组织表达（精选11篇）
组织表达 篇1
血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一种促血管新生的细胞因子,在肿瘤的发生发展中具有重要作用[1],为探讨其在脑膜瘤中的作用,作者采用免疫组化S-P法测定了38例脑膜瘤组织中VEGF的表达情况,并分析其与脑膜瘤分级的关系。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择驻马店市中心医院神经外科于2011年1月～2014年12月收治的经病理学证实并行手术切除的脑膜瘤患者38例,其中男22例,女16例；年龄20～70岁,中位年龄56岁；主要症状：头痛36例,头晕38例,呕吐10例,肢体无力10例,视物不清5例,抽搐或某些精神症状3例；依据WHO提出的脑膜瘤分级标准[1],Ⅰ级22例,Ⅱ级10例,Ⅲ级6例。
1.2 VEGF的测定及结果评定
采用免疫组化S-P法测定38例脑膜瘤组织中VEGF的表达,以PBS代替一抗作为阴性对照,抗体及试剂盒为福州迈新生物技术有限公司产品,其结果评定为(±)、(+)、(++)、(+++),后三者均为阳性。
1.3 统计学方法
用SPSS20.0统计学软件处理数据。计数资料以率(%)表示,实施χ2检验。检验水准α=0.05,P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
VEGF主要表达于脑膜瘤细胞的细胞膜和(或)细胞浆。见图1。38例脑膜瘤组织VEGF的阳性率为42.1%(16例),其中Ⅰ级为22.7%[(±)17例,(+)4例,(++)1例,(+++)0例],Ⅱ级为50.0%[(±)5例,(+)4例,(++)1例,(+++)0例],Ⅲ级为100.0%[(±)0例,(+)0例,(++)0例,(+++)6例],不同级别脑膜瘤组织中表达率差异有统计学意义(P<0.05),随分级的进展VEGF的阳性率逐渐增高。
3 小结
血液供应是肿瘤生长的必要条件,提供肿瘤生长所必须的营养成分和氧等,研究[1]证实,肿瘤组织中新生血管的情况决定了肿瘤的生长快慢,如果新生血管不能满足肿瘤生长所需的血液供应,肿瘤组织就会坏死。另外,脑组织是人体血供丰富,且对血液供应变化最为敏感的器官之一,脑膜瘤的生长对血液供应的依赖也非常明显。VEGF是目前已知作用最强的促血管新生的因子,主要通过与血管内皮细胞表面的受体结合,促进机体新血管形成,在肿瘤的发生发展及浸润转移过程中具有重要作用,在胃癌、肝癌、卵巢癌、结直肠癌、乳腺癌脑膜瘤等实体肿瘤中已经得到证实[1,2,3]。本文通过对不同级别脑膜瘤组织中VEGF表达的差异进行分析发现脑膜瘤组织中VEGF的阳性率为42.1%,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级分别为22.7%、50.0%、100.0%,随分级的进展VEGF的阳性率逐渐增高,这与文献[1]一致,提示,脑膜瘤组织中存在VEGF的高表达,其与脑膜瘤的浸润转移有关。
摘要：目的 探讨脑膜瘤组织中血管内皮生长因子(VEGF)的表达与脑膜瘤分级的关系。方法 采用免疫组化S-P法测定38例脑膜瘤组织中VEGF的表达。结果 脑膜瘤组织中VEGF的阳性率为42.1%,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级分别为22.7%、50.0%、100.0%,随分级的进展VEGF的阳性率逐渐增高,不同级别脑膜瘤组织中VEGF阳性表达率,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 脑膜瘤组织中存在VEGF的高表达,其与脑膜瘤的浸润转移有关。
关键词：脑膜瘤,免疫组化,血管内皮生长因子
参考文献
[1]Baumgarten P,Brokinkel B,Zinke J,et al.Expression of vascular endothelial growth factor(VEGF)and its receptors VEGFR1 and VEGFR2 in primary and recurrent WHO gradeⅢmeningiomas.Histol Histopathol,2013,28(9):1157-1166.
[2]于乐,丁雪贞,孙雅静,等.CD90和VEGF在肝细胞癌组织中的表达.肿瘤基础与临床,2014,27(2):102-104.
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组织表达 篇2
棉铃虫酚氧化酶原基因的克隆、序列分析和组织表达
利用RT-PCR和RACE方法,获得了棉铃虫Helicoverpa armigera酚氧化酶原(prophenoloxidase,PPO)基因一个亚型cDNA的完整序列.该序列全长2 405 bp,含有一个2 097 bp的开放阅读框,编码一个由698个氨基酸残基组成的.蛋白质.推导的氨基酸序列与其他鳞翅目昆虫PPO2基因相应氨基酸序列有较高的同源性(76%～80%),同时该序列具有铜离子结合位点等PPO基因所具有的典型特征.组织特异性表达分析表明,该基因在棉铃虫血细胞、体壁和中肠中均有表达.
作 者：张小玉 徐晓宇 张俊彦 王国秀 刘绪生 ZHANG Xiao-Yu XU Xiao-Yu ZHANG Jun-Yan WANG Guo-Xiu LIU Xu-Sheng 作者单位：华中师范大学生命科学学院,武汉,430079 刊 名：昆虫学报 ISTIC PKU英文刊名：ACTA ENTOMOLOGICA SINICA 年，卷(期)：2006 49(3) 分类号：Q966 关键词：棉铃虫 酚氧化酶原基因 克隆 序列分析 组织表达组织表达 篇3
[关键词] 大肠癌；Wnt信号通路；β-catenin；CyclinD1；免疫组织化学
[中图分类号] R735.3+4???[文献标识码] A???[文章编号] 2095-0616（2012）10-26-03
近年来，Wnt信号系统已经成为分子细胞生物学以及肿瘤学相关领域的研究热点之一，国内外学者的實验研究结果证实：Wnt途径作为调控细胞生长、发育、分化的一条关键路径，一方面决定着胚胎的正常发育，另一方面它的异常启动或异常表达都会引起正常细胞向恶性细胞转变，导致肿瘤的发生[1-4]。
肿瘤的发生与Wnt信号传导通路在β-catenin介导下被异常激活，有着密切的关联。作为Wnt信号传导通路中一个重要的成员，它存在肿瘤的侵袭、转移机制中也有着不容忽视的关系。本研究旨在探讨β-catenin和cyclinD1在大肠癌的发生发展中的作用关系，采用免疫组化法检测其分别在正常的大肠黏膜、大肠腺瘤以及大肠癌中的表达结果，现总结报道如下。
1?资料与方法
1.1?一般资料
选择2008年6月～2011年9月笔者所在医院普外科实施手术切除治疗的大肠癌患者病理标本60例，其中男33例，女27例；平均年龄（53.3±10.4）岁；术后病理诊断为结肠癌34例，直肠癌26例。选择同期诊断为大肠腺瘤的患者病理标本30例，其中男18例，女12例；平均年龄（55.5±10.1）岁。另选取同期正常患者的大肠黏膜病理标本20例作对照，其中男12例，女8例；平均年龄（51.6±9.6）岁。以上所有标本均有病理组织学诊断依据。
1.2?试剂
兔抗β-catenin及cyclinD1多克隆抗体均购自Thermo，美国，工作浓度分别为1∶300及1∶200。
1.3?方法
采用免疫组织化学方法——二步法染色。将所有病理标本选取4 μm做连续病理切片，进行HE染色及免疫组化染色。参照说明书上的具体方法操作，兔抗β-catenin及cyclinD1多克隆抗体在孵育前，经微波抗原对病理切片进行修复。阴性对照组：PBS代替一抗，阳性对照组为选取的大肠癌阳性组织标本。
1.4?结果判定标准
1.4.1?β-catenin的染色判断?按照参考文献[5]的方法：阳性——细胞内可以看到棕黄色颗粒作为标志。
1.4.2?β-catenin的表达特征?可从其在细胞膜、细胞浆以及细胞核3个部位的表达结果进行判断。β-catenin的正常表达主要定位在细胞膜上，正常表达即为超过70%的细胞膜表达阳性，小于70%即为在细胞膜上的表达缺失；异位表达是指β-catenin在细胞浆、细胞核上的阳性表达超过10%。每张切片观察5个高倍镜视野。
1.4.3?CyclinD1的染色判断?阳性：当超过10%的细胞核存在癌细胞阳性表达时；不足则为阴性。
1.5?统计学处理
采用SPSS10.0统计学软件研究所得数据进行录入分析，计数资料采用x2检验，采用直线相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
2?结果
2.1?不同大肠组织中β-catenin的表达结果
2.1.1?正常大肠黏膜组?β-catenin在正常大肠黏膜上的表达呈现出清晰的棕黄色染色，β-catenin的阳性表达几乎全部定位于细胞膜上，仅有个别标本细胞浆可见极弱的染色，但未发现细胞核的表达。
2.1.2?大肠腺瘤组?β-catenin在大肠腺瘤组织细胞浆和细胞核上的表达呈现出异位表达的现象，在细胞膜膜上显示表达缺失增加。
2.1.3?大肠癌组?β-catenin在大肠癌组织细胞浆和细胞核表达明显增加，在细胞膜上显示表达有不同程度的减少。
