原核基因表达

原核基因表达（通用10篇）

原核基因表达 篇1

高等植物体内含有两类不同的三磷酸-甘油醛脱氢酶 (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GAPDH) , 一类是在叶绿体中有活性的参与卡尔文循环的关键酶, 另一类是存在于细胞质中参与糖酵解途径的关键酶[1]。在叶绿体中, GAPDH由GAPA和GAPB两个亚基组成, 在NADP (H) 的作用下参与卡尔文循环。在糖分解过程中, GAPDH可以在生物体内高效表达, 能催化3-磷酸甘油醛脱氢氧化并磷酸化生成高能化合物1, 3-二磷酸甘油酸, 是维持生命活动的基本酶之一[2]。GAPDH作用机制十分复杂, 在生物体内表达丰富, 常作为植物基因表达中的内参基因[3]。另外, GAPDH基因还具有抵御逆境胁迫的功能, 特别是在热激、高盐、低温等逆境胁迫下, 其基因表达模式将发生改变。刘志华[4]等利用酵母技术证明了GAPDH基因具有抗盐、碱以及高温胁迫的功能, 是一种重要的抗逆境胁迫基因。本研究以拟南芥c DNA为模板, 克隆得到正确的GAPB基因序列, 并将GAPB连接到表达载体PET28a (+) 中, 获得了原核表达载体PET28a (+) -GAPB, 为进一步研究GAPDH参与胁迫响应的机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

哥伦比亚型拟南芥、大肠杆菌DH5α和BL21 (DE3) 由本实验室保存。胶回收试剂盒和质粒小量提取试剂盒购于上海华舜生物技术公司。PET28a (+) 质粒载体由四川大学遗传学重点实验室惠赠。所需引物由上海英俊生物技术有限公司合成。限制性内切酶Bam HI和Xho I、高保真酶Pfu以及T4 DNA连接酶购于MBI Ferments公司。

1.2 方法

1.2.1 拟南芥总RNA的提取

利用TRIZOL试剂盒提取哥伦比亚型拟南芥总RNA, 1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA产物。然后用反转录试剂盒将RNA反转合成c DNA, 作为扩增基因的模板。

1.2.2 引物的设计

利用Primer primer5.0根据GAPB的基因序列设计特异性引物, 引物含有Bam HI和Xho I酶切位点, 序列如下:

上游酶切位点为Bam HI, 下游酶切位点为Xho I, 引物由上海英俊公司合成。

1.2.3 PCR扩增和胶回收GAPB基因

以拟南芥c DNA为模板, 用PCR法扩增GAPB基因, 反应体系如下:10×PCR Buffer (含Mg Cl2) 2.5μL, (2.5 m M) d NTP 2μL, 上游引物 (F) 1μL, 下游引物 (R) 1μL, c DNA 0.5μL, Pfu酶0.2μL, dd H2O 17.8μL。PCR反应条件:94℃预变性3 min后进入以下循环, 94℃35 s, 59℃35 s, 72℃1 min30 s, 共进行30个循环, 最后72℃延伸10 min结束PCR反应, 扩增得到GAPB基因的全长。按胶回收试剂盒的说明回收GAPB基因片段。

1.2.4 PET28a (+) 质粒的提取

将PET28a (+) -DH5α菌株划线于含Kan的LB固体培养基中, 37℃培养过夜, 次日挑单菌落于含Kan的LB液体培养基中, 37℃培养过夜, 按照质粒小量抽提试剂盒说明书提取PET28a (+) 质粒。

1.2.5 目的基因和载体的双酶切

采用50μL酶切体系, 分别用Bam HI和Xho I双酶切PET28a (+) 载体和纯化的GAPB基因片段, 用胶回收试剂盒纯化回收酶切后的载体片段和基因片段, 取少量回收产物作1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.6 连接及重组质粒的转化

用T 4连接酶连接酶切纯化后的GA P B基因和PET28a (+) 载体片段, 连接体系为25μL, 16℃连接过夜。然后制备大肠杆菌DH5α感受态细胞, 将连接体系转化大肠杆菌DH5α。在转化时设置阳性和阴性对照, 阳性对照为未酶切的PET28a (+) 质粒, 用以检测转化效率;阴性对照为空的大肠杆菌感受态, 用以检测感受态细胞是否有污染。将转化产物涂布于含Kan的LB固体培养基中, 37℃过夜培养。

1.2.7 重组质粒阳性克隆的鉴定

在含有重组质粒的LB平板上随机挑取多个单菌落, 以其为模板分别作PCR扩增反应, 1%琼脂糖凝胶电泳检测是否有目的条带。同时将挑取的多个单菌落分别摇菌, 按质粒提取试剂盒的说明提取质粒, 并用Bam HI和Xho I双酶切质粒, 电泳检测酶切产物。

1.2.8 表达质粒的构建与鉴定

将双酶切鉴定正确的阳性克隆菌株送上海华大基因测序, 分析克隆基因的序列组成及其阅读框的正确性。测序正确后, 提取PET28a (+) -GAPB/DH5α阳性克隆的质粒, 将该质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3) 感受态细胞, 并挑取多个单菌落作PCR鉴定, 得到含有PET28a (+) -GAPB质粒的BL21 (DE3) 表达菌。

2 结果与分析

2.1 RNA纯度的测定

对提取的拟南芥总RNA进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测, 发现RNA产物条带清晰, 并且28S条带亮度是18S的2倍左右 (图1) 。紫外分光光度计分析显示, A260/A280=1.92, 表明获得的RNA纯度及浓度较高, 可以用于基因全长的扩增。

2.2 GAPB基因的扩增

利用设计的特异性引物作梯度PCR, 寻找扩增GAPB基因的最佳退火温度, 发现在59℃退火温度下, GAPB基因扩增的条带最好。电泳图 (图2) 显示大约在1344 bp左右有一目标条带, 说明已根据设计的引物克隆出所需要的基因片段。

2.3 PET28a (+) -GAPB重组质粒的PCR鉴定

选用PET28a载体上的T7上游引物与GAPB的下游引物配对, 进行菌落PCR筛选阳性克隆。通过1%的琼脂糖凝胶电泳检测, 大多数都得到与GAPB基因大小一致的片段 (图3) , 说明得到了重组质粒的阳性克隆。

2.4 PET28a (+) -GAPB重组质粒的双酶切鉴定

重组质粒经Bam HI和Xho I双酶切后出现2条带, 其中1条带大小约为1344 bp左右 (图4) , 与GAPB基因大小一致, 说明PET28a (+) -GAPB重组质粒构建正确。

2.5 转化BL21 (DE3) 重组质粒的鉴定

将重组质粒PET28a (+) -GAPB转化到大肠杆菌BL21 (DE3) 中, 经抗性筛选, 挑取单菌落, 作菌落PCR鉴定, 经1%的琼脂糖凝胶电泳检测到目的条带 (图5) , 说明转化成功。

3 讨论

在植物的糖酵解和糖异生途径中, 三磷酸-甘油醛脱氢酶 (GAPDH) 是关键酶, 参与糖酵解过程中第一个ATP的形成。由于GAPDH具有高度的保守性, 人们通过比较不同物种的该基因核酸序列和蛋白序列的异同, 对物种进行分类, 建立物种之间的系统发育关系[5]。在外界胁迫如热胁迫、渗透胁迫、缺氧胁迫或营养缺失条件下, 一些糖酵解相关基因的m RNA大量积累表达[6]。近年来, 有许多研究表明GAPDH基因的表达可能增强了植物抵抗胁迫的能力。Pillai等[7]将水稻幼苗进行干旱、淹没和脱落酸 (ABA) 处理, 结果表明GAPDH基因的转录水平显著提高。在植物中, 经H2O2诱导GAPDH的转录水平也可显著增加。Baek等[8]将GAPDH基因转化到拟南芥原生质体中, 发现该基因能强烈抑制热击时H2O2的产生和细胞的死亡。本研究以拟南芥c DNA为模板, 克隆出GAPB基因的全长, 并构建了原核表达载体PET28a (+) -GAPB, 为后续研究GAPB的功能提供了理论基础。

摘要：以拟南芥cDNA为模板, 用PCR扩增出GAPB的基因全长, 然后将GAPB基因片段连接到PET28a (+) 载体上, 构建重组质粒并转化大肠杆菌DH5α, 经菌落PCR和酶切鉴定筛选出阳性克隆, 测序正确后, 再将阳性克隆的质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3) 。结果表明:成功构建了原核表达载体PET28a (+) -GAPB, 为后续的GAPB融合蛋白的表达以及纯化奠定了基础。

关键词：GAPB,大肠杆菌BL21,PET28a (+) ,融合蛋白

参考文献

[1]李晓泽, 刘关君, 杨传平.西伯利亚蓼甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的cDNA克隆与序列分析[J].植物生理学通讯, 2007, 43 (1) :41-48.

[2]鲁国东, 郑学勤, 谢联辉.稻瘟病菌3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆及序列分析[J].热带作物学报, 1998, 19 (4) :83-89.

[3]朱华, 李珅, 赵瑞强, 等.三七植物GAPDH基因克隆及序列分析[J].西北植物学报, 2006, 26 (7) :1316-1319.

