原核表达

原核表达（共10篇）

原核表达 篇1

抗菌肽是由生物防御系统产生的一类小分子肽类物质[1], 具有高效的杀菌能力和广谱的抗菌活性。在抗生素滥用而产生大量耐药菌株的情况下, 具有独特抗菌作用机理的抗菌肽具有很好的开发和应用前景。

基因工程表达的方法是目前最经济的获得大量抗菌肽的途径。如何选择高效表达系统对基因工程合成具有生物活性的抗菌肽非常重要。其中大肠杆菌表达系统具有产量高、生长速度快、易操作、基因导入方便、成本较低等优点, 受到人们的青睐。由于抗菌肽分子量小, 对宿主菌有毒性, 用基因工程的方法直接表达抗菌肽存在产量低, 纯化困难的难题。目前研究的热点是以优化稀有密码子, 串联表达和融合表达的方法来改善抗菌肽在大肠杆菌中表达量低的问题, 取得了一些成效。

1 抗菌肽的结构特点及作用机理

在过去的几十年内, 已经发现700多种抗菌肽。大多抗菌肽是由13~45个氨基酸组成的一类小分子短肽, 对抗革兰阳性、抗革兰阴性菌及真菌有较广的抗菌活性, 尤其对耐药菌株有明显的杀灭作用, 且不破坏生物体细胞, 无免疫原性[2]。虽然抗菌肽种类繁多, 从细菌到植物、从低等动物到人类体内均有存在, 但其具许多共同特点:多数抗菌肽的等电点大于7, 呈现较强的阳离子特征、水溶性好、耐酸碱性、耐热性强;抗菌肽的高级结构中N端易形成两亲α-螺旋, 带电荷氨基酸均在螺旋一侧分布, C端有形成疏水 (螺旋) 的趋势, 中间部分易形成β-折叠, 使抗菌肽呈现出双亲性, 从而易于抗菌肽发挥其抗菌功能[3]。

抗菌肽的作用原理不同于抗生素, 其主要的作用靶点是细胞膜。带正电的抗菌肽通过静电作用与细菌细胞膜相结合后, 在细菌质膜上形成穿膜孔道, 引起胞内物质渗出, 从而最终导致细菌的死亡。抗菌肽的这种膜作用机制让细菌很难有机会产生具有抗性的突变型。抗菌肽与细菌细胞膜作用模型主要有“桶板模式”、“覆毯模式”、“胶束模式”等。多篇有关抗菌肽的综述对此已有详细阐述[4]。

2 抗菌肽基因在大肠杆菌中的表达策略

2.1 密码子偏爱性

大肠杆菌基因对密码子的使用有相当程度的偏爱性, 主要是因为大肠杆菌基因组缺乏识别这些密码子的t RNA。由于受大肠杆菌密码子使用频率的限制, 真核蛋白表达常有困难。为解决这一问题, 一是根据表达宿主偏爱性密码子设计合成抗菌肽的编码基因。2004年, Li[5]等将人β-防御素基因改造为大肠杆菌的密码子偏爱的基因, 在大肠杆菌中获得高效融合表达, 融合蛋白占细菌总蛋白的50%以上, 是野生型基因的9倍。二是选择合适的表达菌株, Rosetta系列宿主菌是BL21衍生菌, 能够明显增强带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白的表达, 该菌株通过一个相容性的氯霉素抗性质粒补充密码子AUA, AGG, AGA, CUA, CCC和GGA的t RNAs。这样就实现了大肠杆菌的“万能”翻译, 克服了稀有密码子的偏好性对外源基因表达效率的负面影响。

2.2 串联表达

抗菌肽分子量较小, 克隆、表达、纯化、检测都会有一定困难, 为了减少外源表达引起的目的蛋白的低产量, 从源头上提高目的蛋白的回收率, 人们采用一个基因多拷贝同向串联融合表达的策略, 将抗菌肽基因多拷贝同向串联或将几种抗菌肽相连接形成杂合抗菌肽的方法来提高目的蛋白的产量。2007[6]年, 沈益等将TNFa基因 (天然型肿瘤坏死因子) 3'端连接抗菌肽cecropin-Xm基因三拷贝串联体, 在大肠埃希菌BL21 (DE3) 中诱导表达融合蛋白, 表达后的融合蛋白经CNBr切割后用CM52纤维索柱分离纯化得到纯度大予95%的抗菌肽cecropin-Xm, 体外活性实验显示其具有广谱抗菌和抗肿瘤作用。串联表达的方法不受限制酶和载体的局限, 既可以提高外源蛋白表达量和稳定性, 又不影响抗菌肽的活性, 稍加改变便适用于各种基因和载体。

2.3 融合表达

研究结果表明抗菌肽的毒性对原核微生物具有抑制作用, 难以在原核表达体系中直接表达具有天然生物活性的抗菌肽。如何防止抗菌肽对表达宿主菌的伤害, 是提高抗菌肽基因表达水平的关键问题。现在一般采用以融合蛋白的形式在大肠杆菌中表达抗菌肽基因。融合蛋白表达法是在抗菌肽的N端连接一段适合在细菌中表达的蛋白质序列, 宿主菌表达出这样的融合蛋白没有杀菌活性, 不会对宿主造成伤害, 从而提高了抗菌肽基因的表达水平。同时, 表达出的抗菌肽带上一个融合蛋白中还含有许多便于特异性的标签, 便于外源蛋白的分离纯化出来。2006年, 杨旭[7]等利用GST融合表达系统在大肠杆菌中表达了抗菌肽基因Pexiganan和IB-367, 表达产物经Xa因子酶切后显示出抗菌活性。2008年[8], 陈晓平等采用SOE法人工设计和合成抗菌肽MagaininlI基因, 以p ET 28a表达载体, 在E.coli BLP中以His融合的方式进行了表达, 以镍柱亲和层析纯化, 对融合蛋白的包涵体进行变性、复性和切除融合标签后, 通过琼脂孔穴扩散法活性试验证明表达产物具有抗菌活性。目前成功的融合表达系统主要有:a.GST系统;b.β-半乳糖苷酶系统;c.麦芽糖结合蛋白 (MBP) 系统;d.金黄色葡萄球菌蛋白A系统;e.纯化标签融合:如FLAG-tag和His-tag;f.其他融合系统, 如硫氧还原蛋白等。

3 结论

随着对抗菌肽的研究不断深入, 其应用已涉及医药、食品等多个领域。国内外已经对抗菌肽进行了临床可行性研究, 部分产品已初具规模, 并相继问世。许多实验对抗菌肽的重组表达进行了尝试, 涉及多种表达系统, 包括大肠杆菌系统、酵母系统、昆虫表达系统, 哺乳动物表达系统等。大肠杆菌遗传图谱明确, 易培养、周期短、费用低, 对许多蛋白质有较强的耐受能力, 能较高水平地表达多种蛋白。抗菌肽分子量小, 对宿主菌有毒害作用, 成为制约抗菌肽在原核生物中表达的主要因素。通过优化稀有密码子, 串联抗目的基因以及融合表达的策略, 可有效提高抗菌肽在大肠杆菌表达系统中的表达水平。伴随分子生物学新技术的涌现, 大肠杆菌势必在实验研究及工业生产重组蛋白的应用中发挥出更大的作用。

参考文献

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[8]陈晓平, 詹冬玲, 贾惠文, 商雪娇, 钱爱东.抗茵肽MagaininⅡ基因的克隆及其在E.coil BLP中的融合表达[J].吉林农业大学学报, 2008, 30 (6) :797-804.

原核表达 篇2

目的 构建人His标记的γ干扰素诱导蛋白10 (interferon-γ-inducible protein 10, IP-10)融合蛋白表达载体并在原核细胞中表达、纯化,获得有活性的IP-10蛋白,为进一步研究其在炎症过程中的作用机制及寻找新的抗炎途径提供基础.方法 从人肺cDNA文库中PCR扩增无信号肽的`IP-10基因编码序列,构建重组载体pET-14b/IP-10;重组质粒经酶切、测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株;经异丙基γ-D-硫代半乳糖(IPTG)诱导后,用镍离子亲和层析柱纯化融合蛋白,以THP-1细胞进行微室跨膜迁移(transwell)实验鉴定融合蛋白活性.结果 酶切、测序鉴定重组载体pET-14b/IP-10构建正确,并纯化得到高纯度的IP-10融合蛋白.而且该蛋白具有诱导单核细胞THP-1跨膜迁移活性.结论 成功构建了人IP-10融合蛋白表达载体,并纯化得到具有活性的IP-10融合蛋白,为进一步研究IP-10的功能提供了重要的实验材料.