在大肠癌组织中β-catenin的异位表达率为60%，显著高于大肠腺瘤组的40％，差异有统计学意义（P＜0.05）。β-catenin细胞膜表达缺失率在大肠腺瘤组织为30%，在大肠癌组中为70%，大肠癌组细胞膜表达缺失率显著高于大肠腺瘤组，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1。
2.2?CyclinD1蛋白在大肠肿瘤组织中的表达结果
CyclinD1在正常大肠黏膜组织中表达阴性，在大肠腺瘤以及大肠癌组织中主要呈现细胞核的表达，呈细胞质表达占少数。CyclinD1的阳性表达率在大肠癌组织中为70%，显著高于大肠腺瘤组的40%，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表2。
2.3?大肠癌组织中β-catenin与cyclinD1表达的关系
在大肠癌组织中，β-catenin 的异位表达率与cyclinD1的阳性表达率，经过直线关系统计学分析方法处理后显示，二者存在显著的正相关关系（r=0.31，P＜0.05）。见表3。
3?讨论
大肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一，而大肠腺瘤则是一种具有癌变潜能的良性肿瘤。1990年Fearon和 Vogelstein[6]提出大肠癌发生的相关分子模型，并认为大肠癌的发生是经过正常的肠道黏膜上皮形成了早期腺瘤、进而进展为中、晚期腺瘤，最后转变为浸润性癌组织的，再发生以及癌组织的转移表现出一个循序渐进的进展过程。在大肠癌多阶段的发展过程中，涉及到许多癌基因、抑癌基因和信号通路的改变。近年来有很多学者进行了此方面的研究，结果发现在大肠癌发生发展过程中β-catenin及其相关通路基因的转变起着十分关键的作用。β-catenin基因定位在人3p21.3染色体上，作为一种原癌基因存在，它的mRNA长度约为3 362个核苷酸残基。β-catenin蛋白的分子量约为92～95 KD，是一个多功能调节蛋白，作用机制表现为两个相对独立的过程：第一它作为连接细胞间粘附的一种主要的结构成分，第二又作为Wnt信号通路中的一个重要的中枢成分存在。正常情况下，β-catenin存在于成熟的细胞胞浆内，大部分能够与细胞膜上的E-cadherin胞内肽段结合，参加到细胞的粘连、生长、增殖等过程中；另有一少部分与可以与细胞浆内的GSK-3β、APC以及Axin蛋白相结合，进一步构建成为多蛋白复合体，而后的降解则主要是通过磷酸化与去磷酸化作用来实现。从以上的机制决定了β-catenin在胞浆内的表达水平极低，因此不能够进入到细胞核，不能调控相关基因的表达。但如果由于一些原因导致游离的β-catenin在胞浆内堆积，进一步与Tcf-4结合，并形成复合物，再次进入到细胞核内，激活了位于下游的如 c-myc、cyclinD1、gastrin 等的靶基因，转录该通路就会发生异常，肿瘤生长的相关程序会被进一步的启动[7-9]。
本实验选择了60例大肠癌组织、30例大肠腺瘤组织以及20例正常的大肠黏膜组织进行了β-catenin及cyclinD1表达的相关研究，结果显示β-catenin在正常的大肠黏膜组织上的表达几乎全部定位于细胞膜上，未发现其于细胞核内的表达。β-catenin的异常表达在大肠腺瘤以及大肠癌组织中存在相对普遍，并呈现出逐渐增高增多的趋势，尤其在大肠癌组织的细胞核和细胞浆中，β-catenin的异位表达呈现出明显的增加，细胞膜表达存在不同程度的表达缺失。仅统计学分析显示，大肠癌组织中β-catenin的异位表达率明显高于大肠腺瘤组织，大肠癌组织β-catenin细胞膜表达缺失率显著高于大肠腺瘤，差异具有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）。
近年来的研究结果还发现，β-catenin基因突变在大肠癌组织中普遍存在，β-catenin外显子3的第33、37、41、45 位密码子编码区域构成的β-catenin蛋白的NH2末端，它是与GSK-3β结合后可以发生磷酸化的位点，他的缺失或突变均会导致β-cateni不与GSK-3β结合而免于降解，进一步导致β-catenin在胞浆的积聚。β-catenin的基因突变在大肠腺瘤以及大肠癌组织中相当明显，其中以外显子3的突变最为常见。Samowitz等[10]采用类似的实验方法对202例大肠肿瘤组织病例进行的研究发现，β-catenin的基因突变率在小于1 cm的大肠小腺瘤组织中占12.5%，明显高于1 cm 及以上的腺瘤组织（2.4%）以及浸润性腺癌组织（1.4%），差异有统计学意义。另外，β-catenin mRNA在大肠癌组织以及癌转移灶中都被发现具有明显增加的趋势[11]。
Hao等[12]分析了74例大肠腺瘤、65例瘤旁正常黏膜以及52例腺瘤癌变的结果显示，β-catenin在正常黏膜中的表达大多表现为在细胞膜的表达，但在大肠腺瘤以及大肠癌组织中的细胞核的异位表达就出现了不同程度的增多，而细胞膜的表达减少，且β-catenin异位表达的程度是伴随着大肠腺瘤组织中上皮细胞不典型的增生程度的增高，呈现出增强趋势。故笔者认为，β-catenin在细胞膜上表达的下降以及细胞核表达的增加，对大肠腺瘤恶变进展为腺癌存在不容忽视的关系，是大肠癌发生的早期事件。Brabletz等[13]也分析了88例大肠腺瘤组织中的的β-catenin表达结果，显示45.4％的腺瘤组织中细胞核表达呈现阳性，统计学分析显示细胞核的表达与大肠腺瘤组织的大小呈现出正相关的关系，同时证实β-catenin 的异常表达参与了大肠肿瘤的发生过程。
Cyclin D1作为细胞周期调节的一种正性调控因子， 在细胞增殖周期卡点G1/S 转换过程中，他的含量以及活化的程度均具有限速作用，cyclin D1过度的表达可以诱发细胞周期调控的异常， 进一步导致肿瘤的发生[14]。随着对Wnt信号传导通路进一步的深入研究显示，cyclinD1同样是该通路下游一个十分重要的靶基因。本研究结果显示cyclinD1在正常的大肠黏膜中无表达，大肠癌 cyclinD1阳性表达率为70%，显著高于大肠腺瘤（40%，P＜0.05），提示cyclinD1的过度表达可能与大肠癌的发生有关，进一步证实cyclinD1为原癌基因。在结肠家族性息肉病患者腺瘤组织中发现β-catenin、cyclin D1的表达明显高于正常黏膜，而且β-catenin与cyclinD1表达呈正相关[15]。
大肠癌相关的分子模型的建立，直观显示除了大肠癌发生发展的规律，也就是它由正常的黏膜组织逐步发展成为大肠腺瘤，最后在种种刺激下被诱导向大肠癌转变，最后发生局部的浸润、远处的转移的一个进展过程。
β-catenin基因在大肠癌发生发展过程中有着非常重要的作用，β-catenin蛋白表达的异常，尤其是其在细胞核以及细胞浆中表达的增加，能够进一步激活cyclinD1、c-myc等基因的表达，导致细胞增殖和分化的失调，这与大肠腺瘤癌变和大肠癌发生早期中扮演重要的角色。同时β-catenin蛋白的异常表达也可以作为预测大肠癌患者侵袭转移及评估预后的一个重要的指标。因此，β-catenin相关的信号通路作为大肠肿瘤发生发展的一条重要通路，在肿瘤患者的诊断以及治疗中具有重要意义，可作为大肠癌治疗中新的作用靶点，进一步研究β-catenin 的相关基因极其信号转导途径，势必会在未来为大肠肿瘤的诊断和基因治疗提供新的发展前景及研究基础。
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组织表达 篇4
作为企业文化的奠基人, “埃德加·沙因 (Edgar H.Schein) 是在国际上享有盛誉的实战派管理咨询专家, ‘企业文化’一词被业界公认是由他“发明”的。”1 9 8 6年, 他又把企业文化划分为三种水平, 我国学者凌文辁、郑晓明等将其译为: (1) 表面层。系指组织的明显品质和物理特征 (如建筑、文件、标语等肉眼可见的特质) 。 (2) 应然层。位于表层之下, 主要指价值观。 (3) 突然层。位于最内部, 是组织用以应付环境的实际方式。”
按照沙因的理论, 企业文化经过长期的建设、维护与形成后, 终将以明显的物理特征如建筑、文件、标语等符号的形式表达与他人面前。
我国台湾学者在解释沙因的表面层文化时, 将其命名为器物及创制 (artifacts and creations) , 是指语言、典礼、制度、行为等有形文化, 它是组织文化中最可见的部分。当我们无法直接观察到组织的价值、规范和期望时, 往往可以由这些可以观察得到的人工器物和创造物来加以判读和推测。在这些器物与创制中, 主要包括:
1. 语辞类的人造品。
一是指符号、手势、标帜等, 它们常可用来对外宣示组织的特质或理想, 对内促进组织成员对组织的认同及承诺感。二是与组织相关的典故, 其中包含着组织所珍视的价值和行为规范;三是迷思的使用。迷思是传奇性的神话, 以光耀组织并巩固主角人物的德行。四是术语的编制。通常组织成员发明一种新语言, 只对该团体成员有用, 此举一方面能加速组织成员的沟通, 再方面可作为确认成员的手段。
2. 行为上的人造品。
一是指仪式。仪式是一种精炼化的活动, 颇具戏剧效果, 在保持与传承文化方面扮演着相当重要的角色。二是庆典。组织中另一种明显仪式是在成员地位的改变方面, 许多机构常以豪华隆重的表扬典礼, 展示公司对员工工作表现的认同。
3. 物质上的人造品。
一是指组织的物质环境如建筑物, 这些物理特征非常显著的人造品是一个组织区别于其他组织的最明显符号;二是室内隔间及设计, 家具的购买与摆放, 装饰品的挑选与使用等, 这些人造品会强调组织的审美与品味, 是企业文化的典型体现;三是成员的服饰, 以及公司为不同的员工配备的不同待遇, 如高档轿车等, 这些器物一是对内激发组织成员责任感与荣誉感的手段, 二是对外表征企业的能力与水准。
