骨相关基因表达

骨相关基因表达（精选5篇）

骨相关基因表达 篇1

现代分子遗传学研究证实:肿瘤是染色体基因异常引起的疾病。骨肉瘤的发生、演进和生物学特性, 同其它许多恶性肿瘤一样, 是以癌基因激活和/或抑癌基因失活为主的多基因异常共同作用的结果, 且肿瘤的生物学特性与基因变异的程度呈正相关。本文对与骨肉瘤相关的基因及作一概述。

1与骨肉瘤发生相关的基因

1.1抑癌基因的改变

1.1.1最常见的抑癌基因是p53[1], 定位于染色体17q13, 野生型的p53的蛋白在NH末端具有转录因子的活性, 可与启动子上特异性的DNA序列相结合而激活靶基因 (如pZ1) 。其在骨肉瘤中的改变有点突变、重排或缺失。骨肉瘤中p53改变文献很多, 最近, Lonardo等总结前人文献, 发现骨肉癌中p53改变为l8%~42%。近年来, 有关p53基因在骨肉瘤的研究热点放在p53和MDM2联合作用上。Chen等研究发现MDM2通过与p53基因结合来阻止p53的功能, 当MDM2过量时, 导致肿瘤或转化。在另一研究中还发现MDM2抑制抑癌基因引起p53的Gl期生长停滞和凋亡的功能。

1.1.2 Rb基因Rb基因定位干l3ql4[9], 是目前研究的最多和公认的抑癌基因之一。国内外研究均已证实, 其功能失活在骨肉瘤的发生和发展中起着重要的作用。骨肉瘤中Rb功能失活机制可归纳如下: (1) Rb基因缺失、重排、点突变, 从而不能编码Rb蛋白口。 (2) Rb基因结构正常, 但转录调节、转录后修饰或翻译等异常, 也不能产生Rb蛋白或产生异常Rb蛋白 (3) Rb基因蛋白活性受到抑制, 如骨肉瘤中细胞周期调控蛋白 (Cycllns、CDKs、CKIS) 异常造成pRb磷酸化, 从而功能丧失。Feugeas等发现Rb基因杂合性缺失与骨肉瘤的预后不良密切相关, 提示Rb基因缺失可以作为判断骨肉瘤预启的指标之一。

1.1.3 DCC基因DCC基因[8] (deleted|n col-orectal carcinoma) 是Fearon等研究结直肠癌于1990年确定并命名的一个重要的抑癌基因.其长约1.35Mh, 含转录起始部位、信号肽及编码跨膜蛋白的基因位点, 至少含有29个外显子。最近, Horstmann等应用RT-PCR技术研究骨肉瘤中DCC基因m RNA表达, 发现19倒高度恶陛骨肉瘤中有l4倒, 6倒低中度恶性骨肉瘤有3例DCC基因不表达或低表达他们采用免疫组他技术检测其中的l 4侧, 结果和RT-PCR结果相吻合。他们还发现包括骨肉瘤细胞系在内的多数肿瘤细胞系DCC基因缺失或低表达。这证实DCC抑癌基因的失活和骨肉瘤的发生有关。

1.1.4 PTEN基因PTEN基因[5,9]位于染色体10q23。PTEN作为抑癌基因, 最主要的生理性底物就是3, 4, 5一三磷酸磷脂酰肌醇 (PIP3) 。PIP3是上皮生长因子、胰岛素样生长因子、血小板样生长因子等细胞生长因子的细胞中的第二信使。这些生长因子通过与特异性受体结合, 激活磷脂酰肌醇3激酶 (PI3K) , 调节细胞的AKT的功能, 从而调节细胞的转移、黏连及细胞的生长。PTEN基因抑制对AKT的活化, 而对肿瘤产生抑制作用。Nielsen等对人骨肉瘤细胞系研究发现, PTEN表达的缺失能增加AKT的活性从而导致骨肉瘤细胞的生长。

1.5 pt16、P15抑癌基因又称MTSI、CDKN2基因[13]。编码分子量为15.84kD的单链多肽。p16、p15抑癌基因突变或缺失广泛存在于各种肿瘤中如胶质瘤、黑色素瘤等。最近Miller等用PCR-SSCP和Southerm bolt方法研究52倒骨肉瘤, 发现2例有p16、p15基因缺失。他们还发现骨肉瘤细胞系中p16、P15基因缺失为5/8。

1.2促癌基因

1.2.1 MDM一2基因[2,4]最初是从致瘤的鼠成纤维细胞系中发现的, 随后人类的MDM一2也被鉴定出来并定位于染色体12q上。MDM一2基因所编码的蛋白质能与p53以及RB相结合并抑制它们的功能。约1/4的人类骨肉瘤中有MDM一2基因扩增, 而在有基因扩增的患者中大部分已发生肿瘤转移。Michael等一通过DNA杂交分析确定了MDM一2的基因扩增与骨肉瘤的复发和转移之间存在着显著的相关性。MDM一2通过和p53结合才能发挥功能, MDM一2包含491个氨基酸, 只有N末端100个氨基酸序列和p53相结合, 人为造成的MDM一2的突变比野生型的MDM一2所导致的p53水平高20倍, 说明这种突变的MDM一2能保护p53蛋白使其不被降解。如果对p53进行突变修饰p53~I (缺少氨基酸1 3~19) , 它就不和MDM一2相结合但仍然具有野生型p53的功能, 能够诱导细胞凋亡和阻止细胞在Gl期的增殖。

