原核载体

原核载体（精选7篇）

原核载体 篇1

高等植物体内含有两类不同的三磷酸-甘油醛脱氢酶 (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GAPDH) , 一类是在叶绿体中有活性的参与卡尔文循环的关键酶, 另一类是存在于细胞质中参与糖酵解途径的关键酶[1]。在叶绿体中, GAPDH由GAPA和GAPB两个亚基组成, 在NADP (H) 的作用下参与卡尔文循环。在糖分解过程中, GAPDH可以在生物体内高效表达, 能催化3-磷酸甘油醛脱氢氧化并磷酸化生成高能化合物1, 3-二磷酸甘油酸, 是维持生命活动的基本酶之一[2]。GAPDH作用机制十分复杂, 在生物体内表达丰富, 常作为植物基因表达中的内参基因[3]。另外, GAPDH基因还具有抵御逆境胁迫的功能, 特别是在热激、高盐、低温等逆境胁迫下, 其基因表达模式将发生改变。刘志华[4]等利用酵母技术证明了GAPDH基因具有抗盐、碱以及高温胁迫的功能, 是一种重要的抗逆境胁迫基因。本研究以拟南芥c DNA为模板, 克隆得到正确的GAPB基因序列, 并将GAPB连接到表达载体PET28a (+) 中, 获得了原核表达载体PET28a (+) -GAPB, 为进一步研究GAPDH参与胁迫响应的机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

哥伦比亚型拟南芥、大肠杆菌DH5α和BL21 (DE3) 由本实验室保存。胶回收试剂盒和质粒小量提取试剂盒购于上海华舜生物技术公司。PET28a (+) 质粒载体由四川大学遗传学重点实验室惠赠。所需引物由上海英俊生物技术有限公司合成。限制性内切酶Bam HI和Xho I、高保真酶Pfu以及T4 DNA连接酶购于MBI Ferments公司。

1.2 方法

1.2.1 拟南芥总RNA的提取

利用TRIZOL试剂盒提取哥伦比亚型拟南芥总RNA, 1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA产物。然后用反转录试剂盒将RNA反转合成c DNA, 作为扩增基因的模板。

1.2.2 引物的设计

利用Primer primer5.0根据GAPB的基因序列设计特异性引物, 引物含有Bam HI和Xho I酶切位点, 序列如下:

上游酶切位点为Bam HI, 下游酶切位点为Xho I, 引物由上海英俊公司合成。

1.2.3 PCR扩增和胶回收GAPB基因

以拟南芥c DNA为模板, 用PCR法扩增GAPB基因, 反应体系如下:10×PCR Buffer (含Mg Cl2) 2.5μL, (2.5 m M) d NTP 2μL, 上游引物 (F) 1μL, 下游引物 (R) 1μL, c DNA 0.5μL, Pfu酶0.2μL, dd H2O 17.8μL。PCR反应条件:94℃预变性3 min后进入以下循环, 94℃35 s, 59℃35 s, 72℃1 min30 s, 共进行30个循环, 最后72℃延伸10 min结束PCR反应, 扩增得到GAPB基因的全长。按胶回收试剂盒的说明回收GAPB基因片段。

1.2.4 PET28a (+) 质粒的提取

将PET28a (+) -DH5α菌株划线于含Kan的LB固体培养基中, 37℃培养过夜, 次日挑单菌落于含Kan的LB液体培养基中, 37℃培养过夜, 按照质粒小量抽提试剂盒说明书提取PET28a (+) 质粒。

1.2.5 目的基因和载体的双酶切

采用50μL酶切体系, 分别用Bam HI和Xho I双酶切PET28a (+) 载体和纯化的GAPB基因片段, 用胶回收试剂盒纯化回收酶切后的载体片段和基因片段, 取少量回收产物作1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.6 连接及重组质粒的转化

用T 4连接酶连接酶切纯化后的GA P B基因和PET28a (+) 载体片段, 连接体系为25μL, 16℃连接过夜。然后制备大肠杆菌DH5α感受态细胞, 将连接体系转化大肠杆菌DH5α。在转化时设置阳性和阴性对照, 阳性对照为未酶切的PET28a (+) 质粒, 用以检测转化效率;阴性对照为空的大肠杆菌感受态, 用以检测感受态细胞是否有污染。将转化产物涂布于含Kan的LB固体培养基中, 37℃过夜培养。

1.2.7 重组质粒阳性克隆的鉴定

在含有重组质粒的LB平板上随机挑取多个单菌落, 以其为模板分别作PCR扩增反应, 1%琼脂糖凝胶电泳检测是否有目的条带。同时将挑取的多个单菌落分别摇菌, 按质粒提取试剂盒的说明提取质粒, 并用Bam HI和Xho I双酶切质粒, 电泳检测酶切产物。

1.2.8 表达质粒的构建与鉴定

将双酶切鉴定正确的阳性克隆菌株送上海华大基因测序, 分析克隆基因的序列组成及其阅读框的正确性。测序正确后, 提取PET28a (+) -GAPB/DH5α阳性克隆的质粒, 将该质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3) 感受态细胞, 并挑取多个单菌落作PCR鉴定, 得到含有PET28a (+) -GAPB质粒的BL21 (DE3) 表达菌。

2 结果与分析

2.1 RNA纯度的测定

对提取的拟南芥总RNA进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测, 发现RNA产物条带清晰, 并且28S条带亮度是18S的2倍左右 (图1) 。紫外分光光度计分析显示, A260/A280=1.92, 表明获得的RNA纯度及浓度较高, 可以用于基因全长的扩增。

2.2 GAPB基因的扩增

利用设计的特异性引物作梯度PCR, 寻找扩增GAPB基因的最佳退火温度, 发现在59℃退火温度下, GAPB基因扩增的条带最好。电泳图 (图2) 显示大约在1344 bp左右有一目标条带, 说明已根据设计的引物克隆出所需要的基因片段。

2.3 PET28a (+) -GAPB重组质粒的PCR鉴定

选用PET28a载体上的T7上游引物与GAPB的下游引物配对, 进行菌落PCR筛选阳性克隆。通过1%的琼脂糖凝胶电泳检测, 大多数都得到与GAPB基因大小一致的片段 (图3) , 说明得到了重组质粒的阳性克隆。

2.4 PET28a (+) -GAPB重组质粒的双酶切鉴定

重组质粒经Bam HI和Xho I双酶切后出现2条带, 其中1条带大小约为1344 bp左右 (图4) , 与GAPB基因大小一致, 说明PET28a (+) -GAPB重组质粒构建正确。

2.5 转化BL21 (DE3) 重组质粒的鉴定

将重组质粒PET28a (+) -GAPB转化到大肠杆菌BL21 (DE3) 中, 经抗性筛选, 挑取单菌落, 作菌落PCR鉴定, 经1%的琼脂糖凝胶电泳检测到目的条带 (图5) , 说明转化成功。

3 讨论

在植物的糖酵解和糖异生途径中, 三磷酸-甘油醛脱氢酶 (GAPDH) 是关键酶, 参与糖酵解过程中第一个ATP的形成。由于GAPDH具有高度的保守性, 人们通过比较不同物种的该基因核酸序列和蛋白序列的异同, 对物种进行分类, 建立物种之间的系统发育关系[5]。在外界胁迫如热胁迫、渗透胁迫、缺氧胁迫或营养缺失条件下, 一些糖酵解相关基因的m RNA大量积累表达[6]。近年来, 有许多研究表明GAPDH基因的表达可能增强了植物抵抗胁迫的能力。Pillai等[7]将水稻幼苗进行干旱、淹没和脱落酸 (ABA) 处理, 结果表明GAPDH基因的转录水平显著提高。在植物中, 经H2O2诱导GAPDH的转录水平也可显著增加。Baek等[8]将GAPDH基因转化到拟南芥原生质体中, 发现该基因能强烈抑制热击时H2O2的产生和细胞的死亡。本研究以拟南芥c DNA为模板, 克隆出GAPB基因的全长, 并构建了原核表达载体PET28a (+) -GAPB, 为后续研究GAPB的功能提供了理论基础。

摘要：以拟南芥cDNA为模板, 用PCR扩增出GAPB的基因全长, 然后将GAPB基因片段连接到PET28a (+) 载体上, 构建重组质粒并转化大肠杆菌DH5α, 经菌落PCR和酶切鉴定筛选出阳性克隆, 测序正确后, 再将阳性克隆的质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3) 。结果表明:成功构建了原核表达载体PET28a (+) -GAPB, 为后续的GAPB融合蛋白的表达以及纯化奠定了基础。

关键词：GAPB,大肠杆菌BL21,PET28a (+) ,融合蛋白

参考文献

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原核载体 篇2

1 材料和方法

1.1 材料:

表达带有GST标签pGEX-4T-1载体。基因工程菌E.coli DH5α和BL21 (DE3)(由厦门大学附属中山医院消化实验室赠送)。EcoRⅠ、SalⅠ限制性内切酶,T4DNA连接酶,Taq酶,以及PCR反应试剂盒为TaKaRa产品。DL15000 Marker、DNA Markerl,质粒提取试剂盒、DNA小量胶回收纯化试剂盒。异丙基硫代β-D半乳糖苷(IPTG)以及氨苄西林均为大连宝生物工程有限公司产品。逆转入试剂盒(MBI),Mouse anti-TSLP单克隆抗体(R&D公司),HRP标记Goat anti-Mouse IgG,ECL为杭州联科生物技术有限公司。其它试剂为进口或国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 引物合成:

参考GenBanK中TSLP全长基因的序列,应用primer primier5.0设计一对可扩增TSLP基因开放读码框区域的引物:上游引物PF:5'-CCGGAATTCCGGGTGTCCACGTATGT-TC-3 (画线部分为EcoRⅠ的酶切位点),下游引物PR:5'-CCGGTCGACGATGGTTACTGTTGTTTCAG-3'(画线部分为的SalⅠ酶切位点),(由上海英骏生物工程有限公司合成)。