[4]刘志华, 杨谦.球毛壳菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因克隆及特性分析[J].微生物学报, 2005, 45 (6) :885-889.

[5]于丽丽, 高彩球, 王玉成, 等.柽柳甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的克隆和表达分析[J].东北林业大学学报, 20010, 38 (7) :105-108.

[6]Yin L.P., Sun T., Li W., et al.Analysis of iron deficiency-induced transcriptome and proteome in the rice roots and vesicular transport[J].Progress in Natural Science, 2004, 14 (5) :522-527.

[7]Pillai M A, Lihuang Z, Akiyama T.Molecular cloning, characterization, exp ression and chromosomal location of OsGAPDH, a submergence responsive gene in rice (Oryza sativa L.) [J].Theor Appl Genet, 2002, 105 (1) :34-42.

[8]Baek D, J in Y, Jeong J C, et al.Suppression of reactive oxygenspecies by glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase[J].Phytochemistry, 2008, 69 (2) :333-338.

原核基因表达 篇2

以大肠杆菌BL21染色体DNA为模板,根据glgC基因的全序列设计了1对引物,在优化的.PCR反应条件下扩增出了glgC基因片段,测序结果显示该片段大小为1 296 bp,编码432个氨基酸残基.将该基因克隆到原核表达载体pET-28a-c(+)中,重组载体pET-glgC转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳鉴定,得到了与理论推算的glgC基因表达产物分子质量(约53 kD)相符的特异蛋白条带.

作 者：贾笑英 张金文 王蒂 JIA Xiao-ying ZHANG Jin-wen WANG Di 作者单位：贾笑英,JIA Xiao-ying(甘肃农业大学,农学院,兰州,730070)

张金文,王蒂,ZHANG Jin-wen,WANG Di(甘肃农业大学,农学院,兰州,730070;甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室,兰州,730070)

原核基因表达 篇3

关键词：猪流行性腹泻病毒；COE基因；原核表达；免疫原性；诊断抗原；PED基因工程疫苗

中图分类号： S858.285.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）09-0034-02

收稿日期：2013-12-03

基金项目：2013年度河南省科技计划（编号：132102110147）。

作者简介：霍军（1962—），男，河南信阳人，副教授，研究方向为动物解剖生理。Tel：（0371）65765528；E-mail：huojun@tom.com。猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起，临床上以猪的急性肠炎、呕吐、腹泻、脱水以及哺乳仔猪的高死亡率为特征[1]。由于PEDV感染所引起的疾病与猪传染性胃肠炎在临床上难以区分，因此，对于PED的鉴别诊断往往需要借助实验室手段。

S蛋白是冠状病毒囊膜上的糖蛋白，负责病毒的吸附、融合和侵入宿主细胞，也是诱导宿主体液免疫反应的免疫原性蛋白。目前研制的冠状病毒基因工程疫苗所选取的抗原基因主要集中在S基因上[2-4]。Chang等报道，猪流行性腹泻病毒S基因存在中和抗原表位（COE），Brl/87株的COE基因为S基因序列的1 495～1 914 bp[5]；而韩国PEDV株的COE基因为S基因序列的1 504～1 923 bp[6]。本试验结合上述文献，成功扩增了PEDV流行毒株CH/HNZZ/13株S基因的 1 474～1 950 bp 处（包括COE基因），将其连接至pET-32a原核表达质粒进行表达，进而探讨将原核表达的重组COE蛋白作为诊断抗原的可行性；并为PED基因工程疫苗的研制提供参考。

1材料与方法

1.1PEDV阳性样本

2013年采集于河南省郑州郊区某猪场PEDV阳性粪便样本，命名为CH/HNZZ/13株。

1.2主要试剂

rTaq DNA聚合酶、dNTP、pMD18-T载体、鼠源反转录酶（M-MLV）、RNA酶抑制剂（Rnase Inhibitor）、T4 DNA连接酶、限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ均购自大连宝生物工程有限公司；Bradford蛋白质定量试剂盒购自TIANGEN公司；TRIzon Regent、 Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒、DAB显色试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司。

1.3PCR引物的设计

参考PEDV CV777株全基因序列（GenBank：AF 353511）设计1对特异性引物，上游引物为CGGATCCCTTCTGAGTCACGAACAG，加入酶切位点BamHⅠ；下游引物为CCTCGAGGGTACACACATCCAGAGTCAT，加入酶切位点XhoⅠ。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4样本处理及RNA的提取

将粪便样本用PBS（0.01 mol/L，pH值7.2）进行10倍稀释并研磨，8 000 r/min离心10 min取上清备用，参照说明书使用TRIzon Regent提取RNA。

1.5反转录与PEDV S基因片段的扩增

20 μL反转录体系：RNA模板10 μL，5×buffer 4 μL，dNTP（10 mmol/L）1 μL，下游引物1 μL（20 pmol/μL），RNase抑制剂（40 U/μL）0.5 μL，反转录酶M-MLV（200 U/μL）0.5 μL，补加灭菌双蒸水至20 μL；反应条件为：42 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min。50 μL PCR扩增体系：10×buffer 5 μL，MgCl2（25 mmol/μL）5 μL，反转录产物（cDNA）5 μL，dNTP（10 mmol/L）1 μL，rTaq DNA聚合酶（5U/μL）0.5 μL，上、下游引物（20 pmol/μL）各1 μL，补加灭菌双蒸水至50 μL。反应循环参数：95 ℃ 5 min；然后94 ℃ 1 min，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；循环结束后再72 ℃ 10 min。PCR产物使用1%琼脂糖凝胶进行电泳，回收目的片段连接至pMD18-T载体，阳性重组质粒命名为pMD18-T-COE。

1.6pET-32a-COE重组质粒的构建及表达

使用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ对pET-32a空质粒和pMD18-T-COE进行双酶切，回收目的片段，并使用T4 DNA连接酶进行连接。将连接产物转化至DH5α感受态细胞中，对重组质粒进行双酶切鉴定和PCR鉴定，阳性重组质粒命名为pET-32a-COE。将阳性重组质粒转化至宿主菌BL21（DE3）中，在菌液D600 nm值为0.6～0.8时加入终浓度为1 mmol/mL的IPTG（Isopropylthio-β-D-galactoside），37 ℃条件下进行诱导表达。取诱导后的菌液1 mL于10 000 r/min离心5 min收集沉淀，加入细菌裂解液将其混匀后使用超声波破碎菌体，破碎完全后10 000 r/min离心5 min后，分别取上清和沉淀加入适量的2×SDS凝胶上样缓冲液后沸水煮 5 min，然后再8 000 r/min离心5 min后取上清进行SDS- PAGE电泳分析，检测目的蛋白的表達形式。

nlc202309042148

1.7目的蛋白纯化、定量及Western-blot分析

使用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒纯化目的蛋白，使用Bradford蛋白质定量试剂盒对目的蛋白进行定量分析。然后将纯化的目的蛋白经SDS-PAGE电泳后转印到PVDF膜上，与抗PEDV小鼠阳性血清反应，再加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG进行作用，最后使用DAB进行显色观察。

1.8目的蛋白的动物免疫试验及ELISA检测

取6周龄左右昆明鼠20只，分成2组，每组10只。试验组小鼠第一次免疫50 μg的重组蛋白加等量的弗氏完全佐剂；2周后进行二免，每只小鼠免疫50 μg的重组蛋白加等量的弗氏不完全佐剂；2周后三免，方法与二免相同。对照组在3次免疫时均注射0.1 mL生理盐水。三免后2周小鼠眼球采血进行ELISA检测，使用的ELISA方法为本实验室建立的基于PEDV全病毒包被的抗体检测ELISA。

2结果与分析

2.1pET-32a-COE重组质粒构建

通过RT-PCR方法扩增PEDV COE基因，连接至pET-32a原核表达质粒。对重组质粒进行双酶切鉴定和PCR鉴定，结果双酶切鉴定时在5 900 bp和491 bp左右有2条带，PCR鉴定时在491 bp有1条特异性条带（图1），表明重组pET-32a-COE质粒构建成功。

2.2融合蛋白的诱导和纯化

对含有重组质粒的E.coli BL21进行诱导表达，经 SDS-PAGE 电泳分析，重组表达质粒在E.coli BL21中以包涵体蛋白的形式表达，其相对分子质量约为35.5 ku，与预测大小相符。使用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒纯化目的蛋白，SDS-PAGE显示纯化后蛋白在35.5 ku处有单一条带（图2），说明回收纯化效果较好；将重组蛋白进行复性，然后使用Bradford蛋白质定量试剂盒对重组蛋白进行定量，蛋白浓度为0.21 mg/mL。

2.3表达产物的Western-blot分析

以纯化的重组蛋白为抗原，以抗PEDV小鼠阳性血清为一抗进行Western-blot检测，结果在35.5 ku处出现l条清晰的反应条带，说明重组蛋白在大肠杆菌中得到了正确表达并具有生物学活性（图2）。