作 者：邵紫韫 彭毅 SHAO Zi-yun PENG Yi 作者单位：邵紫韫,SHAO Zi-yun(广州军区武汉总医院医务部,武汉,430070)

彭毅,PENG Yi(广州军区武汉总医院心血管内科)

原核表达 篇3

关键词：山桃；醇腈酶；基因克隆；原核表达

中图分类号：S662.101；Q786 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）07-0020-05

利用酶作为催化剂用于合成单一对映体或直接分离特定手性异构体，被广泛应用于不对称合成领域。醇腈酶作为一种不对称催化手性反应的酶，自20世纪初在扁桃中发现以来，受到愈来愈多的关注[1]。它可逆地催化HCN和醛/酮类化合物反应生成手性氰醇[2]，进而转化成为羟基化合物等多种手性中间体，并用于合成多种手性药物，从而克服了为得到纯手性化合物而采用光学拆分所带来的生产工序复杂、成本高等一系列问题[3-4]。此外，在植物体内，醇腈酶可催化氰基糖苷类化合物，反应生成羰基化合物和HCN，而后者在植物防御草食类动物摄食或其他致病菌感染中起到作用，即植物的生氰作用[5-6]。

HNL在自然界中是广泛存在的。据统计，有3 000～12 000 种植物内含有HNL。HNL主要分为两大类：R构型和S构型。目前，已分离纯化并进行酶活分析的R型HNL多来自于蔷薇科植物[7]，如扁桃、黑樱桃、梅、枇杷、西番莲等[8-13]；而S型HNL多来自于木薯、橡胶树、海檀木与高粱[14-17]。笔者所在研究组根据前期公布的桃的基因组数据[18]，通过序列同源比对分析，发现其中有3条序列为编码推测的HNL蛋白。此外，山桃、桃与扁桃同属于蔷薇科桃属，目前有关山桃中HNL的研究并未报道。因此，本研究采用生物信息学结合PCR的方法，克隆得到1个山桃HNL基因，并对其进行了相关的生物信息学分析与原核表达研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山桃[Prunus davidiana （Carr.） C.]叶片取自江苏省中国科学院植物研究所，采集后迅速放入液氮中冷冻，于 -80 ℃ 保存备用。

高纯总RNA快速提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司，表达载体pET28（a）购自Novagen公司，rTaq DNA聚合酶、克隆载体pMD19-T、Oligo （dT）18、DNA Markers、限制性内切酶和反转录酶M-MLV （RNase H—）等购自大连宝生物工程有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物购自Oxoid公司；其他化学试剂均为国产分析纯。大肠杆菌DH5α、TOP10和BL21 （DE3）菌株为笔者所在实验室保存，引物合成和测序工作分别委托北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司与上海美吉生物医药科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取及cDNA的合成 按照高纯总RNA快速提取试剂盒的操作说明，提取山桃叶片的RNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度与完整性，并以此为模板，根据TaKaRa公司的反转录试剂盒说明书反转录得到山桃cDNA。

1.2.2 [WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]基因的克隆及生物信息学分析 根据桃基因组测序组公布的序列，通过比对搜索出编码假定醇腈酶蛋白的基因序列，并根据这些序列设计特异引物，上游引物为 F0：5′-ATGGTGAAATCAACAATGTC-3′，下游引物为 R0：5′-AGTATCAAACGCAAAGGAT-3′。以反转录得到的 cDNA 为模板进行 PCR扩增，扩增反应程序为：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35个循环；72 ℃ 延伸10 min。PCR产物经 1%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，纯化后的产物连接到 pMD19T载体上，转入大肠杆菌 DH5α感受态细胞，挑取克隆进行PCR与质粒酶切检测，鉴定结果均为阳性的重组子送交公司测序。

测序结果通过NCBI的ORF finder在线软件查找该序列的开放阅读框，得到其编码的氨基酸序列，将该序列使用BlastP进行比对，选择与PdHNL同源的其他植物的醇腈酶蛋白序列，进一步利用DNAman软件进行多重序列比对并使用MEGA5构建系统进化树；使用ExPASy的Compute pI/MW计算蛋白的等电点与分子量；用TMHMM预测跨膜结构；用SignalP 4.1预测信号肽；用PROSITE数据库进行功能结构预测；用SWISS-MODEL预测三级结构并建模。

1.2.3 [WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]基因的载体构建与原核表达 根据获得的[WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]基因与pET28（a）载体图谱，分析并设计带有酶切位点EcoRⅠ和NotⅠ的引物PdHNL1-pETF和PdHNL1-pETR （表1），使用rTaq DNA聚合酶进行PCR扩增。

将pMD19T-[WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]重组质粒与pET28（a）载体质粒同时进行EcoRⅠ和NotⅠ双酶切，回收并纯化目的片段，并使用T4 DNA连接酶16 ℃连接过夜，随后转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，重组质粒经卡那霉素筛选，PCR扩增并进行质粒双酶切验证后，最后挑去阳性克隆子进行测序。将测序正确的重组质粒pET28（a）-[WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]和空载体pET28（a）分别转入表达宿主菌BL21（DE3）中，挑取克隆并使用 T7通用引物进行PCR，筛选阳性菌株。

GAPB基因原核表达载体的构建 篇4

1 材料与方法

1.1 材料

哥伦比亚型拟南芥、大肠杆菌DH5α和BL21 (DE3) 由本实验室保存。胶回收试剂盒和质粒小量提取试剂盒购于上海华舜生物技术公司。PET28a (+) 质粒载体由四川大学遗传学重点实验室惠赠。所需引物由上海英俊生物技术有限公司合成。限制性内切酶Bam HI和Xho I、高保真酶Pfu以及T4 DNA连接酶购于MBI Ferments公司。

1.2 方法

1.2.1 拟南芥总RNA的提取

利用TRIZOL试剂盒提取哥伦比亚型拟南芥总RNA, 1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA产物。然后用反转录试剂盒将RNA反转合成c DNA, 作为扩增基因的模板。

1.2.2 引物的设计

利用Primer primer5.0根据GAPB的基因序列设计特异性引物, 引物含有Bam HI和Xho I酶切位点, 序列如下:

上游酶切位点为Bam HI, 下游酶切位点为Xho I, 引物由上海英俊公司合成。

1.2.3 PCR扩增和胶回收GAPB基因

以拟南芥c DNA为模板, 用PCR法扩增GAPB基因, 反应体系如下:10×PCR Buffer (含Mg Cl2) 2.5μL, (2.5 m M) d NTP 2μL, 上游引物 (F) 1μL, 下游引物 (R) 1μL, c DNA 0.5μL, Pfu酶0.2μL, dd H2O 17.8μL。PCR反应条件:94℃预变性3 min后进入以下循环, 94℃35 s, 59℃35 s, 72℃1 min30 s, 共进行30个循环, 最后72℃延伸10 min结束PCR反应, 扩增得到GAPB基因的全长。按胶回收试剂盒的说明回收GAPB基因片段。

1.2.4 PET28a (+) 质粒的提取

将PET28a (+) -DH5α菌株划线于含Kan的LB固体培养基中, 37℃培养过夜, 次日挑单菌落于含Kan的LB液体培养基中, 37℃培养过夜, 按照质粒小量抽提试剂盒说明书提取PET28a (+) 质粒。

1.2.5 目的基因和载体的双酶切

采用50μL酶切体系, 分别用Bam HI和Xho I双酶切PET28a (+) 载体和纯化的GAPB基因片段, 用胶回收试剂盒纯化回收酶切后的载体片段和基因片段, 取少量回收产物作1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.6 连接及重组质粒的转化

用T 4连接酶连接酶切纯化后的GA P B基因和PET28a (+) 载体片段, 连接体系为25μL, 16℃连接过夜。然后制备大肠杆菌DH5α感受态细胞, 将连接体系转化大肠杆菌DH5α。在转化时设置阳性和阴性对照, 阳性对照为未酶切的PET28a (+) 质粒, 用以检测转化效率;阴性对照为空的大肠杆菌感受态, 用以检测感受态细胞是否有污染。将转化产物涂布于含Kan的LB固体培养基中, 37℃过夜培养。

1.2.7 重组质粒阳性克隆的鉴定

在含有重组质粒的LB平板上随机挑取多个单菌落, 以其为模板分别作PCR扩增反应, 1%琼脂糖凝胶电泳检测是否有目的条带。同时将挑取的多个单菌落分别摇菌, 按质粒提取试剂盒的说明提取质粒, 并用Bam HI和Xho I双酶切质粒, 电泳检测酶切产物。

1.2.8 表达质粒的构建与鉴定

将双酶切鉴定正确的阳性克隆菌株送上海华大基因测序, 分析克隆基因的序列组成及其阅读框的正确性。测序正确后, 提取PET28a (+) -GAPB/DH5α阳性克隆的质粒, 将该质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3) 感受态细胞, 并挑取多个单菌落作PCR鉴定, 得到含有PET28a (+) -GAPB质粒的BL21 (DE3) 表达菌。

2 结果与分析

2.1 RNA纯度的测定

对提取的拟南芥总RNA进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测, 发现RNA产物条带清晰, 并且28S条带亮度是18S的2倍左右 (图1) 。紫外分光光度计分析显示, A260/A280=1.92, 表明获得的RNA纯度及浓度较高, 可以用于基因全长的扩增。

2.2 GAPB基因的扩增

利用设计的特异性引物作梯度PCR, 寻找扩增GAPB基因的最佳退火温度, 发现在59℃退火温度下, GAPB基因扩增的条带最好。电泳图 (图2) 显示大约在1344 bp左右有一目标条带, 说明已根据设计的引物克隆出所需要的基因片段。

2.3 PET28a (+) -GAPB重组质粒的PCR鉴定

选用PET28a载体上的T7上游引物与GAPB的下游引物配对, 进行菌落PCR筛选阳性克隆。通过1%的琼脂糖凝胶电泳检测, 大多数都得到与GAPB基因大小一致的片段 (图3) , 说明得到了重组质粒的阳性克隆。

2.4 PET28a (+) -GAPB重组质粒的双酶切鉴定

重组质粒经Bam HI和Xho I双酶切后出现2条带, 其中1条带大小约为1344 bp左右 (图4) , 与GAPB基因大小一致, 说明PET28a (+) -GAPB重组质粒构建正确。

2.5 转化BL21 (DE3) 重组质粒的鉴定

将重组质粒PET28a (+) -GAPB转化到大肠杆菌BL21 (DE3) 中, 经抗性筛选, 挑取单菌落, 作菌落PCR鉴定, 经1%的琼脂糖凝胶电泳检测到目的条带 (图5) , 说明转化成功。