1.2.2 目的基因的扩增:

人鼻黏膜上皮细胞总RNA的提取:按Trizol试剂盒所述方法提取人鼻黏膜RNA。-80℃,保存备用。以Oligo (dT)18为引物,遵循cDNA Synthesis System操作步骤合成cDNA。以cDNA为模板,以人TSLP基因的引物进行PCR扩增,扩增反应的条件为:95℃预变性2min,以95℃变性30 s,57℃退火30 s,72℃延伸1 min,35个循环后,再于72℃延伸10min。同时设立无模板的阴性对照。反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳鉴定,目的DNA片段的胶条用胶回收试剂盒回收。

1.2.3 重组质粒pGEX-4T-1/TSLP的构建与鉴定:

将纯化的PCR产物和载体pGEX-4T-1用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后,分别回收酶切产物,在T4 DNA连接酶作用下定向将TSLP基因片段与pGEX-4T-1连接,将连接产物转化入DH5α感受态细菌,在LB (Amp+)培养基中筛选培养。挑取克隆,培养后小量提取质粒,用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切鉴定筛选阳性重组质粒并送上海英骏生物技术有限公司测序。

1.2.4 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达及鉴定:

(1)重组质粒的诱导表达及SDS-PAGE分析:将鉴定成功的重组质粒DNA转化感受态细菌E.coli BL21,在LB (Amp+)培养基中筛选培养。将含有重组表达质粒的E.coli BL21在LB (Amp+)培养液中,37℃振荡培养过夜。以1%接种于LB (Amp+)培养液中,于37℃培养至A600nm约为0.6时,加入1mmol/L IPTG,于30℃继续诱导培养4 h。离心收集菌体,经超声碎菌后,提取菌体全蛋白,将菌体全蛋白进行SDS-PAGE (浓缩胶浓度为4%,分离胶浓度为12%)分析后,用考马斯亮蓝R250染色30min,用甲醇-冰醋酸脱色液脱色后观察结果。另外,取诱导前和诱导后2、4、6h的裂解菌液及超声裂解菌离心后的上清和沉淀,分别进行12%SDS-PAGE,分析目的蛋白的表达与诱导时间的关系,以及目的蛋白的表达形式。(2) Western blot分析:将表达产物经SDS-PAGE后,电转移至聚偏氟乙烯(PVDF)上,用封闭液(含5%脱脂奶粉的TBST)室温振荡封闭2 h。依次滴加Mouse antiTSLP单克隆抗体(室温反应1.5 h)及HRP标记Goat antiMouse IgG (室温反应1 h),用ECL化学发光试剂盒底物液显色后,观察结果。

2 结果

2.1 TSLP基因的扩增与鉴定结果:

人鼻黏膜上皮细胞TSLP基因进行PCR扩增,所获产物在2g/L琼脂糖凝胶中电泳,经EB染色,在紫外灯下观察到1条约500bp的带,同预期的目的片段的大小相符(图1)。

[M:DNA marker;1.2:PCR产物;3:阴性对照(without TSLP tem-plate)]。

(1.pGEX-4T-1/TSLP/EcoRⅠ、SalⅠ;2.pGEX-4T-1/TSLP/EcoRⅠ;3.pGEX-4T-1/TSLP/SalⅠM:MAKER)

2.2 重组质粒的构建与鉴定结果:

重组质粒pGEX-4T-1/TSLP的构建图略。将重组质粒pGEX-4T-1/TSLP用EcoRⅠ、SalⅠ分别进行单酶切及双酶切,pGEX-4T-1的大小约为4.9kb,扩增产物TSLP基因的大小约为509bp,线状重组质粒的大小为5.4kb,说明重组质粒大小正确。pGEX-4T-1/TSLP经EcoRⅠ、SalⅠ双酶切后,分成4.9 kb和0.5 kb两个片段,同预期值相符,表明目的基因已正确插入pGEX-4T-1载体中(图2)。阳性重组质粒测序结果在NCBI网进行BLAST分析比对,与GenBank登入的基因的序列完全一致(图3)

2.3 GST-TSLP融合蛋白的表达与鉴定结果:

以重组质粒转化感受态E.coli BL21,挑取阳性克隆后进行酶切鉴定将经IPTG诱导表达的产物用SDS-PAGE分析。结果表明,在Mr为40KD处有1条明亮带,同预期的目的蛋白的Mr相符,Mr 26KD处条带为融合蛋白GST-TSLP受细菌内蛋白酶的作用而降解产生的GST蛋白。表达时间分析表明,目的蛋白在诱导4 h时表达量最高(图4)。表达形式分析表明,目的蛋白大多以可溶性非包涵体形式存在于胞质中。将融合蛋白GST-TSLP经SDS-PAGE后,电转移至PDVF膜上,用抗TSLP抗体检测显示,在Mr为40 KD处有1条明显的带,预计TSLP的大小约14KD (图5)。

3 讨论

变应性疾病是一个多因素、多环节、多阶段的复杂疾病,随着对鼻息肉和过敏性鼻炎的基础研究日益深入,我们认识到其发病和转归有许多复杂的细胞、细胞因子、细胞间信号转导通路和大量免疫活性物质参与。TSLP基因是1994年Friend等首次从胸腺基质细胞中鉴定出来,由A、B、C、D4个螺旋束组成短链的I型细胞因子,研究表明,TSLP对淋巴细胞的发育、分化,尤其对树突状细胞的活化、分化起着重要的调控作用[3,4],研究显示受TSLP作用而被激活的CD11C+DC,可促进幼稚CD4+T细胞增殖,分泌大量IL-4,IL-5及TNF-α。同时,CD8+T细胞在TSLP激活DC的作用下,可产生大量INF-γ,IL-5和IL-13。INF-γ,IL-5和IL-13水平的升高,可导致炎性反应的加剧以及组织损伤,表明TSLP可能是炎症发生过程中一个重要的启动因子。鉴于TSLP具有的重要的免疫学功能及生理、病理学意义,探究TSLP在变应性疾病中的发生机制,因此寻找新的治疗方案及将多种治疗方法联合应用是变应性疾病治疗研究的热点。

选择有效的表达系统是进行外源基因高效表达的重要前提,本研究中利用分子克隆技术研究TSLP在原核基因的表达,明确诱导表达条件和目的蛋白的大小,因表达量是随着诱导剂量的增高而增高,但诱导剂对宿主菌有一定的毒害作用。我们将诱导时间定为2～6h,分别用9个不同终浓度的IPTG诱导。电泳分析,确定1mmol/L为最佳浓度。本实验采用1 mmol/L IPTG诱导浓度,分别诱导2～6h,电泳分析,确定4h为最佳诱导时间。外源基因表达为融合蛋白,分子量约为40 kD,在SDS-PAGE胶上的表观分子量基本符合此值,其中表达产物的N末端有一段含有GST标签的融合蛋白,大约为26 kD,此标签有利于目的蛋白的纯化。表达的GST-TSLP融合蛋白可用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析的方法纯化,GST序列后有一个可被凝血酶和Xa因子识别的蛋白酶切位点,通过蛋白酶的切割可产生天然的TSLP蛋白,为研究其抗原性提供了必要的条件。

本试验成功构建表达了含有TSLP的原核重组载体,并在大肠杆菌中表达,通过本试验所摸索的培养条件,我们可获得足够的融合蛋白,为进一步研究TSLP的抗原性和其抗体的免疫保护性奠定基础,为TSLP在变态反应性疾病的发病机制和临床应用等方面的研究提供了一定的理论和实验依据。

参考文献

[1]Wang Y H,Liu Y J.Thymic stromal lymphopoietin,OX40-ligand,and interleukin-25 in allergic responses[J].Clinical and Experimental Allergy,2009,86:236.

[2]Harada M,Hirota T,Jodo AI,et al.Functional analysis of the thymic stromal lymphopoietin variants in human bronchial epithelialcells[J].Am J Respir Cell Mol Biol.2009,71:236.

[3]Yong-Jun-Liu.Thymic stromal lymphopoietin:master switch for allergic infl animation[J].The Journal of Experimental Medicine,2006,122:310.

原核载体 篇3

试验通过对水牛Sox2基因进行体外原核表达研究, 为进一步研究其特性和功能、阐明干细胞调控网络和制备水牛Sox2多克隆抗体奠定基础。

1 材料

普通质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、DNA Marker、BL21 (DE3) 感受态细胞、增强型HRP-DAB底物显色试剂盒、羊抗鼠IgG-HRP, 天根生化科技 (北京) 有限公司生产;限制性内切酶 (BamHⅠ、Hind Ⅲ) 、T4 DNA连接酶, TaKaRa公司生产低分子质量蛋白, Fermentas公司生产;Anti-Sox2 Antibdy, Santa Cruz Biotechnology Inc公司生产。

2 方法

2.1 原核表达载体的构建

用限制性内切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ对含有目的基因的重组质粒pMD18-T- Sox2 (由广西大学动物繁殖所提供) 和原核表达载体pET-32a (+) 分别进行双酶切, 对酶切产物进行胶回收, 于16 ℃用T4 DNA连接酶连接12 h, 再转化感受态DH5α细菌, 获得目的基因原核表达载体pET- Sox2。

2.2 目的基因的诱导表达

用目的基因原核表达载体pET-Sox2转化表达菌株BL21 (DE3) 感受态细胞, 37 ℃恒温摇床培养, 当菌液OD值≈0.6时, 加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/L , 继续培养3～4 h, 收集菌体, 进行SDS-PAGE电泳, 分析目的基因的表达情况。