2.4重组蛋白的免疫原性分析

采用基于PEDV全病毒包被的抗體检测ELISA方法检测重组蛋白免疫小鼠后的血清抗体产生情况。ELISA检测结果表明，在重组蛋白中加入弗氏佐剂免疫小鼠，在三免后2周试验组小鼠的血清中ELISA抗体效价可达1 ∶3200，而对照组未检测到PED抗体。

3讨论

本试验成功构建pET32-a-COE重组质粒并进行诱导表达，结果显示目的蛋白主要以包涵体形式存在。虽然以包涵体形式表达的蛋白有一定缺点，主要是对包涵体的处理要先变性溶解后再进行复性，才能得到溶解的具有活性的蛋白，且复性后蛋白活性容易降低；但它也有很大的优点，能够避免细胞内蛋白质水解酶的作用，而且有利于目的蛋白的富集和分离纯化，适合大规模商品化生产。本研究使用的pET-32a原核表达载体本身带有His标签，可以在变性条件下用 Ni-Agarose His 标签蛋白纯化试剂盒进行目的蛋白的纯化，然后再经复性处理获得具有活性的目的蛋白。将纯化的蛋白进行SDS-PAGE分析后显示在35.5 ku处出现单一条带，未见杂带，说明对目的蛋白纯化效果良好。Western-blot分析结果显示，所表达的重组蛋白能与抗PEDV全病毒小鼠阳性血清反应，表明所表达的重组蛋白具有良好的反应原性，可以作为诊断抗原用于PEDV抗体的检测。另外，将纯化的重组蛋白加入弗氏佐剂后免疫小鼠，可诱使小鼠机体产生高水平的PED抗体，说明所表达的蛋白具有良好的免疫原性。

目前，由PEDV感染所引起的腹泻疫情在我国仍然十分严重，因此，急需建立可靠的PEDV抗体检测方法用于PED流行病学的监测以及猪群免疫PED疫苗后抗体水平的检测。本试验表达的针对PEDV COE基因主要抗原区的重组蛋白表达量高、反应原性好，为PEDV抗体检测试剂盒的研发提供了参考。另外，由于所表达的蛋白具有良好的免疫原性，也为将该蛋白作为PED基因工程疫苗候选抗原的研究提供依据。

参考文献：

[1]Debouck P，Pensaert M. Experimental infection of pigs with a new porcine enteric coronavirus，CV 777[J]. Am J Vet Res，1980，41（2）： 219-223.

[2]Liu R Y，Wu L Z，Huang B J，et al. Adenoviral expression of a truncated S1 subunit of SARS- CoV spike protein results in specific humoral immune responses against SARS-CoV in rats[J]. Virus Res，2005，112（1/2）：24-31.

[3]韦显凯，侯继波，姜平. 表达猪流行性腹泻病毒S基因片段重组腺病毒的构建与免疫特性[J]. 中国兽医学报，2008，28（10）：1128-1132.

[4]董丽娜，高凤山，许崇波，等. 表达猪流行性腹泻病毒COE基因的重组乳酸菌的构建与鉴定[J]. 畜牧兽医学报，2008，39（12）：1743-1747.

[5]Chang S H，Bae J L，Kang T J，et al. Identification of the epitope region capable of inducing neutralizing antibodies against the porcine epidemic diarrhea virus[J]. Mol Cells，2002，14（2）： 295-299.

[6]Kang T J，Seo J E，Kim D H，et al. Cloning and sequence analysis of the Korean strain of spike gene of porcine epidemic diarrhea virus and expression of its neutralizing epitope in plants Protein[J]. Expression and Purification，2005，41（2）：378-383.

王志强，俞红贤，荆海霞，等. 牦牛SLC25A6基因的CDS序列及其表达蛋白生物信息学分析[J]. 江苏农业科学，2014，42（9）：36-39.

PRK基因原核表达质粒的构建 篇4

关键词：PRK基因,载体构建,PCR

磷酸核酮糖激酶基因 (PRK) 所编码的磷酸核酮糖激酶, 是参与光合作用卡尔文循环中的一种关键调节酶, 在PRK的催化下5-磷酸核酮糖再生成1, 5-二磷酸核酮糖, 在碳循环的调控过程中具有重要作用[1]。研究表明, PRK只存在于植物的叶绿体内, 在光照条件下PRK的活性可增加40倍, 并受铁氧还蛋白/硫氧还蛋白系统居间的影响, 以F6 cDNA作探针与用HindⅢ酶降解的小麦核基因组DNA进行杂交, 证明了单拷贝的PRK基因存在于小麦第6组染色体的长臂上[2]。Raines等 (1989) 曾分离出含有小麦PRK亚基整个编码序列的cDNA克隆并对其进行了序列分析, 得出c DNA含有一个1212个核苷酸的开放读框, 成熟的蛋白质含有351个氨基酸, 近氨基末端的50个氨基酸片段与ATP的结合有关, 并且酶催化活性受光的调节。近年来的研究发现, PRK与植物的逆境胁迫有一定的相关性。喻娟娟等发现星星草在受到盐胁迫的条件下, 参与卡尔文循环的PRK激酶表达下调, CO2的同化受到了抑制[3], 表明PRK与植物的盐胁迫存在一定的联系。梁根云等在蛋白表达水平上研究小麦品种受到病原菌侵染后的反应, 发现感锈品种接种14 d后病叶中的磷酸核酮糖激酶 (PRK) 上调, 由此推测该酶表达的变化可能是条锈菌侵入寄主后寄主的代谢途径发生变化引起的[4]。为了进一步研究P R K与植物抗逆机制的相互联系, 我们以拟南芥c DNA为模板, 扩增出PRK基因, 构建重组质粒pET-28a (+) -PRK转化大肠杆菌DH5α, 将阳性克隆的质粒转化到大肠杆菌表达载体BL21中, 构建PRK基因原核表达质粒, 以期为以后研究其抗逆机制提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

拟南芥植株为哥伦比亚型, 大肠杆菌E.coliDH5a和BL21均为本实验室保存菌株, 表达载体pET-28a (+) 由四川大学遗传实验室惠赠。

PCR试剂及各种限制性内切酶、PrimeSTAR HS DNA Polymerase Taq酶、DNA聚合酶、T4 DNA Ligase、AMV反转录试剂盒等均购自日本TaKaRa公司;质粒抽提试剂盒和胶回收试剂盒等购自成都博瑞克生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成

根据NCBI上公布的PRK基因序列设计得到的引物: (PRK) F:5'CGGGATCC ACAATGGCTGTCTCAACTATCT 3' (PRK) R:5'CCGCTCGAGGTTCTATTTGGCTTCGCTTC 3'其中上游引物加BamH1酶切位点, 下游引物加XhoI酶切位点, 引物由上海英俊生物技术有限公司合成和纯化, 引物所扩增的目的片段大小为1218 bp。

1.2.2 拟南芥RNA的提取和cDNA的合成

采取幼嫩的拟南芥叶片, 用于总RNA的小量抽提。RNA抽提方法采用Trizol法, 反转录步骤参照反转录试剂盒使用说明, 合成第一链c DNA于-20℃保存, 作为扩增模板。

1.2.3 目的基因的扩增

以拟南芥反转录产物c DNA为模板, 进行PCR扩增。用PrimeSTAR HS DNA Polymerase Taq酶扩增PRK基因。在25μLPCR反应体系中:dNTP2μL, 上下游引物各1μL, c DNA 1μL, PrimeSTAR HS DNAPolymerase Taq酶0.5μL, 10×PCR缓冲液2.5μL;混匀后进行PCR反应。PCR反应条件为:94℃预变性3 min;94℃变性40 s, 59℃退火40 s, 72℃、90 s, 复性并延伸30个循环;72℃后延伸10 min。

1.2.4 pET-28a (+) -PRK载体的构建

将上述经过PCR扩增得到的PRK基因进行胶回收, 将胶回收产物即目的基因用BamH1和XhoI进行酶切, 同时用相同的酶对载体pET-28a (+) 进行酶切, 回收纯化构建载体所需要的目的片段并测定含量, 将酶切后的pET-28a (+) 载体与PRK基因按照摩尔比1∶3混合, 用Takara的T4连接酶16℃连接过夜, 取连接产物10μL转化大肠杆菌DH5a感受态细胞 (氯化钙法制备) 。

1.2.5 重组质粒阳性克隆的筛选

主要是利用重组子上带有的卡拉霉素抗性基因和菌落PCR法进行筛选。将转化的大肠杆菌在含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上涂板, 进行阳性克隆的筛选。挑取经抗生素筛选的单菌落做菌落PCR验证, 以单个菌落为模板, 共挑选5个菌落, 用设计的特异引物经PCR法扩增PRK基因。

1.2.6 pET-28a (+) -PRK载体的验证

将上述筛选得到的阳性大肠杆菌菌落接种于含有卡那霉素 (50μg/mL) 的LB液体培养基中, 37℃振荡培养, 提取质粒, 然后用BamH1和XhoI双酶切质粒进行进一步验证, 酶切产物作1%琼脂糖电泳。将正确的阳性克隆送上海华大基因有限公司进行测序。