1.2.2 SAS基因SAS基因 (sarcoma amplifled sequence) [7,9]最初从恶性纤维组织细胞瘤中分离出来, 其编码的蛋白质是跨膜超家族 (TM4SF) 的一员, 可能在细胞信号传递和生长控制方面起作用。Tarkkanen用互补基因组杂交法研究1l倒骨肉瘤, 发现8倒有SAS区域的扩增。最近Noble等用Southern blot方法研究28例骨肉瘤, 发现l0例有SAS基因扩增, 其中7例表面性骨肉瘤均有扩增, 而15例髓性骨肉瘤只有2例扩增, 提示表面性骨肉瘤和髓性骨肉瘤可能存在基因的改变不同。

1.2.3 c-myc基因也是较早发现的癌基因之一, 它的过表达与骨肉瘤细胞的生长、转移关系密切。肖强等[3]通过实验显示了c-myc蛋白的表达在骨肉瘤中表达成正相关, 提示c-myc的激活可能与骨肉瘤的发生、发展有关。

2与骨肉瘤生物学特性相关基因

2.1 CDK4基因CDK4基因位于染色体12q13, 其编码的CDK4蛋白是cylins-cdk-ck网络系统的重要一员, 是通过调控细胞周期参与细胞增殖、细胞分化和凋亡。CDK4所处的区域在人肉瘤中经常被扩增。王文己等应用S-P免疫组织化学方法检测68例骨肉瘤组织中P16和CDK4的表达情况后发现, 低分化骨肉瘤组织中P16的阳性率和阳性强度明显低于高分化骨肉瘤组织, 而低分化骨肉瘤组织中CDK4的阳性率和阳性强度明显高于高分化骨肉瘤组织, 说明CDK4和PI6存在某种负相关, 且都与骨肉瘤的病理分期有关。

2.2 HER2基因HER2基因位于l7q2l。HER2蛋白的高表达与骨肉瘤的恶性生物学行为密切相关, 并且是预后不好的表现。Scotlandi等[5,8]运用免疫组化染色研究了84例骨肉瘤, 发现32%的骨肉瘤中有HER2基因扩增。

2.2.3 PTEN基因PTEN基因位于染色体10q2, 张宏军等[11]人的研究表明, 骨肉瘤I级组阳性表达率为85.7% (6/7) , 其中阴性 (一) 1例, 弱阳性 (+) 3例, 中度阳性 (++) 3例。Ⅱ、Ⅲ级组阳性表达率为65.2% (15/23) , 其中阴性 (一) 8例, 弱阳性 (+) 4例, 中度阳性 (+十) 9例, 强阳性 (+++) 2例。Ⅱ、Ⅲ级组与I级组染色阳性率和染色强度相比, 虽有下降趋势, 但差异无统计学意义 (P>0.05) 。骨肉瘤骨母细胞型VIEN染色阴性4例, 阳性10例;软骨母细胞型) 染色阴性l例, 阳性4例;纤维母细胞型染色阴性3例, 阳性5例;混合型染色阴性1例, 阳性2例。各型间染色结果比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。说明PTEN表达与病理分级及分型的关系相关性不大。

3与骨肉瘤治疗相关基因

3.1 TK基因即胸腺嘧啶核苷激酶基因, 目前用于基因治疗的为病毒TK基因, 包括单纯疱疹病毒I型胸苷激酶基因 (HSVI-TK) 和水痘带状疱疹病毒胸苷激酶基因 (VZV-TK) , 前者应用最多。肿瘤细胞转染该基因后, 对本来无毒的前体药物丙氧鸟苷 (GCV) 或无环鸟苷 (ACV) 变得敏感而能被其杀灭。转导该基因的肿瘤细胞, 类似于自杀, 所以称为自杀基因 (suicide gene) , 其机制为TK酶可以将GCV或ACV磷酸化为一磷酸核苷, 后者在细胞内二磷酸脱氧核苷激酶作用下转变为二磷酸核苷。继续磷酸化为三磷酸核苷, 三磷酸核苷为细胞毒性药物, 能抑制DNA聚合酶活性, 或作为DNA链延伸的终止来阻止DNA合成, 导致细胞死亡-4。在对骨肉瘤动物模型的实验研究中发现, TK基因可选择性地杀伤转染TK基因的骨肉瘤细胞, 而对正常的骨组织毒副作用小。但TK基因治疗骨肉瘤目前仍仅限于实验研究阶段。

3.2细胞周期素 (cyclin) cyclin为重要的细胞周期蛋白的调控基因, 其表达产物能激活CDK的活性, 使其底物Rh蛋白磷酸化, 造成细胞周期调节失控、肿瘤形成。目前发现的cyclin有cyclin A~H。cyclin A~B主要出现于G2/M期, cyclin C、D、E主要出现于G1/S期, cyclinD在Gl期中晚期发挥重要作用, cyclin E在G1/S交界处达到高峰。目前有关cyclin D1对化疗疗效的预测作用是研究的热点。人类恶性肿瘤中, CyclinDl常常出现过度表达。通过CDK4的作用导致肿瘤的发生发展, 常作为预测疗效的指标, Cyclin D1过表达的患者化疗疗效差。Benassi等用免疫组化技术和蛋白质印迹法证实Cyclin D1是预测骨肉瘤预后的有价值指标。而Maitra等[11]用免疫组化技术研究表明在38名儿童骨肉瘤患者中, 未发现Cyclin D1过表达。Molendini等通过对92个骨肉瘤标本免疫组化染色, 未发现Cyclin D1过表达, 反而发现Cyclin D1低表达者, 发生转移的几率高, 预后差。Ewen等发现将野生型Rb与Cyclin D1共同导入Rb基因缺失的骨肉瘤细胞株SAOS一2中, 没有发现Rb的过磷酸化, 而将Rb与Cyclin D2导入SAOS-2中, 可发现Rb过磷酸化, 使Rb对细胞生长的抑制效应失活, 提示骨肉瘤中Cyclin D的作用是不相同的J。Molendini等研究发现cyclin A和Cyclin E在骨肉瘤细胞中高表达, 并发现Cyelin A阳性表达率越高化疗后的复发率也越高, 表明Cyelin A的表达与骨肉瘤的化疗疗效呈负相关。