2.3 目的蛋白的Western-blot检测

收集阳性菌液, 加入2×SDS上样缓冲液混匀;100 ℃煮沸5 min后冰浴10 min, 室温1 200 r/min离心6 min, 进行12% SDS-PAGE电泳;然后以80 mA恒流30 min半干转入NC膜;再用含有3%脱脂奶粉的封闭液于4 ℃封闭过夜;然后用一抗 (1∶500) 孵育1.5～2.0 h, 二抗 (1∶200) 孵育1 h;最后用现配制的DAB显影液显影。

3 结果

3.1 表达载体pET- Sox2的构建与检测

对含有水牛Sox2基因的重组质粒pMD18-T- Sox2进行双酶切后, 定向克隆入原核载体pET-32a (+) , 连接产物pET-Sox2经1%琼脂糖凝胶电泳, 在6 866 bp处有目的条带 (见图1) ;再对pET-Sox2进行双酶切和PCR鉴定, 可以看到966 bp处有目的条带 (见图2) , 与预期结果相符。

M.超螺旋DNA标记物;1.pET-32a (+) 质粒;2.pET- Sox2重组质粒。

M.DNA Marker Ⅲ;1.pET- Sox2双酶切;2.pET- Sox2 PCR检测。

3.2 目的基因Sox2的诱导表达

将重组质粒pET-Sox2转化E.coli BL21 (DE3) , 在菌液OD值≈0.6时, 加入IPTG进行目的蛋白的诱导表达, 再取样进行SDS-PAGE分析。空载体pET-32a (+) 带有硫氧还蛋白标签 (Trx·Tag) 、组氨酸标签 (His·Tag) 和S标签 (S·Tag) , 其融合标签蛋白大小为20.4 ku。因此, 对空载体pET-32a (+) 进行IPTG诱导后, 在20.4 ku处有明显的特异性条带。Sox2蛋白的大小为34.6 ku, 所以对pET-Sox2进行IPTG诱导后, 在55.0 ku处有明显的特异性条带, 与预期结果相符 (见图3) 。

M.低分子质量标准;1.BL21 (DE3) 菌体蛋白;2.未诱导的pET-Sox2;3, 4.诱导表达的pET-32a (+) 空载体;5, 6.诱导表达的pET-Sox2。

3.3 目的蛋白Sox2的Western-blot检测

对pET-Sox2进行IPTG诱导表达后, 用特异性Sox2抗体进行Western-blot检测, 有特异性条带出现 (见图4) , 表明Sox2基因在E.coli BL21 (DE3) 中能正确表达。

4 讨论

载体pET-32a (+) 含有Amp+抗性基因, 可以用来进行药物抗性筛选;含有3个融合标签, 即Trx·Tag、His·Tag和S·Tag。其中, His·Tag可以特异性地与某些金属离子 (如Ni2+、Cu2+、Co2+、Zn2+) 螯合, 是常用来纯化蛋白的融合标签, 特别是那些以包涵体形式表达的蛋白, 它可以将蛋白在完全变性条件下溶解后进行亲和纯化。试验选择pET-32a (+) 作为基础载体, 以便于后续获得纯化的Sox2蛋白, 并进行下一步研究。在对pET- Sox2的诱导表达中, 可以看到对于没有诱导的pET- Sox2, 在55.0 ku处也出现了较弱的特异性条带, 这是因为即使在没有 IPTG 存在的情况下, 也会有少量lacUV5 启动子表达的 T7 RNA聚合酶, 因此存在目的蛋白的本底表达。另外, 在对pET- Sox2进行诱导时, 为了使目的蛋白大量表达, 添加IPTG的时间一般控制在宿主菌BL21 (DE3) 快速生长期至对数生长期, 以获得足够大量的细菌。可以将目的基因的诱导表达过程分为两个阶段:第一阶段, 不添加诱导剂, 由于缺乏T7 RNA聚合酶, pET载体上的目的基因基本上处于沉默状态;第二阶段, 添加诱导剂IPTG, 从而启动BL21 (DE3) 菌株的lacUV5启动子对T7 RNA聚合酶的转录, 再进一步启动pET-32a (+) 载体上的T7lac启动子对目的基因的转录, 目的基因开始快速而高效地表达。

试验成功地利用E.coli诱导表达了Sox2蛋白, 并且经过Western-blot检测, 表明所表达的Sox2蛋白具有较强的反应原性, 能够顺利进行水牛Sox2多克隆抗体的制备以及展开Sox2蛋白的结构特性和功能研究。

摘要：水牛Sox2基因对体内胚胎的早期发育至关重要, 它是重要的多能性干细胞 (iPS细胞) 标记基因之一, 试验通过双酶切重组质粒pMD18-T-Sox2, 将水牛Sox2基因定向克隆入原核载体pET-32a (+) , 成功构建了原核表达载体pET-Sox2, 然后利用IPTG诱导, 获得诱导表达蛋白, 并经过SDS-PAGE电泳分析和Western-blot检测。结果表明:诱导表达蛋白为特异性Sox2蛋白。

关键词：Sox2基因,原核表达,载体,构建,诱导表达

参考文献

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原核载体 篇4

神经细胞粘附分子( neural cell adhesion mole- cule,NCAM) 属于免疫球蛋白超家族细胞粘附分子的成员之一,在神经系统的发育、再生及可塑性调节等过程中发挥重要作用,与神经精神疾病的发生、发展密切相关［1 － 3］。按分子量大小NCAM主要分为NCAM120、NCAM140、NCAM180三种亚型,它们的胞外段结构均由5个免疫球蛋白样( Ig) 结构域和2个纤维连接蛋白Ⅲ( fibronectin,FNⅢ) 结构域构成。 NCAM120通过糖基磷脂酰肌醇( glycosylphosphati- dylinositol,GPI) 锚定在细胞膜上,主要表达于胶质细胞表面。NCAM140和NCAM180均为跨膜蛋白, NCAM140在胶质细胞、神经元轴突和未成熟神经元的脂伐上富集,NCAM180则主要存在于成熟神经元的突触后致密物［2 － 3］。NCAM的很多功能都依赖于对细胞内信号转导通路的调节,已有研究发现, NCAM ICD可以与酪氨酸激酶受体B( tyrosine kinase receptor B,Trk B ) 、接头蛋白相关复合物3 ( adaptor protein complex 3,AP3) 、突触发动相关蛋白( syndap- in) 等结合伴侣相互作用发挥调节突触可塑性、突触小泡循环通路等作用［4 － 6］。目前国内外针对NCAM ICD的研究不够深入,本实验首次利用p ET29b原核表达载体成功构建小鼠NCAM140 ICD和NCAM180 ICD表达质粒,并实现其在原核细胞中表达及纯化, 从而为进一步明确NCAM ICD生物学作用及机制奠定基础。

1材料与方法

1. 1材料

1. 1. 1实验材料

大肠杆菌E. coli BL21( DE3) 菌株、E. coli Nov- ablue菌株、p ET29b原核表达载体购自美国Novagen公司; 小鼠脑c DNA文库购于Clontech公司; E. coli BL21( DE3) 、E. coli Novablue感受态细胞由作者实验室制备; 引物合成由大连万泽有限公司完成; DNA序列测定由上海生工生物工程有限公司完成; 目的蛋白的质谱鉴定由深圳华大基因公司完成。

1. 1. 2试剂

NdeⅠ、Xho Ⅰ、Hpa Ⅰ、Pst Ⅰ、Xba Ⅰ 等限制性内切酶、PCR反应试剂盒购自大连Ta KaRa生物有限公司; p JET PCR克隆试剂盒、快速DNA连接试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、ECL发光试剂盒、预染蛋白分子量标准购自Thermo公司; 异丙基硫代- β - D半乳糖苷( IPTG) 、氨苄青霉素( Amp) 、卡那霉素( Kan) 、甲叉双丙烯酰胺购自Sigma公司; 大鼠抗小鼠NCAM单克隆抗体购自美国BD公司; HRP标记的羊抗大鼠Ig G购自美国Abbkine公司; Ni - NTA琼脂糖亲和层析填料购自德国Qiagen公司。

1. 1. 3仪器设备

美国Thermo公司Multiskan Ascent酶标仪; 日本Takara公司PCR仪; 日本日立高速冷冻离心机; 上海福玛实验设备公司恒温培养箱; 美国伯乐公司凝胶成像仪; 大连竞迈生物科技公司半干式转移电泳仪、紫外投射凝胶成像系统; 宁波海曙科生仪器厂超声波细胞破碎仪。

1. 1. 4培养基

LB液体培养基: 10 g / L氯化钠,10 g / L胰蛋白胨,5 g /L酵母提取物。使用前加入对应的抗生素。

1. 2方法

1. 2. 1小鼠NCAM ICD克隆载体构建

根据小鼠NCAM ICDs的编码序列设计引物,并在上下游引物中分别加入NdeⅠ和XhoⅠ限制性内切酶酶切位点。上游引物( F) : 5’- AACATATGGA- CATCACCTGCTACTTCC - 3 ’,下游引物( R) : 5 ’- AACTCGAGTGCTTTGCTCTCATTCTC - 3 ’,小鼠NCAM140 ICD和NCAM180 ICD均可使用该引物。 以小鼠脑c DNA文库为模板,经PCR分别扩增出NCAM140 ICD和NCAM180 ICD。反应条件设定为: 95℃ 30 s、95℃ 20 s、55℃ 30 s、72℃ 90 s,30个循环。PCR产物经1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定后,利用DNA凝胶回收试剂盒纯化,加入到快速T4 DNA连接酶反应体系,2个PCR产物分别与p JET1. 2线性平端克隆载体室温连接。连接产物分别转化E. coli Novablue感受态细胞,37℃ 培养过夜,通过Amp抗性筛选获得阳性克隆菌落。挑取单菌落,接种于3 ml LB培养基( 含50 !g / ml Amp ) ,37℃ 振荡过夜。 采用碱裂解法提取质粒DNA,p JET1. 2 - NCAM180 ICD克隆质粒经Pst Ⅰ 酶切鉴定,p JET1. 2 - NCAM140 ICD克隆质粒由PstⅠ和XbaⅠ酶切鉴定, 质粒DNA由上海生工生物工程有限公司进行测序分析。