1.2.7 PRK基因原核表达质粒的构建

将测序正确的PRK阳性克隆菌株pET-28a (+) -PRKDH5α培养后, 提取质粒。将该质粒转化感受态大肠杆菌BL21, 挑取多个单菌落经IPTG进行诱导表达。

2 结果与分析

2.1 拟南芥RNA质量检测

取5μL提取的拟南芥总RNA在1%的琼脂糖凝胶上进行快速电泳检测 (如图1) 。结果显示RNA条带清晰, 降解很少。紫外分光光度法测得OD260/OD280的值为1.91, 表明RNA的纯度较高, 可用于后续实验。

2.2 PCR扩增PRK全长基因片

以拟南芥的cDNA为模板, 用设计好的引物进行扩增, 经0.8%的琼脂糖凝胶电泳得到目的片段大小为1200 bp左右的产物 (如图2) , 大小与理论预期值一致。

2.3 pET-28a (+) -PRK载体的构建和阳性克隆的筛选

用胶回收试剂盒回收PCR产物, 并用BamH1和XhoI酶切PCR产物和载体pET-28a (+) , 然后连接并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞, 采用卡那霉素筛选、菌落PCR方法筛选鉴定出阳性克隆, PCR鉴定结果 (如图3) 。

2.4 pET-28a (+) -PRK载体的鉴定

将鉴定出的pET-28a (+) -PRK阳性克隆在加有抗生素的LB液体培养基中培养, 提取质粒, 采用BamH1和XhoI进行双酶切, 酶切释放的片段大小正确 (如图4, 2号泳道) , 表明PRK已经连接到p ET-28a (+) 载体上。用酶切验证正确后, 送往公司测序分析, 结果表明与网上公布序列的同源性100%, 说明大肠杆菌表达载体pET-28a (+) -PRK构建成功, 说明此为我们需要的目的基因。

2.5 PRK基因原核表达质粒的构建

将PRK阳性克隆的菌株pET-28a (+) -PRKDH5α培养后, 提取质粒。将该质粒转化感受态大肠杆菌BL21。挑取多个单菌落经IPTG进行诱导表达, 保存能表达目的蛋白的菌落。

3 讨论

植物在长期进化过程中, 形成了对环境胁迫的抵抗或忍耐能力, 即植物的抗逆性。当植物受到胁迫时, 植物体内许多基因的表达都会发生变化, 包括LED蛋白、转录因子、蛋白激酶与磷酸酶等[5]。磷酸核酮糖激酶 (PRK) , 作为参与光合作用中卡尔文循环过程的一种关键性酶, 近年来有研究PRK与植物的抗逆胁迫也存在一定的联系, 研究发现植物在遭受病害、盐害时PRK表达量也相应发生变化[6], 但对于PRK激酶在抗逆中的作用机制还需要进一步的研究, 文章通过构建PRK基因正确的原核表达载体, 为进一步研究PR K参与胁迫响应的机制奠定了基础, 也为以后进一步研究植物的耐盐机制与光合作用的关系做铺垫。

参考文献

[1]魏松涛.农杆菌介导PRK基因转化水稻及鉴定[D].兰州大学硕士学位论文, 2008.

[2]赵微平.植物基因组构建、表达和调控[M].北京:首都师范大学出版社, 1996:231-236.

[3]喻娟娟, 孙国荣, 戴绍军.星星草 (Puccinellia teniflora) 响应NaCl胁迫蛋白质组学研究[A].第三届全国植物蛋白质组学学术研讨会论文摘要集[C].武汉, 2010.

[4]梁根云, 姬红丽, 章振羽, 等.条锈菌侵染慢锈性小麦品种川麦107后的蛋白质组学分析[J].麦类作物学报, 2007, 27 (2) :335-340.

[5]程晓亚, 汤章城.植物生理与分子生物学[M].北京:高等教育出版社, 2007.

原核基因表达 篇5

绵羊重组朊蛋白的原核表达与结构分析

利用DNA重组技术,将绵羊朊病毒正常成熟蛋白基因OvPrPc插入表达载体pET30a,在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,获得的表达产物为绵羊朊蛋白OvPrP(23～256).经SDS-PAGE分析,表达产物以包涵体形式存在.将包涵体蛋白用8 mol/L尿素溶解,在变性条件下经Ni-NTA柱亲和层析纯化,而镍柱能竞争性结合含有6×His标签的pET30a表达的.目的蛋白.由于目的蛋白是在变性条件下纯化的,需要将其复性后才能恢复天然构象.采用梯度尿素透析复性后,复性率为25%左右.为了进行重组朊蛋白的结构分析,将重组蛋白进行超滤浓缩,至蛋白浓度为0.4 mg/mL时,采用远紫外线圆二色谱(CD)分析其二级结构,并对其高级结构进行了预测.结果表明:通过Western-blotting鉴定,表达的绵羊朊病毒正常成熟蛋白OvPrP(23～256)的分子量为25172.80 u左右.经过Jascow32软件分析后,测得OvPrP(23～256)的二级结构含量为:α螺旋为39.4%,β折叠为0%,转角为0%,无规卷曲为60.6%.绵羊重组朊蛋白高级结构的分析为朊病毒疾病的发生机理的探讨提供科学依据.

作 者：刘美丽 赵德明 周向梅 尹小敏 LIU Mei-li ZHAO De-ming ZHOU Xiang-mei YIN Xiao-min 作者单位：中国农业大学,国家动物海绵状脑病实验室,北京,100094刊 名：中国预防兽医学报 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF PREVENTIVE VETERINARY MEDICINE年，卷(期)：28(6)分类号：Q78关键词：绵羊朊病毒蛋白 原核表达 圆二色谱 结构分析

原核基因表达 篇6

1 材料与方法

1.1 牛INF-τ基因

牛INF-τ基因, 由沈阳农业大学预防兽医学实验室保存。

1.2 菌株及试剂

大肠杆菌BL21 (DE3) 感受态细胞, 购自天根生化科技 (北京) 有限公司; 质粒小量抽提试剂盒、Red Taq酶、胶回收试剂盒, 购自上海生工生物工程技术服务有限公司;限制性内切酶 (EcoRⅠ、XhoⅠ) 、 T4 DNA 连接酶, 均购自宝生物工程 (大连) 有限公司。其他常规试剂按照《分子克隆实验指南》的要求配制。

1.3 引物的设计与合成

根据NCBI上发表的牛IFN-τ基因序列 (登录号为AY665673) 设计并合成1对引物, 引物序列:5′-ATTAGAATTCATGGCCTTCGTGCTCTCTC-3′, 5′-CTCGAGAGGTGAGTTCAGATCTCCAT-3′, 下画线部分分别为EcoRⅠ、XhoⅠ的酶切位点。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.4 牛INF-τ基因的PCR扩增

PCR管中依次加入超纯水11 μL, 25 mmol/L MgCl2 2 μL, 10×PCR Buffer 2 μL, 2.5 mmol/L dNTP Mixture 1 μL, 20 μmol/ L的上、下游引物各1 μL, 5 U/μL Red Taq 酶 1 μL, 模板 1 μL, 混匀后短暂离心, 进行PCR反应。

PCR 反应条件: 95 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min, 55 ℃退火1 min, 72 ℃延伸50 s, 共35个循环;72 ℃再延伸7 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳, EB 染色, 采用GeNius 凝胶电泳图像分析系统分析鉴定并用胶回收试剂盒回收PCR产物。

1.5 牛INF-τ基因原核表达载体的构建及鉴定

采用内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ分别对回收的PCR产物和pET-28表达载体进行双酶切, 回收酶切产物。胶回收酶切目的片段, 构建表达载体pET- 28a- INF-τ, 转化大肠杆菌BL21 (DE3) 感受态细胞, 将转化成功的细菌涂布于含100 μg/mL 卡那霉素的 LB 琼脂培养基, 培养10～16 h, 挑选单个菌落, 接种于含卡那霉素的 LB液体培养基中, 置于37 ℃ 摇床振荡培养12 h, 抽提质粒, 进行PCR以及酶切鉴定, 取阳性克隆进行测序。

1.6 牛INF-τ基因原核表达

将测序正确的重组工程菌接种于含100 μg/mL卡那霉素的 LB液体培养基中, 37 ℃ 振荡至菌液OD600值达到0.6, 加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG) , 37 ℃诱导6 h, 收集菌液进行 SDS- PAGE 鉴定。同时设立阴性对照。

取诱导后的菌液进行 SDS- PAGE 电泳, 然后电转移至硝酸纤维素膜 (NC膜) 上, 用含5%脱脂奶粉的封闭液室温封闭2 h, 换新鲜的封闭液, 加入鼠抗 His单克隆抗体作为一抗, 37 ℃ 摇床反应2 h。1×PBST 洗涤3～5次, 每次4 min, 于1×PBST 中加入辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的羊抗兔IgG作为二抗, 37 ℃ 摇床反应2 h, 最后 DAB 显色至目的条带清晰时终止反应 。