3 讨论

在植物的糖酵解和糖异生途径中, 三磷酸-甘油醛脱氢酶 (GAPDH) 是关键酶, 参与糖酵解过程中第一个ATP的形成。由于GAPDH具有高度的保守性, 人们通过比较不同物种的该基因核酸序列和蛋白序列的异同, 对物种进行分类, 建立物种之间的系统发育关系[5]。在外界胁迫如热胁迫、渗透胁迫、缺氧胁迫或营养缺失条件下, 一些糖酵解相关基因的m RNA大量积累表达[6]。近年来, 有许多研究表明GAPDH基因的表达可能增强了植物抵抗胁迫的能力。Pillai等[7]将水稻幼苗进行干旱、淹没和脱落酸 (ABA) 处理, 结果表明GAPDH基因的转录水平显著提高。在植物中, 经H2O2诱导GAPDH的转录水平也可显著增加。Baek等[8]将GAPDH基因转化到拟南芥原生质体中, 发现该基因能强烈抑制热击时H2O2的产生和细胞的死亡。本研究以拟南芥c DNA为模板, 克隆出GAPB基因的全长, 并构建了原核表达载体PET28a (+) -GAPB, 为后续研究GAPB的功能提供了理论基础。

摘要：以拟南芥cDNA为模板, 用PCR扩增出GAPB的基因全长, 然后将GAPB基因片段连接到PET28a (+) 载体上, 构建重组质粒并转化大肠杆菌DH5α, 经菌落PCR和酶切鉴定筛选出阳性克隆, 测序正确后, 再将阳性克隆的质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3) 。结果表明:成功构建了原核表达载体PET28a (+) -GAPB, 为后续的GAPB融合蛋白的表达以及纯化奠定了基础。

关键词：GAPB,大肠杆菌BL21,PET28a (+) ,融合蛋白

参考文献

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原核表达 篇5

将扩增的甘蔗花叶病毒P1基因克隆到原核表达载体pET-32a上,转化BL21(DE3),获得重组子pET-32a-P1.超声波结果显示,所得的.融合蛋白以可溶性的形式存在.SDS-PAGE检测其表达产物与目的蛋白大小一致,割胶免疫注射家兔得到抗体.间接ELISA测定结果表明稀释51200倍仍呈阳性信号,并通过western blot检测,证明抗体特异性良好.

作 者：郭莺 阮妙鸿 刘佳 杨川毓 张木清 GUO Ying RUAN Miao-hong LIU Jia YANG Chuan-yu ZHANG Mu-qing 作者单位：郭莺,GUO Ying(福建省亚热带植物研究所,福建,厦门,361006;农业部甘蔗生理生态与遗传改良重点开放实验室,福建,福州,350002)

阮妙鸿,刘佳,杨川毓,张木清,RUAN Miao-hong,LIU Jia,YANG Chuan-yu,ZHANG Mu-qing(农业部甘蔗生理生态与遗传改良重点开放实验室,福建,福州,350002)

原核表达 篇6

1 材料与方法

1.1 牛INF-τ基因

牛INF-τ基因, 由沈阳农业大学预防兽医学实验室保存。

1.2 菌株及试剂

大肠杆菌BL21 (DE3) 感受态细胞, 购自天根生化科技 (北京) 有限公司; 质粒小量抽提试剂盒、Red Taq酶、胶回收试剂盒, 购自上海生工生物工程技术服务有限公司;限制性内切酶 (EcoRⅠ、XhoⅠ) 、 T4 DNA 连接酶, 均购自宝生物工程 (大连) 有限公司。其他常规试剂按照《分子克隆实验指南》的要求配制。

1.3 引物的设计与合成

根据NCBI上发表的牛IFN-τ基因序列 (登录号为AY665673) 设计并合成1对引物, 引物序列:5′-ATTAGAATTCATGGCCTTCGTGCTCTCTC-3′, 5′-CTCGAGAGGTGAGTTCAGATCTCCAT-3′, 下画线部分分别为EcoRⅠ、XhoⅠ的酶切位点。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.4 牛INF-τ基因的PCR扩增

PCR管中依次加入超纯水11 μL, 25 mmol/L MgCl2 2 μL, 10×PCR Buffer 2 μL, 2.5 mmol/L dNTP Mixture 1 μL, 20 μmol/ L的上、下游引物各1 μL, 5 U/μL Red Taq 酶 1 μL, 模板 1 μL, 混匀后短暂离心, 进行PCR反应。

PCR 反应条件: 95 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min, 55 ℃退火1 min, 72 ℃延伸50 s, 共35个循环;72 ℃再延伸7 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳, EB 染色, 采用GeNius 凝胶电泳图像分析系统分析鉴定并用胶回收试剂盒回收PCR产物。

1.5 牛INF-τ基因原核表达载体的构建及鉴定

采用内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ分别对回收的PCR产物和pET-28表达载体进行双酶切, 回收酶切产物。胶回收酶切目的片段, 构建表达载体pET- 28a- INF-τ, 转化大肠杆菌BL21 (DE3) 感受态细胞, 将转化成功的细菌涂布于含100 μg/mL 卡那霉素的 LB 琼脂培养基, 培养10～16 h, 挑选单个菌落, 接种于含卡那霉素的 LB液体培养基中, 置于37 ℃ 摇床振荡培养12 h, 抽提质粒, 进行PCR以及酶切鉴定, 取阳性克隆进行测序。

1.6 牛INF-τ基因原核表达

将测序正确的重组工程菌接种于含100 μg/mL卡那霉素的 LB液体培养基中, 37 ℃ 振荡至菌液OD600值达到0.6, 加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG) , 37 ℃诱导6 h, 收集菌液进行 SDS- PAGE 鉴定。同时设立阴性对照。

取诱导后的菌液进行 SDS- PAGE 电泳, 然后电转移至硝酸纤维素膜 (NC膜) 上, 用含5%脱脂奶粉的封闭液室温封闭2 h, 换新鲜的封闭液, 加入鼠抗 His单克隆抗体作为一抗, 37 ℃ 摇床反应2 h。1×PBST 洗涤3～5次, 每次4 min, 于1×PBST 中加入辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的羊抗兔IgG作为二抗, 37 ℃ 摇床反应2 h, 最后 DAB 显色至目的条带清晰时终止反应 。

2 结果与分析

2.1 目的基因的PCR扩增

PCR 结果显示:在588 bp处有1条带, 与预期片段大小一致, 没有非特异性条带出现 (见图1) 。

M.DL-2 000 Marker;1.PCR扩增产物;2.阴性对照。

2.2 原核表达载体pET- 28a- INF-τ的构建

质粒pET-28a 和回收的PCR产物分别经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后, 回收酶切片段, 16 ℃连接过夜, 连接产物转化至大肠杆菌BL21 (DE3) 感受态细胞, 随机挑取菌落, 抽提质粒, 双酶切产物电泳后, 阳性克隆出现的2条带分别位于5 300 bp和588 bp处 (见图2) , 以提取质粒为模板进行PCR扩增, 在588 bp处同样出现特异性条带。将鉴定正确的阳性菌落送上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定, 所得结果与目的基因序列一致。

1.重组质粒的酶切;2.重组质粒;M.DL-2 000 Marker;3.PCR产物;4.阴性对照。

2.3 蛋白诱导表达及鉴定

将原核表达载体pET- 28a- INF-τ转化至大肠杆菌BL21 (DE3) 感受态细胞中, 获得重组工程菌, 接种 LB 液体培养基, 于 37 ℃培养至 OD600 值达到 0.6时, 加入终浓度为1 mmol/L IPTG 诱导6 h, 收集菌体进行 SDS- PAGE 检测, 可见在分子质量约为25.5 ku处出现1条新的蛋白带 (见图3) , 与理论预测值基本相符。空载体转化菌 pET- 28/BL21诱导后和未诱导重组工程菌在同一位置未出现相应的蛋白带。将诱导后的全菌进行 SDS- PAGE分离后电转移至NC 膜上, 依次加入一抗和二抗, DAB 显色后在分子质量为 26 ku的新生蛋白带处有1条特异性条带, 同时以空载体菌作为对照, 未发现条带, 说明该蛋白带为目的蛋白 (见图4) 。

M.低分子质量蛋白标准;1.pET- 28a- INF-τ诱导6 h;2.空载体转化菌 pET- 28/BL21诱导后;3.未诱导重组工程菌。

M.低分子质量蛋白标准;1.融合蛋白。

3 讨论

IFN-τ作为一种新的Ⅰ型干扰素, 具有很强的抗病毒、免疫调节、抗黄体溶解等生物学功能, 特别是其抗病毒作用受到了人们的高度重视。作为一种新型抗逆转录病毒干扰素, IFN-τ具有比 IFN-α更有效的抗人免疫缺陷病毒 (HIV) 作用。同时, 也可以有效地抑制巨噬细胞内HIV 早期的复制过程, 减少细胞间的HIV-RNA, 抑制病毒 RNA 逆转录的起始及前病毒DNA 的形成[3]。因此, IFN-τ被认为是一种新型的具有发展潜力的分子药物。 但是, IFN-τ在特定的空间和时间才会表达, 并且直接进行组织培养和提取也很繁琐而且困难, 试验通过基因工程技术将克隆的IFN-τ片段转入载体细胞进行表达, 表达蛋白的量也很高。

参考文献

[1]THOMAS W C, SANDRA B.Interferon-τ:Current applicationsand potential in antiviral therapy[J].J Inter Cytok Res, 2010, 30:477-483.

[2]付加雷, 宋长征.干扰素-τ的研究进展[J].药物生物技术, 2006, 13 (1) :74-78.