二、“剧班”的印象整饰与企业文化的符号表达
在日常互动中, 人们总是通过行为来表现自己以便给人留下印象。社会学著名学者戈夫曼的印象整饰理论认为, 人生是个大舞台, 而人与人之间的社会互动有如演员相互配合的演戏。其中, 戈夫曼从戏剧舞台中借用来的另一个最为形象、妥帖的说明日常互动和印象整饰的词语是“剧班”。剧班指的是“在表演同一常规程序时相互合作的任何一班人。”在戈夫曼看来, 不能将剧班视为个体表演者的简单相加, 因为如果说个体表演者表现的只是自己的特征, 那么剧班表现的则是成员间的关系和被表演的工作的特征。用我们现在的话来说, 剧班的表演是一种群体性的印象整饰。
所谓印象整饰, 即人们按社会剧本的需要 (即社会期望的需要) 扮演自己的角色, 而他们的演出又受到互动对方的制约。因此, 要使互动能够顺利进行, 互动的双方都应有能力运用某种互动的技巧对自己的印象进行控制、管理、整饰。这种对自我形象的管理能力就叫印象整饰。
戈夫曼的“剧班”整饰理论, 可以很好地说明企业文化表面层文化符号表达的过程。按照戈夫曼的理论, 企业不断地设计、寻求、谋划各种器物与人造品的过程, 就是在为所有成员制定统一的规范与形象, 并试图通过所有成员刻意使用这种形象, 以达到对外界“表演”的目的。
以往的研究中, 大家更重视个体的印象整饰。笔者以为, 组织的印象整饰在企业文化的符号表达中, 有着比个体整饰更加重要的作用。因为一个企业文化的符号表达, 不是通过哪个员工自己就能完成的, 它需要组织整体表达出一种特定的、共有的状态。这就需要通过企业文化的内化, 形成每个员工共同支持企业文化符号的愿望, 并时刻以群体的利益为前提, 刻意去表达它。
三、组织印象整饰的过程与技巧
组织的印象整饰, 同个体的印象整饰一样, 都需要前期的自我知觉与设计。其过程大体包括以下阶段:
1. 印象动机的产生与形成。
所谓印象动机, 就是指组织是否试图对自己的形象进行管理, 或者这种表达自我形象的愿望是否强烈。有的企业只有对员工的内部管理, 却没有集合所有企业形象去对外表达的动机, 或者这种动机不是很强烈。
因此, 若想进行组织的印象整饰, 就必须先行形成组织的印象动机, 使企业从上到下产生一致对外进行“表演”的愿望, 而且应该使用一切手段使这种愿望达到最强烈的程度。
2. 印象构建的过程。
当组织与所有员工都形成了印象动机后, 第二个阶段就是思考与谋划阶段。即组织的管理者要思考我们的组织想给社会与他人留下一个什么样的印象?而且我们用怎样的物质符号才能够表达这种印象?
这种印象构建的过程, 就是企业文化从深层次的价值观的确立, 到全体员工的认同, 再提炼出器物与人造品的过程。它是一个复杂而且艰巨的过程, 需要凝结全体员工与管理者的智慧。
当以上过程完成后, 组织就可以开始表达自己企业文化的符号了。
组织通过印象整饰表达自己的文化符号时的技巧包括:
(1) 强调团体的声誉。在组织员工“表演”时, 要加强员工的归属感与荣誉感, 使其进入激情状态。有了情感的投入, 演出效果才会良好。
(2) 明确团体任务。只有目标清晰, 任务明确, 表演的目的性才会增强。使大家时刻牢记自己的角色, 并以主人翁的精神支持、表达这种符号。
摘要：以往的研究中, 大家更重视个体的印象整饰。笔者以为, 组织的印象整饰在企业文化的符号表达中, 有着比个体整饰更加重要的作用。社会学著名学者戈夫曼的印象整饰理论, 可以很好地说明企业文化表面层文化符号表达的过程。
关键词：企业文化的层面,符号表达,印象整饰
参考文献
[1]周施恩:从埃德加·沙因“眼”里看中国企业文化.企业研究, 总261期2006～3～8
组织表达 篇5
[摘要] 目的 研究乏氧诱导因子-1α在原发性肝细胞癌组织、癌旁肝硬化组织、非癌肝硬化组织及正常肝组织中的表达状态。 方法 收集2009年3月～2010年9月在笔者所在医院诊断原发性肝细胞癌而行手术治疗的56例肝癌组织标本，同时收集合并有肝硬化背景的癌旁肝组织27例，因乙肝肝硬化门脉高压症而行门奇断流术的非癌肝硬化组织23例及11例取自肝血管瘤周围或肝外伤后切除的肝组织作为对照。通过免疫组织化学技术SP染色方法检测HIF-lα在4种肝脏组织中的蛋白表达情况。 结果 在肝细胞癌组织中HIF-lα蛋白的阳性表达率为71.4％，明显强于癌旁肝硬化组织中（48.1％）的表达，两者比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；癌旁肝硬化组织中的阳性表达率又强于非癌肝硬化组织中的表达（17.4％），两者比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；但非癌肝硬化组织与正常肝组织（9.1%）比较，HIF-lα的表达则差异无统计学意义（P＞0.05）。 结论 HCC中存在着乏氧现象，并以其为始动因素诱导了调控因子HIF-lα基因的过度表达。
[关键词] 乏氧诱导因子-1；肝细胞癌；肝硬化
组织表达 篇6
促性腺激素释放激素受体( Gonadotropin - Releasing Hormone Receptor,GnRHR ) 是细胞膜上GnRH结合蛋白偶联家族体系的成员,是由丘脑下部神经内分泌细胞合成的一种十肽,是下丘脑 - 垂体 - 性腺轴 ( Hypothalamus - pituitary - gonadal - axis,HPG) 的关键神经内分泌调节因子,GnRH作用的发挥依赖于促性腺激素释放激素受体的存在[1]。GnRHR在结构上是由组成7种跨膜区域的多肽单链构成。属于7次跨膜的G蛋白耦联受体超家族[2]。Montgnmery G W[3]等通过研究把绵羊的GnRHR基因定位到6号染色体上。Campion Christine E[4]等获得了绵羊GnRHR基因完全的编码序列,绵羊GnRHR基因由3个外显子和2个内含子组成。
目前关于贵州地方山羊组织内GnRHR基因表达方面的研究未有报道,魏锁成[5]等检测了GnRHR在卵巢和子宫上表达的情况。杜红丽等[6]对二花脸和杜洛克猪GnRHR基因在输卵管、垂体组织中的表达差异进行了研究。张育军[7]在黄淮山羊的GnRHR基因外显子1上发现A58C突变,结果突变型比野生型产羔多0. 66只; 黄杨河[8]采用PCR - SSCP技术在GnRHR基因发现G154A处发生突变,该突变位点与川东白山羊产羔数显著相关。本试验拟利用荧光定量PCR技术检测GnRHR基因在高繁殖力的黔北麻羊、贵州白山羊和低繁殖力的贵州黑山羊和小香羊南江黄羊母羊下丘脑、垂体、卵巢、子宫、输卵管组织的表达水平差异,为研究贵州地方山羊的繁殖力遗传机制打下基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验材料
采集6月龄黔北麻羊、贵州黑山羊、贵州白山羊和小香羊母羊( 各3只) 垂体、下丘脑、输卵管、子宫和卵巢组织。黔北麻羊、贵州黑山羊、贵州白山羊和小香羊母羊分别采自贵州省习水县、赫章县、沿河县、 雷山县。提取组织总RNA,- 80℃保存。
1.1.2试剂
DEPC、c DNA反转率试剂盒、p UCm - T载体、小量质粒抽提试剂盒、感受态细胞DH5ɑ、胶回收试剂盒均购自生工生物工程( 上海) 股份有限公司; EASY dilution、DL2000 DNA marker均购自鼎国生物工程技术有限公司; TAE缓冲液、双蒸水等为作者实验室自制。
1.1.3仪器
紫外分光光度计( Ultrospec 2100 pro,安玛西亚中国有限公司) ; 高速冷冻离心机( Heraeus Multifuge X1R,美国赛默飞世尔公司) ; 荧光定量PCR扩增仪 ( C1000 TouchTM,美国BIO - RAD公司) 。
1.2方法
1.2.1荧光定量引物的设计与合成
参照Gen Bank收录的GnRHR c DNA基因序列 ( 登录号: NM_001009397) ,运用Primier 5. 0和Oligo软件设计跨外显子2和3的特异性引物。引物由生工生物工程( 上海) 股份有限公司合成。引物的详细信息见表1。
1.2.2RT-PCR反应和克隆测序
反应条件: 2 × Es Taq Master Mix 10 μl,上、下游引物( 10mmol/L) 各1 L,c DNA 1μl,用灭菌水补充至总体积20 μl。反应程序为: 94 ℃ 预变性5 min; 94 ℃ 变性30 s,表1退火温度30 s,72 ℃ 延伸30 s,共33 ~ 36个循环; 最后72 ℃ 延伸10 min。PCR扩增产物经1 ﹪琼脂糖凝胶电泳分离,紫外灯下割取目的片段,用胶回收试剂盒回收纯化。纯化的PCR产物送英潍捷基贸易公司测序。
1.2.3荧光定量PCR
试验采用SYBR GreenⅠ法进行荧光定量反应, 以GAPDH基因为内参基因。用克隆有目的片段的质粒梯度稀释后做标准品制作标准曲线,每个样品做3次重复。荧光定量PCR采用20 μL反应体系: SYBR Rremix Ex TaqTMⅡ( 北京康为世纪科技有限公司) 10 μl,上游引物0. 75 μL,下游引物0. 75 μL,H2O 7. 5 μL,c DNA 1 μL。实时荧光定量PCR反应程序: 95 ℃ 预变性30 s,然后95 ℃ 10 s,表1所列退火温度退火30 s读板收集荧光,39个循环; 最后从55 ℃ 到95 ℃ ,按0. 5 ℃ 增值进行溶解曲线分析,荧光采集时间为5 s。