2 结果与分析

2.1 目的基因的PCR扩增

PCR 结果显示:在588 bp处有1条带, 与预期片段大小一致, 没有非特异性条带出现 (见图1) 。

M.DL-2 000 Marker;1.PCR扩增产物;2.阴性对照。

2.2 原核表达载体pET- 28a- INF-τ的构建

质粒pET-28a 和回收的PCR产物分别经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后, 回收酶切片段, 16 ℃连接过夜, 连接产物转化至大肠杆菌BL21 (DE3) 感受态细胞, 随机挑取菌落, 抽提质粒, 双酶切产物电泳后, 阳性克隆出现的2条带分别位于5 300 bp和588 bp处 (见图2) , 以提取质粒为模板进行PCR扩增, 在588 bp处同样出现特异性条带。将鉴定正确的阳性菌落送上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定, 所得结果与目的基因序列一致。

1.重组质粒的酶切;2.重组质粒;M.DL-2 000 Marker;3.PCR产物;4.阴性对照。

2.3 蛋白诱导表达及鉴定

将原核表达载体pET- 28a- INF-τ转化至大肠杆菌BL21 (DE3) 感受态细胞中, 获得重组工程菌, 接种 LB 液体培养基, 于 37 ℃培养至 OD600 值达到 0.6时, 加入终浓度为1 mmol/L IPTG 诱导6 h, 收集菌体进行 SDS- PAGE 检测, 可见在分子质量约为25.5 ku处出现1条新的蛋白带 (见图3) , 与理论预测值基本相符。空载体转化菌 pET- 28/BL21诱导后和未诱导重组工程菌在同一位置未出现相应的蛋白带。将诱导后的全菌进行 SDS- PAGE分离后电转移至NC 膜上, 依次加入一抗和二抗, DAB 显色后在分子质量为 26 ku的新生蛋白带处有1条特异性条带, 同时以空载体菌作为对照, 未发现条带, 说明该蛋白带为目的蛋白 (见图4) 。

M.低分子质量蛋白标准;1.pET- 28a- INF-τ诱导6 h;2.空载体转化菌 pET- 28/BL21诱导后;3.未诱导重组工程菌。

M.低分子质量蛋白标准;1.融合蛋白。

3 讨论

IFN-τ作为一种新的Ⅰ型干扰素, 具有很强的抗病毒、免疫调节、抗黄体溶解等生物学功能, 特别是其抗病毒作用受到了人们的高度重视。作为一种新型抗逆转录病毒干扰素, IFN-τ具有比 IFN-α更有效的抗人免疫缺陷病毒 (HIV) 作用。同时, 也可以有效地抑制巨噬细胞内HIV 早期的复制过程, 减少细胞间的HIV-RNA, 抑制病毒 RNA 逆转录的起始及前病毒DNA 的形成[3]。因此, IFN-τ被认为是一种新型的具有发展潜力的分子药物。 但是, IFN-τ在特定的空间和时间才会表达, 并且直接进行组织培养和提取也很繁琐而且困难, 试验通过基因工程技术将克隆的IFN-τ片段转入载体细胞进行表达, 表达蛋白的量也很高。

参考文献

[1]THOMAS W C, SANDRA B.Interferon-τ:Current applicationsand potential in antiviral therapy[J].J Inter Cytok Res, 2010, 30:477-483.

[2]付加雷, 宋长征.干扰素-τ的研究进展[J].药物生物技术, 2006, 13 (1) :74-78.

原核基因表达 篇7

试验通过对水牛Sox2基因进行体外原核表达研究, 为进一步研究其特性和功能、阐明干细胞调控网络和制备水牛Sox2多克隆抗体奠定基础。

1 材料

普通质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、DNA Marker、BL21 (DE3) 感受态细胞、增强型HRP-DAB底物显色试剂盒、羊抗鼠IgG-HRP, 天根生化科技 (北京) 有限公司生产;限制性内切酶 (BamHⅠ、Hind Ⅲ) 、T4 DNA连接酶, TaKaRa公司生产低分子质量蛋白, Fermentas公司生产;Anti-Sox2 Antibdy, Santa Cruz Biotechnology Inc公司生产。

2 方法

2.1 原核表达载体的构建

用限制性内切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ对含有目的基因的重组质粒pMD18-T- Sox2 (由广西大学动物繁殖所提供) 和原核表达载体pET-32a (+) 分别进行双酶切, 对酶切产物进行胶回收, 于16 ℃用T4 DNA连接酶连接12 h, 再转化感受态DH5α细菌, 获得目的基因原核表达载体pET- Sox2。

2.2 目的基因的诱导表达

用目的基因原核表达载体pET-Sox2转化表达菌株BL21 (DE3) 感受态细胞, 37 ℃恒温摇床培养, 当菌液OD值≈0.6时, 加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/L , 继续培养3～4 h, 收集菌体, 进行SDS-PAGE电泳, 分析目的基因的表达情况。

2.3 目的蛋白的Western-blot检测

收集阳性菌液, 加入2×SDS上样缓冲液混匀;100 ℃煮沸5 min后冰浴10 min, 室温1 200 r/min离心6 min, 进行12% SDS-PAGE电泳;然后以80 mA恒流30 min半干转入NC膜;再用含有3%脱脂奶粉的封闭液于4 ℃封闭过夜;然后用一抗 (1∶500) 孵育1.5～2.0 h, 二抗 (1∶200) 孵育1 h;最后用现配制的DAB显影液显影。

3 结果

3.1 表达载体pET- Sox2的构建与检测

对含有水牛Sox2基因的重组质粒pMD18-T- Sox2进行双酶切后, 定向克隆入原核载体pET-32a (+) , 连接产物pET-Sox2经1%琼脂糖凝胶电泳, 在6 866 bp处有目的条带 (见图1) ;再对pET-Sox2进行双酶切和PCR鉴定, 可以看到966 bp处有目的条带 (见图2) , 与预期结果相符。

M.超螺旋DNA标记物;1.pET-32a (+) 质粒;2.pET- Sox2重组质粒。

M.DNA Marker Ⅲ;1.pET- Sox2双酶切;2.pET- Sox2 PCR检测。

3.2 目的基因Sox2的诱导表达

将重组质粒pET-Sox2转化E.coli BL21 (DE3) , 在菌液OD值≈0.6时, 加入IPTG进行目的蛋白的诱导表达, 再取样进行SDS-PAGE分析。空载体pET-32a (+) 带有硫氧还蛋白标签 (Trx·Tag) 、组氨酸标签 (His·Tag) 和S标签 (S·Tag) , 其融合标签蛋白大小为20.4 ku。因此, 对空载体pET-32a (+) 进行IPTG诱导后, 在20.4 ku处有明显的特异性条带。Sox2蛋白的大小为34.6 ku, 所以对pET-Sox2进行IPTG诱导后, 在55.0 ku处有明显的特异性条带, 与预期结果相符 (见图3) 。

M.低分子质量标准;1.BL21 (DE3) 菌体蛋白;2.未诱导的pET-Sox2;3, 4.诱导表达的pET-32a (+) 空载体;5, 6.诱导表达的pET-Sox2。

3.3 目的蛋白Sox2的Western-blot检测

对pET-Sox2进行IPTG诱导表达后, 用特异性Sox2抗体进行Western-blot检测, 有特异性条带出现 (见图4) , 表明Sox2基因在E.coli BL21 (DE3) 中能正确表达。

4 讨论

载体pET-32a (+) 含有Amp+抗性基因, 可以用来进行药物抗性筛选;含有3个融合标签, 即Trx·Tag、His·Tag和S·Tag。其中, His·Tag可以特异性地与某些金属离子 (如Ni2+、Cu2+、Co2+、Zn2+) 螯合, 是常用来纯化蛋白的融合标签, 特别是那些以包涵体形式表达的蛋白, 它可以将蛋白在完全变性条件下溶解后进行亲和纯化。试验选择pET-32a (+) 作为基础载体, 以便于后续获得纯化的Sox2蛋白, 并进行下一步研究。在对pET- Sox2的诱导表达中, 可以看到对于没有诱导的pET- Sox2, 在55.0 ku处也出现了较弱的特异性条带, 这是因为即使在没有 IPTG 存在的情况下, 也会有少量lacUV5 启动子表达的 T7 RNA聚合酶, 因此存在目的蛋白的本底表达。另外, 在对pET- Sox2进行诱导时, 为了使目的蛋白大量表达, 添加IPTG的时间一般控制在宿主菌BL21 (DE3) 快速生长期至对数生长期, 以获得足够大量的细菌。可以将目的基因的诱导表达过程分为两个阶段:第一阶段, 不添加诱导剂, 由于缺乏T7 RNA聚合酶, pET载体上的目的基因基本上处于沉默状态;第二阶段, 添加诱导剂IPTG, 从而启动BL21 (DE3) 菌株的lacUV5启动子对T7 RNA聚合酶的转录, 再进一步启动pET-32a (+) 载体上的T7lac启动子对目的基因的转录, 目的基因开始快速而高效地表达。

试验成功地利用E.coli诱导表达了Sox2蛋白, 并且经过Western-blot检测, 表明所表达的Sox2蛋白具有较强的反应原性, 能够顺利进行水牛Sox2多克隆抗体的制备以及展开Sox2蛋白的结构特性和功能研究。

摘要：水牛Sox2基因对体内胚胎的早期发育至关重要, 它是重要的多能性干细胞 (iPS细胞) 标记基因之一, 试验通过双酶切重组质粒pMD18-T-Sox2, 将水牛Sox2基因定向克隆入原核载体pET-32a (+) , 成功构建了原核表达载体pET-Sox2, 然后利用IPTG诱导, 获得诱导表达蛋白, 并经过SDS-PAGE电泳分析和Western-blot检测。结果表明:诱导表达蛋白为特异性Sox2蛋白。

关键词：Sox2基因,原核表达,载体,构建,诱导表达

参考文献

[1] AVILION A A, NICOLIS S K, PEVNY L H, et al. Multipotent cell lineages in early mouse development depend on Sox2 function[J]. Genes Dev, 2003, 17 (1) : 126-140.