3.3细胞周期素依赖激酶 (cyclin dependent kinases, CDK) CDK是细胞周期调控的中心环节, 分为CDK1 (CDC2) 、CDK2~CDK7、CDK分别受到细胞周期素 (cyclin) 的正调控和细胞周期素依赖抑制蛋白 (CKI) 的负调控。在稳定的条件下, 细胞增殖周期是由不同的CDK在GI/S和G2/M 2个限制点 (restrictionpoint) 进行自控性调节。CDK可被正调节信号即cyclin活化, 活化后可以使底物Rb蛋白磷酸化, 使其抑制细胞增殖作用丧失。当GI/S和GI/S的关键限制点失控, 就有可能使本应停止增殖或生理性凋亡的细胞不停地进入细胞周期, 从而导致恶性增生。Ragazzini等[11]的研究结果显示CDK4蛋白在20例低分化的骨肉瘤中强表达, 表达率为65%。Benassi等研究了39例骨肉瘤中p Rb/pI6/CDK4的表达情况, 发现CDK4过表达的患者除预后差以外, 也影响化疗疗效:CDK4过表达的病人其化疗疗效比低表达的病人差。

3.4高迁移率族蛋白A2 (High mobility group A2, HMGA2) HMGA2是HMGA家族成员之一, 可选择性结合到DNA特异构像中, 调节复制、转录及DNA修复。曲珊珊等[12]通过靶向HMGA2的shRNA真核表达载体稳定转染人骨肉瘤U2OS细胞, 观察其对U2OS细胞恶性表型的影响研究结果表明, HMGA2的异常高表达在维持U2OS细胞恶性表型的多方面发挥作用, 提示靶向HMGA2的基因疗法在临床骨肉瘤的治疗中具有很好的应用前景。

综上可见骨肉瘤的基因改变是复杂的, 与之相关的基因很多。它们之间既相互独立又相互作用, 相互影响。我们对引发这些基因改变的根本原因及基因间的相互还不够了解, 未来的研究将着重于这一方面。期待基因研究能给骨肉瘤的治疗带来根本上的改变。

骨相关基因表达 篇2

应用双向电泳及质谱技术对5周龄三基因(apoE-/-/LDLR-/-/Leprdb/db)联合突变小鼠和野生型小鼠肝组织的差异蛋白质进行比较研究,借此分析脂代谢相关三基因联合突变小鼠肝脏蛋白质表达特点,研究差异表达蛋白与血脂代谢紊乱和动脉粥样硬化的关系.在实验中检测到三基因联合突变小鼠和野生型小鼠肝脏中分别平均有(841±57)个和(1 017±50)个蛋白点(n=3),两者的.平均匹配率分别为71.9%,83.2%.三基因联合突变小鼠有140个蛋白点未能与野生型小鼠匹配,其中相差5倍以上的上调点和下调点分别为7个和39个.选取其中的6个点做质谱分析,鉴定为endoplasmin precursor(Grp-94)、酸性富亮氨酸核磷蛋白32家族成员A(acidic leucin-rich nuclear phosphoprotein 32 family member A)、转铁蛋白前体、果糖二磷酸酶1、纤维连接蛋白前体、补体C3前体,纤维蛋白原B β多肽7种蛋白.该结果提示,差异表达的蛋白对三基因联合突变小鼠的血脂代谢紊乱和动脉粥样硬化发生发展过程起一定作用.

作 者：傅强 顾黛君 沈龙祥 杜文喜 王娜 宋兴辉 金晓蕾 潘杰 FU Qiang GU Dai-Jun SHEN Long-Xiang DU Wen-Xi WANG Na SONG Xing-Hui JIN Xiao-Lei PAN Jie 作者单位：傅强,顾黛君,王娜,宋兴辉,金晓蕾,FU Qiang,GU Dai-Jun,WANG Na,SONG Xing-Hui,JIN Xiao-Lei(浙江大学生命科学学院,生物实验中心,杭州,310058)

沈龙祥,杜文喜,SHEN Long-Xiang,DU Wen-Xi(浙江中医学院,杭州,310053)

潘杰,PAN Jie(山东师范大学生命科学学院,济南,250014)

骨相关基因表达 篇3

【关键词】 视网膜；再灌注损伤；基因，WTp53；基因，bax；基因，bcl-2；大鼠，Wistar

【中图分类号】R774.1 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2015）03-0248-02

视网膜缺血再灌注损伤是眼科常见的病理过程，严重影响病人视功能。其发生机制十分复杂，已成为近年眼科的研究热点之一。目前研究发现，视网膜缺血再灌注损伤中存在着神经细胞凋亡现象，且凋亡是视网膜神经细胞丢失的重要因素之一[1]。本實验通过建立大鼠视网膜缺血再灌注损伤模型，研究凋亡相关基因野生型p53（WTp53）、bax和bcl-2的表达变化，探讨视网膜缺血再灌注损伤的发生机制。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1动物及分组 健康无眼疾的Wistar大鼠（青岛市实验动物与动物实验中心提供）28只，体质量250～300 g，雌雄不拘，室温环境饲养。随机分为两组：正常组（4只）、缺血再灌注组（24只），其中缺 血再灌注组又分为再灌注后1、6、12、24、48和72 h等6个组，每组4只大鼠。

1.1.2主要试剂 兔抗大鼠WTp53、bax、bcl-2多抗（美国Santa Cruz生物技术公司生产），链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（SABC）免疫组化试剂盒（武汉Boster生物工程公司）。

