基因表达与调控论文

基因表达与调控论文（精选6篇）

基因表达与调控论文 篇1

致病性大肠杆菌为医学和兽医学临床感染中最常见的病原菌之一。近年来,随着抗生素的长期、大量应用,大肠杆菌多重耐药株日益增多,耐药水平不断增高[1],给预防和治疗该病带来了诸多困难[2]。研究表明,引起大肠杆菌多重耐药的主要原因是菌体细胞外排泵或外排载体的过量表达[3]。在大肠杆菌中存在AcrAB、AcrEF、EmrAB、Ecr等几十种主动外排系统[4],其中AcrAB外排泵是最主要的,该系统的表达量增加可引起大肠杆菌多重耐药。

由药物质子转运子AcrB、间质融合蛋白AcrA和外膜通道蛋白TolC组成的AcrAB外排泵的表达受多种调控因子及操纵系统的调节,如SdiA、Rob 及Mar操纵系统等[5,6,7]。主要外排调节系统Mar操纵系统包括MarA、MarB、MarC、MarO、MarR调节蛋白,其中MarR可正向调控MarA,增强AcrAB和TolC表达,从而增强菌体对药物的抗性[8]。本试验拟通过对大肠杆菌多重耐药调控基因marR的克隆及其原核表达,获得MarR目的蛋白,为制备其多克隆抗体奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

大肠杆菌药敏质控株ATCC25922,购自中国兽药监察所;感受态细胞E.coli JM109、E.coli BL21(DE3)、E.coli DH5α及pET-28a(+),由吉林农业大学药理实验室保存;pMD18-T 载体、 Ex Taq聚合酶(5 U/μL)、限制性内切酶BamH Ⅰ、Xho Ⅰ和T4 DNA连接酶等,均购自宝生物工程(大连)有限公司;大肠杆菌阳性血清,购自天津生物芯片有限公司;低分子质量蛋白质标准,购自北京鼎国生物技术有限责任公司;DNA凝胶回收纯化试剂盒,购自杭州维特洁公司。

1.2 大肠杆菌基因组DNA的提取

按参考文献[9]中的方法提取大肠杆菌药敏质控株ATCC25922的基因组DNA。

1.3 大肠杆菌marR基因的获取

根据GenBank中大肠杆菌的marR基因序列(NC000913),采用Primer Premier 5.0 软件设计引物,上游引物P1为CGGGATCCACCATGAAAAGTACCAGC(下划线部分为BamH Ⅰ酶切位点),下游引物P2为GCCTCGAGTTACGGCAGGACTTTCTT(下划线部分为Xho Ⅰ酶切位点)。以大肠杆菌基因组DNA为模板,以P1、P2为引物进行PCR扩增。PCR条件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,43 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,共30个循环;72 ℃ 10 min。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,并以DNA凝胶回收纯化试剂盒回收并纯化目的基因,按照说明书进行操作。

1.4 大肠杆菌marR基因的克隆与鉴定

将回收的marR片段与pMD18-T载体于16 ℃连接6 h,转化至E.coli JM109[8]中,在含有氨苄西林(100 μg/mL)的LB琼脂平板上筛选阳性克隆,提取质粒进行BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切、PCR及测序鉴定。

1.5 大肠杆菌marR基因的原核表达

对重组质粒pMD18-T-marR、表达载体pET-28a(+)分别用BamH Ⅰ、Xho Ⅰ进行双酶切、纯化,再用T4 DNA连接酶于16 ℃连接12 h,4 ℃过夜;连接产物转化至感受态细胞E.coli DH5α中,在含卡那霉素(500 μg/mL)的LB琼脂平板上筛选阳性质粒并测序;将获得的原核表达重组质粒pET-28a-marR转化到E.coli BL21(DE3)受体菌中;挑取其阳性克隆接种于5 mL含卡那霉素的液体LB培养基中,以1 mmol/L IPTG诱导表达,每隔1 h取菌液1次,直至诱导后第7小时。以同样的方法诱导含pET-28a(+)质粒的E.coli BL21(DE3)并作为对照。收集表达产物12 000 r/min离心3 min,PBS悬浮后加等体积的上样缓冲液,水浴煮沸10 min进行SDS-PAGE电泳。