[2] YUAN H, CORBI N, BASILICO C, et al. Developmental-specific activity of the FGF-4 enhancer requires the synergistic action of Sox2 and Oct-3[J].Genes Dev, 1995, 21 (9) : 2635-2645.

[3]TAKAHASHI K, YAMANAKAS.Induction of pluripotent stem cel-ls frommouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined fac-tors[J].Cell, 2006, 126 (4) :663-676.

[4]WERNIG M, MEISSNER A, FOREMAN R, et al.In vitro repro-gramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state[J].Nature, 2007, 7151 (448) :318-324.

[5]KIM J B, ZAEHRES H, WU G, et al.Pluripotent stem cells in-duced fromadult neural stemcells by reprogramming with two factors[J].Nature, 2008, 7204 (454) :646-650.

[6] GIORGETTI A, MONTSERRAT N, RODRIGUEZ-PIZA I, et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood cells with only two factors: Oct4 and Sox2[J]. Nat Protoc, 2010, 5 (4) : 811-820.

[7] LIAO J, CUI C, CHEN S, et al. Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells[J].Cell Stem Cell, 2009, 4 (1) : 11-15.

[8] ZHOU H, WU S, JOO J Y, et al. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins[J].Cell Stem Cell, 2009, 4 (5) : 381-384.

原核基因表达 篇8

辽宁绒山羊是世界上绒毛品质优良、产绒量最高的白绒山羊品种,以个体大、产绒量高、适应性强、遗传性能稳定而在国内外享有盛誉,所产山羊绒被专家称作“纤维宝石”,在国际市场上具有“软黄金”的美誉,是纺织工业最上乘的动物纤维纺织原料。辽宁绒山羊在改良和提高我国各省区绒山羊品质方面起着至关重要的作用,社会效益和经济效益巨大。

试验对辽宁绒山羊进行PrP基因克隆与表达辽宁绒山羊PrP前体蛋白的研究,并结合部分已发表的种属PrP基因序列进行PrPC基因功能表位分析和TSE易感性的预测,以便为TSE发病机理的研究提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 工具酶和试剂

质粒快速提取试剂盒(Plasmid Rapidisolation Kit)、全血基因组DNA快速提取试剂盒(Genomic DNA Rapid Isolation Kit,for blood),均为BioDev-Tech公司生产;凝胶提取试剂盒(E.Z.N.A.®Gel Extraction Kit),Omega公司生产;克隆载体pEASY-T1、大肠杆菌Top10和BL21(DE3)感受态细胞、表达载体pEASY-E1、T7启动子引物,购自北京全氏金公司;EcoRⅠ限制性内切酶及T4 DNA 连接酶、X-gal、IPTG,均为 Promega 公司产品;DNA Marker、蛋白质Marker、ExTaq DNA 聚合酶,宝生物工程(大连)有限公司产品;其余试剂均为国产分析纯。

1.2 辽宁绒山羊基因组DNA 的提取

分别从40只健康纯种辽宁绒山羊(1～5岁,来自辽宁省各地区) 采集5 mL血液(枸橼酸钠抗凝),用全血基因组DNA快速提取试剂盒提取基因组DNA,-20 ℃保存,备用。

1.3 目的基因(PrP基因)的PCR 扩增

PCR 反应体系组成参照参考文献[5],引物由沈阳农业大学组胚病理实验室保存,上游引物5′-TAAGTCATCATGGTGAAAAGC-3′,下游引物5′-CCCCCAACCTGGTAAAGATTAA-3′。反应程序:94 ℃ 5 min; 94 ℃ 45 s,53 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,共34个循环;最后72 ℃ 10 min。用1% 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

1.4 基因的克隆与鉴定

用凝胶提取试剂盒进行DNA 片段回收,参照参考文献[6]并稍加修改连接DNA片段与pEASY-T1载体,并转化至大肠杆菌Top10感受态细胞中,筛选获得阳性克隆菌株进行质粒的提取及酶切鉴定。

1.5 重组质粒的序列测定及分析

采用质粒快速提取试剂盒提纯重组质粒,对重组质粒测序[由宝生物工程(大连)有限公司测序]。用DNAMan及DNAStar分析软件进行朊蛋白基因和氨基酸序列分析。

1.6 PrP基因前体蛋白表达质粒的构建及鉴定

将表达载体pEASY-E1与回收、纯化的PCR产物(各1 μL)轻轻混匀,37 ℃反应5 min;将连接产物转化至大肠杆菌Top10感受态细胞中,37 ℃培养12 h;挑取菌落,摇菌,提取质粒,用T7启动子引物和目的基因的下游引物进行PCR扩增,鉴定重组子正确表达方向;再挑取阳性质粒送北京六合华大基因股份有限公司测序,以鉴定插入序列是否准确。

1.7 PrP基因前体蛋白在大肠杆菌中的表达

于 37 ℃对鉴定正确的阳性质粒摇菌,提取质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,然后用IPTG诱导,再用SDS-PAGE方法进行表达产物的检测,设空载体和重组质粒为对照。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增、克隆与酶切鉴定结果

PCR 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳显示,在830 bp处有1条特异性条带,见图1;对重组菌落(白斑) 进行PCR鉴定,结果扩增出了目的条带;对重组质粒进行酶切鉴定,得到预期大小的目的片段(GenBank登录号为EU253454),见图2。

M.DL-2 000 Marker;1～3.不同样品PCR 扩增产物。

1～3.不同样品重组质粒酶切产物;M.DL-2 000 Marker。

2.2 基因序列分析与比较结果

重组质粒序列分析结果表明,试验获得长为771 bp、共编码256个氨基酸的朊蛋白基因前体蛋白。40只辽宁绒山羊朊蛋白基因核苷酸序列同源性为99.6%,共发现5个碱基突变,即G126A、C414T、A428G、A652C和T718C(等位基因多态性频率见表1,部分序列的GenBank登录号为EU253454),其中G126A、C414T为同义突变,A428G、A652C和T718C为异义突变,即CAT变为CGT、ATC变为CTC、TCC变为CCC,分别引起 143位点由His(H)变为Arg(R)、218 位点由Ile(I)变为Leu(L)和240位点由Ser(S)变为Pro(P)。40只绒山羊PrP基因均是密码子为136,154,171的PrP ARQ等位基因。

2.3 山羊朊蛋白基因氨基酸序列分析与比较结果

利用DNAMan对所克隆的辽宁绒山羊PrP氨基酸序列与GenBank所能得到的山羊PrP氨基酸序列、某些学者所报道的山羊PrP氨基酸序列多态性位点进行比较分析,结果显示,山羊朊蛋白基因(PRNP)氨基酸序列同源性均为99.41%～100%,与大多数哺乳动物八肽重复区相同,首尾各为1个九肽,中间为3个稳定八肽重复区,见图3。

2.4 目的基因的原核表达质粒的构建和鉴定结果

将鉴定正确的PrP基因片段与表达载体pEASY-E1连接,构建成重组表达质粒pEASY-E1-PrP。应用T7启动子引物和目的基因下游引物进行PCR鉴定,结果PrP基因正确插入表达载体中(见图4),然后将重组质粒转至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。经测序确定,PrP基因的读码框完全正确。

M.DL-2 000 Marker;1.pEASY-E1-PrP 的PCR产物。

2.5 表达产物的SDS-PAGE分析结果(见图5)

重组表达质粒pEASY-E1-PrP转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后,经培养和IPTG诱导收集菌液,再经SDS-PAGE分析,在30 ku左右出现1条与预期大小相符的特异性条带。