1.2 实验方法

1.2.1动物模型的建立 采用前房穿刺加压法建立大鼠缺血再灌注损伤模型，方法见文献[2]。

1.2.2标本的取材、固定与切片 分别于再灌注后1、6、12、24、48、72 h处死动物，摘除眼球，制作石蜡切片，方法见文献[2]。

1.2.3免疫组织化学染色 将标本的石蜡切片脱蜡至水，用蒸馏水新鲜配制体积分数0.03过氧化氢室温放置10 min，以灭活内源性过氧化氢酶，复合消化液室温浸浴10 min修复抗原，正常山羊血清室温 10 min封 闭非特异性抗原，加一抗（兔抗大鼠WTp53、bax、bcl-2多抗） 37 ℃孵育2 h， 加二抗（生物素化山羊抗兔IgG）37 ℃水浴20 min，SABC法染色，DAB显色，苏木精轻度复染，脱水、透明、封片。

1.2.4结果观察及数据处理 每只眼球取两张切片进行分析，应用双目光学显微镜（400倍）分别观察WTp53、Bax、Bcl-2蛋白表达（阳性染色呈棕黄色）。应用图像分析系统对免疫组化切片进行图像分析（每张切片取4个视野，以视神经为基准分别向两侧各取2个视野），对视网膜组织中WTp53和Bax蛋白表达进行相对定量。

2 结果

2.1WTp53蛋白的表达变化 正常大鼠视网膜中几乎无WTp53蛋白表达。WTp53蛋白于再灌注6 h开始在视网膜神经节细胞层少量表达，位于细胞核内，以后表达量逐渐增加，24 h达到高峰，此时除在神经节细胞层有强表达外，内核层也有散在的表达；48 h仍持续强表达； 72 h明 显下降，但仍较正常组为高。再灌注6、12、24、48、72 h的WTp53蛋白阳性表达结果与正常组比较，差异有显著性。见表1。

2.2 Bax蛋白的表达变化 正常大鼠视网膜中几乎无Bax蛋白表达。Bax蛋白于再灌注6 h开始在视网膜神经节细胞层有表达，位于细胞浆中，以后表达量逐渐增加，24 h达到高峰，此时除在神经节细胞层有强表达外，内核层也有散在表达；48 h已有所下降，但仍表达较强；72 h明显下降。再灌注6、12、24、48、72 h的Bax蛋白阳性表达结果与正常组比较，差异有显著性。见表1。

2.3Bcl-2蛋白的表达变化 正常组视网膜Bcl-2蛋白低表达于神经节细胞层、神经纤维层及内核层。缺血再灌注后各时间段表达差异无显著性。再灌注6、12、24、48、78 h的Bcl-2蛋白阳性表达结果与正常组比较，差异无显著性（ P gt；0.05）。见表1。

表1 视网膜缺血再灌注后不同时段WTp53、Bax、Bcl-2蛋白的表达变化（略）

骨肉瘤发病相关基因的筛选 篇4

1 材料与方法

1.1 组织标本

收集2011年6月～2012年4月中南大学附属第二医院与南华大学附属第二医院手术切除骨肉瘤与正常骨组织标本各3例。骨肉瘤组织标本中男2例,女1例;年龄12～19岁,平均15.33岁,其中股骨1例,胫骨1例、肱骨1例。收集原发骨肉瘤手术切除标本切除后立即置于液氮罐中冻存备用。

1.2 试剂与引物

反转录试剂ReverTra Ace qPCR RT Kit购自TOYOBO公司,PCR试剂购自天根生化科技有限公司,Bax Antibody(Human Specific)#2774及GAPDH Antibody(Human Specific)#5174购自cellsignal公司;HMMR Antibody EPR4055及SHB Antibody EPR7976购自Origen公司。利用软件Primer 5.0设计上、下游引物,由上海英骏生物技术有限公司合成(引物序列见表1)。

1.3 组织总RNA抽提

将原发骨肉瘤和正常骨组织标本分别在液氮中碾磨碎后,按体积比1∶10加入预冷的Trizol,采用Qiagen RNeasy minikit进行总RNA的抽提和纯化,总RNA的抽提和纯化严格按照试剂盒提供的说明进行。采用1%的琼脂糖凝胶电泳,Quantity one凝胶成像分析软件检测28S/18S rRNA条带灰度值比值,以及紫外可见分光光度法测定OD260/OD280,评估总RNA的纯度和质量。

1.4 芯片杂交和信号检测

骨肉瘤和正常骨组织间基因的差异表达情况:以>2或<0.5者表示基因表达存在差异。检测所用基因芯片为Affymetrix HG-U133芯片包含的约14 500个已知基因(约22 000个转录本),可定性及定量分析人类基因组中的绝大多数基因的表达。基因芯片结果采用Affymetrix扫描仪3000进行扫描。芯片结果用Microarray Suite 5.0软件进行软件读取及数据分析。

1.5 生物信息学分析

差异表达基因的分析借助于Affymetrix芯片分析中心(www.affymetrix.com/analysis)、GenBank数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank)、Swissprot数据库等完成,骨肉瘤组织与正常骨组织间差异表达>2倍的基因(>2或<0.5)被筛选出来,选取其中3个差异表达基因(上调与下调)采用RT-PCR与Western-blot进行检测。

1.6 RT-PCR检测基因的表达

按照TOYOBO反转录试剂盒操作步骤,以Oligo(dT)为引物合成c DNA,然后按照以下条件进行相关基因表达的PCR扩增检测,反应条件为95℃1 min、94℃25 s、55℃25 s、72℃30 s,30个循环,72℃延伸5 min,然后将PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.7 Western blot检测蛋白质的表达