人表皮生长因子的原核表达及纯化 篇7

有人利用带有透明质酸的脱细胞支架结合1 μg / m L EGF后再置于带有伤口的兔皮上,伤口愈合速度要明显地快于甘油组与不含有EGF的脱细胞支架组,并且试验组在28天时就长出了皮肤再生附属物[8],而现今大多数对于EGF的研究都与癌症相关。还有人证明了人肝癌细胞( HCC) 的增殖、转移和炎症性细胞因子的产生都需要经由EGF - EGFR信号通路[9]。A. Claperon等[10]证明EGF/EGFR能触发CCA细胞中一个非常显著改变的EMT通路。

在医学方面EGF具有较大的用处,宋振强等[11]通过临床实践证明了当EGF与碱性成纤维细胞生长因子联合应用时对于糖尿病创面的治疗具有协同效应。处理后14天,联合用药组创面愈合率比生理盐水组创面愈合率高出12% 。彭艳阳等[12]在细胞水平上证明10 μg /L重组人表皮生长因子干预5 d促进人角膜上皮细胞克隆形成效果最好。EGF与神经生长因子联合用药干预创伤性脑损伤后内源性神经干细胞的增殖试验证明了二者联合用药的效果要明显优于对照组和分别用药组[13]。

目前,EGF的制备工艺较复杂,纯化困难。军事医学科学院六室建立了一种新型的制备工艺,简化了纯化步骤同时保证较高的回收率。

1材料与方法

1. 1菌株及质粒

E. coli JM109、BL21( DE3) 和p ET - 28a - EGF质粒,均为军事医学科学院六室保存; p ET - SUMO - T载体,购自美国Invitrogen公司。

1. 2主要试剂

LA Tap聚合酶及PCR反应所用各种试剂、T4 DNA连接酶,宝生物工程( 大连) 有限公司生产; DNA凝胶回收试剂盒,康为试剂生物科技有限公司生产; 质粒小提试剂盒,OMEGA Bio - TEK生产; 其余产品均为国产分析纯。分离介质( Celating Sepha- roseTMFast Flow,SephadexTMG - 25 Fine、Q Sepharose High performance、Superdex 200 prep grade) ,GE公司生产。

1. 3引物的设计及合成

设计并委托宝生物工程( 大连) 有限公司合成无首位Met密码子的EGF引物,用于扩增EGF目的片段。序列为: F 5' - AACTCCGACTCCGAATGTC - 3',R 5' - TTATCTCAATTCCCACCACT - 3',SUMO S1 5' - AGATTCTTGTACGACGGTATTAGA - 3'。

1. 4目的片段的扩增

以p ET - 28a - EGF质粒为模板进行PCR扩增目的基因片段。反应体系( 25 μL) : LA Tap聚合酶0. 25 μL,PCR Buffer 2. 5 μL,d NTP mixture 4 μL, Template 0. 5 μL,上、下游引物F、R各0. 5 μL,用无菌去离子水补足25 μL。反应条件: 94 ℃ 5 min; 94 ℃ 40 s,60 ℃ 40 s,72 ℃ 90 s,共35个循环; 72 ℃ 10 min; 4 ℃ 冷却; 用3% 琼脂糖凝胶电泳,按试剂盒中的使用说明书回收PCR产物。

1. 5重组表达质粒的构建

将目的片段与p ET - SUMO - T载体按1∶6比例进行连接反应,16 ℃ 过夜; 连接产物转化感受态E. coli JM109,置于37 ℃ 恒温培养箱过夜。筛选数个克隆菌落分别接种到含50 μg /m L Kan的LB培养基中,37 ℃ 恒温振荡培养( 200 r/min) 过夜; 提取质粒, 分别以特异性SUMO S1为上游引物、EGF R为下游引物进行PCR鉴定,选取阳性克隆株提取质粒,委托吉林省库美生物科技有限公司进行T7 promotor引物测序。

1. 6目的基因的诱导表达

挑选测序完全正确的质粒以氯化钙法转化到感受态E. coli BL21( DE3) 中,37 ℃恒温培养过夜; 筛选数个克隆菌落分别接种到含50 μg /m L Kan的LB培养基中,37 ℃恒温摇床培养至菌液OD600值为0. 5以上,取出200 μL留种,在原LB培养基中加入终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导菌体表达,30 ℃ 培养4 h; 取出200 μL菌体以21 612 × g离心10 min; 弃去上清液,以200 μL TE( 30 mmol/L Tris、5 mmol/L ED- TA,p H值为7. 5 ) 重悬菌体,超声波破碎处理( 功率400 W,工作时间5 s,间隔时间9 s,共20次) ,镜检确定菌体破碎完全,以21 612 × g离心5 min; 取上清液和沉淀分别进行15% SDS - PAGE检测,确定蛋白表达形式,以未诱导的受体菌做阴性对照。

1. 7菌体的发酵

将菌种在固体LB培养基上划线培养,进行菌体活化,37 ℃ 恒温培养箱培养过夜; 挑取长势较好的单菌落接种至含50 μg /m L Kan的5 m L LB液体培养基中,37 ℃、180 r/min培养至对数生长期后,按1∶500转接至1 L LB液体培养基,继续培养至对数生长期。 将扩大培养的菌种接入50 L发酵罐后,设定发酵参数: p H值7. 25,溶氧30% ,罐压0. 04 MPa,通气量2. 0,温度37 ℃ ,逐渐加入补料( 葡萄糖80. 0 g / L, KH2PO44. 60 g / L,蛋白胨48. 0 g / L,酵母粉24. 0 g / L,K2HPO416. 4 g / L) ,速度随时间先增加后降低,至OD600值约为9. 9降温至30 ℃,加入诱导剂IPTG至终浓度为1 mmol / L,诱导5 h,4 ℃ 离心收集菌体。

1. 8重组蛋白的纯化

取发酵菌体,以20 mmol/L Tris( p H值为7. 5) 重悬,超声波破碎( 功率1 200 W,工作时间5 s,间隔时间9 s,共90次) ,镜检确定菌体破碎完全,离心取上清液。

1.8.1初步纯化

样品进行Cu2+(Chelating Sepha-roseTMFast Flow)金属螯合层析(XK26×20,柱床体积100 mL)。用5倍柱床体积的20 mmol/L Tris(p H值为7.5)、20 mmol/L咪唑溶液平衡层析柱,2 mL/min上样,上样结束以20 mmol/L Tris(p H值为7.5)、20 mmol/L咪唑溶液洗涤流穿至基线后,用含200 mmol/L咪唑、20 mmol/L Tris(p H值为7.5)溶液进行洗脱,将200 mmol/L咪唑洗脱样品经以20 mmol/L Tris(p H值为7.5)溶液平衡的SephadexTMG-25 Fine层析柱(柱床体积300 mL)脱盐,测定洗脱液体积与蛋白浓度,按蛋白质总量的1%加入SU-MO蛋白酶,4℃酶切过夜,将His-Tag sumo融合蛋白部分与EGF部分分离。酶切后样品进行Cu2+金属螯合层析。层析柱以5倍柱床体积的20 mmol/LTris(p H值为7.5)溶液平衡,2 mL/min上样,上样结束后以含200 mmol/L咪唑、20 mmol/L Tris(p H值为7.5)溶液洗脱His-Tag组分。将第2次Cu2+流穿进行以5倍柱床体积的20 mmol/L Tris(p H值为7.5)溶液平衡的Q Sepharose High performance阴离子交换层析。上样结束后用20 mmol/L Tris(p H值为7.5)溶液洗流穿至基线,以500 mmol/L Na Cl、20 mmol/L Tris(p H值为7.5)洗脱,得到95%纯度以上的目的蛋白。

1.8.2高度纯化

Superdex 200 prep grade层析介质以2倍的柱床体积20 mmol/L Tris(p H值为7.5)溶液平衡,收集洗脱样品进行层析。收集靠近盐峰的目的蛋白,将收集的流穿进行Q Sepharose High performance阴离子交换层析,以500 mmol/L Na Cl、20 mmol/L Tris(p H值为7.5)洗脱浓缩目的蛋白,电泳检验目的蛋白。

2结果与分析

2. 1 EGF的PCR扩增结果

PCR产物经3% 琼脂糖凝胶电泳,结果见图1。

M.DL-2 000 Marker;1~5.目的片段。

由图1可见,在159 bp处可见清晰的扩增条带, 与预期片段大小相符。

2. 2重组表达质粒的鉴定结果

重组表达质粒p ET - SUMO - EGF的PCR扩增产物经3% 琼脂糖凝胶电泳分析,可见264 bp片段, 证明EGF目的片段正确插入载体中,并委托吉林省库美生物科技有限公司完成测序,结果表明,PCR鉴定正确的DNA片段与设计基因序列完全一致。

2. 3表达产物的鉴定结果

经诱导表达菌及菌体裂解产物经15% SDS - PAGE电泳,以空白受体菌做阴性对照,在约25 ku处出现1条明显的表达带,与融合蛋白预期大小一致。 裂解产物电泳结果表明,大部分目的蛋白呈可溶性表达形式,见图2。

1.诱导菌体超声上清液;2.诱导菌超声沉淀;M.蛋白质Marker。

2. 4发酵结果

将菌种活化,加5 m L LB液体培养至对数生长期后,按1∶500转接至1 L LB液体培养基,继续培养至对数生长期,再扩大培养接入50 L发酵罐后诱导5 h,4 ℃ 离心收集菌体。经逐级扩大培养,平均每升发酵液可收集49. 5 g /L菌体。

2. 5纯化产物的鉴定结果

EGF蛋白先后经过金属螯合层析、阴离子交换层析与分子筛,最终得到纯度在98% 以上的EGF蛋白纯品,见图3。

1.纯化蛋白;M.小分子多肽Marker。

3讨论

通过基因工程技术获得目的片段,在现今大多数的重组蛋白中首位都含有Met[8],但本试验所设计的引物以及最终得到的蛋白中首位不含有Met,获得完全天然结构的EGF。

