植物表达

植物表达（共9篇）

植物表达 篇1

摘要：目的:构建银杏CONSTANS基因的表达载体。方法:PCR扩增CO基因得到1.2kb左右的片段, 用BamHⅠ+HindⅢ酶切纯化, 通过T4DNA连接酶连接到植物表达载体pCAMBIA1304上, 并转化到农杆菌LBA4404, 然后进行菌落PCR及酶切鉴定。结果:载体构建成功。结论:构建了GbCO正义链和反义链的植物表达载体pCAMBIA 1304-GbCOs和pCAMBIA 1304-GbCOa, 可用于GbCO基因的转基因功能研究。

关键词：银杏,CONSTANS基因,表达载体构建,转化

CONSTANS (CO) 基因属于光周期途径基因[1], 光周期是影响植物花发育的重要环境因[2], 在植物营养生长阶段, CO在叶和茎顶端开始表达, 它转录的mRNA呈渐进方式积累, 当达到一定域值时, 通过激活其下游靶基因使植物由营养生长向生殖发育转变, 开始植物花的发育[3]。CO影响植物的成花过程, 对花发育有直接和间接促进作用, 成花的早晚主要由CO基因所控制[4]。CO基因可以将光信号转换为开花信号传递给FLOWERING LOCUST (FT) 基因, 它和FT基因都是光周期途径中的关键基因[5,6,7]。

银杏 (Ginkgo biloba) 又名“公孙树”, 为我国独存的珍稀名贵树种, 广泛应用于园林景观、医药、食品、保健等领域;是一种童期特别长的中生代孑遗裸子植物。一般实生苗种植15-20年后才能开花结果, 这给银杏优良品种的选种带来了严重的障碍。

近年来, 通过植物基因工程技术对开花相关基因的遗传改造, 在缩短木本植物的童期研究中已经取得了一定成效。但有关CO基因在木本植物中遗传改造的研究较少。本研究构建了GbCO正义链和反义链的植物表达载体pCAMBIA 1304-GbCOs和pCAMBIA 1304-GbCOa, 可用于GbCO基因的转基因功能研究, 为利用CO基因进行银杏等木本植物的遗传转化创造条件。

1 材料和方法

1.1 材料

植物表达载体pCAMBIA 1304、大肠杆菌 (Escherichia coli) TOP10、农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens) LBA4404, 为作者实验室保存。

限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ, T4 DNA连接酶均购自New England BioLabs (NEB) 公司。PCR体系包括 (Taq酶) 及PCR耗材购自Promega公司。胶回收试剂盒为AxyGen Biosciences产品;pMD-18T Vector 购自TaKaRa 生物工程 (大连) 有限公司;卡那霉素、氨苄青霉素钠盐等购自上海生工有限公司;引物由上海生工有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 GbCO基因酶切位点的引进

以含有GbCO的载体pMD-18T-GbCO菌液为模板 (前期实验获得) , 用加上保护碱基和酶切位点的引物进行PCR扩增 (正义链引物GbCOS-FP 5′-GGAATTCATGAGTATGCCAAAGCTATGTGAT-3′;GbCOS-RP 5′-CGGGATCCTTAAAAAGATGGAACAATCCCATA-3′。反义链引物GbCOA-FP 5′-GGAATTCTTAAAAAGATGGAACAATCCCATA-3′;GbCOA-RP 5′-CGGGATCCATGAGTATGCCAAAGCTATGTGAT-3′) , PCR反应程序:94℃ 3 min, 94℃ 1 min, 62℃ 30 s, 35 cycles, 72℃ 3 min, 72℃ 10 min, 电泳检测扩增目的条带, 分别切胶回收富集正义链和反义链。

1.2.2 GbCO基因植物表达载体的构建及鉴定

植物表达载体pCAMBIA 1304, 正义链和反义链的双酶切反应按照试剂公司提供的酶切体系进行, 37℃水浴保温16h, 取2μL电泳检测酶切效果。

酶切后的正义链和反义链分别与植物表达载体pCAMBIA 1304酶切后的直链进行连接反应, 体系为 (总体积10μL) :pCAMBIA 1304直链1μL, 酶切后正义链/反义链3μL (视片段浓度而定) , 10×Ligation Buffer 1μL, T4 DNA Ligase 1μL, 双蒸水4μL, 16℃水浴连接过夜。

将带有正义链和反义链的植物表达载体pCAMBIA 1304转化到大肠杆菌中, 接种于含有Kan (50 μg/mL) 的LB固体培养基上, 平板倒置于37℃恒温培养箱中培养12～18 h。挑取单菌落检测。

参照《分子克隆实验指南 (第3版) 》质粒提取方法提取pCAMBIA1304-GbCO质粒DNA[8]。

1.2.3 GbCO基因植物表达载体转化农杆菌

参照朱锦辉、权军利等人[9]方法, 挑取根癌农杆菌LBA4404单菌落于YEP液体培养基 (含Rif 40μg/mL) 中, 28℃振荡培养至OD600为0.5左右, 制备农杆菌感受态细胞, 把pCAMBIA1304-GbCO质粒DNA转化到农杆菌感受态细胞, 接种于含有50μg/mL Kan和40μg/mL Rif的YEP固体平板上, 28℃培养约48h, 挑单菌落, 接种于YEP液体培养基中, 28℃振荡培养过夜。以GbCO基因特异性引物进行PCR扩增, 进行菌落PCR检测, 电泳检测目的条带。同时提取pCAMBIA1304-GbCO质粒DNA, 进行BamHⅠ和HindⅢ双酶切, 37℃反应过夜, 电泳检测酶切结果, 进一步进行酶切鉴定。

2 结果与分析

2.1 GbCO基因植物表达载体的构建策略

GbCO基因ORF上没有的限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ两个酶切位点, 而植物表达载体pCAMBIA 1304上有这两个酶切位点, 通过设计引入酶切位点及保护碱基引物, 扩增GbCO基因正义链和反义链, 使其两端含有BamHⅠ和HindⅢ两个酶切位点。利用双酶切和连接重组技术, 把GbCO基因正义链和反义链通过酶切位点BamHⅠ和HindⅢ插入植物表达载体pCAMBIA 1304, 从而构建正义表达载体pCAMBIA 1304-GbCOs和反义表达载体pCAMBIA 1304-GbCOa。

2.2 GbCO基因植物表达载体的构建及鉴定

以含有GbCO的载体pMD-18T-GbCO菌液为模板, 使用引入BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的正义引物、反义引物扩增得到了基因两端带有相应双酶切位点的GbCO基因片段, 测序结果表明正确引入了BamHⅠ和HindⅢ酶切位点。

对植物表达质粒pCAMBIA 1304和克隆扩增得到的带有BamHⅠ和HindⅢ双酶切位点的目的基因片段双酶切。酶切电泳结果如图2, 图2 (a) 显示植物表达质粒pCAMBIA 1304经过酶切后, 由原来的环形或超螺旋结构变成了单一的线性结构, 酶切完全;由图2 (b) 可见GbCO基因酶切后基因条带大小与酶切前的一致, 说明基因未被酶切弥散, 可以进行载体构建连接反应。

将分别酶切后的载体和片段进行连接反应, 转化TOP10感受态细胞, 在含有卡那霉素 (50mg/L) 的LB培养基上筛选转化菌落, 挑取单菌落进行菌落PCR鉴定。PCR产物电泳可见大小约1 200bp的特异条带 (图3, a) , 与预期大小一致, 初步说明pCAMBIA 1304-GbCO植物表达载体构建成功。对PCR为阳性的单菌落进行摇菌培养后提取质粒, 用BamHⅠ和HindⅢ双酶切再次鉴定, 电泳可见两条大小约1.2kb和3.0kb的目的条带 (图3, b) , 证明pCAMBIA 1304-GbCO植物表达载体构建准确。构建的表达载体送往上海生工测序, 结果表明克隆的重组质粒是研究所需的植物表达载体pCAMBIA 1304-GbCO。