将收集的组织于液氮中碾磨碎后,加入蛋白裂解液、超声破碎,12 000 r/min 4℃离心15 min,收集上清,并采用BCA法检测蛋白定量,-20℃保存备用。

以每孔20μg采用不连续变性聚丙烯酰胺凝胶,以80/120 V电泳80 min;100 V 50 min将蛋白质转移到PVDF膜上;用5%脱脂奶粉封闭120min;用TBST洗膜15 min 2次;4℃孵育一抗过夜;用TBST洗膜15 min 3次;室温孵育二抗2 h;用TBST洗膜15 min 3次;发光、显影、定影。

2 结果

2.1 基因芯片检测图

基因芯片上每一个点代表一个基因。图中Cy3用绿色表示,Cy5用红色表示,黄色表示两者的表达强度相同,黑色表示没有表达,红色表示Cy5标记组该位点基因表达强度高于Cy3标记组,绿色表示Cy5标记组该位点基因表达强度低于Cy3标记组。

2.2 筛选获得的差异表达基因

3个骨肉瘤组织A-B-C和正常骨组织Z分别的差异表达情况如下;A中上调基因968个,下调基因888个;B中上调基因878个,下调基因896个;C中上调基因1 150个,下调基因803个。三者与正常骨组织相比较均上调的基因42个;均下调的基因63个,其中上调基因包括能量和物质代谢、癌基因、信号转导、细胞复制和转录相关基因等;下调基因则涉及抑癌基因、调亡基因、细胞周期、免疫反应、信号转导等。

42个均上调的基因为:LOC390354、ZNF365、FZD2、BAX、FSD1、TMEM166、NOLA2、TNFSF7、PP FIA3、ARSJ、HSBP1、FSD1、BCAS4、STARD3NL、GALE、PIP4K2C、PRR7、SHB、LOC653103、DPY30、ETNK2、THOC3、BLVRA、PYCR1、RRP9、JPH3、ARFGAP1、HMMR、HSPC152、LOC124512、GATC、RNPEP、SMUG1、PHLDA1、C16orf84、RCN2、NME7、C11orf69、FUT8、SQLE、DPM1、DBN1;63个均下调基因为:HBA1、HBB、C1QC、SPINT2、C1QA、LOC642113、CD36、SLC25A20、LOC647450、LOC652493、ICAM2、TYROBP、CD74、CD36、SSH2、CFLAR、AIF1、FCER1G、COL4A3BP、YIPF6、C1QB、HLA-DRA、SH2D3C、GIMAP4、ELMO1、LOC649143、STOM、LOC648868、RNASE6、LOC648394、MRVI1、WFDC1、CA4、HCP5、APOE、TXNDC13、HLA-DRB4、AQP1、PPM1B、MS4A7、IFI27、CAT、C1QTNF4、PRUNE、LOC642678、MS4A6A、ELF2、ACCN5、LOC652694、CUGBP2、GIMAP5、APBB1IP、ZNF763、GPBAR1、ZNF438、MMRN1、MS4A6A、LRRFIP1、NAALADL1、HLA-DRB3、SLCO2B1、C5orf4。其中BAX及HMMR分别下调6.4倍及4.4倍;SHB上调4.34倍。见图2～4。

2.3 RT-PCR验证基因的表达

分别对正常组及骨肉瘤组的内参基因及目的基因进行灰度值分析(如图5),并对RT-PCR结果与表达芯片结果进行吻合度分析(如图6),表明RT-PCR与表达芯片结果基本吻合。

2.4 Western blot检测蛋白表达

为了进一步了解相关基因的表达情况,通过Western blot分别检测正常骨组织及骨肉瘤组织中相关蛋白的表达(如图7、8和9),BAX(MW:20kD)、HMMR(MW:83.9 kD)、SHB(MW:55 kD)、GAPDH(MW:37 kD)。进行灰度值分析,结果显示正常骨组织与骨肉瘤组织中相关蛋白表达存在明显差异(P<0.01,如图10)。

3 讨论

骨肉瘤是最常见的恶性骨肿瘤,在全部骨肿瘤中,骨肉瘤约占原发性肿瘤的17%,占恶性骨肿瘤的42%。骨肉瘤的主要临床特点是:(1)患者群体主要为青少年;(2)几乎全为高度恶性,预后差;(3)易早期转移,肺为最常见的转移靶器官。虽然骨肉瘤细胞与成骨细胞性质完全不同,但骨肉瘤细胞与成骨细胞有很多相似之处,例如都能分泌碱性磷酸酶(AKP)、都具有BMP、雌激素等一些共同的受体表达,并与相应配体结合产生生物学效应等等[3,4,5]。事实上,由于成骨细胞培养的困难性,很多涉及到它的研究都是以骨肉瘤细胞这种类成骨细胞系作为研究对象的。骨肉瘤的以上特点都说明其发病与成骨生理密切相关。研究这种关系对于揭示骨肉瘤的发病机制有着重大意义。

大量研究表明,骨肉瘤这种恶性程度极高的骨肿瘤在分子和细胞遗传学上具有一些较普遍的、显著的改变。本研究结果显示,获得了105个骨肉瘤发病相关的差异表达基因,包括DNA修复、信号转导、细胞周期调控、能量、物质代谢、肿瘤恶性转移侵袭、癌基因、抑癌基因以及细胞凋亡等相关的基因。Bcl-2家族在细胞凋亡的基因调控过程中起着至关重要的作用,BAX是Bcl-2家族中促进细胞凋亡的一类基因[6],一般出现在胞浆中,并作为一种细胞损伤和刺激的传感器,响应损伤和刺激[7]。目前已报道BAX在大肠腺癌、胃癌、宫颈癌与口腔鳞癌等相关性。KORSMEYER说“在凋亡加速的神经病变性疾病中,抑制前死亡步骤可能有治疗作用;相反,在一些疾病中,比如癌症,加快BAX和BAK的活化也会有治疗效果[8]。”在骨肉瘤组织中BAX基因有明显的表达下调现象,这说明骨肉瘤的发生发展一方面是源于BAX引起的细胞凋亡受到抑制的作用。