本试验通过PCR得到目的片段后装入p ET - SUMO载体中,该载体有几大突出优点: 首先,p ET - SUMO载体中含有His - Tag,有这个标签的存在就简化了该蛋白的纯化步骤,仅通过金属螯合层析就达到蛋白纯化的目的[5]; 其次,提高了回收效率,引入了p ET - SUMO载体后明确了目的蛋白的性质,收集特定位置的峰值即为所需的目的蛋白,该纯化过程具有非常好的重复性; 最后,SUMO融合部分易去除,采用蛋白酶就可以将His - Tag与sumo融合蛋白部分去除[11]。

本制备工艺中先后两次应用到了Cu2 +金属螯合层析: 第1次应用该层析是为了获得较纯净的融合蛋白质,在融合蛋白质中引入了His - Tag标签,能使所需要的蛋白质与层析介质紧密结合,而不含有标签的大多数杂蛋白就成为流穿[9]。第2次应用该层析技术是在目的蛋白质进行了酶切之后。目的蛋白在第1次螯合层析洗脱下来之后通过脱盐处理就应用特异性蛋白酶对目的蛋白进行酶切,目的是使His - Tag标签部分与EGF单体蛋白分开,然后进行金属螯合层析,标签部分和原洗脱液中的杂蛋白就会与层析介质结合[7],而EGF则成为流穿,这样就可以将二者分开获得纯净的EGF单体。后续试验将采用合适的酶将EGF与His - Tag标签部分分离,获得目的蛋白质,为下一步活性试验提供了纯品蛋白质。

4结论

利用PCR扩增EGF片段,成功构建重组表达质粒p ET - SUMO - T - EGF,重组质粒经PCR测序证明构建正确; 转化至BL21( DE3) ,用1 mmol/L IPTG诱导5 h,表达蛋白经SDS - PAGE分析主要以可溶形式表达,可溶表达量占菌体总蛋白的45% 以上; 表达蛋白利用Celating SepharoseTMFast Flow金属螯合层析介质、Q Sepharose High performance阴离子交换层析介质以及Superdex 200 prep grade分子筛进行纯化,采用SephadexTMG - 25 Fine介质进行脱盐,纯化的EGF蛋白纯度达到95% ,为下一步活性试验提供了蛋白质纯品。

摘要：为了利用特殊表达载体在大肠埃希氏菌中表达融合表皮生长因子(EGF)并进行纯化工艺研究,试验采用PCR扩增EGF,克隆至p ET-SUMO-T载体中,构建重组表达质粒p ET-SUMO-TEGF,转化大肠埃希氏菌(E.coil)BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的蛋白经SDS-PAGE分析,利用Celating SepharoseTMFast Flow金属螯合层析介质、Q Sepharose High performance阴离子交换层析介质以及Superdex 200 prep grade分子筛对表达蛋白进行纯化,期间采用SephadexTMG-25 Fine介质进行脱盐、SUMO蛋白酶切割His.tag标签。结果表明:重组质粒经PCR鉴定及测序证明构建正确;表达的EGF蛋白分子质量为6 ku,主要以可溶形式表达,表达量占菌体总蛋白的45%以上;纯化的EGF蛋白纯度达到95%。说明成功在大肠埃希氏菌中表达并经过简易工艺纯化了重组EGF。

原核表达 篇8

1 资料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种、质粒

BL21购自Tiangen公司;D H 5α由笔者所在的实验室提供;pET28a(+)和pG EX-4T-1-FA A P亦由实验室保存。

1.1.2 主要试剂仪器

D 2000 plus D N A ladder购自Solarbio公司;SV M iniprepsD N A Purification System(A 1460)购自Prom ga公司;IPTG、Ex Taq、N co I、N ot I和Pst I购自Takara公司;酵母抽提物、蛋白胨购自O xoid公司;ProBond Purification System购自invitrogen公司;H is-Tag单克隆抗体购自N ovagen;预染SD S-PA G E低分子量标准蛋白质购自长沙欧迈生物科技有限公司;碱磷酶标记抗小鼠Ig G购自北京中杉金桥生物技术有限公司;弗氏不完全佐剂(incom plete freund’s adjuvant,IFA)、弗氏完全佐剂(com plete freund’s adjuvant,CFA)为G ibico公司产品;Bio-R ad公司凝胶电泳仪;U V P公司凝胶成像系统。

1.1.3 实验动物

性成熟昆明白雄性小鼠,体重30 g左右,购自中南大学湘雅医院动物实验部。

1.2 方法

1.2.1 pET 28a-FA A P-H is原核表达载体的构建

载体构建见图1。pG EX-4T-1-FA A P以EcoR I和N ot I双酶切,将所得FA A P片段定向克隆于pET-28a(+)载体中,构建FA A P全长基因的原核表达载体pET-28a(+)-FA A P。为去除载体上H is Tag后面多余序列对表达蛋白的影响,合成引物N co I-hisFA A P:5'-CCA TG G G CA G CA G CCA TCA TCA TCA TCATCA CA TG A G TC-3'和FA A P-R:5'-G G G CTCG A G G CTCTG A TA G TCTTG G A TCTA-3';PCR条件为94℃30 s、60℃45 s、72℃1 m in,25个循环;72℃延伸1m in。通过PCR扩增获得N端带有6个H is的FA A P基因片段,以N co I单酶切,连接于预先用N co I单酶切pET28a(+)-FA A P载体上。连接产物用CaCl2化学法通过热击转化至E.coli D H 5α菌株中,涂板后挑取单菌落于Luria-Bertani(LB)液体培基(含卡那霉素10 m g/L)中培养过夜,碱裂解法提取质粒,进行PCR、EcoR I单酶切和N co I、Pst I双酶切等初步鉴定。PCR检测引物为FA A P-1:5'-G TA TG CCG CCA A G A A G A T-3';FA A P-2:5'-TCA G TG CCA G TCA GA A CG-3'。初步鉴定正确后送到三博远志公司测序,测序正确的质粒命名为pET28a-FA A P-H is。

1.2.2 pET 28a-FA A P-H is融合蛋白的诱导表达及鉴定

将质粒pET28a-FA A P-H is转化至大肠杆菌BL21(D E3),挑取单菌落接种于LB液体培养基(含卡那霉素10 m g/L)过夜培养,再按1∶100放大培养至O D 600为0.6～0.8时,加入终浓度1 m M的IPTG诱导FA A P重组基因的表达。分别诱导0、1和4 h后,收集菌体,悬浮于上样缓冲液中,煮沸裂解5m in,13 000×g离心5 m in,取上清进行12%SD S-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylam ide gel electropheresis,SD S-PA G E)检测,考马斯亮蓝染色检测重组蛋白的表达。经不同时间的IPTG诱导的菌体裂解液在SD S-PA G E电泳后,将蛋白转到PV D F(poly vinylidene fluoride,聚偏二氟乙烯)膜上,用3%牛血清白蛋白(Bovine Serum A lbum in,BSA)-TTBS(含0.625%Tween20的TBS)于37℃封闭1 h,加入H is-Tag鼠单克隆抗体37℃孵育1 h,洗脱后加入碱磷酶标记抗小鼠Ig G 37℃温育30 m in,洗涤后在N BT/BCIP底物中显色。

1.2.3 H is-FA A P融合蛋白的纯化

表达有H is-FA A P融合蛋白的菌体经过离心后收集沉淀,重悬于经37℃预热的盐酸胍裂解缓冲液(6 m ol/L盐酸胍,20m M N a PO4p H 7.8,500 m M N a Cl)中,室温摇动10 m in后放置于冰上超声破碎菌体1 m in,3 000×g室温离心15 m in,将上清加入已经过变性吸附缓冲液(8m ol/L尿素,20 m M N a PO4pH 7.8,500 m M N a Cl)平衡的树脂中,室温摇动60 m in,500×g室温离心2m in后弃上清。在沉淀的树脂中加入40 m L变性吸附缓冲液室温震摇2 m in,500×g室温离心2 m in后弃上清,重复1次。沉淀的树脂加入变性清洗缓冲液(8 m ol/L尿素,20 m M N a PO4,500 m M N a Cl)室温震摇2 m in,500×g室温离心2 m in,依次经变性清洗缓冲液pH 6.0和pH 5.3洗涤各2次。将处理好的树脂转入柱床中,加入变性洗脱缓冲液(8 m ol/L尿素,20 m M N a PO4,pH 4.0,500 m M N a Cl),室温放置5m in,收集组分在20 m M pH 8.0的Tris-H Cl缓冲液中4℃透析过夜。各步收集的样品进行12%SD S-PA G E检测。

1.2.4 多克隆抗体的制备和特异性检测

首次免疫前,小鼠剪尾采血100μL。取纯化FA A P蛋白和弗氏完全佐剂(FCA/CFA)混合,超声波乳化后注射于实验小鼠背部皮下,每只小鼠约注入100μg目的蛋白。分别在首次免疫2周和3周后,用FA A P纯化蛋白与弗氏不完全佐剂(IFA/FIA)混匀进行第2次和第2次免疫。最后1次免疫1周后剪尾采血,采集的血液在4℃冰箱静置过夜,低速离心后收集血清,加入50%甘油,置于-20℃保存。以制备的抗FA A P免疫鼠血清作为一抗,通过W estern blotting检测纯化的H is-FA A P蛋白和人血管内皮脐静脉细胞中FA A P蛋白的表达。用免疫前小鼠血清作为一抗的对照。