(a) 为pCAMBIA 1304载体双酶切图 (ck为双酶切前的载体, 1、2、3为双酶切后的载体) 。 (b) 为GbCO基因正义和反义ORF片段的双酶切图 (M为DNA marker DL2000, 1、2为酶切后, 3、4为酶切前;1、3为正义链, 2、4为反义链) 。

a为菌落PCR结果电泳, b为pCAMBIA 1304-GbCO质粒酶切。

2.3 GbCO基因植物表达载体转化农杆菌

pCAMBIA 1304-GbCO重组质粒转化农杆菌LBA4404感受态细胞, 涂布YEP平板上培养长菌后, 挑取单菌落进行PCR鉴定。选择GbCOS-FP和GbCOA-FP为单菌落检测的上游引物, 通用引物M13 pM4:GTTTT CCCAG TCACG AC为下游引物。得到约1 200bp的特异条带 (图4) , 证明pCAMBIA 1304-GbCO重组质粒已经被成功转入农杆菌LBA4404感受态细胞中, 命名pCAMBIA 1304-GbCO/LBA4404菌落, 可以作为转基因等后续研究之用。

其中, M为DL2000分子量标记;+1为正义链阳性菌落;+2为正义链阴性对照;-1～-3为反义链阴性对照;-4为反义链阳性菌落。

3 讨论

近年来, 关于光周期的研究已有大量报道[10]。光合周期变化是一种诱导植物开花的环境因子之一。在拟南芥光合周期途径中, 现已证明FT、CO和SOC1等基因的表达均受到光合周期节律的调节[11,12,13]。Koornneef M等人通过光周期失活的拟南芥突变体首先筛选得到CO基因[14], 进而对其结构研究证明, CO基因编码一个转录因子调控植物对光合周期的响应, CO是植物光周期途径中的关键基因。

本研究构建了正义表达载体pCAMBIA 1304-GbCOs和反义表达载体pCAMBIA 1304-GbCOa, 为后期该基因遗传转化银杏, 以及CO基因在银杏中的表达提供了条件;为缩短银杏童期, 进行木本植物的开花机制研究, 以及银杏优良品种的选种等方面奠定了基础, 目前该基因遗传转化工作正在进行之中。

植物表达 篇2

RNA干扰技术已广泛应用于沉默基因表达的研究.本文分析烟草花叶病毒(TMV)基因序列,选择设计编码小分子发卡结构RNA(hpRNA)的.cDNA;并根据农杆菌双元载体质粒p2355多克隆位点区限制性酶切位点,两端分别加入XbaI和BamHI酶切位点;分别合成单链DNA复性后插入到p2355上,经PCR、测序验证,表明已成功构建了具有潜在表达烟草花叶病毒siRNA的植物表达载体.图3表1参26

作 者：马欣荣 谈心 刘华玲 张义正 MA Xinrong TAN Xin LIU Hualing ZHANG Yizheng 作者单位：马欣荣,MA Xinrong(四川大学生命科学学院,成都,610064;中国科学院成都生物研究所,成都,610041)

谈心,刘华玲,TAN Xin,LIU Hualing(中国科学院成都生物研究所,成都,610041)

张义正,ZHANG Yizheng(四川大学生命科学学院,成都,610064)

植物表达 篇3

1 抗旱适应性变化

蕨类植物有孢子体和配子体两个独立生活植物体,生活史中有明显的世代交替现象。蕨类植物从孢子萌发到孢子体阶段具备不同的抗旱能力。研究者认为,蕨类孢子体与种子植物相比抗旱力较弱,但配子体比苔藓植物拥有更好的抗旱能力[1,2]。在进化过程中,蕨类植物的适应性也会发生变化,分布在热带地区的部分蕨类物种已经失去了其生活史中的孢子体阶段,而通过无性繁殖产生的配子体不但更适合在干冷的环境下存活,而且比通过无性繁殖产生的孢子体更具耐旱力[3]。

2 形态学应答策略

无论是蕨类植物孢子体还是配子体,还是快速或缓慢失水,都会对植物体造成损伤。干旱胁迫下的形态学变化通常表现为:萎蔫、干枯、叶色变化与内部结构变化等。通常,干旱条件下的植株叶片会逐渐卷曲或折叠,以期用最小叶面积暴露于光下[4,5,6]。因此笔者认为,蕨类植物的形态学变化也是一种干旱适应机制,即植物减小暴露于光下的叶面积避免对植物组织造成光损伤,同时也认为干旱初期叶片的动态变化是植物幼嫩地上部分阻止遭受过度辐射的有效手段。除叶片自主规避光照损伤外,植物在长期进化过程中也形成了特殊的结构用以抵御干旱。如在附生蕨类植物鹿角蕨属(Piatyceium)的多数种进化出两种典型形态差异的叶片:孢子叶和基叶。孢子叶主要作用是光合作用和产生孢子,并密被纤毛,具有防止水分过度流失功能。基叶中的含水量最高可达95%,可在植物缺水时提供水源[7,8]。除孢子体外,多数蕨类植物配子体表面不同程度分布毛状体[9,10],其功能等同于高等植物叶片或蕨类孢子叶表面的纤毛[11],对防止水分流失具有一定作用,但作用效果还需进一步研究。干旱胁迫也可引起植物细胞结构和大小的改变以及细胞容积的显著减少[12]。含水量良好的叶片细胞形状通常很规则,薄壁细胞内胞质充分,相比之下,脱水叶片细胞则有变形、折叠或发生严重的皱缩。干旱导致的氧化胁迫往往会间接造成叶绿体结构遭到破坏和数量减少[13],进而影响光合作用效果,加剧胁迫损伤。气孔在干旱胁迫下的变形甚至损坏尤其明显,有些蕨类植物能够主动采取干旱规避方式适应环境变化,气孔对水分流失非常敏感,在叶片水分含量达到不利情况前即已经完全关闭,以确保在长时间的干旱条件下以保持水分平衡[14]。

3 生理学调控

干旱能够引起细胞质壁分离、膜结构紊乱和ROS积累造成氧化损伤,这些会导致光合受到抑制、代谢紊乱、细胞结构受损,最终表现为植物发育受阻、繁殖力降低和提前衰老甚至死亡,而渗透调节、渗透保护、抗氧化作用和防御系统的清除作用是植物抗旱的重要基础和保护策略。

3.1 渗透调节物的保护作用

对肾蕨(Nephrolepis auriculata)、凤尾蕨(Pteris nervosa)、蜈蚣草(Pteris vittat)、铁线蕨(Adiantum capiuaris)、毛蕨(Cyclosorus interruptus)进行干旱处理,发现叶片相对电导率、叶绿素含量及游离脯氨酸含量等相关生理指标都有显著变化,随着干旱胁迫时间延长,叶绿素含量均呈下降趋势,而相对电导率和游离脯氨酸含量升高,说明脯氨酸在干旱胁迫下有重要调控功能[13]。对开蕨在PEG6000胁迫后,细胞膜透性与胁迫程度呈正相关,可溶性糖和脯氨酸含量也随胁迫的时间延长而累积,说明脯氨酸和可溶性糖是参与对开蕨(Phyllitis japonica)渗透调节的主要物质[6]。近年来,研究发现海藻糖在蕨类抗旱过程中的功能逐渐突显。海藻糖是植物在逆境胁迫条件下大量积累的一类物质,具有稳定细胞结构和蛋白质的功能。自然界,海藻糖的合成是细菌、真菌、低等植物等有机体在胁迫应答中形成的[15],早期的研究认为在高等植物中不存在海藻糖的形成,但目前已发现被子植物密罗木(Myrothamnus flabellifolia)中存在海藻糖的积累[16],在抗旱力极强的蕨类植物Selaginella lepidophylla[17]与卷柏(Selaginella tamariscina)[18]中也被发现,尤其在卷柏抗旱过程中海藻糖含量持续偏高,成为干旱和复水阶段可溶性糖的主要成分。有研究证明,海藻糖在酵母的糖酵解途径和胁迫应答中作为一个重要的调控组分[15],干旱也能诱导转基因烟草(Nicotiana Tabacum)海藻糖的合成,起到渗透保护和稳定细胞结构。这些都说明,海藻糖对蕨类植物抗旱具有重要调控作用,但调控方式很可能是通过海藻糖代谢间接实现的[19]。

