗2次,加入蛋白裂解液,置冰上15min,收集裂解液,超声波处理,12 000r/min、30min,取上清,测定蛋白浓度。取蛋白50μg加入点样buffer,转入制好的15%SDS-PAGE凝胶点样孔中,点入预染蛋白Marker作参照;电泳分离后,采用电转法将蛋白转移到PVDF膜上(100V,300mA,1.5h)。采用5%的脱脂奶粉封闭PVDF膜2h后,加入一抗(30℃、50r/min,孵育2h),用TBST洗3次,每次5min;加入辣根过氧化物酶标记的二抗(30℃、50r/min,孵育2h),TBST洗3次,每次5min;在暗室中加入发光剂,压片、洗片。

2 结果与分析

2.1 Stathmin基因SiRNA质粒表达载体的鉴定与分析

MluⅠ和SalⅠ双酶切通用阴性对照pGenesil-1.1HK质粒表达载体和目标基因pGenesil1.1-STM质粒表达载体,有约316bp大小的酶切片段,其结果与预测相符合(见图1)。测序结果表明,构建的质粒载体序列与设计序列完全一致,插入方式与位点正确(见图2),表明构建质粒表达载体可靠。

M:DNA Marker;1:p Genesil1.1-HK;2:p Genesil1.1-STM.

A:阴性对照pGenesil1.1-HK;B:stathmin基因pGenesil1.1-STM。

A:Negative control group pGenesil1.1-HK;B:stathmin pGenesil1.1-STM.

2.2 构建的质粒表达载体转染效率分析

质粒载体pGenesil1.1能表达绿色荧光蛋白,质粒转入细胞后能进行转染效率分析,转染效率为78.8±6.8%。

2.3 Stathmin基因SiRNA质粒表达载体抑制stathmin的mRNA表达

与脂质体组和阴性对照pGenesil1.1-HK组比较,stathmin基因特异性pGenesil1.1-STM组stathmin表达明显降低;脂质体组和阴性对照pGenesil1.1-HK组比较,stathmin表达无明显差别(见图3)。

2.4 Stathmin基因SiRNA质粒表达载体抑制stathmin的蛋白表达

与脂质体组和阴性对照pGenesil1.1-HK组比较,stathmin基因特异性pGenesil1.1-STM组stathmin蛋白表达明显降低;脂质体组和阴性对照pGenesil1.1-HK组比较,stathmin蛋白表达无明显差别(见图4)。

3 讨论

载体对外源蛋白表达的影响 篇7

已将β-1, 4-内切木聚糖酶xynⅢ基因成功地连接到原核表达载体p ET20b (+) (分子量为3716bp) 和p ET21a (+) (分子量为5443bp) 上, 并转化入大肠杆菌 (Escherichia coli) BL21 (DE3) 。为了确定xynⅢ基因在哪个载体中更能高效表达, 本实验对其作了研究比较。

1材料与方法

1.1材料

(1) 菌株与载体大肠杆菌 (Escherichia coli) BL21 (DE3) 为实验室保藏菌种。p ET20b (+) 和p ET21a (+) 为Novagen公司产品。

(2) 主要试剂胰蛋白胨 (Tryptone) , 酵母抽提物 (Yeast Extract) , 琼脂糖 (Agarose) , 牛血清蛋白, 桦木木聚糖等生化试剂均为Ta Ka Ra产品;氨苄青霉素Amp购自创生公司, DNA分子量Marker (DL2000、λHindⅢ) 购自Ta Ka Ra公司, 蛋白质分子量Marker购自宝赛公司, 氢氧化钠、氯化钠等普通试剂为分析纯。

(3) 主要仪器SK18型高速冷冻离心机, Sectrophotometer ND-1000, JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎机, DYY-5型稳压稳流电泳仪, 衡温振荡培养箱, 紫外透射仪紫外分光光度计。

1.2方法

1.2.1质粒的提取

(1) 挑取含有重组质粒p ET21a (+) -xynⅢ和p ET20b (+) -xynⅢ的单克隆, 分别接种于10 ml含有100mg/m L Amp的LB液体培养基中, 37℃, 220 rpm, 摇床过夜培养。

(2) 用紫外分光光度仪检测菌体浓度显示均为2.2, 剩余菌液用碱裂解法提取质粒DNA, 并用Sectrophotometer ND-1000测其浓度。

1.2.2 PCR扩增xynⅢ, 并通过电泳检测扩增产物的亮度

分别以重组质粒p ET21a (+) -xynⅢ和p ET20b (+) -xynⅢ为模板对xynⅢ进行PCR扩增, PCR体系如下:

PCR程序:94℃3min;94℃30s, 52.8℃30s, 72℃40s, 15个循环;72℃7min。

1.2.3 SDS-PAGE电泳检测外源蛋白表达

(1) 挑取含有重组质粒和含有空质粒p ET21a (+) /p ET20b (+) 的单克隆, 分别接种于3 ml含有50mg/m LAmp的LB液体培养基中, 37℃, 220 rpm, 摇床过夜培养。

(2) 取上述过夜培养物以1/100的比例转接入含50 mg/m L Amp的LB液体培养基中, 37℃, 220rpm, 培养2-3h (OD值达到0.6-0.8) , 加入IPTG于30℃条件下诱导培养6 h。

(3) 分别取IPGT诱导前和诱导后的菌液样品l ml, 收集菌体, 用30 u L的PBS缓冲液 (p H7.2) 重悬细胞沉淀, 再加入6×SDS-PAGE buffer, 混匀后100℃煮沸10 min, 离心取上清, 即可用于SDS-PAGE检测。

1.2.4蛋白含量测定

采用Bradford法测定蛋白浓度[3], 以牛血清蛋白作为标准蛋白。

蛋白浓度C= (91.69Y+2.743) /V

其中:C———蛋白浓度, 单位μg/μl;

Y———A595值;

V———加样体积, 单位μl。

2结果

2.1质粒浓度的测定结果

用Sectrophotometer ND-1000对提取的质粒测浓度。结果如表2。

由此可以看出:在菌体浓度相同的情况下, 分子量小的质粒对菌体细胞造成的负荷较小, 从而在细胞中的扩增倍数较多。

2.2PCR扩增xynⅢ的电泳检测结果

分别以质粒p ET21a (+) -xynⅢ和p ET20b (+) -xynⅢ为模板对xynⅢ进行PCR, 通过电泳检测 (如图1) 可以明显看出以p ET20b (+) -xynⅢ为模板扩增的基因产量高。足以说明在相同体积下p ET20b (+) -xynⅢ质粒浓度大。

2.3 p ET21a (+) -xynⅢ和p ET20b (+) -xynⅢ表达产物检测结果

以大肠杆菌的超声波破碎酶液为对照:将全细胞蛋白和超声波破碎细胞离心后得到的上清酶液进行SDS-PAGE检测, 如图2所示, 有明显的外源蛋白产物条带出现;p ET20b (+) -xynⅢ表达产物的条带明显比p ET21a (+) -xynⅢ表达产物的条带亮。

2.4蛋白含量的测定

在595nm下, 用紫外分光光度仪测两种重组菌的酶液上清的吸光值, 得到表3的数据, 进而带入公式计算出各蛋白的浓度。明显看出p ET20b (+) -xynⅢ表达产物的量多于p ET21a (+) -xynⅢ表达产物的量。

3讨论

外源基因表达产量与细胞浓度和细胞表达产量呈正相关。单个细胞产量取决于:外源基因的拷贝数。本实验所选用的p ET20b (+) 载体因为其分子量小于p ET21a (+) 载体的分子量, 在细胞内进行扩增时对细胞造成的负荷会小一点, 所以p ET20b (+) 载体的拷贝数多于p ET21a (+) 载体的, 进而载体上所连接的外源基因的拷贝数也多, 因此外源基因的表达产量会相对的增多。

参考文献

[1]张世敏, 刘寅, 刘新育, 等.木聚糖酶基因研究进展[J].微生物学杂志, 2006, 7, 26 (4) :61-67

[2]何成新, 张厚瑞.木聚糖水解酶的研究进展[J].广西轻工业, 1998, 4:12-15.

miR-16表达载体的构建 篇8

1 材料

pSuper质粒由武汉同济医院临床免疫室保存。E.coli DH5α感受态细胞、H e p G 2细胞由华中科技大学微生物系病毒实验室保存。T a q D N A聚合酶购自F e r m e n t a s公司。T r i z o l、Lipofectamine 2000为invitrogen公司产品。SYBR GreenⅠ、ECL试剂盒为Roche公司产品。M-mulv、DNase (RNase free) 为Promega公司产品。T4DNA连接酶、限制性内切酶、质粒抽提试剂盒、凝胶回收试剂盒、基因组DNA提取试剂盒为Takara公司产品。