2 结果

2.1 pE T28a-FA A P-H is表达载体的构建

FA A P基因全长1 518 bp,在936和1211位处分别有一个Pst I和N co I限制性酶切位点。由图1可见,在pET-28a-FA A P载体用N co I酶切后,FA A P基因上游片段和包括EcoR I位点在内的多克隆位点被去除,为防止载体酶切不完全对下步实验的干扰,在pET-28a-FA A P载体用N co I酶切后首先自连,转化大肠杆菌D H 5α后,挑选去除了上游FA A P基因片段的质粒扩增后,作为载体再与带有H is的FA A P基因连接转化后,进行初步鉴定;阳性重组子应具有如下特点:不能被EcoR I酶切(结果没有显示),PCR检测产物片段大小约528 bp(见图1A),和经N co I和Pst I双酶切后主要产生大小约5.6 kb和936 bp片段(见图1B)。将符合上述特点的重组子进一步测序,最终得到序列正确的pET28a-FA A P-H is表达载体。

2.2 H is-FA A P融合蛋白的表达

带有p ET28a-FA A P-H is质粒的大肠杆菌BL21(D E3)菌株,在经过0.1 m M IPTG诱导1 h和4 h后检测到FA A P融合蛋白表达(图3,泳道5和2),该蛋白的分子量与H is-FA A P融合蛋白55 kD的大小相符。而在诱导0 h(图3,泳道8)没有检测到FA A P融合蛋白表达;另外,带有BL21,BL21-pET28a(+)质粒的大肠杆菌(图3,泳道3、4、6、7、9和10)没有检测到FA A P融合蛋白表达。

2.3 H is-FA A P融合蛋白的纯化

以上述优化的诱导条件实现H is-FA A P融合蛋白的大量表达,收集菌体,超声波裂解后离心取沉淀,将菌体裂解沉淀重悬于盐酸胍缓冲液中裂解数分钟后,离心后向上清加入已平衡的树脂,并用变性清洗缓冲液清洗后,得到纯度较高的目的蛋白。将纯化的蛋白透析过夜后,得到较高浓度的纯化的目的蛋白。从图4的2～7泳道可以看出,洗涤液中没有明显的FA A P融合蛋白质条带,可判断FA A P融合蛋白质大部分已经被吸附到ProBond树脂上。通过8～10泳道可以看出FA A P融合蛋白质已经从ProBond树脂上洗脱下来,从而达到纯化的目的,并可以判断出第2次洗涤时,洗脱下来的FA A P融合蛋白质量达到峰值。

2.4 H is-FA A P融合蛋白的特异性检测

将纯化的FA A P蛋白进行SD S-PA G E电泳,将1和2泳道的胶转膜,转膜后1～3泳道用考马斯亮蓝染色液染色。图5A结果显示,在转膜后凝胶1泳道中的M arker和2泳道中的FA A P纯化蛋白大部分消失,而未转膜的3号泳道上的55 kD的FA A P条带清晰,表明1和2泳道中H is-FA A P融合蛋白质已经成功转移到二氟化树脂(polyvinylidene fluoride,PV D F)膜上。采用鼠抗H is单克隆抗体检测PV D F膜上2泳道,结果显示出现特异性55 kD目的条带,与预计的H is-FA A P融合蛋白大小完全相符(见图5B)。

2.5 FA A P鼠多抗的特异性检测

W estern blotting结果显示,以制备的抗FA A P免疫鼠血清作为一抗可检测到纯化的H is-FA A P蛋白;同时人血管内皮脐静脉细胞中在大小约55 kD处出现了特异蛋白条带(见图6)。用免疫前小鼠血清作为一抗的对照中没有检测到特异性条带,说明所制备的抗FA A P抗体与纯化的和细胞中天然的FA A P蛋白均能够特异性结合。

3 讨论

小鼠FA A P与其同源蛋白在小鼠和其他哺乳动物各种器官、组织和细胞中广泛表达,并且在许多肿瘤细胞中还出现了高表达的现象[1,7]。笔者的前期研究结果显示,细胞中FA A P与LR表达量呈现正相关性,其与LR对细胞黏附影响类似,也能够抑制细胞的黏附[11]。小鼠LR与肿瘤细胞的黏附和转移有关[12],其可以作为一些肿瘤细胞,例如乳腺癌细胞等的标记性蛋白分子[13]。FA A P在肿瘤细胞的研究尚未见报道。

原核表达 篇9

试验通过对水牛Sox2基因进行体外原核表达研究, 为进一步研究其特性和功能、阐明干细胞调控网络和制备水牛Sox2多克隆抗体奠定基础。

1 材料

普通质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、DNA Marker、BL21 (DE3) 感受态细胞、增强型HRP-DAB底物显色试剂盒、羊抗鼠IgG-HRP, 天根生化科技 (北京) 有限公司生产;限制性内切酶 (BamHⅠ、Hind Ⅲ) 、T4 DNA连接酶, TaKaRa公司生产低分子质量蛋白, Fermentas公司生产;Anti-Sox2 Antibdy, Santa Cruz Biotechnology Inc公司生产。

2 方法

2.1 原核表达载体的构建

用限制性内切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ对含有目的基因的重组质粒pMD18-T- Sox2 (由广西大学动物繁殖所提供) 和原核表达载体pET-32a (+) 分别进行双酶切, 对酶切产物进行胶回收, 于16 ℃用T4 DNA连接酶连接12 h, 再转化感受态DH5α细菌, 获得目的基因原核表达载体pET- Sox2。

2.2 目的基因的诱导表达

用目的基因原核表达载体pET-Sox2转化表达菌株BL21 (DE3) 感受态细胞, 37 ℃恒温摇床培养, 当菌液OD值≈0.6时, 加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/L , 继续培养3～4 h, 收集菌体, 进行SDS-PAGE电泳, 分析目的基因的表达情况。

2.3 目的蛋白的Western-blot检测

收集阳性菌液, 加入2×SDS上样缓冲液混匀;100 ℃煮沸5 min后冰浴10 min, 室温1 200 r/min离心6 min, 进行12% SDS-PAGE电泳;然后以80 mA恒流30 min半干转入NC膜;再用含有3%脱脂奶粉的封闭液于4 ℃封闭过夜;然后用一抗 (1∶500) 孵育1.5～2.0 h, 二抗 (1∶200) 孵育1 h;最后用现配制的DAB显影液显影。

3 结果

3.1 表达载体pET- Sox2的构建与检测

对含有水牛Sox2基因的重组质粒pMD18-T- Sox2进行双酶切后, 定向克隆入原核载体pET-32a (+) , 连接产物pET-Sox2经1%琼脂糖凝胶电泳, 在6 866 bp处有目的条带 (见图1) ;再对pET-Sox2进行双酶切和PCR鉴定, 可以看到966 bp处有目的条带 (见图2) , 与预期结果相符。

M.超螺旋DNA标记物;1.pET-32a (+) 质粒;2.pET- Sox2重组质粒。

M.DNA Marker Ⅲ;1.pET- Sox2双酶切;2.pET- Sox2 PCR检测。

3.2 目的基因Sox2的诱导表达

将重组质粒pET-Sox2转化E.coli BL21 (DE3) , 在菌液OD值≈0.6时, 加入IPTG进行目的蛋白的诱导表达, 再取样进行SDS-PAGE分析。空载体pET-32a (+) 带有硫氧还蛋白标签 (Trx·Tag) 、组氨酸标签 (His·Tag) 和S标签 (S·Tag) , 其融合标签蛋白大小为20.4 ku。因此, 对空载体pET-32a (+) 进行IPTG诱导后, 在20.4 ku处有明显的特异性条带。Sox2蛋白的大小为34.6 ku, 所以对pET-Sox2进行IPTG诱导后, 在55.0 ku处有明显的特异性条带, 与预期结果相符 (见图3) 。

M.低分子质量标准;1.BL21 (DE3) 菌体蛋白;2.未诱导的pET-Sox2;3, 4.诱导表达的pET-32a (+) 空载体;5, 6.诱导表达的pET-Sox2。

3.3 目的蛋白Sox2的Western-blot检测

对pET-Sox2进行IPTG诱导表达后, 用特异性Sox2抗体进行Western-blot检测, 有特异性条带出现 (见图4) , 表明Sox2基因在E.coli BL21 (DE3) 中能正确表达。

4 讨论

载体pET-32a (+) 含有Amp+抗性基因, 可以用来进行药物抗性筛选;含有3个融合标签, 即Trx·Tag、His·Tag和S·Tag。其中, His·Tag可以特异性地与某些金属离子 (如Ni2+、Cu2+、Co2+、Zn2+) 螯合, 是常用来纯化蛋白的融合标签, 特别是那些以包涵体形式表达的蛋白, 它可以将蛋白在完全变性条件下溶解后进行亲和纯化。试验选择pET-32a (+) 作为基础载体, 以便于后续获得纯化的Sox2蛋白, 并进行下一步研究。在对pET- Sox2的诱导表达中, 可以看到对于没有诱导的pET- Sox2, 在55.0 ku处也出现了较弱的特异性条带, 这是因为即使在没有 IPTG 存在的情况下, 也会有少量lacUV5 启动子表达的 T7 RNA聚合酶, 因此存在目的蛋白的本底表达。另外, 在对pET- Sox2进行诱导时, 为了使目的蛋白大量表达, 添加IPTG的时间一般控制在宿主菌BL21 (DE3) 快速生长期至对数生长期, 以获得足够大量的细菌。可以将目的基因的诱导表达过程分为两个阶段:第一阶段, 不添加诱导剂, 由于缺乏T7 RNA聚合酶, pET载体上的目的基因基本上处于沉默状态;第二阶段, 添加诱导剂IPTG, 从而启动BL21 (DE3) 菌株的lacUV5启动子对T7 RNA聚合酶的转录, 再进一步启动pET-32a (+) 载体上的T7lac启动子对目的基因的转录, 目的基因开始快速而高效地表达。

试验成功地利用E.coli诱导表达了Sox2蛋白, 并且经过Western-blot检测, 表明所表达的Sox2蛋白具有较强的反应原性, 能够顺利进行水牛Sox2多克隆抗体的制备以及展开Sox2蛋白的结构特性和功能研究。