3.2 光合作用的变化

干旱造成的重要影响之一就是光合作用受到抑制,主要因为干旱下气孔关闭、叶片膨大率减小、光合代谢减弱、叶片提前衰老和相关养分供应率下降[20]。

干旱能够诱导气孔关闭,植物对水分供应反应敏锐。气体交换测定分析表明,附生蕨类要比陆生蕨类植物有更高的光合水分利用率[14],如附生的巢蕨(Neottopteris nidus)和星蕨(Microsorium punctatum)相对含水量达到70%左右时气孔会完全关闭,此时也保持着比较恒定的Fv/Fm,而陆生的网脉铁角蕨(Asplenium finlaysonianum)和似薄唇蕨(Paraleptochilus decurrens)直至胁迫后期相对含水量至45%,Fv/Fm降低时,气孔才会关闭。干旱能够引起蕨类植物光合原件受损和光合参数的变化[21],而光合原件被破坏同时限制了CO2的吸收和转运,CO2的不足很可能降低植物对光合损伤的敏感性[22]。树蕨(Dicksonia antarctica)和桫椤(Cyathea australis)在高光和干旱胁迫下,对水分流失非常敏感,表现在光合参数如最大羧化速率、最大电子传递速率、光饱和净光合速率和气孔导度的显著降低[23]。干旱胁迫期内,多数蕨类植物的光合代谢通路会受到抑制[24,25],但对于某些特殊生境和特殊形态的蕨类植物如附生蕨类的光合代谢变化会有不同。附生蕨类最重要的适应性之一即在水分流失时启动光合代谢中的景天酸代谢(CAM,crassulacean acid metabolism)。CAM是热带及亚热带干旱及半干旱地区的一些肉质植物所具有的一种光合固定二氧化碳的附加途径,研究者在干旱和高辐射胁迫下的二歧鹿角蕨(Platycerium bifurcatum)中发现此代谢表达[26],并且只在基叶中检测到。虽然二歧鹿角蕨中的功能性CAM比较弱,而且仅限于基叶而不是孢子叶,但苹果酸的昼夜代谢变化也为高等植物中存在古老的CAM系统提供了进一步证据,同时也表明蕨类植物耐旱过程中光合代谢的复杂性。

3.3 ABA调节和抗氧化酶系统的激活

干旱胁迫下内源激素水平的变化调节不可忽视。研究表明,水含量的轻微下降即可导致复苏被子植物Craterostigma wilmsii内源ABA的急速应答[5],极度耐旱的密罗木的离体叶片在脱水条件下ABA含量会显著增加[27]。在复苏蕨类卷柏中,干旱条件下内源ABA的含量提高了3倍多[18],ABA作为卷柏类植物干旱调控的重要因素,在干旱期内的显著积累,也可能是促使可溶性糖和脯氨酸的含量升高的诱因之一,同时也可能参与过氧化水平的调控与气孔的开闭[24,28]。但最新研究中对于蕨类植物内源ABA是否介导气孔的关闭还有一定争议[29]。干旱导致的氧化胁迫往往会促使ROS的积累。ROS是导致核酸、蛋白、膜质损伤的重要物质,并可造成细胞结构的变化[24],抗氧化酶系统的启动对消除ROS作用巨大。植物中的SOD构成了消除体内ROS的第一防线,在对井栏边草(Pteris multifida)、红盖鳞毛蕨(Dryopteris erythrosora)、阔鳞鳞毛蕨(Dryopteris championii)和贯众(Cyrtomium fortunei)进行干旱胁迫,叶片SOD活性即会显著提高,同时因为SOD可以消除自由基对质膜的损伤,故而笔者也认为适度的干旱能起到“炼苗”的作用[30]。卷柏在干旱和复水处理下,同时启动的四种抗氧化酶(SOD、 POD、CAT、GR)活性变化都有助于清除ROS的积累和对植物体的过度损伤[24]。

4 分子生物学机制

植物细胞失水会造成基因的上调或下调表达,不同类型的基因会被干旱诱导,基因表达也可能被胁迫间接启动,但干旱胁迫应答是一个复杂的过程,也是多基因联合作用的过程。

4.1 胁迫蛋白和基因表达

胁迫蛋白和基因的合成是植物对失水的普遍应答反应。研究表明,复苏植物干旱条件下细胞壁的塑化是该类植物的普遍策略,富阿拉伯多聚体(Arabinose-rich polymers)如阿拉伯果胶(Pectin-arabinans)、阿拉伯半乳糖蛋白(Arabinogalactan proteins)和阿拉伯木聚糖(Arabinoxylans)对保持细胞壁弹性作用巨大。复苏蕨类植物(Mohria caffrorum)干旱条件下的阿拉伯果胶与阿拉伯半乳糖蛋白的表达为保证细胞的完整性提供了保障[31]。热激蛋白属于分子伴侣中的一大类,很多热激蛋白会被干旱胁迫诱导,对胁迫下植物蛋白的折叠和防止蛋白变性有一定作用[32],该作用在复苏卷柏和S.lepidophylla的抗旱过程中有显著体现[24,28]。膜蛋白和胚发育晚期丰富蛋白是另一类干旱胁迫应答蛋白,无论从蛋白表达水平还是转录水平,这两类蛋白都在蕨类植物的抗旱过程中表达,这些蛋白和基因的表达同时也有助于防止伴侣蛋白的降解[22]。东北多足蕨(Polypodium virginianum)[33]中的光合酶、M.caffrorum中的热稳定蛋白以及卷柏抗旱过程中主要涉及的光合、能量代谢和细胞结构等功能类群蛋白的表达都为蕨类植物的抗旱性分析提供了大量分子信息。

4.2 干旱胁迫的信号调节

蕨类植物在中度缺水的情况下即可诱导内源ABA浓度的快速升高[24],而ABA又作为信号会介导胁迫相关基因的表达变化。ABA介导的基因表达高度复杂,涉及转录调控因子的正负调控,最终导致干旱条件下植物生长发育受到抑制[34]。S.lepidophylla中与ABA响应元件(ABA-responsive elements)和AP2结构域转录因子(AP2 domain-containing transcription factor)绑定的bZIP转录因子(bZIP transcription factor)的表达,表明S.lepidophylla内存在着依赖ABA和非依赖ABA两种基因调控[28],卷柏的转录组与蛋白质组学研究结果也证实了这一点[18,24],这些研究结果似乎也表明蕨类植物在脱水应答过程中采取了与高等维管植物相似的分子调控策略。另外,ABA缺失突变体的遗传学分析表明,ABA在水分流失过程中对于气孔的调控是必须的,而且无论是内源还是外源ABA,均可作为胁迫信号诱导基因表达。二歧鹿角蕨中的外源ABA诱导了净光合速率和气孔导度的下降[26],进而可以推测,外源ABA也介导了气孔的关闭和相关基因的调控。

通常条件下,胁迫信号的表达也发生在氧化还原系统和代谢循环的关键时期。信号表达途径的复杂性与蛋白激酶表达、胁迫的敏感性、ROS积累等的密切相关。如干旱胁迫可促使蕨类植物中第二信使如蛋白激酶、14-3-3蛋白等基因的表达调节干旱胁迫应答[24]。目前,具有耐旱能力的垫状卷柏(Selaginella pulvinata)海藻糖-6-磷酸合成酶基因已被克隆[35],其信号调节功能在很多高等植物中已得到验证,其在蕨类植物中信号通路的作用不可忽视,更需要进一步深入研究。

植物表达 篇4

产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)LT和ST是导致人和动物腹泻的主要病原菌.利用PCR方法分别从pGEM-5Zf(+)-STI、K88ab(LT+,ST+)质粒中扩增到了STI、STII基因,然后通过三引物PCR实现了STI、STII基因的融合,再与LTB基因融合,并置同一阅读框.LTB基因的5′位于STII基因的.3′端,并在ST基因和LTB基因之间插入7个氨基酸的连接肽.将融合基因STI-STII-LTB构建到带有核基质结合区序列(MARs)的植物表达载体pBI121-MARs中,并通过冻融法导入根癌农杆菌EHA105.