2 实验

2.1 实验方法

(1) 设计PCR引物扩增hsa-miR-16的编码基因片段:从“The miRNA Registry” (MI0000070) 数据库中获得成熟的miRNA和PremiRNA序列, 通过Pre-miRNA序列获得Pri-miRNA序列, 以及成熟序列两侧约125nt的侧翼序列, 加上保护碱基和酶切位点。产物片段总长度为270bp。依据该序列设计引物, 引入PolyT (TTTTT) 和BamHI, SalI的酶切位点和保护碱基。引物由上海英骏生物公司合成。引物序列如下:上游引物 (命名为M16f1) 5'GCGGATCCAGCACATCATGGTTTACA 3’下游引物 (命名为M16r1) 5’GCGTCGACAAAAAATGTTACCTTAAAGGG 3’。

(2) 重组质粒PmiR-16的构建:使用Takara公司质粒抽提试剂盒提取 (HepG2) 细胞基因组DNA, 利用M16f1、M16r1引物进行PCR扩增, 反应条件:94℃4min, 94℃45s, 50℃45s, 72℃45s×30。将270bp目的片段切胶回收后用BamHI、SalI酶切, 获得目的基因。pSUPER经BglⅡ、SalI双酶切后回收线性化空载体。取1uL线性化载体, 与6uL的目的基因片段, 在T4连接酶作用下, 16℃连接过夜12h, 转化E.coli DH5α感受态细胞, 均匀涂于Amp (氨苄青霉素) +LB平皿上, 37℃培养过夜12h。随机挑取菌落小量培养, 直接用PCR鉴定和抽提质粒后用EcoRⅠ, SalⅠ酶切鉴定。酶切分析正确的克隆送上海英骏生物公司测序进一步证实。

2.2 实验结果

重组质粒PmiR-16的酶切鉴定, 证实重组质粒PmiR-16构建成功。见图1。酶切分析正确的克隆送上海英骏生物公司测序与the miRNA Registry的序列一致。

3 讨论

1993年Lee[3]等首次在线虫中发现, 基因Lin-4[4]通过转录生成的RNA调控虫体的发育过程。2000年研究人员又在线虫中发现Let-7基因[5], 这2种基因编码一类长度约为21nt的小分子RNA, 这种小分子RNA的长度很短而且作用时间也是暂时的, 所以开始被命名为stRNA (Small Temporal RNA) 。随后多个研究小组在线虫、果蝇、人类Hela细胞等多种真核细胞中发现近千个相似的小分子RNA, 并将这些小分子RNA统称为miRNA。miRNA是一种21～25nt的单链小分子RNA。它不编码蛋白质, 本身不具有开放阅读框 (OFR) 。miRNA在各个物种间具有高度的进化保守性。这种高度的物种间保守性可能与其功能有着密切的关系。miRNA作为一种新近发现的小分子RNA, 其在生物体内起着重要的作用。到目前为止, 已明确靶基因及确定功能的miRNA为数不多。研究表明在miRNA慢性淋巴细胞白血病中起到重要的作用[6], 但具体的作用机制还须进一步的试验证实。

目前较为常用的制备miRNAs的方法, 有体外制备miRNAs和以DNA为模板转染到细胞并在体内转录得到miRNAs。本实验采用了后一种方法, 本法简便, 不需要直接操作RNA, 克服了人工合成miRNA容易降解, 成本昂贵的缺点。而且由于含表达载体的菌株可长期保存并大量扩增, 为今后的研究提供了极大的方便。目前在病毒性疾病的治疗研究中, 可设计针对病毒基因组RNA的miRNAs或针对宿主细胞受体的miRNA来抗病毒, 现阶段已经开展了针对HBV、HCV、脊髓灰质炎病毒及HIV-1等研究, 已经取得一定的成果[7]。本试验成功构建了重组质粒PmiR-16, 将为进一步将miR-16作为基因靶向治疗药物打下分子生物学基础。

摘要：目的构建miR-16表达载体, 为研究miR-16对HBV的干扰作用打下基础。方法根据miRNA的成熟序列以及附近约100多碱基共270个碱基序列, 设计PCR引物, PCR扩增, 退火后用T4联接到线性化的pSUPER质粒中, 并对重组质粒 (命名为pmiR-16) 进行酶切及测序鉴定。结果成功构建了重组质粒PmiR-16。结论成功构建miR-16表达载体。

关键词：表达载体,microRNAs,miR-16

参考文献

[1]Lagos-quintana, M Rauhat, Lendecked W, et al.Identification of novel genes coding for small expressed RNAs[J].Science, 2001, 294:883～858.