HMMR错配修复基因(humane mismatch repair gene,HMMR),DNA错配修复系统是针对错配碱基的一种修复系统,人类的错配修复基因有hMSH2、hMLH1、hPMS1和hPMS2,已知人类错配修复基因的突变在人类遗传性非息肉型结直肠癌的发病过程起重要作用[9]。HMMR可能一起参与了癌的发生、发展、侵袭及转移的过程。HMMR功能缺陷导致肿瘤发生的机制主要可能包括增加癌基因或抑癌基因的突变率以及使一些重要功能基因发生遗传不稳定等。HMMR基因在骨肉瘤组织中的表达下调,可能增强了癌的发生、发展、侵袭或转移的可能性[10]。

SHB(Src homology 2 domain containing adaptor protein B,SHB)基因是Src基因的一员,Src家族中的各种蛋白都具有酪氨酸激酶的活性,它们是非受体-酪氨酸激酶类癌基因中的一类[11,12]。SHB蛋白包含SH2和SH3的结构域。SH2和SH3位点发生改变:如基因突变、磷酸化和去磷酸化的修饰都影响它的活化。有研究发现SHB基因的启动子区一个SNP在健康人和乳腺癌患者之间差异具有统计学意义,表明该SNP可能与乳腺癌的发生有关[13]。而本实验SHB蛋白表达量的上调,表明在骨肉瘤组织中,可能受启动子SNP的影响提高了表达促进了肿瘤的发生发展。

骨相关基因表达 篇5

1 材料和方法

1.1 材料

Nikon UFX-ⅡA显微镜、摄像镜 (日本) , HPIAS-1000高清晰度彩色病理图像分析系统 (中国武汉) , 计算机放射成像系统 (Regius model-150, 日本KONIC公司) , 液压脑损伤模型由柳州医疗器械厂制作 (参考方加胜教授) [2], 以上设备均由柳州市人民医院提供。主要试剂:试剂CGRP购于武汉博士德公司。EDTA-2NA (乙二胺四乙酸二钠) 骨组织脱钙试剂:瑞兴科技有限公司;磷酸盐缓冲液:福州迈新生物技术有限公司 (批号701020060v) 。检测方法均按试剂盒要求操作, 雄性12周龄wistar大鼠100只, 体重 (500±50) g, Wistar大鼠由广西医科大学试验动物中心提供 (实验动物生产许可证号SCXK2003-003, 清洁级) 。实验过程中于室温20℃自然光照的动物房中分笼饲养, 供给大鼠标准饲料, 自用饮用水, 定期紫外线消毒与排风, 喂养1周适应环境后随机分为骨折组和骨折合并脑外伤组, 两组间无统计学差异。

1.2 方法

1.2.1 动物分组

3～4个月龄雄性Wistar大鼠100只, 体重450～550 g。随机分为两组, 单纯右胫骨折组50只, 编为3、7、14、21、28 d小组, 每小组10只;脑外伤组加右胫骨骨折组50只, 编为3、7、14、21、28 d小组, 每小组10只。

1.2.2 模型制作

术前禁食, 大鼠随机分组并称重, 经氯胺酮 (1 mL/kg) 腹腔内注射麻醉后, 常规去毛、备皮、碘伏消毒。显露右颅顶骨, 中线旁2 mm处开直径5 mm骨窗, 液压打击致中度脑损伤。复苏后, 沿胫骨前外侧钝性分离进入到达胫骨干, 在胫骨骨干中1/3段用摆锯锯断成横形骨折, 以直径1 mm克氏针作逆行髓内固定, 经查骨折固定牢固后, 生理盐水冲洗, 关闭伤口, 碘伏再消毒。骨折组头部只做颅骨开窗, 正常对照组不做任何处理, 术毕分笼饲养。

1.2.3 标本采集和处理

分别将受试大鼠经氯胺酮 (1 mL/kg) 腹腔内注射麻醉后, 于术后第3、7、14、21、28天心脏取血处死, 每组各10只, 取血4～6 mL离心后取血清贮存 (-70℃) 待测;待血清收集齐后一批进行检测碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase, ALP) 的含量。处死大鼠后立即取带骨膜和少许肌肉的右胫骨, 照片后置于装有4%多聚甲醛 (pH7.2) 瓶中, 标明动物编号、日期, 放入4℃冰箱中固定24 h。之后取出, 充分水洗后, PBS液浸泡30 min, 放入10%乙二胺四乙酸钠 (EDTA) pH7.3溶液中脱钙, 每周换2次脱钙液, 经5周脱钙后, 用针头能轻易扎穿骨皮质, 则脱钙充分。接着进行骨痂的免疫组化操作步骤。切片与胫骨纵轴垂直, 连续切片, 间距为6 um。具体步骤参照试剂说明书。

1.2.4 计算机X线摄像仪 (CR) 摄片

14、21、28 d将大鼠完整的右侧胫骨干骨折标本经CR摄片 (距离:90 cm, 电压:40 Kvp, 电流:3.0 mA) , 观察大鼠胫骨骨折骨痂的连续性及骨折愈合情况。所得图像运用photoshop7进行处理, 计算骨痂面积大小、不同骨痂比例。