1.2.4数据分析
试验结果以GAPDH为内参基因,选取垂体组织为对照,应用2- △△Ct法[9]分析GnRHR基因在不同品种山羊不同组织中的差异表达量。
2结果与分析
2.1GnRHR基因片段的PCR扩增
M. DL2000 marker; 1. GnRHR; 2. GAPDH.
反转录合成c DNA,进行PCR扩增,用1 ﹪琼脂糖凝胶电泳观察结果,得到与预期大小相符的单一扩增条带( 图1) 。扩增产物回收纯化后克隆测序,测序结果与预期扩增片段一致。
2.2实时荧光定量PCR产物特异性
由试验结果可知,该标准曲线的相关系数( R2) 为0. 999、扩增效率( E) 为102. 8% ( 图2、3) ,说明GnRHR和GAPDH基因扩增效率基本相同,可用于 △△Ct相对定量PCR分析。溶解曲线( 图4) 表明, GnRHR和GAPDH基因片段溶解曲线均为单峰,无引物二聚体峰和非特异性扩增产物出现,说明引物特异性好,可用于后续试验。
1. A 为 GnRHR 基因,B 为 GAPDH 基因; 2. 横坐标为循环数,纵坐标为。1. A: GnRHR,B: GAPDH; 2. Abscissa represent threshold cycle,ordinates represent fluorescent value.
2.3GnRHRmRNA在贵州地方山羊不同组织中的转录水平
对同一年龄段不同品种的山羊组织中FSHR基因的表达量进行检测,结果以垂体组织对照,黔北麻羊、贵州白山羊和小香羊垂体组织表达量最高,而贵州黑山羊下丘脑组织表达量最高。
1. A 为 GnRHR 基因,B 为 GAPDH 基因; 2. 横坐标为起始浓度对数值, 纵坐标为循环数。1. A: GnRHR,B: GAPDH; 2. Abscissa represent Log starting quantity,ordinates represent threshold cycle.
3讨论
GnRH是下丘脑 - 垂体 - 性腺轴上的调节器,下丘脑是其主要分泌器官,GnRH通过血液循环到达垂体,刺激垂体产生与释放促性腺激素,然后调节性腺产生性激素与生殖细胞,GnRH发挥作用的前提就是需要与GnRHR特异性结合,通过GnRHR介导产生生理作用[10]。哺乳动物的排卵依赖于LH高峰,GnRH分泌的增加和GnRHR数量的增加都会引起LH高峰。因此,GnRH基因和GnRHR基因在哺乳动物的繁殖调控中起着重要作用。GnRH通过旁分泌或者自分泌作用于HPG轴,因此HPG轴上的每个器官都应该存在GnRHR,尤其作为靶器官的垂体含量最高。随着GnRHR研究的深入,在许多动物的HPG轴以外的很多器官也检测到GnRHR,发挥着不同功能,例如在乳腺癌细胞发现GnRH及受体,抑制性自调节癌细胞的生长[11]; 张伟[12]等在湖羊消化系统的各个器官均检测到GnRHR; 彭亮[13]对GnRHR的检测发现在番鸭的HPG轴上的下丘脑、垂体、性腺( 卵巢或睾丸) 均有表达,并且垂体的表达量最高。韩有胜[14]发现GnRHR基因在巴美肉羊子宫和卵巢组织的表达量双羔组大于单羔组。张涛研究发现GnRHR基因在垂体组织中高表达,显著高于下丘脑、卵巢、心和肝等组织。因此,试验说明GnRHR基因主要在垂体组织中表达,在其他组织中表达量较低。本试验对GnRHR基因在黔北麻羊、贵州白山羊、贵州黑山羊、小香羊下丘脑、垂体、子宫、输卵管、卵巢中的表达规律进行了检测,结果表明5种组织中均有表达。其中GnRHR mRNA在黔北麻羊和小香羊垂体组织中的表达水平均高于其它组织,这与之前研究结果一致。而贵州黑山羊下丘脑组织中的表达量远高于其它组织, 这可能与贵州黑山羊性成熟较早有关。贵州黑山羊在6月龄以达到初配月龄,早于白山羊和黔北麻羊, 而GnRHR分泌量的增加是性成熟启动的关键因素[14]。
1. A 为 GnRHR 基因,B 为 GAPDH 基因; 2. 横坐标为退火温度,纵坐标。 1. A: GnRHR,B: GAPDH; 2. Abscissa represent annealing temperature,ordinates represent fluorescent value.
4结论
本研究运用荧光定量PCR技术检测出GnRHR基因在贵州白山羊、黔北麻羊和小香羊垂体组织中的表达量高于下丘脑、卵巢、输卵管和子宫,在贵州黑山羊下丘脑组织的表达量高于其他组织。
摘要：[目的]了解GnRHR基因的功能,为山羊选种选育提供更好的科学依据。[方法]采用荧光定量PCR技术分析了贵州地方山羊不同组织GnRHR基因的表达差异。[结果]黔北麻羊中子宫、下丘脑、输卵管和卵巢组织的表达量分别是是垂体组织的0.31、0.42、0.01和0.03倍。贵州白山羊和小香羊垂体组织中表达量是输卵管和卵巢组织的0.13和0.01倍;GnRHR基因在贵州黑山羊下丘脑组织中的表达量是垂体组织的5.5倍,且远高于其它组织。[结论]该研究结果将会为进一步研究该基因对山羊繁殖相关功能影响的研究奠定基础。
组织表达 篇7
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集我院2006～2009年存档的腮腺肿瘤蜡块标本58例, 均为10%中性福尔马林固定, 石蜡包埋, 制备常规连续切片与组织芯片, 并根据镜下特征将腮腺癌分为高分化组和中低分化组。
1.2 仪器设备及试剂
Germany Leica系列石蜡切片机, 摄像显微镜, 摊片机, 烘片机, 电热恒温培养箱, 微量移液器等;鼠单克隆抗体survivin Ab-2, PV6000二步法免疫组化染色试剂盒。
1.3 免疫组织化学染色
采用PV6000二步法, 按说明书进行。
1.4 统计学方法
SPSS11.0统计软件分析, 采用χ2 检验, P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 survivin免疫组化定性结果
survivin蛋白阳性染色呈棕褐色颗粒, 主要分布在细胞浆内。在腮腺肿瘤组织中阳性表达清晰 (见表1) 。
2.2 高分化腮腺癌组与中低分化腮腺癌组survivin表达的比较
38例高分化腮腺癌中有21例阳性表达, 阳性率55.26%, 20例低分化腮腺癌中17例阳性, 阳性率85.00%, 中低分化组中survivin的表达明显高于高分化组。
2.3 组织芯片与常规切片的比较
芯片HE染色各点阵排列整齐, 染色层次分明, 形态学观察:与组织切片在形态学上无差异;常规切片与组织芯片survivin免疫组化阳性的检验结果无差异 (P>0.05) , 所以认为常规切片与组织芯片survivin免疫组化结果有较好的一致性 (见表2) 。
3 讨论
通过PAS染色、阿辛蓝染色、粘液卡红染色、甲苯胺蓝染色, 检测肿瘤细胞所含粘多糖的性质有助于腺泡细胞癌、粘液表皮样癌和非特异性透明细胞癌等肿瘤的鉴别[1], 通过磷钨酸苏木素染色, 检测肿瘤细胞是否含有线粒体而有助于嗜酸性腺瘤等肿瘤的鉴别诊断, 通过脂肪染色, 有助于含皮脂腺细胞肿瘤的鉴别[2]。免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术是利用抗原与抗体的特异性结合反应, 研究抗原与抗体在细胞和组织内的分布的技术。它特异性强, 灵敏度高, 结果客观, 广泛用于肿瘤的诊断与鉴别诊断, 尤其在判断肿瘤的组织来源更有其突出的优点[3]。免疫组织化学技术常用于涎腺肿瘤鉴别诊断的有:淀粉酶对腺泡细胞癌与其他透明性肿瘤的鉴别:calonin、s-100蛋白、肌动蛋白、肌球蛋白等用于肌上皮细胞肿瘤的鉴别。另外, 在腮腺癌中survivin的表达与肿瘤 的分化程度有关, 组织分化愈差, survivin阳性表达率愈高[4], 说明survivin基因的表达程度与肿瘤进展和恶性程度相一致, 故可作为判断预后的指标之一。本实验还应用腮腺肿瘤组织芯片进行了survivin免疫组化研究, 结果显示组织芯片免疫组化染色清晰[5], 可保护腮腺肿瘤标本。
关键词：survivin,腮腺肿瘤,免疫组化,组织芯片
参考文献
[1]Lo-Muzio L, Staibano S, Pannone G, et al.Expression of the apop-tosis inhibitor survivin in aggressive squamous cell carcinoma[J].Exp Mol Pathol, 2001, 70 (3) :249-254