作 者：武冬梅 祝建波 陈创夫 王琦 张金波 WU Dong-mei ZHU Jian-bo CHEN Chuang-fu WANG Qi ZHANG Jin-bo  作者单位：武冬梅,WU Dong-mei(石河子大学生命科学学院,新疆石河子,832003;新疆地方与民族高发病实验室,新疆石河子,832003)

祝建波,ZHU Jian-bo(新疆兵团绿洲生态农业重点实验室,新疆石河子,832003)

陈创夫,CHEN Chuang-fu(新疆石河子大学动物科技学院,新疆石河子,832003)

王琦,张金波,WANG Qi,ZHANG Jin-bo(石河子大学生命科学学院,新疆石河子,832003)

刊 名：西北农业学报  ISTIC PKU英文刊名：ACTA AGRICULTURAE BOREALI-OCCIDENTALIS SINICA 年，卷(期)：2006 15(5) 分类号：Q786 关键词：产肠毒素大肠杆菌   ETEC   STI   STII   LTB   融合基因   植物表达载体  

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植物表达 篇5

拟南芥转录激活因子CBF/DRE1(C-repeating binding factor/Dehydration-responsive element 1)基因家族是拟南芥中能与胞啼健重复序列识别的结合蛋白,具有一个典型的AP2/EREBP结构域。CBF基因在低温驯化中控制一系列低温反应基因的表达,从而增加植物抵御冻害的能力。

在某种逆境条件下生长的植物,不仅具有抵抗该逆境的能力,而且还有抵抗其它逆境的能力,这种现象称为植物的交叉适应。一系列研究表明,植物冰冻首先发生在细胞膜系统。低温引起植物胞外或胞内结冰,由于胞外空间冰点较高且有一些灰尘或细菌作冰核,所以胞外先于胞内形成冰晶,冰晶溶液比液态溶液的水势低,并且温度越低,水势差值越大,因而胞内的水分通过质膜流出,导致细胞严重脱水[1]。一些转基因植物在抗寒性提高的同时其抗旱性也相应提高。其原因为植物在抗寒性增加的同时能够使细胞脱水减少,耐旱性增加。许多科学家又发现植物在低温和干旱条件下反应的分子机理非常相似。许多基因如RD、ERD、COR、LTI及KIN均受低温和干旱诱导[2]。Seki M等利用cDNA距阵法分析了1300个拟南芥基因的表达,确认了19个抗寒基因,而其中15个冷诱导基因同样也能被干旱诱导[3]。CBF调节因子的基本作用是在冻害和其他涉及水分胁迫时保护细胞。过量表达CBF1及CBF3的转基因拟南芥与对照相比不仅抗冻,而且对干旱或盐害造成的水分胁迫也具有抗性。Hakke V等发现,在干旱胁迫条件下,CBF4基因能被诱导表达,但在冷冻条件下,CBF4的表达没有变化。利用35S组成型启动子使CBF4过量表达,能引起COR15a及COR78a的组成型表达,而这两个基因是与抗寒性和抗旱性有关,结果使CBF4转基因拟南芥的抗寒性和抗旱性都大大提高[4]。

烟草是一种经济作物,在我国农业中占有非常重要的地位。本实验从拟南芥中克隆出CBF4基因,转化进烟草而培育出耐寒的烟草,意义一方面能提高烟草的产量和品质,筛选出抗寒且品质优良的新品系,为烟草育种提供资源。另一方面烟草作为模式植物可以验证基因功能,同时还可以为其它作物转抗寒基因提供一个技术平台。因此,转录因子的研究对调节植物的抗寒性方面具有十分重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

大肠杆菌DH5α、农杆菌LBA4404由黑龙江省烟草科学研究所中心实验室提供;拟南芥DNA和pC2301-35S-OCS表达载体由中国农业科学院提供。

1.1.2 试剂

DNA回收试剂盒为上海申能博彩公司产品;质粒提取试剂盒为北京全式金生物技术有限公司产品;pMD18-T Vectoer、限制性内切酶、T4 DNA连接酶为TaKaRa公司产品;低熔点琼脂糖为Sigma产品,其它常用试剂为国产分析纯。

1.1.3 仪器

BECKMAN高速冷冻离心机;PTC-200PCR仪;EPS600电泳仪;HPY-92S恒宇恒温培养摇床;DZKW-D-2电热恒温水浴锅。

1.1.4 培养基

LB固体培养基;LB液体培养基;YEB固体培养基;YEB液体培养基。

1.2 方法

1.2.1 CBF4基因的片段序列获得及克隆

通过NCBI网站查找到公布的5 种不同株系的拟南芥的CBF4基因序列(NO:EF523192;NO:EF523191;NO:EF523190;NO:EF523189;NO:NM124578)应用Align Plus4软件对五个株系的CBF4基因DNA进行序列比对,寻找高度同源保守区域。根据比对结果确定一段长度为 700bp左右的同源序列作为目的序列。采用Primer Designer4软件对这段CBF4基因目的序列进行引物设计和筛选。选定引物命名为CBF4-f/CBF4-r。

CBF4-f: 5’ggatcc atgaatccattttactctac3’

CBF4-r: 5’gagctc ttactcgtcaaaactccaga3’

以拟南芥DNA为模板,CBF4-f/CBF4-r为引物进行PCR扩增。PCR扩增反应条件:95℃预变性5min→94℃变性40s→58℃退火40s→72℃延伸1.2min→35次循环→72℃保温7min。

PCR产物连接到pMD18-T Vector(含BamHⅠ/PstⅠ酶切位点)后,质粒经冻融法转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞扩繁,应用LB(Amp+)选择培养基培养,抗性筛选呈阳性菌落(重组质粒命名为pMD18-T-CBF4),提取重组子质粒DNA。经特异引物PCR验证后备用。

1.2.2 CBF4基因烟草表达载体的构建

将质粒pMD18-T-CBF4和pC2301-35S-OCS表达载体的质粒分别用BamHⅠ/PstⅠ进行双酶切,电泳后分别回收700bp左右和11kb左右片段,将两者在T4 DNA Ligase作用下定向连接,构成CBF4基因表达载体。经冻融法转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞扩繁,应用LB(Kan+)选择培养基培养,筛选表现抗性呈阳性菌落(重组质粒命名为pC2301-35S-OCS-CBF4)提取重组子质粒DNA。经特异引物PCR和BamHⅠ/PstⅠ酶切验证存在特异条带,证实表达载体构建(图1)完成,菌液低温保存备用。

1.2.3 双元载体系统构建

提取表达载体pC2301-35S-OCS-CBF4质粒DNA,经液氮冻融法转化到只含辅助质粒的根癌农杆菌LBA4404中,应用YEB(Kan+和rif+)选择培养基筛选抗性菌落,提取表现抗性的农杆菌质粒DNA,经菌落PCR和双酶切验证特异条带存在,菌液经液氮速冻-70℃保存备用,完成双元载体系统的构建。

2 结果与分析

2.1 CBF4基因靶序列克隆产物PCR验证及测序

经PCR扩增获得的CBF4基因靶序列,连接到pMD18-T Vector后,提取重组子pMD18-T-CBF4质粒DNA经特异引物PCR后,产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳,电泳图2表明:7个菌落中有7个菌落的PCR产物在700bp处出现条带,证实靶序列已经连接进入pMD18-T Vectoer。

取其中的2号泳道菌液(定名为CBF4)大量培养,取500μL菌液送测序公司进行测序证实所得序列(675bp)符合原始设计。

2.2 重组pC2301-35S-OCS-CBF4表达载体PCR验证、酶切验证

pC2301-35S-OCS载体质粒DNA和pMD18-T-CBF4载体质粒DNA分别双酶切(BamHⅠ/PstⅠ),产物经电泳分离,分别回收载体质粒DNA大片段和目的基因CBF4 DNA片段(图3和4)。

泳道1和2:pMD18-T-CBF4质粒双酶切; 泳道3:2000 DNA Marker; 泳道5:5000 DNA Marker。

泳道1-3:pC2301-35S-OCS双酶切;泳道4:pC2301-35S-OCS对照;M:λ-HindⅢ digest DNA Marker。

回收的两个片段经T4连接酶连接,重组质粒pC2301-35S-OCS-CBF4转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中,经含有Kan抗生素的LB固体选择培养基筛选,选取9个抗性菌落,利用CBF4-f/CBF4-r引物进行PCR扩增并提取质粒DNA,利用BamHⅠ/PstⅠ双酶切,产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离进行双重验证(图5和6)。

从图5中可以看出选取的9个抗性菌落,经电泳验证,均在700bp附近出现特异性条带。图6中看到pC2301-35S-OCS-CBF4质粒经BamHⅠ/PstⅠ双酶切,4个菌落中有4个菌落酶切产物出现700bp特异条带,证明pMD18-T-CBF4载体上的目的片段正确插入到pC2301-35S-OCS表达载体相应酶切位点。