[2]Lee Y, Jeon K J, Kim S, Kim V N.MicroRNA maturation:stepwise processing and subcellular localization[J].EBO J, 2002, 21:4663～4670.

[3]Lee RC, Feinbaum RL, Ambros V.The Caenorhabditiselegans heterochronic gene lin-4encodes small RNAswith antisense complementarity to lin-4[J].Cell, 1993, 75 (5) :843～854.

[4]Reinhart BJ, Slack FJ, Basson M, et al.The21-nucleotide let-7RNA regulates developmental timing in caenorhabditis elegans[J].Nature, 2000, 403 (6772) :901～906.

[5]Horvitz, H.R.&Sulston, J.E.Isolation and genetic characterization of cell-lineage mutants of the nematode Caenorhabditis elegans[J].Genetics, 1980, (6) :435～454.

[6]Mourelatos Z, Dostie J, and Paushkin S, et al.MiRNPs:A novel class of ribonucleoproteins containing numerous microRNA[J].Gene Dev, 2002, 16 (6) :720～728.

GAPB基因原核表达载体的构建 篇9

1 材料与方法

1.1 材料

哥伦比亚型拟南芥、大肠杆菌DH5α和BL21 (DE3) 由本实验室保存。胶回收试剂盒和质粒小量提取试剂盒购于上海华舜生物技术公司。PET28a (+) 质粒载体由四川大学遗传学重点实验室惠赠。所需引物由上海英俊生物技术有限公司合成。限制性内切酶Bam HI和Xho I、高保真酶Pfu以及T4 DNA连接酶购于MBI Ferments公司。

1.2 方法

1.2.1 拟南芥总RNA的提取

利用TRIZOL试剂盒提取哥伦比亚型拟南芥总RNA, 1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA产物。然后用反转录试剂盒将RNA反转合成c DNA, 作为扩增基因的模板。

1.2.2 引物的设计

利用Primer primer5.0根据GAPB的基因序列设计特异性引物, 引物含有Bam HI和Xho I酶切位点, 序列如下:

上游酶切位点为Bam HI, 下游酶切位点为Xho I, 引物由上海英俊公司合成。

1.2.3 PCR扩增和胶回收GAPB基因

以拟南芥c DNA为模板, 用PCR法扩增GAPB基因, 反应体系如下:10×PCR Buffer (含Mg Cl2) 2.5μL, (2.5 m M) d NTP 2μL, 上游引物 (F) 1μL, 下游引物 (R) 1μL, c DNA 0.5μL, Pfu酶0.2μL, dd H2O 17.8μL。PCR反应条件:94℃预变性3 min后进入以下循环, 94℃35 s, 59℃35 s, 72℃1 min30 s, 共进行30个循环, 最后72℃延伸10 min结束PCR反应, 扩增得到GAPB基因的全长。按胶回收试剂盒的说明回收GAPB基因片段。

1.2.4 PET28a (+) 质粒的提取

将PET28a (+) -DH5α菌株划线于含Kan的LB固体培养基中, 37℃培养过夜, 次日挑单菌落于含Kan的LB液体培养基中, 37℃培养过夜, 按照质粒小量抽提试剂盒说明书提取PET28a (+) 质粒。

1.2.5 目的基因和载体的双酶切

采用50μL酶切体系, 分别用Bam HI和Xho I双酶切PET28a (+) 载体和纯化的GAPB基因片段, 用胶回收试剂盒纯化回收酶切后的载体片段和基因片段, 取少量回收产物作1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.6 连接及重组质粒的转化

用T 4连接酶连接酶切纯化后的GA P B基因和PET28a (+) 载体片段, 连接体系为25μL, 16℃连接过夜。然后制备大肠杆菌DH5α感受态细胞, 将连接体系转化大肠杆菌DH5α。在转化时设置阳性和阴性对照, 阳性对照为未酶切的PET28a (+) 质粒, 用以检测转化效率;阴性对照为空的大肠杆菌感受态, 用以检测感受态细胞是否有污染。将转化产物涂布于含Kan的LB固体培养基中, 37℃过夜培养。