M.低分子质量蛋白标准;1,2,3,4.分别为诱导 5,4,3,2 h的电泳结果;5.pEASY-E1-PrP诱导前; 6.pEASY-E1空质粒诱导2 h。

3 讨论

朊蛋白基因氨基酸的变异影响朊病毒的致病性、遗传易感性及种间屏障,这在人、绵羊和鼠的朊病毒疾病方面已经得到了证实[1,7,8,9,10]。痒病是最早被发现的TSE,已成为传染性海绵状脑病的研究模型,绵羊PrP基因密码子136,154,171具有多态性,并决定着绵羊对TSE的易感性和抗性。136位点编码的缬氨酸(V)与易感性有关,而编码D的丙氨酸(A)与抗性有关;154位点编码的组氨酸(H)与易感性有关,而精氨酸(R)与抗性有关;171位点编码的谷氨酸(Q)和组氨酸(H)与易感性有关,而编码的精氨酸(R)与抗性有关[11,12,13]。山羊朊蛋白基因的多态性较复杂,多态性位点较多,研究发现,21,23,37,49,10,110,127,133,137,142,143,146,154,168,211,218,220,222,240位点氨基酸都存在多态性[11,12,13,14,15,16,17]。Acutis P L等[12]报道,37V(缬氨酸)、110P(脯氨酸)、127S(丝氨酸)、133Q(谷氨酰胺)、137I(异亮氨酸)型山羊对痒病具有抗性,这些位点的氨基酸只存在于健康动物中,在痒病病例中从未出现。同样Goldmann W等[14,15]的研究表明,102G(甘氨酸)和142M(蛋氨酸)型山羊接种痒病和疯牛病毒株后,潜伏期显著延长,这就提示这些等位基因对痒病具有一定的抗性。此外,R143、H154型希腊山羊对痒病也具有一定的抗性[17]。Acutis P L等[12]研究发现,在所发现的山羊痒病病例中,没有一例是222K(赖氨酸)型山羊,这个位点正好等同于人(Q219K),它是唯一的一个具有抵抗散发式克雅病的等位基因,因此222位点是K时可能对痒病具有抗性。通过痒病抗性基因对比分析表明,辽宁绒山羊朊蛋白基因的这些位点分别是G37、W102、T110、G127、L133、M137、I142、H143R、R154H、Q222,除了R143和R154对痒病具有抗性外,其他位点的密码子对痒病都不具有抗性,这就提示辽宁绒山羊对痒病可能具有一定的易感性。另外,通过氨基酸变异位点区域分析表明,139～158位、185～194位和α螺旋3这3个区域氨基酸的变异将影响动物对TSE 的易感性[18],而辽宁绒山羊朊蛋白基因氨基酸多态性位点(H143R、I218L和S240P)恰巧位于这3个区域内,因此辽宁绒山羊这3个位点氨基酸的多态性将有可能影响其对TSE的易感性。目前,在朊病毒致病机理尚未完全明了的情况下,对辽宁绒山羊朊蛋白基因进行多态性分析,可为预测辽宁绒山羊对朊病毒的抗性、揭示朊病毒病之间的种属特异性提供基础数据。

原核基因表达 篇9

1 材料

多重耐药大肠杆菌4株, 自行分离鉴定;药敏质控株ATCC25922, 购自吉林大学医学部细菌室;敏感株H10407, 由吉林大学农学部生物化学教研室惠赠;大肠杆菌感受态细胞BL21 (DE3) 、JM109、DH5α, 由吉林大学农学部预防兽医学教研室惠赠;p MD18-T载体、蛋白Marker, 购自Ta KaRa公司;原核表达载体p ET-28a, 购自Novagen公司;辣根过氧化物酶标记羊抗兔血清, 购自北京中山生物技术有限公司。

2 方法

2.1 大肠杆菌Acr A、Acr B基因片段的克隆

2.1.1 PCR引物的设计与合成

根据Gen Bank中Acr A基因序列设计扩增引物, 序列为:Acr A基因上游引物5'-GGATCCCCTCAAGTTAGCGGGAT-3', 下画线部分为Bam HⅠ酶切位点;下游引物5'-AAGC-CCTTCTTCCAGACGTGCG-3'。Acr B基因上游引物5'-GGATCCAAGATGGAACCGTTCTTCCCGTC-3', 下画线部分为Bam HⅠ酶切位点;下游引物5'-CTC-GAGCTAGTGCGTGCTCTTCTCG-3', 下画线部分为XhoⅠ酶切位点。引物由Ta KaRa公司合成。

2.1.2 大肠杆菌染色体DNA的提取

提取多重耐药水平较高的2株大肠杆菌 (命名为1, 2号) 的染色体DNA。

2.1.3 Acr A、Acr B基因片段的PCR扩增

以大肠杆菌染色体DNA为模板, 用设计的引物扩增Acr A (696 bp) 、Acr B (641 bp) 的基因片段, 反应体系 (50μL) :染色体DNA 1μL, 10×Ex Taq Buffer (Mg2+plus) 5μL, d NTPs Mixture (各2.5 mmol/L) 4μL, 上、下游引物各1μL, Ex Taq (5 U/μL) 0.25μL, dd H2O 37.75μL。PCR反应条件:95℃2 min, 94℃30 s, 64℃30 s, 72℃45 s, 共30个循环;72℃10 min。

2.2 测序

PCR产物经回收纯化后, 连接p MD18-T载体并转化大肠杆菌感受态细胞JM109, 提取质粒后进行鉴定, 取鉴定正确的质粒送宝生物工程 (大连) 有限公司进行序列测定。

2.3 表达载体的鉴定

将测序正确的质粒及原核表达载体p ET-28a同时用Bam HⅠ、HindⅢ (Acr A) /Bam HⅠ、XhoⅠ (Acr B) 双酶切, T4 DNA连接酶连接, 转化大肠杆菌感受态细胞DH5α, 提取质粒后, 经PCR、酶切鉴定后进行序列测定。

2.4 重组蛋白的表达及检测

将鉴定正确的质粒Acr A-p ET28a、Acr B-p ET28a转化大肠杆菌感受态细胞BL21 (DE3) , 挑取单个菌落接种于5 m L LB液体培养基 (含30μg/m L卡那霉素) , 37℃、200 r/min振荡培养5 h;加入IPTG (终浓度为1 mmol/L) 于37℃诱导6 h;取菌体1.5 m L按照常规方法制样进行SDS-PAGE和Western-blot检测。同时作空质粒p ET-28a (+) 对照。

2.5 包涵体的提取及纯化

按照参考文献[3]提取包涵体, 分别收集上清液和沉淀, 经SDS-PAGE检测证实, 超声裂解的上清液中存在大量的目的蛋白Acr A。采用切胶回收法和磷酸盐缓冲液透析法对表达蛋白进行纯化。

3 结果

3.1 Acr A、Acr B基因的克隆结果

3.1.1 1, 2号大肠杆菌基因组DNA的提取结果

见图1。

1.2号大肠杆菌基因组;M.λ-HindⅢMarker;2.1号大肠杆菌基因组。

3.1.2 Acr A、Acr B基因片段的PCR扩增结果

见图2、图3。

1.Acr B片段;2.Acr A片段;M.DL-2 000 Marker。

M.DL-2 000 Marker;1.Acr B片段。

利用Ex Taq DNA聚合酶扩增, PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳, 分别在约696 bp、641 bp处出现特异性目的片段, 与预计的片段大小吻合。

3.2 PCR产物的克隆序列分析结果

结果表明:克隆质粒Acr A序列与Gen Bank中发表的序列同源性为99.7%, 所编码的氨基酸没有改变。1, 2号大肠杆菌克隆质粒Acr B序列与Gen Bank中发表序列同源性均为92.3%、93.2%, 二者与质控株ATCC25922的Acr B序列的同源性为97.5%、98.3%, 所编码的氨基酸序列与Gen Bank中发表序列相比同源性较高。

3.3 表达载体的鉴定及测序结果

结果表明, Acr A、Acr B基因按照正确的阅读框架插入了p ET-28a中。

3.4 Acr A-p ET28a、Acr B-p ET28a在宿主菌中的诱导表达与初步纯化结果

3.4.1 重组基因的诱导表达

结果表明, 在约33 ku处出现1条明显的表达条带, 见图4。质粒Acr B-p ET28a表达的全菌体蛋白中未见明显的蛋白特征带。对Acr A-p ET28a表达蛋白进行Western-blot检测, 出现特异性的反应带, 见图5。

3.4.2 包涵体的制备与初步纯化结果

振荡培养1 L表达菌液, 经IPTG诱导表达后, 制备获得了大量包涵体。应用SDS-PAGE技术检测包涵体, 结果表明, 重组基因表达的嵌合蛋白是以包涵体形式存在的。采用切胶回收法和磷酸盐缓冲液透析法对表达蛋白进行纯化, 效果良好。

4 讨论

由于大肠杆菌易于培养, 培养周期短, 成本低, 表达蛋白可大量生产, 又易于纯化, 还能诱发机体的抗体反应, 通常将外源基因导入到大肠杆菌中用于蛋白质的大量表达, 在蛋白质的纯化、定位及功能分析方面有一定价值[4]。

p ET-28a表达系统的转录调控元件包括T7启动子和其后的Lac操纵子, 二者均为高效调控启动子。其转录是由来源于溶源菌染色体上的Lac UV5启动子控制的T7 RNA多聚酶基因表达的T7 RNA多聚酶控制。IPTG可以激活Lac UV5启动子, 从而表达T7 RNA多聚酶, 进而高效表达T7启动子下游的外源基因。

由于Acr A的前24个氨基酸是信号肽, 本试验中设计了对除掉信号肽的部分Acr A基因进行克隆的引物, 并在上游引物的前面加上了酶切位点, 以便正向插入表达p ET-28a表达载体中。通过原核表达载体p ET-28a的构建, 成功地将Acr A基因的原核表达质粒转化到大肠杆菌感受态细胞BL21 (DE3) 后, 经IPTG诱导, SDS-PAGE检测获得大小约为33 ku的表达蛋白带, Western-blot检测可见特异条带, 证实Acr A基因在p ET原核表达系统中可以进行表达。采用切胶回收法和磷酸盐缓冲液透析法对表达蛋白进行纯化, 效果良好, 说明其具有很好的反应原性。

选用同样的设计方法及表达载体对Acr B片段进行克隆及原核表达, 对1号、2号菌的Acr B片段的克隆过程中发现, 其与Gen Bank中Acr B片段的碱基序列相比碱基突变率较高, 同源性较差, 碱基序列的突变位点基本一致。可能是由于Acr B片段上的碱基突变率较高, 且更多的碱基突变后表达率更低的原因, 该片段未能成功表达。由于碱基的突变位点分布得比较均匀, 导致无法通过点突变来进行改造。通过合成Acr B的短肽而制备Acr B抗体可能是一个较为理想的途径。

参考文献

[1]POOLE K.Efflux-mediated resistance to fluoroquinolones in gramnegative bacteria[J].Antimicrob Agents Chemother, 2000, 44 (9) 4:2223-2241.