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[3]于萍, 步宏, 王华, 等.免疫组化结果的图象分析与人工计算方法的对比研究[J].生物医学工程杂志, 2003, 20 (2) :288-290
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瘦素受体在小尾寒羊组织中的表达 篇8
OB-R是leptin 在机体发挥生物学效应的特异性结合蛋白, 以往的研究大都集中在内分泌、外周生殖等系统, 对OB-R在胃肠消化系统中的分布及作用研究较少。试验采用H.E.和免疫组织化学方法, 对小尾寒羊神经内分泌中下丘脑、垂体和消化系统中皱胃、十二指肠的OB-R 进行定位研究, 以期为进一步研究瘦素调节机理奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
在屠宰厂选取6月龄左右、健康、发育正常、雌性小尾寒羊6只。动物大抹脖法处死后立即开膛, 剪取十二指肠中段和皱胃底部组织, 生理盐水冲洗后放入已准备好的4%中性甲醛固定液中。同时割下羊脑, 打开头盖骨, 摘取下丘脑和脑垂体并及时放入固定液。待组织固定2 h后对组织进行修剪, 去除多余的脂肪组织和肠系膜等, 并更换固定液。固定12～24 h后常规石蜡包埋切片, 切片厚5 μm。分别做H.E.和免疫组织化学SABC染色。
1.2 H.E.染色
切片经脱蜡、染色、脱水、透明和封片后于显微镜下进行组织学观察。
1.3 免疫组织化学SABC染色
兔抗山羊OB-R一抗试剂盒, 购自北京博奥森生物工程有限公司;浓缩型DAB显色试剂盒, 购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
染色过程: (1) 常规石蜡切片、脱蜡、水化, PBS (pH值7.2) 冲洗 (5 min×3) ; (2) 枸橼酸盐缓冲液 (pH值 6.0) 92 ℃ 热修复15 min, 自然冷却至室温, PBS冲洗 (5 min×3) ; (3) 滴加3%去离子水过氧化酶阻断溶液, 作用10 min; (4) 加入封闭用正常山羊血清工作液 (试剂A) , 作用30 min; (5) 滴加一抗 (4 ℃过夜) , PBS冲洗 (5 min×3) ; (6) 滴加生物素标记的羊抗兔二抗工作液 (试剂B) , 37℃作用35 min; (7) 滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液 (试剂C) , 37 ℃作用40 min; (8) DAB显色, 显微镜控制, 一般10～15 min, PBS 冲洗10 min, 纯化水冲洗10 min; (9) 苏木素复染, 纯化水冲洗, 脱水, 透明, 中性树胶封片, 镜检。
1.4 对照试验
采用PBS代替一抗作为阴性对照, 以脂肪组织的染色结果作为阳性对照。
1.5 结果判断
OB-R阳性细胞为细胞质内出现棕黄色颗粒。
2 结果与分析
2.1 H.E.染色
显微镜下观察, 不同器官的组织形态均清晰可见, 结构正常。脑垂体远侧部可见嗜酸性细胞、嗜碱性细胞和嫌色细胞等。胃壁各层结构清晰, 固有层的胃底腺可见壁细胞、主细胞、颈黏液细胞。十二指肠肠壁结构完整清晰。
2.2 对照试验
阴性对照试验结果:镜下可见大小不等的淡蓝色细胞核, 细胞轮廓不清。阳性对照试验结果:脂肪细胞胞浆内出现深棕色颗粒。
2.3 免疫组织化学SABC 染色 (见图1)
A.下丘脑呈OB-R免疫反应阳性; B.下丘脑神经细胞呈OB-R免疫反应阳性细胞; C.垂体的腺垂体呈OB-R免疫反应阳性; D.腺垂体嗜色细胞呈OB-R免疫反应阳性; E.皱胃胃壁呈OB-R免疫反应阳性; F.胃底腺壁细胞呈OB-R免疫反应阳性; G.十二指肠肠壁呈OB-R免疫反应阳性;H.固有层小肠 腺柱状细胞呈OB-R免疫反应阳性。
2.3.1 下丘脑免疫组织化学染色结果
在下丘脑中, 可见大量棕黄色OB-R阳性细胞 (见图1A) 。部分神经元的胞质呈棕黄色, 胞体大小不一, 呈梭形或圆形, 胞核位于中央 (见图1B) 。
2.3.2 脑垂体免疫组织化学染色结果
在垂体中, OB-R阳性细胞主要分布于腺垂体的远侧部 (见图1C) 。阳性细胞体积较大, 细胞核圆形位于细胞中央, 部分为深棕色, 腺管周围的阳性细胞较多, 细胞浆棕黄色 (见图1D) 。
2.3.3 皱胃免疫组织化学染色结果
在皱胃肌层和浆膜层未见明显的OB-R阳性细胞, 在黏膜层胃底腺的底部和顶部, 可见呈纵向条带状分布的大量OB-R阳性细胞, 固有层结缔组织中未见阳性细胞 (见图1E) 。阳性细胞体积较大, 圆形, 呈弥漫分布。细胞核较大呈圆形或锥体形, 胞质呈棕黄色 (见图1F) , 经与H.E.染色的玻片对比观察, 免疫反应阳性细胞的形态、大小及分布特点与H.E.染色的壁细胞一致。因此, 认为胃腺中呈OB-R免疫反应阳性细胞主要是壁细胞。
2.3.4 十二指肠免疫组织化学染色结果
在黏膜层、肌层和浆膜层未见明显的OB-R阳性表达颗粒, 固有层的肠腺中可见大量阳性表达细胞 (见图1G) 。柱状细胞胞质为棕黄色, 胞核较小位于细胞的基底部。杯状细胞呈空泡状, 未见OB-R蛋白质表达 (见图1H) 。
3 讨论与小结
下丘脑是机体调节内脏活动的较高级中枢, 又是机体调节能量动态平衡、食欲和繁殖的中枢神经系统的关键部位。腹内侧核微注射瘦素可引起循环中儿茶酚胺浓度增高, 同时可以促进外周组织对葡萄糖的摄取 [3]。到达下丘脑的瘦素通过抑制神经肽Y分泌、促进黑色素皮质激素与受体结合, 导致食欲降低, 摄食量减少[4]。OB-R在下丘脑神经细胞中的高度表达说明瘦素在小尾寒羊的神经内分泌中具有重要作用, 可能通过位于下丘脑的瘦素受体完成瘦素对食欲的控制和调节, 而这恰与瘦素最重要的生理功能即调节摄食、控制体重以及下丘脑的摄食调节机能相吻合。垂体的腺垂体细胞通过分泌多种激素来调节和促进动物的生长发育, 垂体瘦素主要调节促性腺激素的释放。往小鼠垂体内注射少量瘦素, 可以显著增强动物的兴奋性[5]。小尾寒羊腺垂体部嗜色细胞中OB-R蛋白的大量表达, 证实瘦素是调节促性腺激素释放的关键激素, 通过调节促性腺激素的释放, 进而影响一系列激素的合成或释放。神经内分泌系统瘦素受体的大量存在, 为进一步研究瘦素受体的作用机理初步奠定了理论基础。
自1998年报道大鼠胃腺中存在OB-R后, Badoer等在小鼠的小肠中发现了OB-R的存在。瘦素可促进胃肠黏膜细胞生长和营养物质吸收, 并通过旁分泌、自分泌或内分泌的方式发挥调节摄食和能量代谢的效应[6]。瘦素在胃黏膜局部可发挥类似转化生长因子 (TGF) 2β 和表皮生长因子 (EGF) 的作用, 维护黏膜上皮完整并促进其增生。人胃黏膜的胃底和胃窦基底黏膜侧细胞或壁细胞的泌酸小管中存在OB-R[7]。彭彦霄等[8]发现, 在人和大鼠的十二指肠、空肠和结肠中有瘦素OB-R 受体存在, 定位在肠上皮细胞的刷状缘、基底外侧膜和细胞质内。试验中, 阳性表达细胞主要位于小尾寒羊皱胃胃底腺的壁细胞和十二指肠小肠腺的柱状细胞中, 与上述研究结果基本一致。进一步证实letin通过壁细胞的OB-R发挥调节盐酸分泌的功能, 进而控制食物的消化速度。瘦素浓度的升高对肠运动起一定的抑制作用。说明瘦素又可以调节肠道蠕动的快慢, 可能通过抑制肠管蠕动, 减少蠕动频率而减缓其排空, 延长食物的滞留时间, 不仅保证营养物质得到充分吸收, 也可减少进食量。在畜牧业中应用有望降低料肉比, 提高生产效益和饲料利用率。
摘要：为了研究瘦素受体在小尾寒羊组织中的表达, 试验采用H.E.和免疫组织化学SABC染色方法对小尾寒羊下丘脑、垂体、皱胃和十二指肠的瘦素受体 (OB-R) 进行定位研究。结果表明:H.E.染色显示各组织结构正常, 细胞形态均清晰可见;SABC染色可见在下丘脑的神经元胞质、脑垂体的腺垂体细胞、皱胃胃体部固有层的壁细胞和十二指肠固有层肠腺的柱状细胞均可见大小不等的棕黄色颗粒, 呈阳性表达。表明瘦素对小尾寒羊的消化系统具有调节作用, 瘦素受体对小尾寒羊的生长发育起着重要作用。
关键词：瘦素受体,小尾寒羊,免疫组织化学
参考文献
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组织表达 篇9
1 材料与方法
1.1 试验动物及试剂
试验用泸宁鸡, 来自四川省凉山州冕宁县原生农业有限公司, 屠宰后迅速采集其组织样置于液氮中, 备用。