1. 2. 2小鼠NCAM ICD表达载体构建

p JET1. 2 - NCAM180 ICD和p JET1. 2 - NCAM140 ICD重组质粒测序正确后,将二者和p ET29b表达载体分别用NdeⅠ及XhoⅠ双酶切,进一步纯化后,分别与快速T4 DNA连接酶室温连接,然后转化E. coli Novablue感受态细胞,37℃ 培养过夜,通过Kan抗性筛选获得阳性克隆菌落。挑取单菌落,接种于3 ml LB培养基( 含100 !g / ml Kan) ,37℃ 振荡过夜。提取质粒后,p ET29b - NCAM180 ICD和p ET29b - NCAM140 ICD表达质粒分别用PstⅠ与HpaⅠ酶切鉴定。

1. 2. 3目的蛋白的诱导表达

将酶切鉴定正确的p ET29b - NCAM180 ICD及p ET29b - NCAM140 ICD表达质粒及p ET29b空载体分别转化E. coli BL21( DE3) 感受态细胞,获得BL21 ( DE3 ) /p ET29b - NCAM180 ICD、BL21 ( DE3 ) / p ET29b - NCAM140 ICD、BL21 ( DE3 ) / p ET29b菌株。37℃培养过夜,通过Kan抗性筛选获得阳性克隆菌落。挑取单菌落,接种于3 ml LB培养基( 含100 μg / ml Kan) ,37℃ 震荡过夜后,将菌液分别按1∶ 100接种到20 ml LB培养基( 含100 !g / ml Kan) , 37℃ 振荡培养至OD595处于0. 4 ~ 0. 6之间时( 约3 ~ 4 h) ,加入终浓度为0. 5 mmol / L的IPTG,30℃ 培养6 h,收集细菌,加入20 !l 5 × 上样缓冲液,100℃ 煮沸10 min,4℃、12 400 g离心1 min。NCAM180 ICD和NCAM140 ICD分别经10% SDS - PAGE和15% SDS - PAGE分离。电泳结束后利用考马斯亮蓝进行染色,脱色后观察表达结果。

1. 2. 4目的蛋白的纯化

将BL21 ( DE3 ) /p ET29b - NCAM180 ICD和BL21( DE3) / p ET29b - NCAM140 ICD单菌落分别接种到LB培养基( 含100 !g /ml Kan) 中,37℃ 振荡过夜后,将2 ml过夜菌接种于200 ml LB培养基( 含100 !g / ml Kan) 中,37℃ 振荡培养3 h后加入终浓度为0. 5 mmol/L的IPTG,30℃ 诱导培养6 h。4℃、 4 500 g,离心15 min收集细菌,用10 ml细菌裂解液( 20 mmol/L Tris - HCl,0. 5 mol/L Na Cl,20% 甘油, 1 mmol / L PMSF) 充分重悬细菌,超声破碎15 min ( 工作30 s,间歇30 s) 。4℃、12 400 g,离心20 min。 取上清加入Ni - NTA亲和树脂,4℃ 充分结合15 min,待上清全部通过亲和层析柱后,用20 ml洗脱液( 20 mmol/L Tris - HCl,0. 5 mol/L Na Cl,20% 甘油,30 mmol/L咪唑,1 mmol/L PMSF) 去除非特异性结合蛋白,最后用5 ml洗脱液( 20 mmol/L Tris - HCl,0. 5 mol / L Na Cl,20% 甘油,200 mmol / L咪唑, 1 mmol / L PMSF) 洗脱,获得目的蛋白,分别经10% SDS - PAGE和15% SDS - PAGE分离,经考马斯亮蓝染色,脱色后观察纯化结果。

1. 2. 5纯化的His - NCAM ICD蛋白的鉴定

将诱导表达的NCAM180 ICD和NCAM140 ICD目的蛋白分别经10% SDS - PSGE和15% SDS - PAGE分离,半干转移法转移蛋白质到硝酸纤维素膜,9 V恒压分别转膜,用10% 脱脂奶粉4℃ 封闭过夜,TBST洗膜3次,每次10 min。加入大鼠抗小鼠NCAM抗体( 1 ∶ 3 000 ) 室温孵育2 h,TBST洗膜3次,每次10 min。加入标记有辣根过氧化物酶的羊抗大鼠Ig G二抗( 1∶ 10 000) ,室温孵育1 h,TBST洗膜3次,每次10 min,ECL显色观察结果。纯化的目的蛋白经蛋白电泳及考马斯亮蓝染色,切胶后,制备质谱样品送华大基因公司进行质谱鉴定。

2结果与分析

2. 1小鼠NCAM ICDs克隆载体构建及鉴定

以小鼠脑c DNA文库为模板,应用设计的引物进行PCR扩增,将得到的PCR产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳分析,分别于1 200 bp和357 bp处获得特异性片段( 图1) 。重组质粒p JET1. 2 - NCAM180 ICD经PstⅠ酶切,p JET1. 2 - NCAM140 ICD经PstⅠ 和Xba Ⅰ 酶切后行1% 琼脂糖凝胶电泳,分别于1 375 bp和2 773 bp,2 606 bp和741 bp处获得与预期相符的条带( 图2) ,并进行DNA测序鉴定。

2. 2小鼠NCAM ICD表达载体构建和鉴定

将测序正确的重组质粒p JET1. 2 - NCAM180 ICD和p JET1. 2 - NCAM140 ICD分别用Nde Ⅰ 及XhoⅠ进行双酶切,与经相同酶切的p ET29b表达载体连接后得到p ET29b - NCAM180 ICD和p ET29b - NCAM140 ICD表达质粒,均用Hpa Ⅰ 酶切并进行1% 琼脂糖凝胶电泳后分别于1 392 bp和5 007 bp, 1 392 bp和4 206 bp获得条带( 图3) 。

2. 3 His - NCAM ICD蛋白的诱导表达和纯化

IPTG诱导NCAM180 ICD和NCAM140 ICD蛋白在E. coli BL21( DE3) 中大量表达( 图4) ,利用Ni - NTA亲和层析填料对目的蛋白进行纯化,分别经10% SDS - PAGE和15% SDS - PAGE电泳进行分离,经考马斯亮蓝染色,脱色后分别可在80 k Da和25 k Da上方出现条带( 图5) 。

图 2 重组质粒 p JET1． 2 － NCAM180 ICD 和p JET1． 2 － NCAM140 ICD 的酶切鉴定M． 1 kb DNA 分子量标准; 1． PstⅠ酶切 p JET1． 2 － NCAM180 ICD重组质粒; 2． PstⅠ和 XbaⅠ酶切 p JET1． 2 － NCAM140 ICD 重组质粒。Figure 2 Analysis of the recombinant plasmid p JET1． 2 －NCAM180 ICD and p JET1． 2 － NCAM140 ICD bydigestion of restriction enzymesM． DNA ladder marker; 1． Ｒecombinant plasmid p JET1． 2 －NCAM180 ICD digested by PstⅠ; 2． Ｒecombinant plasmid p JET1． 2－ NCAM140 ICD digested by PstⅠ and XbaⅠ．

图 3 重组质粒 p ET29b － NCAM180 ICD 和p ET29b － NCAM140 ICD 酶切鉴定M． 1 kb DNA 分子量标准; 1，2． HpaⅠ酶切的 p ET29b － NCAM180ICD 重组质粒和 p ET29b － NCAM140 ICD 重组质粒。Figure 3 Analysis of the recombinant plasmid p ET29b －NCAM180 ICD and p ET29b － NCAM140 ICD bydigestion of restriction enzymeM． 1 kb DNA ladder marker; 1，2． Ｒecombinant plasmid p ET29b －NCAM180 ICD and p ET29b － NCAM140 ICD digested by Hpa Ⅰ，respectively．

2. 4纯化的His - NCAM ICD蛋白的鉴定

使用大鼠抗小鼠NCAM单克隆抗体对纯化的His - NCAM180 ICD和His - NCAM140 ICD蛋白进行Western blot鉴定,结果显示分别约在80 k Da和25 k Da稍上方出现条带,与SDS - PAGE凝胶结果一致( 图6) 。同时,对纯化后的蛋白行质谱分析,经与小鼠蛋白质数据库对比后发现,蛋白为NCAM蛋白片段的可能性分值大于70分,从而在蛋白水平证实目的蛋白。

图 4 诱导表达 His － NCAM ICD 蛋白的 SDS － PAGE 分析M． 预染蛋 白分 子量 标准; 1、6． BL21 ( DE3 ) / p ET29b; 2． BL21( DE3) /p ET29b － NCAM180 ICD 未诱导表达; 3． BL21 ( DE3) /p ET29b － NCAM180 ICD 诱导表达所获总蛋白; 4． BL21 ( DE3 ) /p ET29b － NCAM180 ICD 诱导表达获得的上清; 5． BL21 ( DE3 ) /p ET29b － NCAM180 ICD 诱导表达获得的沉淀; 7． BL21 ( DE3 ) /p ET29b － NCAM140 ICD 未诱导表达; 8． BL21 ( DE3 ) / p ET29b －NCAM140 ICD 诱导表达所获总蛋白; 9． BL21 ( DE3 ) / p ET29b －NCAM140 ICD 诱导表达获得的上清; 10． BL21 ( DE3) / p ET29b －NCAM140 ICD 诱导表达获得的沉淀。Figure 4 SDS － PAGE analysis of expression ofHis － NCAM ICD proteinM． Prestained protein marker; 1，6． BL21 ( DE3 ) / p ET29b; 2． With-out IPTG induced His － NCAM180 ICD protein; 3 － 5． Total protein，soluble fraction or inclusion bodies of His － NCAM180 ICD proteininduced by IPTG，respectively; 7． Without IPTG induced His －NCAM140 ICD protein; 8 － 10． Total protein，soluble fraction or in-clusion bodies of His － NCAM140 ICD protein induced by IPTG，re-spectively．