泳道1-9:9个单菌落的扩增产物; M:2000 DNA Marker。

泳道1-4:pC2301-35S-OCS-CBF4质粒双酶切产物; M: DNA Marker。

2.3 双元载体系统的构建

经含有Kan和rif抗生素的YEB固体选择培养基筛选,选取6个抗性菌落,利用CBF4-f/CBF4-r引物对PCR扩增并提取质粒DNA,利用BamHⅠ/PstⅠ双酶切,产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离进行双重验证(图7和图8)。

泳道1-6:6个单菌落的扩增产物; M:2000 DNA Marker。

从图7中可以看出选取的6个抗性菌落,经电泳验证,均在700bp附近出现特异性条带。图8中看到重组质粒经BamHⅠ/PstⅠ双酶切,6个菌落中有6个菌落酶切产物出现700bp特异条带,证明pC2301-35S-OCS-CBF4表达载体以成功转入到了农杆菌中,双元表达载体构建正确。

3 讨论

CBF基因家族成员在植物抗寒、抗旱及抗盐碱方面起着很大的作用[5]。在烟草、番茄、油菜和水稻等作物中,拟南芥CBF基因同样可以激活这些作物的逆境响应基因,并使转基因作物获得不同程度的抗逆性,如抗低温、干旱、高盐和氧胁迫等[6,7,8]。有研究发现,在拟南芥中过量表达CBF1和CBF3基因,植株的抗冷性明显提高,不仅能提高COR蛋白的含量,

而且Pro及可溶性糖的含量也大大提高,包括蔗糖、棉子糖、葡萄糖和果糖等,并认为CBF基因是冷驯化反应途径中的主要“开关”[9]。甄伟[10]等将CBF1转入油菜和烟草的试验表明,转基因油菜的抗寒性明显提高,转基因烟草的抗寒性也有一定提高。Hsieh T[11]等将拟南芥的CBF1 转入番茄后,转基因植株的脯氨酸浓度增大、过氧化氢酶活性增强、过氧化氢浓度降低,在正常条件和干旱胁迫下都比野生型植株表现出更强的抗旱能力。金建凤等[12]将拟南芥的CBF1转入水稻后,提高了植株的脯氨酸含量,同时转基因植株抵御寒冷的能力明显提高。Ito Y等[13]将OsCBF基因转入水稻后,Pro及可溶性糖的含量大大提高,水稻的抗寒性、抗旱性、抗盐性都得到提高。刘燕等[14]将转CBF1基因的草莓和普通栽培品种进行有性杂交,杂种后代的电导率低于对照植株,胞间的结冰温度比对照植株低2℃,具有更强的抗寒性。吴琰等[15]在研究转CBF1基因地被石竹抗寒性时发现,不同低温处理后,转基因株系的相对电导率和丙二醛含量均比对照植株低,而脯氨酸含量有所提高,抗寒性也得到增强。

植物表达 篇6

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

E.coli菌株DH5α、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105、pCAMBIA1301质粒、含风疹病毒E1基因片段质粒PGEX-4T-2-E1质粒都由作者实验室保存。

1.1.2 实验试剂

限制性内切酶、DNA Marker、连接酶、胶回收试剂盒等均购自宝生生物工程有限公司;快捷型植物基因组DNA提取系统购自TIANGEN天根生化科技(北京)有限公司;实验所用的樱桃番茄(Lycopersivon esculentum Mill)“沪樱1号”品种种子购自上海农业科学院园艺所。

1.2 方法

1.2.1 幼苗的培养及总DNA的提取

番茄种子在蒸馏水中浸泡1h,无菌水冲洗3次,75%酒精表面消毒20s,无菌水冲洗3次,10%次氯酸钠消毒25 min,无菌水冲洗5次,用无菌滤纸吸干种子表面水分,接种于1/2 MS固体培养基,25℃暗培养3d后,14h/d光照培养,然后提取番茄基因组DNA。

1.2.2 PCR扩增目的片段

根据Deikman报道的番茄Cherry种的果实特异性启动子序列,设计PCR引物,以提取的番茄基因组DNA为模板,扩增樱桃番茄E8启动子基因。

引物合成都由Takara公司完成。以上片段经PCR扩增,其产物用1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定后,回收试剂盒回收目的DNA片段。

1.2.3 植物表达载体pCAM1301E8-E1的构建及转化农杆菌

番茄果实特异性启动子E8基因、风疹病毒E1基因、NOS终止子,以上外源基因片段回收产物依次与植物表达载体pCAMBIA1301连接,然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆,提取重组质粒pCAM1301E8-E1,进行酶切鉴定。将重组质粒pCAM1301E8-E1转化至根癌农杆菌EHA105中,并酶切鉴定。

2 结果与分析

2.1 风疹病毒抗原基因E1植物表达载体的构建策略

本研究将风疹病毒抗原基因E1插入植物表达载体pCAMBIA1301中,构建植物重组表达载体pCAM1301E8-E1。该载体含有“E8番茄果实特异性启动子-E1基因-NOS终止子”,“CaMV35S启动子-hptⅡ基因-NOS终止子”和“CaMV35S启动子-gus基因-NOS终止子”3个表达框,这3种基因在植物中同时表达。pCAM1301E8-E1的结构如图1所示。

LB:左边界;RB:右边界;hptⅡ:潮霉素磷酸转移酶基因;Pro:启动子;Ter:终止子;gus:β-半乳糖醛酸酶。

LB:left border;RB:right border;hptⅡ:hygromycin phosphotransferase Ⅱgene;Pro:promoter;Ter:terminator;gus:β-glucuronidase gene.

2.2 目的片段PCR扩增结果

成功扩增风疹病毒E1基因片段460bp、果实特异性启动子E8基因片段1.1kb、终止子NOS基因片段256bp。PCR扩增各外源基因片段见图2。

Lane M was DL2,000 DNA Marker;Lane 1 was E1 gene;Lane 2 was E8 gene;Lane 3 was NOS gene.

2.3 重组植物表达载体的鉴定

外源基因片段与植物表达载体 pCAMBIA1301连接,经鉴定,含插入片段,如图3所示。测序结果正确。

Lane M were 1kb Ladder Marker and 250 bp DNA Ladder Marker;Lane 1 was pCAM1301E8-E1 DNA;Lane 2 was E8 gene digested by EcoRⅠand BamHⅠ;Lane 3 was E1 gene digested by BamHⅠand PstⅠ;Lane 4 was NOS gene digested by PstⅠand HindⅢ.

2.4 重组植物表达载体转化根癌农杆菌

Lane M were 1 kb Ladder Marker and 250 bp DNA Ladder Marker;Lane 1 was pCAM1301E8-E1 DNA;Lane 2 was E1 gene digested by BamHⅠ and PstⅠ;Lane 3 was E8-E1-NOS gene digested by EcoRⅠ and HindⅢ.

重组质粒pCAM1301E8-E1转化到根癌农杆菌EHA105中后,进行酶切鉴定,结果见图4。

3 讨论

E8 启动子在番茄(Lycopersicon esculentum Mill)果实中发现,它是乙烯应答性基因的启动子,在果实成熟过程中特异表达。花椰菜花叶病毒启动子(CaMV35S)是组成型启动子,其外源基因表达不足,蛋白免疫原性较低,会引起免疫耐受。因此,果实特异性启动子E8常被用在高效和智能化的植物表达载体中。但也有实验表明,转基因番茄中E8的mRNA低表达,使得它的外源蛋白的表达低于35S,同时发现35S番茄果实外表皮的外源蛋白表达量比其他组织高。为了让E8启动子在果实成熟阶段高效表达外源基因,可以增加每单位mRNA蛋白的转录,5’-UTR中的NtADH序列和烟草花叶病毒的前导序列(Ω序列)有效的翻译增强子。此外,与胭脂碱合成酶终止子(NOS)相比,拟南芥热休克蛋白18.2终止子也能够增加mRNA的转录。如果给E8启动子加入这些增强子,在果实成熟阶段外源基因的表达会更高,使得E8启动子为蛋白高效表达有很大的价值[5]。近来研究发现,髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)特别会与RV的E1包膜糖蛋白交联,抗MOG的抗体可以阻断RV的感染[6]。对E1包膜糖蛋白的研究还在不断深入完善。本实验着眼于番茄果实特异性启动子E8和RV的E1包膜糖蛋白,成功构建E8启动子驱动RV的E1基因的植物表达载体,提高了外源基因的表达量,为研制转基因植物风疹病毒疫苗奠定基础,目前该基因遗传转化工作正在进行中。