扩增用的Taq酶、转化载体p MD19-T及反转录试剂盒, 由Ta KaRa公司提供;TRIzol试剂, 由Invitrogen公司提供;胶回收试剂盒, 由北京博大泰克生物基因技术有限责任公司提供;大肠杆菌DH5α感受态细胞, 购于天根生化科技 (北京) 有限公司。
1.2 引物的设计与合成
依据Gen Benk中原鸡的Myo G基因序列 (登录号为NP 989515.1) , 用Primer Premier 5.0软件设计扩增引物, 包括完整的开放阅读框 (ORF) , 引物序列:上游引物5'-TCCCATGGAGCTCTTTGAGACC-3', 下游引物5'-ATCACCATCCCACCCCGTTT-3', 送上海生工生物工程技术服务有限公司合成, 产物长度为741 bp。
1.3 泸宁鸡Myo G基因克隆
采用TRIzol法提取泸宁鸡组织样中的总RNA, 用分光光度仪检测总RNA的浓度, 根据反转录试剂盒说明书对总RNA进行反转录, 以反转录产物c D-NA为模板进行PCR, PCR反应体系 (25μL) :灭菌去离子水9.5μL, 上、下游引物各1μL, c DNA 1μL, Taq酶12.5μL。PCR反应条件:94℃预变性5 min;94℃变性30 s, 60℃退火30 s, 72℃延伸45 s, 共35个循环, 72℃再延伸5 min。取PCR产物5μL, 用1%琼脂糖凝胶对扩增产物进行检测, 用胶回收试剂盒回收目的条带, 连接p MD-19T载体, 16℃连接45 min, 转入大肠杆菌DH5α感受态细胞, 筛选阳性克隆, 提取质粒, 送上海英骏生物技术有限公司测序。
1.4 泸宁鸡Myo G基因氨基酸序列分析
将克隆测序所得的序列用DNAMAN软件拼接并将其翻译成氨基酸序列, 用DNAMAN软件将泸宁鸡与其他物种的同源性进行比对, 制作进化树。根据编码的氨基酸序列用在线软件www.expasy.org分析该氨基酸序列的等电点及其分子质量, 在线分析其信号肽序列 (www.cbs.dut.dk/servcs/Signal P/) 。
1.5 泸宁鸡Myo G基因的组织表达差异
按照上述方法从81日龄泸宁鸡的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑组织中提取总RNA, 并进行反转录。根据已克隆获得的泸宁鸡Myo G基因序列, 利用Primer Premier 5.0软件设计PCR引物, 引物序列:F5'-TGACCCTGTGCCCTGAAAGC-3', R 5'-TCGT-TCACCTTCTTCAGCCTCC-3', 产物长度为178 bp。同时根据泸宁鸡β-actin基因设计引物, 引物序列:S 5'-TGTTGACAATGGCTCCGCTAT-3', A 5'-GC-CCATACCAACCATCACACC-3', 产物长度为118 bp。Myo G基因和β-actin基因的PCR反应体系与上述克隆体系相同, PCR反应条件:94℃预变性5 min;94℃变性30 s, 64℃退火30 s, 72℃延伸45 s, 共33个循环, 72℃再延伸5 min。取PCR产物5μL用1%琼脂糖凝胶电泳分离, 用Bio-Rad凝胶成像系统拍照, 对比分析Myo G基因组织的表达差异。
2 结果与分析
2.1 泸宁鸡总RNA的提取
利用TRIzol法提取组织中的总RNA, 提取的腿肌与胸肌的总RNA, 见图1。可分辨出28S、18S较清晰, 5S较浅, 符合RNA完整性的特性。利用分光光度仪测得OD260/280值在1.8~2.0之间, 纯度较高可用于后续试验。
28S表示rRNA;18S表示tRNA;5S表示mRNA。
2.2 泸宁鸡Myo G基因c DNA的克隆
采用RT-PCR技术对泸宁鸡Myo G基因进行扩增, 获得的1条长度为741 bp左右的特异性条带, 通过测序后得到的核苷酸序列提交NCBI, 获得登录号为FJ882411, 得到的核苷酸及推测出的氨基酸序列, 见图2。
2.3 泸宁鸡Myo G氨基酸序列分析
泸宁鸡Myo G基因经测序获得长度为741 bp的序列, 用DNAMAN软件处理得到227个编码氨基酸, 有碱性螺旋环结构域, 见287页彩图3。
经软件分析得到等电点和分子质量分别为5.46和25.84 ku。经分析获得的泸宁鸡Myo G氨基酸组成, 见287页彩图4。丙氨酸 (Ala) 、谷氨酸 (Glu) 、亮氨酸 (Leu) 、脯氨酸 (Pro) 、精氨酸 (Arg) 、丝氨酸 (Ser) 的使用频率分别为7.93%、11.89%、10.57%、7.49%、9.25%、9.25%, 使用频率较高, 而蛋氨酸 (Met) 、色氨酸 (Trp) 的使用频率分别为0.44%、0.88%, 使用频率较低, 其他氨基酸的使用频率则在1.32%~5.73%之间。推测得到的泸宁鸡Myo G基因氨基酸序列与在Gen Bank上登录的禽类及其他动物的氨基酸同源性, 见表1。同时构建了系统进化树, 见图5。泸宁鸡的Myo G基因和禽类的同源性较高, 与人、小鼠、猪、牛的同源性较低。
2.4 泸宁鸡Myo G基因的组织表达差异
试验利用RT-PCR方法对Myo G基因在泸宁鸡各组织中的表达进行分析, 见图6。在泸宁鸡腿肌、胸肌、肝脏、肾脏、脑、脾脏、心脏中均检测到Myo G基因的表达, 在腿肌、胸肌、心脏、脾脏中的表达水平较高, 但在肝脏、肾脏和脑中的表达水平较低。
*表示终止密码子;下画线1~82为碱性氨基酸区域;80~138为螺旋-环-螺旋结构 (b HLH) 域。
%
3 讨论
Myo G基因是W.E.Wright等[3]利用序列同源性筛选的方法从成肌细胞特异性的c DNA文库中分离得到的, 在肌肉生成中起关键作用[11], 因此对泸宁鸡Myo G基因进行研究, 可在泸宁鸡的育种工作中为改善泸宁鸡生长速度和肉质品质研究奠定基础。
研究克隆得到泸宁鸡Myo G基因片段长度为741 bp, 包括684 bp的完整开放阅读框, 共编码227个氨基酸序列, 具有碱性螺旋结构, 该结构为b HLH结构 (2~138位, 其中第2~82位的氨基酸为碱性结构, 第81~138位的氨基酸为螺旋-环-螺旋结构形成的位置, 等电点为5.46, 小于7.0, 为酸性蛋白) 。泸宁鸡Myo G基因编码的氨基酸序列与猪、牛、人、小鼠、原鸡、火鸡、绿头鸭、游隼的同源性为70%~99%。根据进化树分析结果表明, 泸宁鸡与原鸡亲缘关系最近, 与小鼠、人、猪、牛的亲缘关系较远, 这与传统的形态学和生化特征分类的进化地位基本一致, 说明Myo G基因在用于物种间的系统进化关系分析中具有一定的实际意义。同时分析了Myo G基因的氨基酸组成, Ala、Glu、Leu、Pro、Arg、Ser的使用频率较高, 而Met和Trp的使用频率较低, 这与宋兴超等[12]在原鸡中的分析结果相似。信号肽由氨基酸组成, 指导蛋白质的跨膜转移, 经Signal P4.0软件在线分析结果表明, 该基因编码的蛋白质没有信号肽, 说明Myo G基因编码的蛋白质为非分泌型蛋白质。
1.腿肌;2.胸肌;3.肝脏;4.肾脏;5.脑;6.脾脏;7.心脏。
为了进一步研究Myo G基因在泸宁鸡中的功能, 试验利用半定量RT-PCR的方法对其组织表达规律进行检测, 结果表明, Myo G基因在泸宁鸡的腿肌、胸肌、肝脏、肾脏、脑、脾脏、心脏中均有表达, 在肝脏、肾脏和脑中表达水平较低, 但在腿肌、胸肌、心脏中表达水平较高。林亚秋等[13]研究表明, 该基因仅在九龙牦牛的背最长肌中有表达, 在其他组织中均没有检测到表达。D.G.Edmondson等[14]研究表明, Myo G基因在成年小鼠中除了在肌肉组织中表达外, 在其他组织中均不表达 (包括心肌和平滑肌等) 。马海明等[15]研究表明, Myo G基因在脑中没有检测到表达。有研究表明, Myo G基因在鸭胚14天的心脏中有高表达[16]。由此可见, Myo G基因的表达主要集中在肌肉组织中, 同时不同年龄段在各组织中的表达也有差异, 泸宁鸡Myo G基因的表达也具有相似结果。
摘要：为了研究MyoG基因在鸡生长发育与肉质形成中的作用, 试验以泸宁鸡为研究对象, 采用RT-PCR技术克隆MyoG基因序列, 并利用生物信息学的方法对其理化性质、氨基酸同源性等进行预测和分析, 同时采用半定量方法检测MyoG基因在泸宁鸡不同组织中的表达水平。结果表明:泸宁鸡MyoG基因序列长度为741bp, 其中开放阅读框 (ORF) 长度为684 bp, 编码227个氨基酸, 具有碱性螺旋-环-螺旋结构 (bHLH) , 与哺乳动物的同源性为70%71%, 与原鸡、火鸡、绿头鸭、游隼的同源性为91%99%。组织表达谱结果表明, MyoG基因在泸宁鸡腿肌、胸肌、肝脏、肾脏、脑、脾脏、心脏中均有表达, 在腿肌、胸肌、心脏中表达水平较高, 在肝脏、肾脏和脑中表达水平较低, 说明Myo G基因的表达主要集中于肌肉组织。