图 6 纯化 His － NCAM ICD 蛋白的 Western blot 鉴定M． 预染蛋白分子量标准; 1． His － NCAM180 ICD 蛋白; 2． His －NCAM140 ICD 蛋白。Figure 6 Western blot identification of purifiedHis － NCAM ICD proteinM． Prestained protein marker; 1． His － NCAM180 ICD protein; 2．His － NCAM140 ICD protein．

3讨论

NCAM结构和含量异常与人类神经系统发育异常、退行性及损伤性疾病紧密相关,如自闭症、精神分裂症、阿尔兹海默病和脑卒中等［7 － 8］。在NCAM的3种主要亚型中NCAM140和NCAM180为跨膜糖蛋白,由于选择性剪接,NCAM180 ICD编码基因比NCAM140 ICD编码基因多一个外显子,因此两者在功能和结构上有一定差异［9 － 10］。在各种外界信号分子作用下,NCAM ICD通过激活或抑制细胞内结合伴侣启动一系列信号途径。新近的研究表明, NCAM140 ICD可通过与胞吐复合体、泛素结合酶1 ( ubiquitin - fold modifier - conjugating enzyme - 1, Ufc1) 等蛋白相互作用调节神经细胞突起的生长和分支的新生［1，11 － 12］。NCAM180 ICD可以与动力蛋白( dynein) 、鸟嘌呤核苷酸交换因子A( guanine nu- cleotide exchange factor A,GEF A) 等胞内蛋白结合参与突触稳定性的维持和记忆的形成［13 － 14］。所以, 通过分别研究NCAM140 ICD和NCAM180 ICD能够更加清晰地了解NCAM的功能,明确其在精神分裂症、阿尔兹海默病等精神神经疾病的发生、发展中扮演的角色,从而为相关疾病的治疗奠定理论基础。

为此,本研究采用基因工程的方法,选用p ET29b原核表达载体,该表达载体含有高效的原核表达启动子和组氨酸标签,能够在E. coli BL21 ( DE3) 细菌中高效表达外源蛋白,便于蛋白的分离和纯化。我们根据小鼠NCAM ICD的编码序列设计特异性引物,经测序正确后,成功构建p ET29b - NCAM ICDs表达质粒,并获得纯化的可溶性NCAM140 ICD及NCAM180 ICD蛋白。可溶性蛋白具有正确的空间结构和较高的生物学活性,避免了包涵体蛋白复性造成的蛋白结构异常、活性下降和含量减低。

本实验成功构建了小鼠p ET29b - NCAM140 ICD及p ET29b - NCAM180 ICD原核表达载体,经纯化获得了分子量分别为25 k Da和80 k Da的可溶性蛋白,为深入探讨NCAM的结构和功能提供了可靠的研究手段和实验基础。

摘要：[目的]构建小鼠神经细胞粘附分子胞内段(NCAM ICD)原核表达载体,诱导蛋白表达,并进一步对蛋白进行纯化和鉴定。[方法]以小鼠脑c DNA文库为模板,采用PCR技术分别扩增NCAM跨膜亚型NCAM140及NCAM180的胞内片段,连接p JET1.2克隆载体。经DNA测序正确后,构建pET29b-NCAM140 ICD及pET29b-NCAM180 ICD原核表达质粒,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导目的蛋白的表达,经Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱纯化,以Western blot和质谱的方法鉴定表达的蛋白。[结果]成功构建了pET29b-NCAM140 ICD及pET29b-NCAM180 ICD原核表达质粒,并用Western blot及质谱法证实NCAM140 ICD及NCAM180 ICD蛋白的表达,分子量分别约为25 kDa及80 k Da。[结论]该方法成功构建小鼠pET29b-NCAM140 ICD及pET29b-NCAM180 ICD原核表达载体,实现了其蛋白表达,为进一步研究NCAM ICD的功能奠定了基础。

原核载体 篇5

程序性死亡因子1 (programmed cell death 1,PD-1) 及其配体PD-L1 (programmed cell death 1 ligand 1)是B7-CD28蛋白家族的两个新成员,属于Ⅰ型跨膜分子。作为一种免疫共刺激分子,PD-1主要表达于活化的淋巴细胞膜表面,PD-L1与PD-1结合产生负向免疫调节作用,在机体的免疫稳定与耐受方面发挥正常的调节功能[6]。新近的体内外实验发现,肿瘤细胞膜上高表达PD-L1分子,它与淋巴细胞上的PD-1结合后,将抑制效应性T细胞活性,同时降低后者IL-2和IFN-γ的表达和分泌,形成肿瘤细胞免疫逃逸的微环境,促进肿瘤的生长[7,8]。而可溶性PD1与PD-L1的结合可以阻断PD-L1的活性,促进淋巴细胞的活性,在抗肿瘤和抗病毒中具有摘要作用。

鉴于CRT在肿瘤抗原提呈和sPD-1在促进免疫杀伤中具有重要作用,本研究通过构建表达CRT与PD1胞外区的融合蛋白,这将为肿瘤免疫防治提供新的思路、方法和途径,同时也为研究肿瘤的免疫原性死亡奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料:

原核菌株E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)及质粒pET28a(+)-His为作者实验室所有;基因扩增引物均由上海生工生物公司合成。

1.1.2 试剂:

TaqDNA聚合酶、限制性内切酶及T4连接酶都是Fermentas公司产品;鼠源的CRT单抗、PD1单抗均由本实验组自行完成;羊抗鼠IgG-HRP抗体是北京中杉金桥生物技术有限公司产品;ECL显色液(A、B液)购买于GE Healthcare 公司;其他化学试剂由Sigma等公司提供。

1.1.3 仪器:

DYCP-31DN型水平式琼脂糖电泳槽购买于北京市六一仪器厂;Gel Logic-200 凝胶成像系统是美国Kodak公司产品;Mini型垂直式蛋白质电泳系统、蛋白质转印系统都是美国Bio-Rad公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计

根据基因库中小鼠CRT和PD-1 基因序列,设计2对特异性引物,以小鼠淋巴细胞CDNA为模板PCR克隆获得mCRT、mPD1目的片段。引物由上海生工生物公司合成。其中在mCRT上、下游引物分别引入NcotⅠ和BamHⅠ限制性内切酶位点,mPD1上、下游引物分别引入BamHⅠ和XholⅠ限制性内切酶位点。PCR引物设计如下:

CRT:

上游引物:CAAGCCATGG TCCAAA CATAAG TCCGAT

下游引物:CAAGGGATCCACCTCCACCTTCTGGGTGTATCCAGGTAC

sPD1:

上游引物:CAAGGGATCCGGTGGAGGTGGAGAGGTCCCCAATGGGCCCTG

下游引物:CAAG CTCGAG GCTGGGATAT CTTGTTGA

PCR 扩增上述基因片段后经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析鉴定。

1.2.2 CRT-PD-1融合产物与克隆的鉴定

PCR扩增CRT和PD-1产物,引物如下:

上游引物:CAAGCCATGG TCCAAA CATAAG TCCGAT

下游引物:CAAG CTCGAG GCTGGGATAT CTTGTTGA

经PCR 扩增后用1%琼脂糖凝胶电泳分析鉴定。

1,2.PD-1PCR产物; 3,4.CRT PCR产物。

1,2 Products of PD-1 gene fragment by PCR; 3,4 Products of CRT gene fragment by PCR.

(2a)PCR鉴定pET-28a(+)-CRT-PD-1:1,2.阴性克隆 ;3,4.阳性克隆。 (2b)双酶切鉴定pET-28a(+)-CRT-PD-1:1,3.阳性克隆;2,4.阳性克隆酶切后。

(2a)PCR results of pET-28a (+)-CRT-PD-1.1,2 Negative clones;3,4 Positive clones. (2b) Identification of pET-28a (+)-CRT-PD-1 by double enzyme digestion.1,3 Positive clones;2,4 Positive clones after by double enzyme digestion.

凝胶电泳分离纯化 PCR 产物,目的基因用胶回收试剂盒回收,CRT-PD-1回收产物用NotⅠ/ XholⅠ酶切,同时用NotⅠ和XholⅠ对 pET28a(+)载体双酶切,纯化后两者等体积混合用T4连接酶16 ℃连接16h～20h。连接产物转化至预先制备好的大肠杆菌感受态细胞 DH5α(DE3),离心后弃300μl上清,重悬剩余菌液涂于已预热的卡那霉素的 LB 平板上,细菌培养箱培养过夜。次日挑克隆接种于含有卡那霉素的 LB 培养液中37℃摇床振荡过夜。然 后 提 取 质 粒,命 名 为pET28a(+)-CRT-PD-1,经PCR及酶切鉴定后,将阳性质粒送至上海生工生物公司进行测序。

1.2.3 小鼠CRT-PD-1融合蛋白的表达与鉴定

将测序正确的克隆转化入BL21感受态细菌,同上挑克隆培养。次日以 1∶ 50 的比例转接震荡培养至OD600nm在 0.6～0.8之间后加入 IPTG 至终浓度为 1 mmol/L,37℃ 诱导 4h,收集菌液制样。用10%的SDS-PAGE电泳分析。

1.2.4 融合蛋白CRT-PD-1的纯化

扩大培养200 mL菌液用于蛋白纯化,同上加入IPTG诱导后收集菌液12 000 r / min,离心10min用20ml PBS混匀后,冰浴中超声裂解30min至液体变清亮,12 000 r / min、10min离心收集上清,杂交后加入含有 2 mL Ni平衡柱,分别用不同浓度咪唑洗脱液洗涤后(20 mmol/L、50mmol/L、100mmol/L、200mmol/L、500mmol/L)收集洗脱液进行 SDS-PAGE 分析。