[2]MAZZARIOL A, TOKUE Y, KANEGAWA T M, et al.High-level fluoroquinolone-resistant clinical isolates of Escherichia coli overproduce mulidrug efflux protein AcrA[J].Antimicob Agents Chemother, 2000, 44 (12) :3441-3443.

[3]金东雁.分子克隆实验指南[M].北京:科学出版社, 2002.

原核基因表达 篇10

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料:

:通粳1号水稻种子,由江苏南通种子站提供。

1.1.2 试剂:

p ET5a质粒和BL21(DE3)菌种由南通大学生命科学学院提供;RNAsio、逆转录酶、Taq DNA聚合酶、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、Bam HⅠ和Eco RⅠ内切酶购自Ta Ka Ra公司;LB培养基购自Oxoid公司;SDS-PAGE试剂盒购自碧云天公司。

1.1.3 仪器:

ABI 9700型PCR仪;Bio Rad凝胶图像分析仪;Thermo 400摇床。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR水稻种子常规促发芽:

取幼根剪碎后,按试剂说明提取总RNA。以Oligo d T为引物,逆转录合成c DNA,按照Gen Bank(AF162665)序列设计扩增阅读框架片段的引物,上游引物含有Bam HⅠ酶切位点,下游含有Eco RⅠ位点,以c DNA为模板,PCR法扩增ALDH开放阅读框架序列。引物序列为:

上游引物:5′-CGGGATCCATGGCTGCCGCTGCTGCAAG-GA

下游引物:5′-CGGAATTCTGTTTACAACCACGCGGCGT-TCTTG

预计扩增片段长度为1 668bp(下划线示酶切位点序列),由上海英骏公司合成。

1.2.2 酶切、连接:

Bam HⅠ和Eco RⅠ双酶切PCR产物和p ET5a质粒,琼脂糖电泳分离后,胶回收试剂盒回收PCR产物和质粒。应用T4DNA连接酶于16℃下1h连接PCR产物和质粒。

1.2.3 转化与鉴定:

取连接产物5μl常规转化100μl感受态BL21(DE3)菌,涂布于含氨苄青霉素(Amp)的固体LB培养基上,37℃避光培养16h。随机挑取8个菌落,常规LB(Amp+)液体培养基培养,按质粒提取试剂盒说明提取质粒,Bam HⅠ和Eco RⅠ双酶切,1%琼脂糖电泳检测。

1.2.4 测序:

:重组质粒(p ET5a-ALDH)由上海鼎安生物科技公司公司测序。

1.2.5 诱导表达:

取p ET5a-ALDH/BL21菌,常规LB(Amp+)扩大培养,待菌液浓度达到OD6000.6时,将培养物分为两组,一组加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L进行诱导,诱导时间分别为1、2、3h;另一组加入IPTG至终浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.8mmol/L,诱导3h。两组诱导温度均为37℃,同时设一非诱导对照。

1.2.6 表达产物电泳检测:

:表达菌加入上样缓冲液,100℃水浴5min后,10%SDS-PAGE检测,考马斯亮蓝染色、脱色。

2 结果与分析

2.1 ALDH片段RT-PCR扩增结果

通过RT-PCR方法,得到特异性ALDH扩增片段,片段大小符合预期的1 668bp长度(图1)。

M:DL2000;1:空白;2:ALDH。M:DL2000 DNA Ladder;1:control;2:ALDH.

2.2 ALDH重组质粒酶切结果

酶切结果证实在8个菌落中有4个含有重组质粒,插入片段长度与预期相吻合(图2)。图中显示了其中2个菌落的双酶切结果。

M:DL2000;1:非重组质粒;2-3:重组质粒。M:DL2000 DNA Ladder;1:control plasmid;2-3:recombinant plasmid.

2.3 重组质粒测序结果

测序结果表明,ALDH插入片段的序列与Gen Bank收录序列比较无差异,且片段的插入方向正确无误(图3)。

2.4 表达产物电泳检测结果

以0.4mmol/L浓度的IPTG诱导p ET5a-ALDH/BL21不同时间,发现3h后达到最大表达量(图4);用不同浓度IPTG诱导3h,发现各浓度的诱导效果无显著区别(图5)。表达产物蛋白符合预计的分子量61.8k D(共计562个氨基酸,其中含有融合蛋白的13个氨基酸)。运用计算机软件扫描比较后,得出表达蛋白量占菌体总蛋白的9%。

M:标准分子量蛋白;1:未诱导;2:诱导1h;3:诱导2h;4:诱导3h。M:standard protein;1:non-induced;2:induced for 1h;3:induced for2h;4:induced for 3h.

M:标准分子量蛋白;1:未诱导;2:0.1mmol/L IPTG;3:0.2 mmol/LIPTG;4:0.4 mmol/L IPTG;5:0.8 mmol/L IPTGM:standard protein;1:non-induced;2:0.1mmol/L IPTG;3:0.2 mmol/L IPTG;4:0.4 mmol/L IPTG;5:0.8 mmol/L IPTG.

3 讨论

乙醛脱氢酶(ALDH)在原核细胞到人类、动物以及植物中广泛存在,是细胞防御系统的重要成员。该酶的活性以及多态性不仅与乙醇、乙醛毒性的清除,进而与酗酒行为有关,还与酒精性肝病,甚至细胞恶变相关[1,2,3]。但植物体ALDH的研究资料相对较少[4],也未见体外原核表达的报道。

徐秉芳等从特青水稻中克隆出ALDH c DNA序列(GenBank No.AF162665),并对序列以及水稻的不同组织和不同品系进行了较详尽的对比分析[5]。李新玲等克隆了灰绿型羊草ALDH c DNA序列,并研究ALDH基因在不同条件下的表达情况[6]。研究发现,植物的ALDH不仅对内源性和外源性的毒性物质具有解毒作用,还与植物耐盐、耐旱等抗逆性相关[7]。

研究表明,水稻ALDH共有20个成员,分属10个家族[7]。本文克隆和表达的ALDH定位于线粒体中,属于家族2中的Os ALDH2-5成员。

本文利用PCR定向克隆和体外原核表达方法,获得了含通粳1号水稻ALDH阅读框架质粒的工程菌并获得了原核表达的蛋白,序列比较的结果证明通粳1号水稻的ALDH阅读框架与徐秉芳等报道的序列无差异。本文的工作为进一步研究植物体ALDH的作用分子机制奠定了基础,同时为生物工程方法获得大量ALDH,为研究该酶的动力学参数提供了资料。

参考文献

[1]LI Qing-song,LI Yi-feng,SHAO Min-hua.Cloning and expression of different genotypes of human aldehyde dehydrogenase2gene[J].复旦学报:自然科学版,2004,43(6):1079-1083.

[2]Jelski W,Chrostek Lech,Szmitkowski M.The activity of class I,III,and IV of alcohol dehydrogenase isoenzymes and aldehyde dehydrogenase in gastric cancer[J].Dig Dis Sci,2007,52:531-535.

[3]Yokoyama T,Yokoyama A,Kato H.Alcohol flushing,alcohol and aldehyde dehydrogenase genotypes,and risk for esophageal squamous cell carcinoma in Japanese men[J].Cancer Epidem Biomar,2003,12:1227-1233.

[4]Kirch HH,Schlingensiepen S,Kotchoni S.Detailed expression analysis of selected genes of the aldehyde dehydrogenase(ALDH)gene superfamily in Arabidopsis thaliana[J].Plant Mol Biol,2005,57:315-332.

[5]徐秉芳,邢彦彦,王宗阳.水稻乙醛脱氢酶基因的克隆及其在不育系中的表达[J].植物生理学报,2000,26(3):206-212.

[6]李新玲,杨传平,徐香玲.羊草乙醛脱氢酶(ALDH)基因片段的克隆及表达分析[J].中国农学通报,2007,23(6):115-120.