组织表达 篇10
【摘要】 目的：研究不同宫内缺氧时间对胚胎大鼠脑组织信号转导子与转录激活子3蛋白表达的影响。方法：制备乏氧性缺氧动物模型，从胎龄15d到16d连续宫内缺氧2d，分别缺氧2、4、6、8、12h共5个不同时程，采用免疫组化检测胚胎大鼠脑组织STAT3蛋白表达情况。结果：与对照组比较，缺氧2h胎鼠脑组织STAT3蛋白表达升高（P<0.05），在缺氧6h达最高（P<0.05）；缺氧8h较对照组染色增强，但较缺氧6h表达减弱（P<0.05）；缺氧12h组与对照组相比STAT3表达降低（P<0.05）。结论：短时缺氧（缺氧2、4、6、8h）能增强胎鼠脑组织STAT3蛋白的表达，但缺氧时间较长（缺氧12h）会降低STAT3蛋白的表达，说明宫内缺氧对胚胎脑组织的影响可能通过STAT3通路进行调节。
【关键词】 STAT3；缺氧；胚胎；脑组织
【中图分类号】R693
【文献标志码】A
【文章编号】1007-8517（2015）24-0013-03
胎儿窘迫是胎儿宫内缺氧危及胎儿健康和生命的综合征，常发生在临产或妊娠后期，是未生儿死亡的主要原因。神经组织对缺氧较为敏感，胎儿窘迫可引起严重的神经系统后遗症。研究表明，信号转导与转录激活因子3（signal trnasducer andaetivator of tnarscription 3，STArI3）参与多种基因的表达和调控，并与其他转录因子一起形成复杂的调控网络参与到胚胎的神经系统发育过程。在局部脑缺血再灌注的研究中发现，缺血缺氧可激活神经元STAT3的表达。陈良万等研究缺血性脑损伤发现，通过调节JAK2-STAl3可以减轻脑损伤。研究观察宫内不同缺氧时间对胚胎神经组织STArl3蛋白表达的影响，以探讨STArI3在胎儿窘迫脑损伤中的作用。
1 材料与方法
1.1 动物与试剂云南系健康成年雌性SD大鼠30只（体重250～300g），由昆明医科大学实验动物中心提供。STAT3免疫组织化学检测试剂盒（武汉博士德生物有限公司）。
1.2 仪器泵吸式红外二氧化碳检测仪；J280 -二氧化碳检测仪；奥林巴士显微镜。
1.3 动物模型的建立将30只成年雌性大鼠分别与雄鼠配种，于第二日早晨发现雌鼠阴栓记为妊娠Od，至孕15d。将孕鼠随机分为：对照组、缺氧2h组、缺氧4h组、缺氧6h组、缺氧8h组、缺氧12h组，每组各5只（每只孕鼠可得胎鼠5-8只，每小组均随机选10只胎鼠）。将缺氧组各孕鼠放入装有300ng石灰（可吸收C02）的4000ml容量的玻璃缸内，密闭瓶盖（广口瓶下端通过活塞连接氧气袋，活塞与氧气袋之间有约50ml容量的小气囊）。玻璃缸内还连接有测氧仪，使缸内02浓度维持在10%～11%。当02浓度降低时，通过活塞将小气囊中氧气缓慢挤压入玻璃缸内，维持02浓度恒定。如此反复，直至孕鼠持续低张性缺氧达所需时程取出。孕16d相同操作至缺氧时间，取出复氧2h。然后将各孕鼠脱颈处死，快速剖腹取出胎鼠，取胎鼠脑放入10%甲醛固定。对照组孕鼠不缺氧直接取胎鼠脑组织固定。
1.4 免疫组化每组每只孕鼠随机选2只胎鼠脑组织作常规石蜡切片（冠状切，片厚4μm）。选三张连续切片进行HE染色和免疫组化染色。显微镜下观察、照相、图像分析。
1.5 统计学方法采用SPSS16.0软件进行数据分析，计量资料用均数加减标准差（x+s）表示，采用￡检验，P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 显微观察情况 胎鼠脑组织STAT3免疫组织化学检测阳性结果为细胞质内棕黄色颗粒，主要分布在前脑泡和脑室的室管膜细胞；前脑泡分化为端脑的区域可见阳性实心细胞条带，并在脑泡边缘可见阳性神经上皮细胞层；一些切片可在端脑内见到阳性细胞呈团块状分布；眼泡也有阳性表达。由图1-6可知，各组间STAT3的阳性表达差异较大。对照组室管膜细胞胞质的STAT3阳性表达较弱，缺氧2h组STAT3的阳性表达较对照组颜色明显增强；缺氧4h组阳性区域颜色与缺氧2h组差别不大，但面积增加；缺氧6h组STAT3的棕黄阳性结果最深，而缺氧8h组STAT3的阳性表达较缺氧6h组明显下降，但与对照组比较差别不大；缺氧12h组几乎没有STAT3的表达。
2.2 观密度值情况 由表1可知，与对照组比较，缺氧2h胎鼠脑组织STAT3蛋白表达升高（P<0.05），在缺氧6h达最高（P<0.05）；缺氧2h组和缺氧4h组STAT3的蛋白表达无组间差异；缺氧6h组比缺氧4h组STAT3的表达增强，组间差异有统计学意义（P<0.05）；缺氧8h较对照组染色增强，但较缺氧6h表达减弱（P<0.05）；缺氧12h组与对照组比较，STAT3表达降低（P<0.05）。
3 讨论
组织表达 篇11
miRNA是一类长度为19～25个核苷酸的非编码单链RNA分子, 具有高度保守性、表达多样性和基因簇集排列的特点.对蛋白质编码基因的转录后调节具有极为重要的作用[1]。成熟的miRNA与靶标信使RNA (mRNA) 进行完全或不完全互补配对, 引起靶标mRNA的降解或翻译抑制, 达到调控目的基因表达的作用。通过上述机制miRNA在基因调控网络中发挥作用, 并在发育、细胞增殖、凋亡、分化以及肿瘤的发生等过程中起重要作用[2]。子痫前期是妊娠期高血压疾病进展较严重的一种情况, 是造成孕产妇和围产儿死亡的主要原因之一, 是导致孕产妇和新生儿死亡最常见的产科疾病。Pineles等的研究表明子痫前期患者胎盘中存在异常表达的miRNA, 可见miRNA与子痫前期的发生具有一定的相关性。本研究拟采用实时荧光定量PCR (RealTimePCR) 技术对子痫前期患者胎盘组织中miRNA表达水平进行研究, 进一步采用生物信息学分析技术了解miRNA在子痫前期的发病过程中起到的作用。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 研究对象
选择2007年7月～2008年4月在唐都医院产科分娩的产妇40名作为研究对象, 其中20名为子痫前期患者, 20名为正常分娩的产妇, 以上病例分娩时均为剖宫产。重度子痫前期患者的诊断标准参照乐杰主编的第六版《妇产科学》。具体资料见表1。
1.1.2 实验用品
四套经过高温消毒的器械及两个研钵 (180℃, 6 h) ;冻存管及各种型号枪头先用0.01%DEPC水浸泡过夜, 消毒, 再放入40℃烤箱中烤干, 备用;定量PCR仪 (Roche, 1.2) ;紫外分光光度计 (Nano Drop, ND—1000) ;电泳仪 (北京六一, DYY—2C) ;离心机 (Eppendorf, 5810R、5415D) 。
1.2 实验方法
1.2.1 胎盘的收集
胎盘娩出后用消毒过的器械剪取约1 cm3大小的组织块, 装入冻存管中, 每个患者取四管组织.剪取时尽量在胎盘近母体面的中央部位, 避开钙化点, 取好组织后立刻放入液氮罐中, 在液氮中过夜后再放入-80℃冰箱中保存。
1.2.2 样品RNA的提取
取出1管-80℃冰箱保存的胎盘, 每次剪取100 mg左右, 放入研钵中, 倒入液氮研磨;研磨至粉状, 加入1 mL Trizol, 继续研磨使Trizol与呈粉状的组织充分接触, 直至研磨成为液态, 将溶液移至1.5 mL离心管中, 室温静置5 min;加入200 μL氯仿, 振荡混匀, 室温静置5 min;离心:4℃, 12 000 r/min, 15 min;吸取500 μL上清液移至新1.5 mL离心管中, 加入等体积异丙醇, 轻轻混匀, 室温静置15 min;离心:4℃, 12 000 r/min, 15 min;弃上清, 加入1 mL 75%乙醇, 振荡混匀;离心:4℃, 7 500 r/min, 5 min;弃上清, 并在超净台中将乙醇挥发干净;加入20～40 μL0.01% DEPC H2O, 65℃ 5 min助溶;取1 μL样品分光光度计定量, 然后用1.5%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳法检测所提取的RNA质量, 取100 ng 总RNA (TotalRNA) 进行实验, 剩余RNA -80℃冷冻保存。
1.2.3 RNA质量检测
1.5%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。
1.2.4 反转录体系及反应参数