2 结果与分析

2.1 CRT-PD-1质粒构建及鉴定

应用小鼠淋巴细胞cDNA为模板,PCR 扩增后用1.5% 琼脂糖电泳可看到 在大约500bp和750bp处分别有一条带( 图 1a,1b)。 第二次PCR后得到大小为1 200bp的目的片段,并且目的片段切胶回收,将其克隆入 pET28a(+) 空载,用mCRT、mPD1 的上下游引物PCR和双酶切鉴定无特异性的条带(图 2a,2b),经测序比对后基因序列完全正确。

2.2 CRT-PD-1 融合蛋白的表达、纯化与 SDS-PAGE 分析鉴定

pET28a-CRT-PD-1 重组质粒转入大肠杆菌 BL21( DE3),经 IPTG 37℃ 经诱导4 h后收集菌液。SDS-PAGE 胶电泳可以看出在诱导后的泳道45kDa处有明显条带(然而诱导前的菌液中并无表达),符合预期大小,并且以可溶性的形式存在 ( 图 3) 。

1.IPTG诱导前重组质粒在BL21中的表达;2.IPTG诱导后重组质粒在BL21中的表达;3、4.纯化后的CRT-PD-1融合蛋白。

1 Expression of recombinant vector before induced by IPTG in BL21;2 Expression of recombinant vector after induced by IPTG in BL21;3,4 CRT-PD-1 fusion protein after purified.

2.3 CRT-PD-1 融合蛋白的Western blotting鉴定

将收集的融合蛋白菌液裂解经SDS-PAGE胶转至PVDF膜,150mA 2h后用5%的牛奶封闭过夜,第2d分别用抗CRT的单抗(1:5 000)和抗PD-1的单抗(1:3 000)室温孵育1h后用TBST洗3次,每次10min再用羊抗鼠IgG(1:3 000)室温孵育1h,同上洗3次后,加入等体积A/B液暗室显影(图4)。通过图4a/b可以看出用CRT单抗和PD-1单抗都可以鉴定出融合蛋白CRT-PD-1能很好地表达,说明我们已成功构建、制备获得CRT-PD-1融合蛋白。

3 讨论

CRT是进化中高度保守的内质网常驻蛋白,广泛表达于多类物种及不同组织中[9]。生理状态下CRT的表达有维持机体内钙平衡、增强抗原递呈及抑制血管生成等多种生物学功能。PD-1为主要表达于活化的淋巴细胞膜表面的一类共刺激分子,PD-L1与PD-1的结合是作为一种机体负向免疫调节作用,对维持机体正常的调节功能发挥着重要作用。

本实验采用常规 PCR、酶切、连接等技术,利用原核表达载体 pET28a(+) 成功构建了 CRT-PD-1融合基因的表达载体pET28a(+)- CRT-PD-1,在两个基因之间引入GGGGsGGGG柔性linker,从而获得两个蛋白正确的空间构象。并通过诱导、表达以及纯化获得了浓度较高的CRT-PD-1融合蛋白,为后续对于该蛋白的研究奠定了良好的基础。

CRT-sPD-1融合蛋白中的sPD-1在肿瘤免疫治疗中有两方面的作用:封闭PD-L1和作为载体将CRT特异簇集到肿瘤细胞表面,从而将免疫杀伤和抗原提呈功能联合起来作用于同一个肿瘤细胞,肿瘤细胞被杀伤同时将抗原提呈给DC细胞,作为内源性疫苗产生特异性抗肿瘤免疫应答,这是一种全新的免疫调节设计策略,也是真正意义上的肿瘤生物治疗。

(a)应用CRT抗体测定CRT-PD-1融合蛋白。1.IPTG诱导前重组质粒在BL21中的表达;2.IPTG诱导后重组质粒在BL21中的表达;3.纯化后的CRT-PD-1融合蛋白。(b)应用PD1抗体测定CRT-PD-1融合蛋白。1.IPTG诱导前重组质粒在BL21中的表达;2.IPTG诱导后重组质粒在BL21中的表达;3.纯化后的CRT-PD-1融合蛋白。

(a)Determination of CRT-PD-1 fusion protein by anti-CRT antibody.1 Expression of recombinant vector before induced by IPTG in BL21;2 Expression of recombinant vector after induced by IPTG in BL21;3 CRT-PD-1 fusion protein after purified.(b)Determination of CRT-PD-1 fusion protein by anti-PD-1 antibody.1 Expression of recombinant vector before induced by IPTG in BL21;2 Expression of recombinant vector after induced by IPTG in BL21;3 CRT-PD-1 fusion protein after purified.

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原核载体 篇6

gP48基因编码的蛋白是重要的结构蛋白, 既是构成病毒粒子的一种外壳蛋白, 又是病毒仅有的两种保护性抗原之一, 可诱导机体产生中和抗体, 并且有较高的保守性, 较gP53基因编码的蛋白更适合作亚单位基因工程疫苗[1]。研究通过基因重组技术成功构建了牛病毒性腹泻病毒gP48基因的原核表达载体, 以期为其亚单位基因工程疫苗的研究奠定基础[2], 同时为gP48基因酶学的研究提供有效途径。

1 材料

T4 DNA连接酶, 购自Invitrogen公司;pET32a载体, 河北农业大学动物科技学院动物卫生检疫实验室保存;限制性内切酶BmHⅠ和XhoⅠ以及Taq DNA聚合酶, 均购自宝生物工程 (大连) 有限公司; 牛病毒性腹泻病毒抗体 (牛IgG) , 购自中国兽医药品检察所dNTPs, 大肠杆菌BL21 (DE3) 、DH5α、TOP10, DNA分子质标准Marker, 蛋白Marker, 小量质粒提取试剂盒, PCR产物回收试剂盒, T克隆试剂盒, 辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的兔抗牛IgG二抗, 购自天根生物科技 (北京) 有限公司。

2 方法

2.1 gP48基因的克隆

以pMD18-T-gP48质粒 (由河北农业大学动物科技学院动物卫生检疫实验室保存) 为模板, 在编码区上、下游设计1对寡核苷酸引物, 同时在上、下游引物中分别引入限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ相应的酶切位点 (在序列中用下画线标出) 及保护碱基, PCR扩增获得基因片段。引物序列如下:上游引物5′-CCGGATCCACCAACACAGTGGAATCTACAAG-3′;下游引物5′-GCCTCGAGTTAGCGTAGGGGGAAGCCGCATA-3′。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体系 (25 μL) :模板3 μL, 10×ExTaq Buffer 2.5 μL, dNTPs (2.5 mmol/L) 2 μL, 上、下游引物 (10 μmol/L) 各1 μL, TaqDNA聚合酶 (2 U/μL) 0.5 μL, 灭菌双蒸水15 μL。PCR扩增程序:95 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s, 56 ℃退火45 s, 72 ℃延伸1 min, 共30个循环;72 ℃再延伸10 min。

2.2 PCR产物的回收及T克隆载体的构建

PCR扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测, 在紫外光下切下大小约为700 bp的目的条带, 通过PCR产物回收试剂盒进行回收纯化, 并将其直接与pGM-T载体连接过夜 (16 ℃) 。连接总体系 (10 μL) :回收片段5 μL, pGM-T载体2 μL, T4 DNA连接酶 (3 U/μL) 1 μL, 10×T4 Buffer 1 μL, 灭菌双蒸水1 μL。将连接产物与100 μL大肠杆菌TOP10感受态细胞混匀, 涂布接种于LB培养基[含0.1 mg/mL 氨苄西林 (Amp) 、0.024 mg/mL IPTG、0.04 mg/mL X-gal) ]上, 于37 ℃培养16 h。选取白色单克隆扩大培养, 收获细菌后参照小量质粒提取试剂盒说明抽提质粒, 对经琼脂糖凝胶电泳检测为阳性克隆的质粒进行鉴定, 并送北京华大生物科技有限公司测序。

2.3 gP48-pET32a重组表达载体的构建

对gP48-pGM-T质粒进行BamHⅠ和XhoⅠ双酶切, 回收获得gP48基因目的片段, 将该目的片段插入到同样经过双酶切的pET32a质粒载体片段中, 转化大肠杆菌DH5α感受态细胞, 涂布于LB平板 (含0.1 mg/mL Amp) 上, 随机挑取单克隆扩大培养, 用小量质粒提取试剂盒抽提质粒并进行BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定。

2.4 融合蛋白的诱导表达

将鉴定正确的重组质粒gP48-pET32a加入100 μL大肠杆菌BL21 (DE3) 感受态细胞中, 涂布于LB平板 (含0.1 mg/mL Amp) 上, 于37 ℃培养16 h;随机挑取单克隆扩大培养, 将菌液送北京华大生物科技有限公司测序。将空载体pET32a以及测序正确的阳性克隆菌液按体积比1∶100接种于10 mL LB液体培养基 (含0.1 mg/mL Amp) 中, 37 ℃培养至OD600值为0.5～0.6时, 加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/L, 诱导1～7 h;收集菌液, 于12 000 r/min离心10 min后收集菌体, 然后进行融合蛋白的SDS-PAGE电泳检测。根据所表达蛋白的大小, 配制12%分离胶和5%浓缩胶, 待胶充分凝固后即可点样进行电泳。将获得的菌液与SDS蛋白上样缓冲液等体积混合, 振荡混匀后于沸水浴中煮沸10 min, 室温冷却后取20 μL上样进行SDS-PAGE电泳检测。电泳结束后用0.1%考马斯亮蓝R250进行染色, 加入脱色液于摇床上脱色, 观察电泳结果。