摘要：目的:为了提高目的基因在番茄果实中的表达量,为进一步研究口服植物疫苗打下基础。方法:PCR扩增1.1kb番茄果实特异性启动子E8基因、460bp风疹病毒抗原E1基因、256bp NOS基因,将这些片段插入到pCAMBIA1301多克隆位点,得到植物表达载体pCAM1301E8-E1,经测序鉴定正确,将其转化至根癌农杆菌EHA105,然后进行酶切鉴定。结果:重组质粒酶切鉴定均得到预期片段,测序结果正确。结论:该实验成功构建番茄果实特异性启动子驱动风疹病毒E1基因的植物表达载体。

关键词：番茄果实特异性E8启动子,风疹病毒,番茄

参考文献

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[2]Siddharth Tiwari,Praveen C.Verma,Pradhyumna K.Singh,et al.Plants as bioreactors for the production of vaccine antigens[J].Biotechnology Advances,2009,27(4):449-467.

[3]Priti N Desai,Neeta Shrivastava,Harish Padh.Production of heterolo-gous proteins in plants:Strategies for optimal expression[J].Biotechnology Advances,2010,28(4):427-435.

[4]M.Manuela Riganoa,Carmela Mannab,Anna Giulinic,et al.Plants as biofactories for the production of subunit vaccines against bio-security-re-lated bacteria and viruses[J].Vaccine,2009,27(4):3463–3466.

[5]Tadayoshi Hirai,You-Wang Kim,Kazuhisa Kato,Kyoko Hiwasa-Ta-nase,Hiroshi Ezura.Uniform accumulation of recombinant miraculin protein in transgenic tomato fruit using a fruit-ripening-specific E8promoter[J].Transgenic Research,2011,20(6):1285-1292.

植物表达 篇7

本研究试图构建不同的布鲁菌保护性抗原基因植物表达载体, 同时在其两端附加植物高效表达元件, 旨在提高抗原基因在植物细胞中的表达量, 为提高口服疫苗的产量及改善其免疫效果提供可能。

1 材料与方法

1.1 菌种及质粒

p MD19-T6 (含布鲁菌rpl L基因及植物表达元件) 和p MD19-T7 (含布鲁菌omp31基因) , 均由Ta KaRa公司合成, 植物表达载体p BI121由本实验室保存。大肠杆菌DH5α由本实验室保存。

1.2 工具酶及试剂

Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶等主要分子生物学试剂为TAKARA公司产品;质粒提取试剂盒为Omega公司产品;DNA回收试剂盒购自Millipore公司。

1.3 布鲁菌保护性抗原基因的合成

根据Gen Bank中的rpl L基因与omp31蛋白编码基因序列, 对照植物基因偏性密码子进行设计。在rpl L基因5'端添加烟草花叶病毒Ω序列及Bam H I酶切位点, 3'端添加SEKDEL序列及Sac I酶切位点。将设计好的基因序列送Ta KaRa公司进行合成。

1.4 rpl L基因植物表达载体的构建

携带rpl L基因的质粒p MD19-T6以Sac I和Bam H I双酶切, 回收目的片段rpl L, 然后将其亚克隆入质粒p BI-121, 再转化入大肠杆菌DH5α中扩增。挑取单菌落37℃振荡培养过夜, 提取质粒, 利用EcoR I和HindⅢ双酶切鉴定, 呈阳性者命名为p BI121-rpl L, 即为所要构建的rpl L基因植物表达载体。

1.5 omp31基因植物表达载体的构建

从携带有omp31基因的质粒p MD19-T7中Cla I和Xho I双酶切并回收目的片段omp31基因, 然后将其亚克隆入相应酶切质粒p MD19-T6中, 使两端携带植物表达元件, 再转化入大肠杆菌DH5α中扩增。将转化后的大肠杆菌DH5α涂布于含有氨苄青霉素 (50 mg/L) 的LB固体培养基上进行筛选, 挑取单菌落接种于含有氨苄青霉素 (50 mg/L) 的LB液体培养基上37℃振荡培养过夜, 提取质粒, 利用Bam H I和Xho I双酶切鉴定阳性克隆, 呈阳性者命名为p MD19-T6-omp31。继而利用Sac I和Bam H I双酶切上述阳性质粒, 回收携带植物表达元件的omp31基因目的片段, 亚克隆入质粒p BI-121, 经转化酶切鉴定后, 获得的阳性质粒p BI121-omp31即为所要构建的植物表达载体。

2 结果

2.1 布鲁菌rpl L基因植物表达载体的构建

将含有布鲁菌L7/L12蛋白编码rpl L基因的重组质粒进行双酶切, 用1.0%的琼脂糖凝胶电泳, 获得了约600 bp的目的基因片段, 大小与理论值相符合 (见图1) 。

p BI121质粒用Sac I和Bam H I双酶切后, 低熔点琼脂糖回收载体, 与上述同样双酶切并携带植物表达元件的rpl L基因连接。随机挑取单克隆, EcoR I和HindⅢ双酶切鉴定, 获得约11.9 kb的载体带和约1.7 kb的片段带, 与预期值相符, 证明克隆成功, 且随机挑取的克隆均为阳性, 克隆效率较高 (见图2) 。

M为Marker DS2000 (From up to down:2 kb, 1 kb, 750 bp, 500 bp, 250 bp, 100 bp) ;S为pM D19-T6 Sac I+BamH I

M为Marker LD1000 (From up to down 10 kb, 8 kb, 6 kb, 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1.5 kb, 1 kb) ;No.1~8为pB I121-rplL;1~8 EcoR I+HindⅢ

2.2 布鲁菌omp31基因植物表达载体的构建

将含有布鲁菌omp31基因的重组质粒进行双酶切, 用1.0%的琼脂糖凝胶电泳, 获得了约700 bp的基因片段, 与预期omp31基因大小与理论值相符合 (见图3) 。

将回收的目的基因片段omp31与同样酶切的p MD19-T6载体连接后转化, 提取质粒用Bam H I和Xho I双酶切鉴定, p MD19-T6-omp31重组质粒出现片段大小约为0.8 kp条带, 若片段大小约为0.5 kb则为阴性克隆, 电泳结果证明p MD19-T6-omp31克隆成功 (图4) 。获得的阳性质粒p BI121-omp31即为所要构建的植物表达载体。p BI121质粒用Sac I和Bam H I双酶切后, 低熔点琼脂糖回收载体;同样双酶切p MD19-T6-omp31获得携带植物表达元件的omp31基因, 亚克隆入质粒p BI-121。随机挑取单克隆, EcoR I和HindⅢ双酶切鉴定, 获得约11.9 kb的载体带和约1.8 kb的片段带, 与预期值相符, 证明克隆成功, 且随机挑取的克隆均为阳性, 克隆效率较高 (图5) 。

M为Marker DS2000 (From up to down:2 kb, 1 kb, 750 bp, 500 bp, 250 bp, 100 bp) ;No.1, 2, 4, 5, 6为pM D19-T6-omp31 BamH I+Xho I;No.3, 7为Recreated vector

3 讨论

转基因植物是一种多样化、可再生和低成本的新型分子材料[6]。生产布鲁菌疫苗与其他表达系统相比, 主要优点是安全无毒性、成本低廉。利用细菌其它表达系统生产布鲁菌疫苗存在着将细胞内毒素或病毒传染给畜类的潜在危险, 植物细胞则不会有潜在的动物或人类病原, 因而来源于植物的重组蛋白安全性好。植物与动物同属于真核生物, 具有完整的真核表达系统, 表达产物能进行糖基化、磷酸化、酰胺化、切割、折叠、形成二硫键及亚基的正确装配等翻译后的修饰加工。因此, 转基因植物有利于重组蛋白的正确装置和表达[7], 使表达产物与天然产物具有相似的结构、生物学活性、抗原性和免疫性。