1.2.7 重组质粒阳性克隆的鉴定

在含有重组质粒的LB平板上随机挑取多个单菌落, 以其为模板分别作PCR扩增反应, 1%琼脂糖凝胶电泳检测是否有目的条带。同时将挑取的多个单菌落分别摇菌, 按质粒提取试剂盒的说明提取质粒, 并用Bam HI和Xho I双酶切质粒, 电泳检测酶切产物。

1.2.8 表达质粒的构建与鉴定

将双酶切鉴定正确的阳性克隆菌株送上海华大基因测序, 分析克隆基因的序列组成及其阅读框的正确性。测序正确后, 提取PET28a (+) -GAPB/DH5α阳性克隆的质粒, 将该质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3) 感受态细胞, 并挑取多个单菌落作PCR鉴定, 得到含有PET28a (+) -GAPB质粒的BL21 (DE3) 表达菌。

2 结果与分析

2.1 RNA纯度的测定

对提取的拟南芥总RNA进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测, 发现RNA产物条带清晰, 并且28S条带亮度是18S的2倍左右 (图1) 。紫外分光光度计分析显示, A260/A280=1.92, 表明获得的RNA纯度及浓度较高, 可以用于基因全长的扩增。

2.2 GAPB基因的扩增

利用设计的特异性引物作梯度PCR, 寻找扩增GAPB基因的最佳退火温度, 发现在59℃退火温度下, GAPB基因扩增的条带最好。电泳图 (图2) 显示大约在1344 bp左右有一目标条带, 说明已根据设计的引物克隆出所需要的基因片段。

2.3 PET28a (+) -GAPB重组质粒的PCR鉴定

选用PET28a载体上的T7上游引物与GAPB的下游引物配对, 进行菌落PCR筛选阳性克隆。通过1%的琼脂糖凝胶电泳检测, 大多数都得到与GAPB基因大小一致的片段 (图3) , 说明得到了重组质粒的阳性克隆。

2.4 PET28a (+) -GAPB重组质粒的双酶切鉴定

重组质粒经Bam HI和Xho I双酶切后出现2条带, 其中1条带大小约为1344 bp左右 (图4) , 与GAPB基因大小一致, 说明PET28a (+) -GAPB重组质粒构建正确。

2.5 转化BL21 (DE3) 重组质粒的鉴定

将重组质粒PET28a (+) -GAPB转化到大肠杆菌BL21 (DE3) 中, 经抗性筛选, 挑取单菌落, 作菌落PCR鉴定, 经1%的琼脂糖凝胶电泳检测到目的条带 (图5) , 说明转化成功。

3 讨论

在植物的糖酵解和糖异生途径中, 三磷酸-甘油醛脱氢酶 (GAPDH) 是关键酶, 参与糖酵解过程中第一个ATP的形成。由于GAPDH具有高度的保守性, 人们通过比较不同物种的该基因核酸序列和蛋白序列的异同, 对物种进行分类, 建立物种之间的系统发育关系[5]。在外界胁迫如热胁迫、渗透胁迫、缺氧胁迫或营养缺失条件下, 一些糖酵解相关基因的m RNA大量积累表达[6]。近年来, 有许多研究表明GAPDH基因的表达可能增强了植物抵抗胁迫的能力。Pillai等[7]将水稻幼苗进行干旱、淹没和脱落酸 (ABA) 处理, 结果表明GAPDH基因的转录水平显著提高。在植物中, 经H2O2诱导GAPDH的转录水平也可显著增加。Baek等[8]将GAPDH基因转化到拟南芥原生质体中, 发现该基因能强烈抑制热击时H2O2的产生和细胞的死亡。本研究以拟南芥c DNA为模板, 克隆出GAPB基因的全长, 并构建了原核表达载体PET28a (+) -GAPB, 为后续研究GAPB的功能提供了理论基础。

摘要：以拟南芥cDNA为模板, 用PCR扩增出GAPB的基因全长, 然后将GAPB基因片段连接到PET28a (+) 载体上, 构建重组质粒并转化大肠杆菌DH5α, 经菌落PCR和酶切鉴定筛选出阳性克隆, 测序正确后, 再将阳性克隆的质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3) 。结果表明:成功构建了原核表达载体PET28a (+) -GAPB, 为后续的GAPB融合蛋白的表达以及纯化奠定了基础。

关键词：GAPB,大肠杆菌BL21,PET28a (+) ,融合蛋白

参考文献

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