2.5 融合蛋白的Western-blot检测

将融合蛋白进行SDS-PAGE电泳后, 转移至硝酸纤维素膜上, 于封闭液中4 ℃过夜;用PBST[PBS (pH值为7.4, 含8 g/L NaCl、0.2 g/L KCl、1.44 g/L Na2HPO4、0.24 g/L KH2PO4) +0.1%Tween-20]洗2次, 每次10 min;将膜与牛病毒性腹泻病毒阳性血清一抗共同孵育90 min;再用PBST洗膜2次, 将膜与兔抗牛二抗IgG-HRP共同孵育60 min后用PBST洗2次, 暗室中曝光直至显影出现明显的条带。

3 结果

3.1 gP48基因的PCR扩增结果

通过PCR扩增从gP48-pMD18-T质粒中得到了706 bp的gP48基因片段, 且扩增片段大小与预计结果一致, 见图1。

M. MarkerⅡ;1.重组质粒 gP48-pMD18-T基因PCR产物。

3.2 gP48基因的T克隆载体构建及其酶切鉴定结果

将纯化后的PCR产物插入pGM-T载体中, 并将重组质粒用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定, 酶切后的片段大小与设计大小一致, 见图2, 采用Blast将测序结果与模板序列比对后发现大小一致, 证明成功构建了gP48-pGM-T克隆载体。

M.MarkerⅡ;1.gP48-pGM-T重组质粒的双酶切产物。

3.3 gP48 -pET32a原核表达载体的构建及鉴定结果

用限制性内切酶BmHⅠ和XhoⅠ将目的片段从gP48-pGM-T中切下, 并插入同样经过双酶切的原核表达载体pET32a中, 采用Blast将测序结果与模板序列比对后发现大小一致, 证明gP48-pET32a表达载体构建成功, 见图3。

M.MarkerⅡ;1.gP48-pET32a重组质粒的双酶切产物。

3.4 融合蛋白gP48-pET32a的诱导表达结果

gP48重组蛋白的理论大小约为46 ku, 经IPTG诱导, 获得的表达蛋白大小与所预测的一致, 见图4。

1.空载体pET32a;2.未诱导gP48-pET32a重组表达质粒;3～8.分别为gP48-pET32a重组表达质粒诱导1～6 h的表达产物;M.低分子质量蛋白质标准。

3.5 融合蛋白gP48-pET32a Western-blot检测结果

通过Western-blot检测发现, 融合蛋白gP48-pET32a于沉淀中表达, 见图5。

M.低分子质量蛋白质标准;1.未诱导的gP48-pET32a重组表达质粒;2.诱导产物。

4 讨论

研究通过在pET32a原核载体中表达gP48基因, 对融合蛋白进行SDS-PAGE和Western-blot检测, 发现融合蛋白gP48-pET32a存在于表达系统中, 并且具有良好的反应原性。pET32a (+) 是一种高效的融合表达载体, 其保留了E.coli PBR322复制起始区, 使用T7启动子表达一种20 ku左右的组氨酸 (His) 标签蛋白。由于pET32a (+) 载体上含有β-内酰胺酶基因, 因此其具有氨苄西林抗性。由于多克隆位点位于His标签的下游, 无论外源基因从何处接口插入, 都不会改变载体的SD及PRS序列[3]。用该载体表达的融合蛋白可以选用His融合蛋白纯化试剂盒进行纯化, 由于该载体含有多个融合标签:Trx·Tag、His·Tag和S·Tag, 可表达目的蛋白与这些标签的融合蛋白, 方便蛋白表达的检测与纯化。并且可以通过使用凝血酶和肠激酶切除这些融合标签, 得到完整的目的蛋白, 为下一步纯化蛋白建立ELISA检测方法奠定了基础。

gP48基因编码的蛋白是牛病毒性腹泻病毒的一种囊膜糖蛋白, 在聚蛋白中的位置为Glu272-Ala497, 大约由227个氨基酸残基组成, 未糖基化的多肽分子质量约为25.7 ku, gP48糖基化程度很高, 有9个糖基化位点, 其缺乏疏水序列[4,5]。gP48蛋白具有Rnase活性, Rnase活性具有多种功能, 在病毒感染的过程中, 对于病毒吸附和进入敏感细胞是必不可少的, 在病毒的复制和感染的致病机制中发挥重要作用, 可抑制多种动物淋巴细胞的蛋白合成及淋巴细胞的凋亡[6,7]。因此, 通过分子生物学手段克隆和表达牛病毒性腹泻病毒gP48基因可为获得牛病毒性腹泻病毒诊断和免疫用抗原开辟新途径, 也为牛病毒性腹泻病毒亚单位基因工程疫苗的研究奠定了基础。

摘要：为了研究牛病毒性腹泻病毒gP48基因在大肠杆菌中的原核表达, 试验以pMD18-T-gP48质粒为模板, 经PCR扩增gP48基因的编码序列, 克隆入原核表达载体pET32a, 转化到大肠杆菌BL21 (DE3) 进行双酶切鉴定, 诱导表达重组蛋白并进行SDS-PAGE电泳以及Western-blot鉴定。结果表明:重组质粒gP48-pET32a经PCR及酶切测序鉴定, 质粒构建正确;重组质粒经诱导表达后, 可表达出分子质量约为46 ku的蛋白。

关键词：牛病毒性腹泻,gP48基因,原核表达载体

参考文献

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原核载体 篇7

关键词：小麦,TaCKX1基因,原核表达,His融合蛋白

细胞分裂素 (Cytokinin, CTK) 是一系列N6取代的嘌呤衍生物, 调控着细胞分裂, 参与植物大量的发育过程, 如根、茎的伸长, 叶片扩展, 叶绿体成熟等[1]。细胞内细胞分裂素的动态平衡依赖于从头合成的速率、细胞分裂素接合 (主要是糖苷键) 的断裂和最终的输出及分解速率[2,3]。植物组织中CTK的分解, 在很大程度上是依赖细胞分裂素氧化 (脱氢) 酶 (Cytokinin oxidase/dehydrogenase, CKX) 的作用而实现的。这种酶催化CTK的N6上不饱和侧链裂解而使其彻底丧失活性, 此反应不可逆。玉米[4,5]、拟南芥[6,7]、石斛兰[8]、水稻[9]、大麦[10]、小麦[11]等的细胞分裂素氧化酶基因已经被克隆。转基因实验表明, 通过改变植物细胞分裂素氧化酶基因的表达可以调控内源激素CTK的含量, 从而影响植物的发育。表达CKX基因的转基因玉米在花粉或花药专一启动子的控制下表现雄性不育[12]。Ashikari M等发现在水稻花序分生组织中的细胞分裂素氧化酶基因OsCKX2的表达受抑制时, 可以导致细胞分裂素水平增加、发育旺盛、穗粒数增多, 从而提高产量[13]。2008年, Feng DS等克隆了小麦的细胞分裂素氧化酶基因TaCKX1, 并分析了其序列及表达特点[11]。关于小麦TaCKX1原核表达的研究未见报道, 本研究利用pET-24a表达载体高效表达TaCKX1融合蛋白。以小麦TaCKX1基因为目的基因, 构建原核表达载体;利用BL21 (DE3) plysS表达菌株获得TaCKX1融合蛋白;对其表达条件进行优化。为今后TaCKX1融合蛋白多克隆抗体制备及其基因表达调控机理的研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

大肠杆菌 (DH5α、BL219DE3) plysS均为本实验室保存, 含有小麦细胞分裂素氧化酶基因TaCKX1的重组质粒pMD-QRCKX1也为本实验室保存、原核表达载体pET-24a为山东大学植物细胞与基因工程研究室夏光敏教授惠赠。

1.1.2 试剂

PCR反应所用试剂、胶回收试剂盒、NdeⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNA Marker、蛋白质低分子量标准均为大连TaKaRa公司产品, 质粒提取试剂盒购自北京天根生化公司, 原核表达产物纯化试剂盒His·Bind Purification Kit购自Merck公司, 其它试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 TaCKX1基因的亚克隆

根据GenBank数据库中小麦TaCKX1基因的序列 (序列号为DQ784573) 及质粒pET-24a的载体图谱, 设计PCR引物, 上游引物加入NdeⅠ酶切位点:5'-ACC CATATG GCG ATC GTT TAC GTG C-3', 划线部分为起始密码子;下游引物加入EcoRⅠ酶切位点:5'-CTC GAA TTC CAA AGG ACC AGG TTG AAG-3', 划线部分是为表达融合His·Tag标签而经过改造的终止密码;加粗部分均为引入的酶切序列, 酶切位点序列的上游均为引入的保护碱基。50μl的PCR反应液中含有模板DNA (质粒pMD-QRCKX1) 500ng, dNTPs各200μmol/L, 2×GC缓冲液Ⅱ25μl, 上下游引物各10μmol/L, 1个U的LA GC TaqDNA聚合酶 (TaKaRa) 。PCR反应条件为:95℃预变性3min, 94℃变性40s, 63℃退火40s, 72℃延伸1min 50s, 共35个循环, 然后72℃再延伸10min。扩增产物通过1%琼脂糖凝胶进行电泳分析。

1.2.2 TaCKX1基因片段的纯化与回收

按照DNA胶回收试剂盒操作说明, 从琼脂糖凝胶中将目的条带切下, 用胶回收试剂盒回收纯化PCR产物。

1.2.3 原核表达载体的构建

将纯化的PCR产物和载体pET-24a分别用NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切后, 回收酶切产物, 在T4DNA连接酶的作用下将TaCKX1基因酶切片段与pET-24a酶切产物16℃连接过夜, 构建重组质粒pET-TaCKX1, 以连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α。将转化菌液涂布于含有50 mg·L-1卡那霉素 (Kana) 的LB琼脂平板上, 37℃培养过夜。在平板上挑取单个菌落, 接种于含Kana的LB培养基中, 37℃摇床培养过夜, 提取质粒。以质粒作模板, 使用以上引物对进行PCR鉴定;同时将质粒用酶切和NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切后, 1%琼脂糖电泳进行鉴定。经酶切和PCR鉴定正确后, 送上海Invitrogen公司用T7 pro和T7 ter引物对进行测序, 测序结果用NCBI中的Blast软件进行分析。