M为Marker LD1000 (From up to down 10 kb, 8 kb, 6 kb, 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1.5 kb, 1 kb) ;No.1~5为pB I121-omp31 1~5为EcoR I+HindⅢ

植物表达 篇8

植物转基因技术起源于上世纪80年代,30多年来很多种转基因植物和产品已经从实验室走向了市场,随着转基因产品的商品化和广泛推广,消费者通过不同的渠道逐渐对转基因植物的食品和环境安全性问题产生顾虑[1,2,3]。为此,科研人员开始研究使用相对安全的选择标记基因或者剔除抗生素标记基因[4,5,6,7]。磷酸甘露糖异构酶(phosphomannose isomerase,manA)基因的表达,使甘露糖转化成果糖,因此转化细胞能够利用甘露糖做为主要碳源[8,9,10]。磷酸甘露糖异构酶基因作为选择标记,已成功地用于甜菜[10]、玉米[11]、水稻[12]、鹰嘴豆[13]、油菜籽[14]等多种植物的遗传转化中。本研究从大肠杆菌DH5α中克隆了磷酸甘露糖异构酶基因,并构建了以磷酸甘露糖异构酶基因(manA)为选择标记的植物表达载体,在载体克隆策略上选用Gateway载体系统,避免了过多使用限制性内切酶的繁琐,利用此载体进行遗传转化工作,可以进一步探讨甘露糖异构酶基因在植物遗传转化中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

大肠杆菌E.coli的DH5α菌株感受态细胞购买于北京拜尔迪生物科技公司;根癌农杆菌GV3101和pCAMBIA1301植物表达载体保存在实验室超低温冰箱;pGEM-T载体购自普诺麦格公司。pGWCBF由华中农业大学张卉实验室惠赠。

1.1.2 试剂

使用的限制性核酸内切酶、Taq DNA聚合酶、T4连接酶、DNA 标记、抗生素均购自大连塔克拉公司;LR 反应的混合酶购于美国英骏公司;质粒mini prep试剂盒购自奥博莱科技有限公司、凝胶回收试剂盒和大肠杆菌Genomic DNA提取试剂盒购自北京鼎国公司,引物由北京奥科公司合成。

1.1.3 培养基

LB培养基购自Sigma公司,用于培养大肠杆菌,固体培养基中添加2%的琼脂。

1.2 方法

1.2.1 大肠杆菌Genomic DNA的提取

从保存的平板上挑取单菌落,接种在LB液体培养基中,在37℃恒温条件下振荡培养至对数生长期,取菌液离心,弃上清后收集菌体,具体方法步骤参见北京鼎国公司试剂盒说明书。

1.2.2 扩增大肠杆菌manA基因

根据NCBI上已经登录的甘露糖异构酶基因序列设计引物,在两个引物上都添加XhoⅠ酶切位点,P1:5’-CCCTCGAGATGCAAAAACTCATTAACTCA-3’,P2:5’-AACTCGAGTTACAGCTTGTTGTAAACACG-3’。以大肠杆菌DH5α的genomic DNA为模板,扩增甘露糖异构酶基因全长片段,反应条件为95℃,3min;95℃,30s;55℃,40s;72℃,60s;35个循环后72℃,8min;4℃终止反应。将PCR产物直接连接到pGEM-T载体上,获得中间载体pT-manA。经过XhoⅠ酶切初步鉴定,然后进行序列测定,测序结果在NCBI网站进行blast。

1.2.3 构建pCAMBIA1301-manA中间载体

用XhoⅠ酶切pCAMBIA1301载体,回收大片段,同样用XhoⅠ酶切pT-manA载体,回收目的基因小片段,然后将大小片段连接。

1.2.4 构建植物表达载体pCAMBIA1301-manA-GW

用HindⅢ和XbaⅠ分别双酶切质粒pGWCBF和pCAMBIA1301-manA,回收pGWCBF载体中P35S-T35S-attR1-attR2-CmR-ccdB片段,长约3kb,将其连接到pCAMBIA1301 载体上。

1.2.5 构建pCAMBIA1301-manA-CBF载体并转化到农杆菌中

我们使用已经构建完成的CBF基因片段入门克隆载体与pCAMBIA1301-manA-GW载体进行重组反应,最终获得植物表达载体pCAMBIA1301-manA-CBF,并通过液氮冻融法将其转化到农杆菌中保存。

2 结果与分析

2.1 甘露糖异构酶基因(manA)的克隆和鉴定

将PCR扩增的产物上样跑电泳检测,结果显示得到了约1.3kb的条带(图1),切取凝胶回收并纯化后连接到T载体上,转化大肠杆菌后,蓝白斑筛选,挑单菌落摇菌后提质粒,先酶切初步鉴定,然后筛选能切出1.3kb片段的克隆进行测序测定,结果表明该DNA片段含有1 350个碱基,与NCBI网站上已经登录的甘露糖异构酶基因序列同源性为99%,仅在第305和387碱基处不同,前者由AGU突变为AGC,后者由CAA突变为CAG,但未引起所表达的氨基酸序列改变。因此,本研究中克隆的manA基因编码的氨基酸序列与Genbank发表序列(Accession No.M15380)完全相同。表明所获得的片段正是大肠杆菌manA基因。

2.2 pCAMBIA1301-manA载体和pCAMBIA1301-manA-GW载体的鉴定

在扩增大肠杆菌基因组的甘露糖异构酶基因全长序列时,在两个引物上都添加XhoⅠ位点。先酶切PCR阳性克隆检测是否有manA基因存在,能获得1.3kb片段的克隆初步断定为有manA基因的插入(图2)。再将质粒送公司测序进一步验证manA基因的插入方向是否正确。在8个XhoⅠ酶切鉴定有甘露糖异构酶基因插入的克隆中,测序结果表明有2个是正向插入的。因为pCAMBIA1301载体中含有多克隆酶切位点,将Gateway载体中酶切位点XbaⅠ和HindⅢ之间P35S-T35S-attR1-attR2 -CmR-ccdB结构域重组到表达载体pCAMBIA1301-manA上,对重组质粒进行双酶切鉴定,得到pCAMBIA1301-manA-GW载体(图3)。

2.3 表达载体pCAMBIA1301-manA-CBF的获得并转化到农杆菌中

利用Gateway载体中重组位点的特性,以pCAMBIA1301-manA-GW为入门载体,构建以甘露糖异构酶基因为选择标记的植物表达载体pCAMBIA1301-manA-CBF,其载体结构见图4。用XhoⅠ酶切重组质粒,验证得到1.3 kb的片段,说明以manA基因为选择标记的植物表达载体构建成功,酶切检测电泳见图5。

用液氮冻融法将pCAMBIA1301-manA-CBF载体转化到根癌农杆菌中,设计CBF基因一对特异引物进行菌液PCR扩增,得到长约780bp的条带,与预期一致,说明该载体已经成功导入到农杆菌GV3103菌株中,扩增结果电泳见图6。

3 讨论

近些年,以糖类代谢酶基因作为选择标记的正向遗传转化体系不断有报道,已经在水稻、小麦、棉花、油菜等作物和苹果等果树中取得成功,以它们为选择压,由于培养基中不添加抗生素,对植物生长的没有抑制作用,因此更有利于转化植株的再生,相对来说转化效率更高。Bakshi Suman等人通过构建含有manA基因的表达载体转化豇豆,转化效率达到3.6%[15]。

本研究所使用的主要载体是pCAMBIA系列,它是由澳大利亚的CAMBIA公司开发研究,它在植物遗传转化中应用较普遍,pCAMBIA1301载体上的抗生素标记基因是潮霉素基因,其两端分别有一个XhoⅠ酶切位点,而且它上面还含有多克隆位点,用于其它目的基因的插入。Gateway系统是由美国英骏公司开发的,利用λ噬菌体位点特异性的重组原理,在不同的克隆载体之间实现DNA片段的转移,不需要使用内切酶和连接酶,并保持基因定向定位和阅读框不发生改变[16],精简了克隆步骤,提高了效率和准确性。

本研究中构建的植物表达载体是以manA基因为选择标记基因,将抗性转录因子CBF作为目的基因,然后利用农杆菌介导,对葡萄叶片进行遗传转化,并验证转化后代植株的筛选效果和效率,从而研究和探讨甘露糖异构酶基因在遗传转化中的作用。