摘要：水牛Sox2基因对体内胚胎的早期发育至关重要, 它是重要的多能性干细胞 (iPS细胞) 标记基因之一, 试验通过双酶切重组质粒pMD18-T-Sox2, 将水牛Sox2基因定向克隆入原核载体pET-32a (+) , 成功构建了原核表达载体pET-Sox2, 然后利用IPTG诱导, 获得诱导表达蛋白, 并经过SDS-PAGE电泳分析和Western-blot检测。结果表明:诱导表达蛋白为特异性Sox2蛋白。

关键词：Sox2基因,原核表达,载体,构建,诱导表达

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原核表达 篇10

神经细胞粘附分子( neural cell adhesion mole- cule,NCAM) 属于免疫球蛋白超家族细胞粘附分子的成员之一,在神经系统的发育、再生及可塑性调节等过程中发挥重要作用,与神经精神疾病的发生、发展密切相关［1 － 3］。按分子量大小NCAM主要分为NCAM120、NCAM140、NCAM180三种亚型,它们的胞外段结构均由5个免疫球蛋白样( Ig) 结构域和2个纤维连接蛋白Ⅲ( fibronectin,FNⅢ) 结构域构成。 NCAM120通过糖基磷脂酰肌醇( glycosylphosphati- dylinositol,GPI) 锚定在细胞膜上,主要表达于胶质细胞表面。NCAM140和NCAM180均为跨膜蛋白, NCAM140在胶质细胞、神经元轴突和未成熟神经元的脂伐上富集,NCAM180则主要存在于成熟神经元的突触后致密物［2 － 3］。NCAM的很多功能都依赖于对细胞内信号转导通路的调节,已有研究发现, NCAM ICD可以与酪氨酸激酶受体B( tyrosine kinase receptor B,Trk B ) 、接头蛋白相关复合物3 ( adaptor protein complex 3,AP3) 、突触发动相关蛋白( syndap- in) 等结合伴侣相互作用发挥调节突触可塑性、突触小泡循环通路等作用［4 － 6］。目前国内外针对NCAM ICD的研究不够深入,本实验首次利用p ET29b原核表达载体成功构建小鼠NCAM140 ICD和NCAM180 ICD表达质粒,并实现其在原核细胞中表达及纯化, 从而为进一步明确NCAM ICD生物学作用及机制奠定基础。

1材料与方法

1. 1材料

1. 1. 1实验材料

大肠杆菌E. coli BL21( DE3) 菌株、E. coli Nov- ablue菌株、p ET29b原核表达载体购自美国Novagen公司; 小鼠脑c DNA文库购于Clontech公司; E. coli BL21( DE3) 、E. coli Novablue感受态细胞由作者实验室制备; 引物合成由大连万泽有限公司完成; DNA序列测定由上海生工生物工程有限公司完成; 目的蛋白的质谱鉴定由深圳华大基因公司完成。

1. 1. 2试剂

NdeⅠ、Xho Ⅰ、Hpa Ⅰ、Pst Ⅰ、Xba Ⅰ 等限制性内切酶、PCR反应试剂盒购自大连Ta KaRa生物有限公司; p JET PCR克隆试剂盒、快速DNA连接试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、ECL发光试剂盒、预染蛋白分子量标准购自Thermo公司; 异丙基硫代- β - D半乳糖苷( IPTG) 、氨苄青霉素( Amp) 、卡那霉素( Kan) 、甲叉双丙烯酰胺购自Sigma公司; 大鼠抗小鼠NCAM单克隆抗体购自美国BD公司; HRP标记的羊抗大鼠Ig G购自美国Abbkine公司; Ni - NTA琼脂糖亲和层析填料购自德国Qiagen公司。

1. 1. 3仪器设备

美国Thermo公司Multiskan Ascent酶标仪; 日本Takara公司PCR仪; 日本日立高速冷冻离心机; 上海福玛实验设备公司恒温培养箱; 美国伯乐公司凝胶成像仪; 大连竞迈生物科技公司半干式转移电泳仪、紫外投射凝胶成像系统; 宁波海曙科生仪器厂超声波细胞破碎仪。

1. 1. 4培养基

LB液体培养基: 10 g / L氯化钠,10 g / L胰蛋白胨,5 g /L酵母提取物。使用前加入对应的抗生素。

1. 2方法

1. 2. 1小鼠NCAM ICD克隆载体构建

根据小鼠NCAM ICDs的编码序列设计引物,并在上下游引物中分别加入NdeⅠ和XhoⅠ限制性内切酶酶切位点。上游引物( F) : 5’- AACATATGGA- CATCACCTGCTACTTCC - 3 ’,下游引物( R) : 5 ’- AACTCGAGTGCTTTGCTCTCATTCTC - 3 ’,小鼠NCAM140 ICD和NCAM180 ICD均可使用该引物。 以小鼠脑c DNA文库为模板,经PCR分别扩增出NCAM140 ICD和NCAM180 ICD。反应条件设定为: 95℃ 30 s、95℃ 20 s、55℃ 30 s、72℃ 90 s,30个循环。PCR产物经1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定后,利用DNA凝胶回收试剂盒纯化,加入到快速T4 DNA连接酶反应体系,2个PCR产物分别与p JET1. 2线性平端克隆载体室温连接。连接产物分别转化E. coli Novablue感受态细胞,37℃ 培养过夜,通过Amp抗性筛选获得阳性克隆菌落。挑取单菌落,接种于3 ml LB培养基( 含50 !g / ml Amp ) ,37℃ 振荡过夜。 采用碱裂解法提取质粒DNA,p JET1. 2 - NCAM180 ICD克隆质粒经Pst Ⅰ 酶切鉴定,p JET1. 2 - NCAM140 ICD克隆质粒由PstⅠ和XbaⅠ酶切鉴定, 质粒DNA由上海生工生物工程有限公司进行测序分析。

1. 2. 2小鼠NCAM ICD表达载体构建

p JET1. 2 - NCAM180 ICD和p JET1. 2 - NCAM140 ICD重组质粒测序正确后,将二者和p ET29b表达载体分别用NdeⅠ及XhoⅠ双酶切,进一步纯化后,分别与快速T4 DNA连接酶室温连接,然后转化E. coli Novablue感受态细胞,37℃ 培养过夜,通过Kan抗性筛选获得阳性克隆菌落。挑取单菌落,接种于3 ml LB培养基( 含100 !g / ml Kan) ,37℃ 振荡过夜。提取质粒后,p ET29b - NCAM180 ICD和p ET29b - NCAM140 ICD表达质粒分别用PstⅠ与HpaⅠ酶切鉴定。

1. 2. 3目的蛋白的诱导表达

将酶切鉴定正确的p ET29b - NCAM180 ICD及p ET29b - NCAM140 ICD表达质粒及p ET29b空载体分别转化E. coli BL21( DE3) 感受态细胞,获得BL21 ( DE3 ) /p ET29b - NCAM180 ICD、BL21 ( DE3 ) / p ET29b - NCAM140 ICD、BL21 ( DE3 ) / p ET29b菌株。37℃培养过夜,通过Kan抗性筛选获得阳性克隆菌落。挑取单菌落,接种于3 ml LB培养基( 含100 μg / ml Kan) ,37℃ 震荡过夜后,将菌液分别按1∶ 100接种到20 ml LB培养基( 含100 !g / ml Kan) , 37℃ 振荡培养至OD595处于0. 4 ~ 0. 6之间时( 约3 ~ 4 h) ,加入终浓度为0. 5 mmol / L的IPTG,30℃ 培养6 h,收集细菌,加入20 !l 5 × 上样缓冲液,100℃ 煮沸10 min,4℃、12 400 g离心1 min。NCAM180 ICD和NCAM140 ICD分别经10% SDS - PAGE和15% SDS - PAGE分离。电泳结束后利用考马斯亮蓝进行染色,脱色后观察表达结果。

1. 2. 4目的蛋白的纯化

将BL21 ( DE3 ) /p ET29b - NCAM180 ICD和BL21( DE3) / p ET29b - NCAM140 ICD单菌落分别接种到LB培养基( 含100 !g /ml Kan) 中,37℃ 振荡过夜后,将2 ml过夜菌接种于200 ml LB培养基( 含100 !g / ml Kan) 中,37℃ 振荡培养3 h后加入终浓度为0. 5 mmol/L的IPTG,30℃ 诱导培养6 h。4℃、 4 500 g,离心15 min收集细菌,用10 ml细菌裂解液( 20 mmol/L Tris - HCl,0. 5 mol/L Na Cl,20% 甘油, 1 mmol / L PMSF) 充分重悬细菌,超声破碎15 min ( 工作30 s,间歇30 s) 。4℃、12 400 g,离心20 min。 取上清加入Ni - NTA亲和树脂,4℃ 充分结合15 min,待上清全部通过亲和层析柱后,用20 ml洗脱液( 20 mmol/L Tris - HCl,0. 5 mol/L Na Cl,20% 甘油,30 mmol/L咪唑,1 mmol/L PMSF) 去除非特异性结合蛋白,最后用5 ml洗脱液( 20 mmol/L Tris - HCl,0. 5 mol / L Na Cl,20% 甘油,200 mmol / L咪唑, 1 mmol / L PMSF) 洗脱,获得目的蛋白,分别经10% SDS - PAGE和15% SDS - PAGE分离,经考马斯亮蓝染色,脱色后观察纯化结果。