1.2.5 免疫组织化学染色图像分析

以目标平均吸光度值为指标对所有标本切片的阳性信号进行量化。标本切片置于光镜下, 每个切片选取8个视野, 放大400倍后, 在相同曝光条件下摄片, 同时将图像输入计算机Motic数码医学图像分析系统检测阳性目标平均吸光度。平均吸光度值表示阳性信号的强度。平均吸光度值越大则信号越强, 说明着色越深, 抗原浓度越大。

主要观察指标:骨折合并脑损伤组与骨折组大鼠术后不同时间点CGRP免疫组织化学染色的平均吸光度值;骨折合并脑损伤组与骨折组大鼠术后不同时间点ALP在血清中的浓度;组织形态学观察, 骨痂面积的测量。

1.3 统计处理

运用SPSS13.0软件行统计分析, 对相关指标进行t检验和方差分析。P<0.05表示相比较的组别之间的差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 血清中ALP变化见表1。

2.2 X线片观察

将大鼠离体右侧胫骨干CR摄片, 观察骨痂的连续性发现, 各骨折组大鼠骨折端均未发现不愈合现象。骨折组骨折线清晰, 骨痂量较少;脑外伤组骨性愈合较好, 骨痂量较多, 骨折线模糊。14、21 d骨痂图像分析 (见表2) , 14、21 d脑损伤组骨痂面积比单纯骨折组大 (P<0.01) ;21、28 d骨痂面积比较, 脑损伤组变化明显快于单纯骨折组, 提示骨痂塑性快 (P<0.01) 。

2.3 组织学观察

胫骨骨折合并脑损伤组早期骨膜明显增厚, 骨膜内层形成软骨细胞, 纤维骨痂量较多;14 d纤维骨痂中的软骨细胞团增大, 有的融合在一起, 软骨内骨化少, 骨膜下软骨细胞层增厚;21、28 d仍可见大量纤维骨痂和软骨骨痂, 软骨细胞团周边有少量结构稀疏的编织骨形成, 外骨膜下的软骨层尚未完全转变成编织骨。单纯骨折组骨膜反应轻, 纤维骨痂量少, 膜内成骨和软骨内成骨并存, 以前者为主。

2.4 免疫组织化学观察CGRP表达的时间变化规律

骨折3 d, 纤维母细胞、间充质细胞、单核细胞、内皮细胞均有阳性颗粒表达。骨折1周, 骨痂主要由未完全机化的肉芽组织、软骨骨痂以及小量沿骨折端骨膜下形成的编织骨组成。阳性表达广泛出现于肉芽组织的成纤维细胞样和软骨细胞、间充质细胞中, 也开始在骨折端下编织骨中的成骨细胞中出现。骨折第2周, 软骨骨痂占据骨折区的大部, 并有部分软骨细胞趋向肥大, 阳性表达在成熟的软骨细胞中密集出现。骨折第4周, 软骨细胞成熟、钙化, 软骨骨痂基本被骨性骨痂替代, 骨膜下成骨细胞及软骨痂内成骨细胞阳性表达。脑损伤组3 d和7 d明显增厚的骨膜内层骨祖细胞、幼稚的软骨细胞胞浆内CGRP强阳性表达。CGRP表达的OD值变化:术后3 d, 脑外伤组OD值增加, 与骨折组比较差异有显著性意义 (P<0.05) ;术后7 d脑外伤组OD值最高, 达到高峰, 维持2周, 逐渐开始下降;术后28 d OD值降至骨折组水平 (见表3) 。单纯骨折组3 d弱阳性表达, 7 d才出现阳性表达, 2周达高峰, 随后逐渐开始下降。

3 讨 论

3.1 脑损伤对骨折愈合速度和骨痂中CGRP分布的影响

本实验结果表明, 脑损伤组早期血清中ALP较单纯骨折组高, 说明成骨活性强;脑损伤组14、21 d骨痂量较多, 说明脑损伤后可使骨痂形成增多;28 d后骨痂量减少, 说明塑性快。本实验结果显示, 单纯骨折组骨痂中7 d就有CGRP神经纤维长入, 14 d后在编织骨边缘有CGRP免疫阳性神经纤维出现, 21 d CGRP免疫阳性神经纤维进一步增多, 28 d部分编织骨形成板层骨, 神经纤维稍减少, 这说明神经参与了骨痂的形成和改建过程。组织学观察表明, 脑损伤组骨痂量较多, 但以纤维骨痂和软骨骨痂为主。免疫组织化学染色, 脑损伤组早期骨膜下大量骨祖细胞、未成熟的软骨细胞胞浆内CGRP强阳性表达, 骨痂中可见少许CGRP免疫阳性神经纤维, 但28 d以后骨痂中CGRP阳性表达细胞明显减少, 纤维骨痂中无肽能神经纤维;单纯骨折组骨膜反应轻, 骨膜有肽能神经支配, 骨膜内层骨祖细胞直接形成编织骨骨痂。据此推测, 由于脑损伤后早期骨痂内CGRP强阳性表达, 刺激纤维骨痂和软骨骨痂大量形成, 加速骨折愈合。单纯骨折组, 骨痂中CGRP明显减少, 纤维骨痂和软骨骨痂形成慢, 导致纤维骨痂和软骨骨痂向骨性骨痂转化速度也减慢。

3.2 脑损伤后CGRP影响骨折愈合机制可能如下

CGRP是广泛分布于中枢和周围神经, 具有多种功能及生物活性的分子多肽, 它主要在脊髓背根神经节合成, 向上移行至脊髓后角, 向下移行至感觉神经末梢。CGRP在神经系统和骨折组织之间起着重要的桥接作用, 参与对修复细胞增殖、迁移、分化的调控[3]。