摘要：目的:构建了以manA基因为选择标记的植物表达载体。方法:从大肠杆菌DH5α中克隆出manA基因,连接到质粒pCAMBIA1301的XhoⅠ位点,替换hpt基因,通过酶切和PCR检测了插入片段的正确性,使用XbaⅠ和HindⅢ酶切Gateway载体(pGWCBF)获得含有P35S-T35S-attR1-attR2-CmR-ccdB的结构域,将其插入到表达载体pCAMBIA1301的相应位点中,获得中间表达载体pCAMBIA1301-manA-GW,使用Gateway载体的BP反应与LR反应,将转录因子CBF基因片段整合到载体中。结果:酶切结果表明以甘露糖异构酶基因(manA)为选择标记的植物表达载体pCAMBIA1301-manA-CBF已经构建完成。结论:将构建好的载体用液氮冻融法转化到农杆菌中,可以用于葡萄的遗传转化研究,为将来获得安全的转基因抗寒植株奠定基础。

植物表达 篇9

2002年, Volker Haake等从拟南芥中分离出了CBF转录激活因子家族的又一成员—CBF4基因, 是抗旱转录因子。它与CBF1、CBF2和CBF3相同, 具有保守的AP2区域, 能与CRT/DREDNA (C-repeat/dehydration-responsive element (DRE) DNA binding protein) 调控元件特异结合, 促进启动子中含有这一调控元件的多个冷诱导和脱水诱导基因的表达, 从而激活植物体内的多种耐逆机制。但又与它们不同, CBF4基因的表达不受低温诱导, 而是受干旱诱导[14]。

目前, 我国利用CBF4基因进行抗逆遗传改良研究的报道中所用的启动子基本都是组成型启动子, 应用诱导型启动子调控CBF4基因进行抗逆遗传改良的报道很少。本研究利用已克隆得到的抗旱转录因子CBF4基因及其诱导型启动子CBF4P, 以植物表达载体p3301为基础, 分别构建了由组成型启动子CaMV35s和诱导型启动子CBF4P调控的转录因子CBF4基因的两个植物表达载体p3301-CBF4和p3301-CBF4P, 为今后利用CBF4基因改良苜蓿抗逆性及进一步研究两种启动子的启动效率奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

大肠杆菌 (E.coli) DH5α, T-CBF4质粒 (含有CBF4基因) 、T-CBF4P质粒 (含有CBF4基因及诱导型启动子) , Bluescript M13 (SK) 、p3301 (携带CaMV35S启动子) 表达载体均由由北京市农林科学院北京农业生物技术研究中心园林实验室提供。

1.1.2 试剂

限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、Marker等购自TaKaRa公司;质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒等购自上海生工生物工程有限公司;其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 仪器

PCR仪、恒温水浴箱、自动恒温摇床、电泳仪、凝胶自动成像仪等。

1.1.4 培养基

LB培养基 (胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g, pH 7.0) 。

1.2 方法

1.2.1 感受态细胞制备与转化

大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备及转化方法参照文献[15]进行。

1.2.2 植物p3301-CBF4的构建

将T-CBF4质粒先用SalⅠ酶切成线形, 回收约3 700bp的片段, 然后再用EcoRⅠ部分酶切此片段, 回收670bp片段, 同时将SK用SalⅠ和EcoRⅠ双酶切回收2 960bp片段, 将这两个片段用T4 DNA连接酶进行连接, 得到中间载体SK-CBF4。用BamHⅠ和SpeⅠ双酶切中间载体SK-CBF4, 回收670bp片段, 再将p3301先用BglⅡ单酶切, 再用NheⅠ部分酶切, 回收约9 100bp片段, 用T4 DNA连接酶将这两个回收得到的片段连到一起, 构建成p3301-CBF4表达载体。

注:BamHⅠ与BglⅡ为同尾酶, SpeⅠ与NheⅠ为同尾酶。

1.2.3 植物表达载体p3301-CBF4P的构建

将T-CBF4P和SK同时用EcoRⅠ进行酶切, 分别回收2 000bp片段和2 960bp片段, 再将两个片段进行连接形成中间载体SK-CBF4P。再将p3301先用PastⅠ单酶切, 再用NheⅠ部分酶切, 回收约8 500bp片段, 与用PastⅠ和SpeⅠ双酶切SK-CBF4P回收到的2 000bp片段连接, 构建成p3301-CBF4P表达载体。

1.2.4 表达载体构建过程图

植物表达载体p3301-CBF4构建见图1, 植物表达载体p3301-CBF4P构建见图2。

2 结果与分析

2.1 中间载体SK-CBF4的鉴定

2.1.1 PCR检测

用CBF4 3′引物 (ATT ACT CGT CAA AAC TCC AGA GTG) 和CBF4 5′引物 (AAT GAA TCC ATT TTA CTC TAC) 扩增得到了约670bp DNA片段 (图3) , 只有CBF4片段连接到SK上, 才能扩增到约670bp的DNA片段, 所以PCR检测结果初步验证了中间载体SK-CBF4构建成功。

2.1.2 酶切检测

如果构建的SK-CBF4载体正确, 构建的SK-CBF4载体中存在2个PstⅠ酶切位点。用PstⅠ酶切应切出2 960bp和670bp两个DNA片段。从电泳检测的结果来看 (图4) , 酶切所得到的DNA片段与预期结果完全一致, 证明中间载体SK-CBF4构建是正确的, 可用于下一步实验。

1-4 Plasmid ;5 Check positive ;6 Check negative;7 Marker.

1 PastⅠ;2 Marker.

2.2 植物表达载体p3301-CBF4的鉴定

2.2.1 PCR检测

PCR琼脂糖凝胶电泳结果显示 (图5) , 重组质粒的PCR产物中扩增出约670bp的DNA片段, 说明CBF4基因已整合到p3301载体中, 验证了载体p3301-CBF4构建的正确性。

1 Check positive; 2 Check negative; 3 Plasmid; 4 Marker.

2.2.2 酶切检测

如果构建的p3301-CBF4载体正确, 在它上有3个EcoRⅠ酶切位点, 酶切后应分别得到9 000bp、800bp和180bp 左右的3个DNA片段。从电泳检测的结果来看 (图6) , 酶切所得到的DNA片段与预期结果一致, 说明所得到的p3301-CBF4是我们所要构建的含有CBF4基因和组成型启动子CaMV35s的植物表达载体。

1 EcoRⅠ;2 Marker.

2.3 中间载体SK-CBF4P的鉴定

2.3.1 PCR检测

利用CBF4P 3′引物 (ATG TAG AGT AAA ATG GAT TCC TT) 和CBF4 5′引物 (CAG GTG TGA GAG AAC CAA AGT) , 以重组质粒SK-CBF4P为模板进行PCR检测, 电泳分析结果表明, 重组质粒的PCR产物中含有一条1 200bp的DNA片段 (图7) , 验证了中间载体SK-CBF4P构建正确。

1, 2 Plasmid; 3 Check positive; 4 Check negative; 5 Marker.

2.3.2 酶切检测

正确的SK-CBF4P载体应有2个SpeⅠ酶切位点, 酶切后应分别得到3 000bp和2 000bp左右的2个DNA片段。SpeⅠ酶切的电泳结果 (图8) 与预测的结果一致, 从而证明中间载体SK-CBF4P构建是正确的, 可进行后续实验。

1 SpeⅠ;2 Marker.

2.4 植物表达载体p3301-CBF4P的鉴定

2.4.1 PCR检测

琼脂糖凝胶电泳结果显示 (图9) , PCR产物为1 200bp的特异性片段, 与预期片段大小一致。说明CBF4P基因已整合到p3301载体中。

1 Check positive;2 Check negative;3 Plasmid; 4 Marker.

2.4.2 酶切检测

正确的p3301-CBF4P载体上应只有1个PstⅠ酶切位点和1个BglⅡ酶切位点, 酶切后应得到10 000bp和1 300bp 左右的2个DNA片段。用PstⅠ和BglⅡ双酶切的电泳结果 (图10) 与预测的结果一致, 说明所得到的p3301-CBF4P是我们所要构建的含有CBF4基因和诱导型启动子的植物表达载体。

1 PstⅠ+BglⅡ ; 2 Marker.

3 讨论