1.2.4 表达菌株的获得

将鉴定正确的重组质粒转化感受态大肠杆菌BL21 (DE3) plysS, 获得阳性表达菌株, 方法同1.2.3。

1.2.5 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达及SDS-PAGE分析

分别将含有pET-24a和pET-TaCKX1的BL21 (DE3) plysS在含Kana (50μg/mL) 和氯霉素 (Cm, 34μg/mL) 的LB培养液中, 37℃、200r/min振荡培养过夜, 将此培养物按1%体积比接种于含Kana和Cm的LB培养液中, 37℃、200r/min振荡培养约3h, 当菌液OD600达到0.4～0.5时加入异丙基硫代β-D-半乳糖苷 (IPTG) 至终浓度0.5mmol/L, 继续诱导培养10h, 离心收集菌体, 加入100μl蛋白质提取液, 沸水浴10min, 然后10 000r/min离心, 上清用于SDS-PAGE电泳分析。浓缩胶浓度为3.7%, 分离胶浓度为10%, 10%三氯乙酸和0.005%考马斯亮蓝G-250染色进行固定及染色, 用蒸馏水脱色。

1.2.6 表达条件的优化

将含pET-TaCKX1的BL21 (DE3) plysS过夜培养液以1%的体积比接种于含Kana和Cm的LB液体培养液中, 37℃、200r/min振荡培养3h, 分别加入IPTG至终浓度0、0.5、1.0、1.5、2.0mmol/L分别诱导, 在添加IPTG后继续诱导的0、5、10、20h时分别取样按1.2.5的方法提取蛋白质, 并进行SDS-PAGE分析。

1.2.7 融合蛋白表达形式的鉴定

取菌液40ml, 10 000r/min离心5min收集菌体, 加10ml PBS缓冲液重悬菌体, 冰浴下超声波破碎菌体 (超声3s, 间歇5s, 共10min, 功率180W) , 离心收集上清和沉淀, 分别进行SDS-PAGE分析。

1.2.8 表达产物的纯化

按照Merck公司His·Bind Purification Kit的试剂盒的包涵体蛋白纯化方法进行纯化。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增

将质粒pMD-QRCKX1内的TaCKX1基因片段经过PCR扩增后, 产物经1%琼脂糖凝胶电泳, 在1 575bp处出现特异性扩增条带, 如图1所示。

2.2 重组表达质粒鉴定

重组表达质粒pET-TaCKX1经NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定结果如图2, 其中一条约5 300bp的带为酶切的载体片段, 约1 580bp的带为插入的目的基因片段。

重组pET-TaCKX1表达质粒测序表明, 序列两端与pET-24a质粒中的原序列完全一致, 与GenBank中的小麦TaCKX1基因编码区[11]比对, 其序列完全一致, 能表达出3'末端完整的His标签肽。鉴定结果表明目的片段已正确重组入pET-24a表达载体。

M:经EcoRⅠ和HindⅢ消化的λDNA分子量标准;1: TaCKX1基因扩增产物。

M:Marker of λDNA digested by EcoRⅠ and HindⅢ;1: PCR product of gene.

M:分子量标准;1:pET-TaCKX1的酶切结果;2: pET24a的酶切结果。

M: DNA marker; 1: pET-TaCKX1 digested by NdeⅠ and EcoRⅠ; 2: pET24a digested by NdeⅠ and EcoRⅠ.

2.3 TaCKX1基因的诱导表达

含有pET-24a和pET-TaCKX1质粒的BL21 (DE3) plysS菌体经IPTG诱导后收集菌体, 加蛋白提取液沸水浴10min, 经10% SDS-PAGE电泳分析, 诱导的pET-24a菌体由于HIS标签蛋白分子量小 (约3.5kD) , 未能在电泳图谱中显现。而pET-TaCKX1菌体表达出约58.9kD的大小的特异条带, 即HIS标签与TaCKX1的融合蛋白。随着诱导时间的延长TaCKX1基因的表达量也随之增加, 但相同时间下不同IPTG浓度 (0.5、1.0、1.5、2.0mmol/L) 诱导下的TaCKX1基因的表达量差异不太明显。在实验所做的IPTG的四个浓度下, TaCKX1基因的原核表达差异不明显 (图3) 。本实验独立重复过3次, 结果一致。

2.4 融合蛋白的表达形式及纯化

使用His·Bind Purification Kit试剂盒中的试剂, 在PBS缓冲液中对菌体进行超声破碎后, 分别收集上清和沉淀, SDS-PAGE检测后, 在沉淀中有明显的约58.9kDa重组蛋白特异条带, 而上清中无此特异条带 (图4) , 表明重组蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中。经过His·Bind Purification Kit纯化试剂盒的纯化, 在约58.9 kDa处得到单一条带 (图5) , 适合做抗体制备。

1:BL21 (DE3) plysS菌蛋白;2, 3:含pET24a载体的菌诱导前、后;4:含pET-TaCKX1的菌诱导前;5-8:含pET-TaCKX1的菌株不同IPTG浓度下诱导5h (0.5、1.0、1.5、2.0mmol/L) ;9-12:含pET-TaCKX1的菌株不同IPTG浓度下诱导10h (0.5、1.0、1.5、2.0mmol/L) ;13-16:含pET-TaCKX1的菌株不同IPTG浓度下诱导20h (0.5、1.0、1.5、2.0mmol/L) ;M:蛋白质低分子量Marker。

1: Proteins of BL21 (DE3) plysS;2, 3: BL21 (DE3) plysS with pET24a before and after induction;4: BL21 (DE3) plysS with pET-TaCKX1 before induction ;5-8: BL21 (DE3) plysS with pET-TaCKX1 induced by different IPTG for 5h (0.5, 1.0, 1.5, 2.0mmol/L) ; 9-12: BL21 (DE3) plysS with pET-TaCKX1 induced by different IPTG for 10h (0.5, 1.0, 1.5, 2.0mmol/L) ; 13-16: BL21 (DE3) plysS with pET-TaCKX1 induced by different IPTG for 20hours (0.5, 1.0, 1.5, 2.0mmol/L) ;M: Protein Low molecular weight marker.

1:含pET-TaCKX1的BL21 (DE3) plysS菌体蛋白;2:诱导后菌体经蛋白提取液提取物;3:菌体超声裂解后上清经蛋白提取液提取物;4:菌体超声裂解后的沉淀经蛋白提取液提取物;M:蛋白质低分子量Marker。

1: Proteins of BL21 (DE3) plysS with pET-TaCKX1;2: Protein extract of BL21 (DE3) plysS with pET-TaCKX1 after induction;3: Supernatant of BL21 (DE3) plysS with pET-TaCKX1 after induction;4: Pallet of BL21 (DE3) plysS with pET-TaCKX1 after induction; M: Protein Low molecular weight marker.

3 讨论

大肠杆菌表达系统即原核表达系统, 具有生长速度快、产量高、操作容易、成本低等优点, 本研究中选用菌株BL21 (DE3) plysS作为表达菌, 实现了TaCKX1的大量表达。BL21 (DE3) plysS含有plysS质粒, 它携带编码T7溶菌酶基因, 可产生少量溶菌酶在诱导前抑制T7 RNA聚合酶的基础表达, 这样可以稳定编码影响细胞生长和活力的目标蛋白的pET重组体。在T7启动子控制下, T7溶菌酶降低靶基因的背景表达但并不干扰由IPTG诱导的表达水平。

1-7:纯化蛋白流出液不同收集管中的蛋白;8:含pET-TaCKX1的BL21 (DE3) plysS菌体蛋白;9:诱导表达后菌体蛋白提取物;M: 蛋白质低分子量Marker。

1-7: Proteins of different collecting canal with purifying protein effluent; 8: Proteins of BL21 (DE3) plysS with pET-TaCKX1; 9: Protein extract of induced BL21 (DE3) plysS; M: Protein low molecular weight marker.

关于小麦TaCKX1基因在原核细胞的表达国内外无研究报道。本研究选用pET24a作为表达载体, 进行诱导表达并使用His·Bind Purification Kit纯化试剂盒进行蛋白纯化, 成功表达了带有His标签的TaCKX1融合蛋白。

本研究中实验了IPTG的浓度和诱导时间两个因素, 在试验的三个IPTG浓度下, 表达量差异不大, 所以可以适当减少IPTG的使用量。在实验所做的IPTG的三个浓度下, TaCKX1基因的表达差异不大, 所以在需要大量表达蛋白时可选用0.8mmol/L。这与前人的实验稍不同。如李军等研究认为IPTG终浓度为0.8mmol/L时融合蛋白表达量最大, IPTG浓度继续增加, 蛋白的表达量突然降低[14]。Ye H等在原核表达几丁质酶时, 发现IPTG终浓度为0.8mmol/L 时表达量最高, 而随着IPTG浓度的加大, 表达量也降低[15]。这可能与使用的表达菌株和表达载体有关。三个诱导时间5h、10h、20h的TaCKX1基因的表达量差异较为显著, 随着诱导时间的延长TaCKX1基因的表达量也随之增加, 因此可以选择适宜的诱导时间诱导菌株表达。张传仪等在研究苹果AFL1基因的原核表达时发现, 在IPTG的诱导下, 能够表达出AFL1蛋白, 但随着诱导时间的增加, 蛋白质的表达量没有明显增加[16]。这可能是由于不同真核基因的密码子不同, 导致在原核细胞中表达量存在差异。转入所表达的TaCKX1与HIS标签融合蛋白主要以不溶性的包涵体形式存在。通过使用变性剂 (如盐酸胍、尿素等) 对包涵体进行溶解后, 可以很方便地进行纯化。