3.2.1 CGRP直接调节骨细胞

CGRP能与成骨细胞上CGRP受体结合, 刺激成骨细胞促进成骨。CGRP还可通过与破骨细胞上的降钙素受体结合, 抑制骨吸收的作用。另外, 它还能通过刺激干细胞有丝分裂和骨间质细胞分化, 刺激骨形成。廉凯等[4]发现CGRP可增加成骨细胞中编码胰岛素样生长因子21 (IGF21) 的mRNA的表达及IGF21的合成来调节骨形成和骨吸收的平衡。

3.2.2 CGRP对局部血流量的调节

骨折的愈合需要丰富的血流。CGRP主要分布于血管周围, 参于血管功能的调节, 有明显的扩血管作用。CGRP是目前已知的最强的血管扩张剂之一, 其强烈的扩血管作用主要是通过直接作用于血管平滑肌而实现的, 部分通过内皮途径起作用。CGRP还具有刺激血管内皮细胞增生的作用, 从而可促进血管长入, 增加局部血流。血液供应是骨折愈合的先决条件, 在骨组织周围有大量的CGRP免疫阳性神经纤维, 而CGRP是较强的内源性扩血管肽, 神经系统可通过这些递质调节细胞功能, 增加骨折局部血供。CGRP在血管内皮细胞上有受体与内皮细胞结合可使内皮细胞增生, 有刺激血管生长作用。研究发现, 在体循环中, 神经肽的含量非常低, 与其起到生理作用所需的浓度相差甚远, 所以神经肽主要是由神经纤维在局部分泌而起作用的, 体循环中的神经肽对骨几乎没什么影响[5]。

总之, 研究发现骨折能诱导神经生长入骨折部位, 骨折后7 d, 骨痂内即可检测到蛋白基因产物 (PGP 915) CGRP免疫阳性的感觉纤维。图象分析显示7 d后神经纤维增加, 骨折后21 d CGRP免疫阳性的骨膜神经纤维较正常对照组增加, 提示这些增生的感觉纤维能产生可以影响骨折愈合的神经肽。本实验发现, 脑损伤组在骨折愈合不同阶段, 各种参入愈合的细胞都有CGRP阳性表达。骨折后3 d, 骨痂内阳性CGRP表达, 7 d即有强阳性表达。CGRP主要分布在骨膜内、外层及内骨膜, 2周时达高峰, 维持2周才开始下降。而单纯骨折组, 4 d仅有弱阳性表达, 7 d阳性表达, 4周后逐渐减弱。脑损伤组, CGRP的表达提前, 强度高, 维持时间长, 有利于刺激骨折愈合过程中各种细胞迁移增殖、分化, 刺激骨痂和软骨痂大量形成。本动物实验结果发现, 颅脑损伤组呈典型的成骨加速表现, 即间质细胞渗入, 分化为成骨细胞。大鼠胫骨骨痂量增多, 早期骨痂中神经肽强阳性表达, 刺激纤维骨痂和软骨骨痂大量形成, 骨折愈合明显加速, 与人们日常观察到的脑外伤合并骨折患者, 骨折愈合现象相符, 这些说明脑外伤后骨折部位的CGRP的变化可能是骨折加速愈合的原因之一。但骨的形成和代谢受到机体大环境以及小环境的多层面、多途径调节, 神经系统参与上述过程, 发挥间接性调节作用。近来, 通过一些临床观察和实验, 神经因素对骨代谢和生长的直接性调节虽已经得到证实, 但具体机制以及作用的重要性尚无定论。但随着神经生物学、分子生物学的深入研究, 以及新的实验手段不断涌现, 人们对神经调控骨的发生、形成的机制将会有更明确的认识, 进而提高临床骨折治疗的质量和速度。

摘要：目的研究脑损伤后大鼠胫骨骨痂中降钙素基因相关肽 (CGRP) 的变化及骨痂量的改变。方法将100只雄性Wistar大鼠随机分为两组, 脑损伤加右胫骨骨折组和单纯右胫骨骨折组各50只。术后3、7、14、21、28 d分批处死, 检查血清碱性磷酸酶, 摄右胫骨X线片测量骨痂面积, 骨痂行苏木精2伊红 (HE) 染色和降钙素基因相关肽免疫组织化学染色。结果脑损伤加骨折组较单纯骨折组术后3、7 d, 碱性磷酸酶均显著升高 (P<0.01) ;脑损伤加骨折组较单纯骨折组术后14、21 d, 骨痂X线面积大;脑损伤组早期形成大量纤维骨痂和软骨骨痂, 骨痂中降钙素基因相关肽免疫阳性神经纤维多, 明显增厚的骨膜内层骨祖细胞、幼稚的软骨细胞胞浆内降钙素基因相关肽强阳性表达;骨折愈合快, 降钙素基因相关肽表达明显增强。结论脑损伤后骨痂中降钙素基因相关肽有显著改变, 并引起骨痂量和质的改变, 推测降钙素基因相关肽参与调节骨折愈合过程。

关键词：脑损伤,胫骨骨折,降钙素基因相关肽,大鼠

参考文献

[1]Jones KB, Mollano AV, Morcuende JA, et al.Boneand brain:a review of neural, hormonal, andmusculoskeletal connections[J].Iowa Orthop J, 2004, 24:123-132.

[2]方加胜, 袁贤瑞, 刘运生, 等.实验性液压脑颅损伤模型的建立与研究[J].中国现代医学杂志, 1995, 5 (2) :46-47.

[3]Ransjom, Lie A, Mukohyama H, et al.Microisolatedmouse osteoclasts express VIP-I and PACAP receptors[J].Biochem Biophys Res Commun, 2000, 274 (2) :400-404.

[4]廉凯, 杜靖远.降钙素基因相关肽对鼠成骨细胞IGF-1及IGF-1RmRNA表达的影响[J].中国矫形外科杂志, 2001, 8 (11) :1084-1087.