取100 ng Total RNA, 1 μL M-MLV (购自TAKARA公司) , 1 μL; (1 μmol/μL) miRNA反转录引物, 总体系为20 μL, 反转录合成cDNA.先将模板, 引物与H2O混匀后65℃变性5 min后置冰上, 再加入酶, PCR Buffer等试剂, 反转录参数为16℃ 30 min, 37℃ 30 min, 70℃ 10 min, 4℃保存。
1.2.5 荧光定量PCR反应体系及反应参数
取1 μ LRT产物为模板, 另取miRNA通用Sense引物和特异Anti-Sense引物各0.8 μL, 采用DNA Master SYBR Green I MIX及Roche 1.2型定量PCR仪进行PCR扩增, 反应体系为20 μL, 严格按照试剂盒说明书操作, PCR反应参数: 95℃ 10 min, 1个循环;95℃ 15 s, 60℃ 30 s, 74℃ 3 s, 荧光检测, 共进行40个循环, 溶解曲线 75～95℃。
1.2.6 PCR产物的质量检测:12%聚丙烯酰胺胶电泳
取PCR产物4 μL加入1 μL 6×Loading Buffer混匀后上样, 电泳液用1×TBE;150 V电泳60 min后紫外透射仪下观察;miRNA预期扩增产物大小均为90 bp。
1.2.7 数据处理
Real Time PCR反应刚刚进入对数期时, 原始模板浓度及体系等差异尚未被放大, 扩增的目的片断的量可以近似地看作只与起始模板浓度和扩增效率有关。根据上述原理采用Microsoft Office Excel对实验数据进行处理, 用内参照U6进行归一化;最后miRNA 表达水平的相对量, 以待检测的miRNA的Ct值与U6的Ct值的比值表示。
2 结果
2.1 提取的样品RNA质量检测的结果
提取样品的总RNA采用分光光度计定量, A260nm/A280nm值为1.7～2.1, 并且采用1.5%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量, 选取其中跑出28S, 18S, 5S三条清晰条带的RNA进行下一步实验。
2.2 12%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR产物质量的结果
miRNA序列短小约22 nt, 不同的miRNA其RT引物及PCR引物都是针对特定的miRNA序列设计的, 反转录引物为类似于miRNA前体的茎环结构。由于进行反转录引物带有茎环结构以及PCR引物设计只能与miRNA特定序列互补, 扩增过程中可能会产生引物二聚体或非特异性扩增产物影响定量结果。因此, 首先需要对荧光定量PCR产物进行电泳, miRNA 特异扩增产物大小为90 bp。PCR产物经12%聚丙烯酰胺凝胶电泳, U6 、miR-411均只在90 bp左右有特异的扩增条带。电泳结果表明子痫前期和正常妊娠胎盘组织中均有miR-411的表达。见图1
2.3 荧光定量PCR 结果
荧光定量PCR 结果可以准确定量miR-411的表达水平, 得到miR-411在子痫前期和正常妊娠胎盘中表达水平的变化;miR-411在子痫前期患者胎盘组织中的表达呈下降的趋势。见图2
3 讨论
miRNA 是一类长约22个核苷酸的非编码单链RNA分子, 一类进化上高度保守的、在生命活动中起着重要调控作用的分子;他们广泛的分布在植物、线虫、果蝇和哺乳动物的细胞中, 但是目前只有为数极少的miRNA功能得到确证。这些miRNA主要参与生物体发育、细胞增殖与凋亡、细胞分化等重要的生物学过程, 还参与了神经发育, 激素分泌及肿瘤发生等过程。尤其是miRNA与人类疾病的关系, 现在已经得到了越来越广泛的重视。miRNA能抑制蛋白质的合成, 导致靶标mRNA的降解, 或者以其他形式来抑制靶基因的表达, miRNA 可能在基因表达调控领域中起着超乎想象的重要作用[3]。 2007年初, Pineles等人针对子痫前期和胎儿宫内发育迟缓进行了miRNA水平的研究。并且成功证明了上述两种情况下的胎盘中有miRNA 的异常表达, 此次实验第一次阐明了, 在子痫前期病人的胎盘中有特异miRNA的异常表达[4]。也从侧面佐证了在子痫前期的发病过程中, 胎盘是一个很重要的部分。胎盘是母体与胎儿间进行物质交换的器官, 是胎儿与母体组织结合的结合体, 具有复杂的生理功能。当胎盘娩出后, 妊娠期高血压疾病的临床症状和体征会自然消退。葡萄胎患者合并妊娠期高血压疾病表明胎儿本身在发病中不起重要作用。根据此特点, 我们将胎盘组织作为此次研究的重点[5]。
通过系统查阅文献选择miR-411基因。有文献报道, 共在子痫前期患者的胎盘组织中筛选出了91个表达失常的miRNA, 其中38个miRNA的表达下降, 而miR-411的这38个基因中下降趋势较为明显[6]。本次实验通过Real time PCR技术验证了此结果, Real time PCR技术灵敏度较高;缺点是不能达到高通量筛选目的, 可用于对芯片结果的验证。实验中使用的反转录引物为类似于miRNA前体的茎环结构引物且不同的miRNA其RT引物及PCR引物都是针对特定的miRNA序列设计的, 使之更适用于miRNA的研究。本次实验采用了TAKARA公司的逆转录试剂盒及SYBR Green ITM Kit, 引物用了Ambion公司mirVanaTM Primer Set (miR-411和U6引物) , 进一步证实了结果的可靠性。有研究表明, 未发育成熟小鼠的睾丸细胞与发育成熟小鼠睾丸细胞相比, miR-411表达明显增高[7], 由此可以证明miR-411与细胞的增殖和分化相关, 子痫前期的发病机理可能是某些因素引发免疫功能失调, 造成滋养细胞浸润障碍, 细胞发育异常, 蜕膜发育异常, 胎盘缺血以致发病[8] 。由此可见很可能是特定miRNA的表达失调, 导致了其相对应基因的表达失调, 进而造成胎盘滋养细胞的发育异常, 浸润障碍, 以致发病, 论证这其中的关系也是下一步的研究计划。本次研究成功验证了miR-411在子痫前期患者与正常妊娠产妇胎盘中表达的差别, 为进一步推测miRNA在子痫前期发病中起到的作用奠定了基础。
参考文献
[1] Zhang B, Wang Q, Pan X.Micro RNAs and their regulatoryroles in animals and plants. J Cell Physiology, 2007;210 (2) :279—289
[2] Zhao Y, Srivastava D.A developm ental view of micro RNA function.Trends Biochem Sci, 2007;32 (4) :189—197
[3] He Lin, Hannon G J. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation.Nature Reviews Genetics, 2004;5:522—531
[4]Pineles B L, Romero R, Montenegro D, et al.Distinct subsets of mi-croRNAs are expressed differentially in the human placentas of pa-tients with preeclampsia.Am J Obstet Gyneco l, 2007;196:261—263
[5]Granger J P, Alexander B T, Llinas MT, et al.Pathophysiology of hy-pertension during preeclampsia linking placental ischemia with endo-thelial dysfunction.Hypertension, 2001;38:718—722
[6] Roman A, Ohn W, Qi Zhu, et al. Microrna expression in placenta of patients with preeclampsia.J Ajog, 2008; (09) :S78—S78
[7]Yan Naihong, Lu Yilu, Sun Huaqin, et al.Amicroarray for microR-NA profiling in mouse testis tissues.Reproduction, 2007;134:73—79