1. 2. 5纯化的His - NCAM ICD蛋白的鉴定

将诱导表达的NCAM180 ICD和NCAM140 ICD目的蛋白分别经10% SDS - PSGE和15% SDS - PAGE分离,半干转移法转移蛋白质到硝酸纤维素膜,9 V恒压分别转膜,用10% 脱脂奶粉4℃ 封闭过夜,TBST洗膜3次,每次10 min。加入大鼠抗小鼠NCAM抗体( 1 ∶ 3 000 ) 室温孵育2 h,TBST洗膜3次,每次10 min。加入标记有辣根过氧化物酶的羊抗大鼠Ig G二抗( 1∶ 10 000) ,室温孵育1 h,TBST洗膜3次,每次10 min,ECL显色观察结果。纯化的目的蛋白经蛋白电泳及考马斯亮蓝染色,切胶后,制备质谱样品送华大基因公司进行质谱鉴定。

2结果与分析

2. 1小鼠NCAM ICDs克隆载体构建及鉴定

以小鼠脑c DNA文库为模板,应用设计的引物进行PCR扩增,将得到的PCR产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳分析,分别于1 200 bp和357 bp处获得特异性片段( 图1) 。重组质粒p JET1. 2 - NCAM180 ICD经PstⅠ酶切,p JET1. 2 - NCAM140 ICD经PstⅠ 和Xba Ⅰ 酶切后行1% 琼脂糖凝胶电泳,分别于1 375 bp和2 773 bp,2 606 bp和741 bp处获得与预期相符的条带( 图2) ,并进行DNA测序鉴定。

2. 2小鼠NCAM ICD表达载体构建和鉴定

将测序正确的重组质粒p JET1. 2 - NCAM180 ICD和p JET1. 2 - NCAM140 ICD分别用Nde Ⅰ 及XhoⅠ进行双酶切,与经相同酶切的p ET29b表达载体连接后得到p ET29b - NCAM180 ICD和p ET29b - NCAM140 ICD表达质粒,均用Hpa Ⅰ 酶切并进行1% 琼脂糖凝胶电泳后分别于1 392 bp和5 007 bp, 1 392 bp和4 206 bp获得条带( 图3) 。

2. 3 His - NCAM ICD蛋白的诱导表达和纯化

IPTG诱导NCAM180 ICD和NCAM140 ICD蛋白在E. coli BL21( DE3) 中大量表达( 图4) ,利用Ni - NTA亲和层析填料对目的蛋白进行纯化,分别经10% SDS - PAGE和15% SDS - PAGE电泳进行分离,经考马斯亮蓝染色,脱色后分别可在80 k Da和25 k Da上方出现条带( 图5) 。

图 2 重组质粒 p JET1． 2 － NCAM180 ICD 和p JET1． 2 － NCAM140 ICD 的酶切鉴定M． 1 kb DNA 分子量标准; 1． PstⅠ酶切 p JET1． 2 － NCAM180 ICD重组质粒; 2． PstⅠ和 XbaⅠ酶切 p JET1． 2 － NCAM140 ICD 重组质粒。Figure 2 Analysis of the recombinant plasmid p JET1． 2 －NCAM180 ICD and p JET1． 2 － NCAM140 ICD bydigestion of restriction enzymesM． DNA ladder marker; 1． Ｒecombinant plasmid p JET1． 2 －NCAM180 ICD digested by PstⅠ; 2． Ｒecombinant plasmid p JET1． 2－ NCAM140 ICD digested by PstⅠ and XbaⅠ．

图 3 重组质粒 p ET29b － NCAM180 ICD 和p ET29b － NCAM140 ICD 酶切鉴定M． 1 kb DNA 分子量标准; 1，2． HpaⅠ酶切的 p ET29b － NCAM180ICD 重组质粒和 p ET29b － NCAM140 ICD 重组质粒。Figure 3 Analysis of the recombinant plasmid p ET29b －NCAM180 ICD and p ET29b － NCAM140 ICD bydigestion of restriction enzymeM． 1 kb DNA ladder marker; 1，2． Ｒecombinant plasmid p ET29b －NCAM180 ICD and p ET29b － NCAM140 ICD digested by Hpa Ⅰ，respectively．

2. 4纯化的His - NCAM ICD蛋白的鉴定

使用大鼠抗小鼠NCAM单克隆抗体对纯化的His - NCAM180 ICD和His - NCAM140 ICD蛋白进行Western blot鉴定,结果显示分别约在80 k Da和25 k Da稍上方出现条带,与SDS - PAGE凝胶结果一致( 图6) 。同时,对纯化后的蛋白行质谱分析,经与小鼠蛋白质数据库对比后发现,蛋白为NCAM蛋白片段的可能性分值大于70分,从而在蛋白水平证实目的蛋白。

图 4 诱导表达 His － NCAM ICD 蛋白的 SDS － PAGE 分析M． 预染蛋 白分 子量 标准; 1、6． BL21 ( DE3 ) / p ET29b; 2． BL21( DE3) /p ET29b － NCAM180 ICD 未诱导表达; 3． BL21 ( DE3) /p ET29b － NCAM180 ICD 诱导表达所获总蛋白; 4． BL21 ( DE3 ) /p ET29b － NCAM180 ICD 诱导表达获得的上清; 5． BL21 ( DE3 ) /p ET29b － NCAM180 ICD 诱导表达获得的沉淀; 7． BL21 ( DE3 ) /p ET29b － NCAM140 ICD 未诱导表达; 8． BL21 ( DE3 ) / p ET29b －NCAM140 ICD 诱导表达所获总蛋白; 9． BL21 ( DE3 ) / p ET29b －NCAM140 ICD 诱导表达获得的上清; 10． BL21 ( DE3) / p ET29b －NCAM140 ICD 诱导表达获得的沉淀。Figure 4 SDS － PAGE analysis of expression ofHis － NCAM ICD proteinM． Prestained protein marker; 1，6． BL21 ( DE3 ) / p ET29b; 2． With-out IPTG induced His － NCAM180 ICD protein; 3 － 5． Total protein，soluble fraction or inclusion bodies of His － NCAM180 ICD proteininduced by IPTG，respectively; 7． Without IPTG induced His －NCAM140 ICD protein; 8 － 10． Total protein，soluble fraction or in-clusion bodies of His － NCAM140 ICD protein induced by IPTG，re-spectively．

图 6 纯化 His － NCAM ICD 蛋白的 Western blot 鉴定M． 预染蛋白分子量标准; 1． His － NCAM180 ICD 蛋白; 2． His －NCAM140 ICD 蛋白。Figure 6 Western blot identification of purifiedHis － NCAM ICD proteinM． Prestained protein marker; 1． His － NCAM180 ICD protein; 2．His － NCAM140 ICD protein．

3讨论

NCAM结构和含量异常与人类神经系统发育异常、退行性及损伤性疾病紧密相关,如自闭症、精神分裂症、阿尔兹海默病和脑卒中等［7 － 8］。在NCAM的3种主要亚型中NCAM140和NCAM180为跨膜糖蛋白,由于选择性剪接,NCAM180 ICD编码基因比NCAM140 ICD编码基因多一个外显子,因此两者在功能和结构上有一定差异［9 － 10］。在各种外界信号分子作用下,NCAM ICD通过激活或抑制细胞内结合伴侣启动一系列信号途径。新近的研究表明, NCAM140 ICD可通过与胞吐复合体、泛素结合酶1 ( ubiquitin - fold modifier - conjugating enzyme - 1, Ufc1) 等蛋白相互作用调节神经细胞突起的生长和分支的新生［1，11 － 12］。NCAM180 ICD可以与动力蛋白( dynein) 、鸟嘌呤核苷酸交换因子A( guanine nu- cleotide exchange factor A,GEF A) 等胞内蛋白结合参与突触稳定性的维持和记忆的形成［13 － 14］。所以, 通过分别研究NCAM140 ICD和NCAM180 ICD能够更加清晰地了解NCAM的功能,明确其在精神分裂症、阿尔兹海默病等精神神经疾病的发生、发展中扮演的角色,从而为相关疾病的治疗奠定理论基础。

为此,本研究采用基因工程的方法,选用p ET29b原核表达载体,该表达载体含有高效的原核表达启动子和组氨酸标签,能够在E. coli BL21 ( DE3) 细菌中高效表达外源蛋白,便于蛋白的分离和纯化。我们根据小鼠NCAM ICD的编码序列设计特异性引物,经测序正确后,成功构建p ET29b - NCAM ICDs表达质粒,并获得纯化的可溶性NCAM140 ICD及NCAM180 ICD蛋白。可溶性蛋白具有正确的空间结构和较高的生物学活性,避免了包涵体蛋白复性造成的蛋白结构异常、活性下降和含量减低。

本实验成功构建了小鼠p ET29b - NCAM140 ICD及p ET29b - NCAM180 ICD原核表达载体,经纯化获得了分子量分别为25 k Da和80 k Da的可溶性蛋白,为深入探讨NCAM的结构和功能提供了可靠的研究手段和实验基础。

摘要：[目的]构建小鼠神经细胞粘附分子胞内段(NCAM ICD)原核表达载体,诱导蛋白表达,并进一步对蛋白进行纯化和鉴定。[方法]以小鼠脑c DNA文库为模板,采用PCR技术分别扩增NCAM跨膜亚型NCAM140及NCAM180的胞内片段,连接p JET1.2克隆载体。经DNA测序正确后,构建pET29b-NCAM140 ICD及pET29b-NCAM180 ICD原核表达质粒,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导目的蛋白的表达,经Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱纯化,以Western blot和质谱的方法鉴定表达的蛋白。[结果]成功构建了pET29b-NCAM140 ICD及pET29b-NCAM180 ICD原核表达质粒,并用Western blot及质谱法证实NCAM140 ICD及NCAM180 ICD蛋白的表达,分子量分别约为25 kDa及80 k Da。[结论]该方法成功构建小鼠pET29b-NCAM140 ICD及pET29b-NCAM180 ICD原核表达载体,实现了其蛋白表达,为进一步研究NCAM ICD的功能奠定了基础。