1.6 Western-blot检测

表达蛋白经12%SDS-PAGE电泳后,按参考文献[10]中的方法用BIO-RAD系统电转移至膜上,经牛血清白蛋白封闭后依次以大肠杆菌阳性血清为一抗、以辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体为二抗,最后在联苯胺(DAB)溶液中显色并观察结果。

2 结果

2.1 marR基因的克隆结果

以大肠杆菌基因组DNA为模板,利用大肠杆菌marR基因的上、下游引物进行PCR扩增后对其产物进行1.0%的琼脂糖凝胶电泳,在435 bp处出现明显的特异性条带(见图1)。将回收的扩增片段与pMD18-T载体连接,筛选得到的阳性克隆通过酶切与PCR鉴定得到长约435 bp的目的片段(见图2)。

M.DL-2 000 Marker;1.marR基因扩增产物。

M1.DL-2 000 Marker;1.重组质粒pMD18-T-marR PCR 鉴定结果;2.重组质粒pMD18-T-marR电泳结果;3.重组 质粒pMD18-T-marR酶切鉴定结果;M2.λ-Hind Ⅲ Marker。

2.2 克隆质粒序列的测定结果

阳性克隆的测序结果与GenBank报道的marR基因序列(NC000913)相比,核苷酸序列同源性为97.9%,所编码的氨基酸序列同源性为97.3%。

2.3 重组表达载体的构建与鉴定结果

重组质粒经BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切及PCR鉴定,得到长约435 bp的条带,表明该片段已正确插入到pET-28a(+)表达载体中(见图3)。阳性表达质粒的测序结果与克隆质粒的测序结果相比,核苷酸及氨基酸序列同源性均为100%。

M1.DL-2 000 Marker;1.pET-28a-marR PCR鉴定结果; 2.pET-28a-marR电泳结果;3.pET-28a-marR的BamH Ⅰ与 Xho Ⅰ酶切鉴定结果;M2.λ-Hind Ⅲ Marker。

2.4 SDS-PAGE分析结果

经SDS-PAGE电泳,在约16.1 ku处可见1条明显的蛋白特征带(见图4),这与理论估计的分子质量相符,进一步证明表达产物为MarR融合蛋白。

1.pET-28a(+)阴性对照;M.低分子质量蛋白质标准;2.未用 IPTG诱导时的表达结果;3～9.IPTG诱导后1～7 h表达结果。

2.5 Western-blot检测结果(见图5)

1.重组表达质粒在E.coli BL21中表达产物;M.低分子质量 蛋白质标准。

由图5可见,在16.1 ku处有1条明显的蛋白印迹带,由此说明MarR蛋白具有良好的反应原性。

3 讨论

已有研究表明,Mar操纵系统转录阻遏蛋白MarR可结合MarO,在抑制其自身表达的同时,尚可抑制MarRAB操纵子的表达,激活MarRAB操纵子转录,使MarA的表达量增多,进而激活Mar操纵子,控制MarA在细胞内的表达水平,上调AcrAB和TolC的表达量,导致大肠杆菌对抗生素的耐药性增加[11,12]。在我国畜牧业集约化管理水平相对较低、多重耐药较为严重的情况下,大肠杆菌中的MarR调控子如何调控AcrAB外排泵的表达水平,进而引起大肠杆菌多重耐药还有待于进一步研究。

试验以大肠杆菌药敏质控株ATCC25922的基因组DNA为模板,通过PCR克隆了多重耐药调控基因marR,其克隆质粒的测序结果与GenBank报道的该基因核苷酸序列的同源性为97.9%,所编码的氨基酸序列同源性为97.3%。重组表达质粒pET-28a-marR的测序结果与克隆质粒的测序结果相比,核苷酸序列同源性及所编码的氨基酸序列同源性均为100%。将该阳性原核表达质粒转化到E.coli BL21(DE3)中,获得阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌收集表达产物,通过SDS-PAGE分析证实marR基因得到表达。Western-blot检测结果表明,MarR蛋白具有良好的反应原性。试验获得的MarR蛋白为制备其多克隆抗体,检测临床分离多重耐药大肠杆菌中该基因的表达水平,阐明临床分离大肠杆菌中AcrAB外排泵表达水平的调控机制奠定了基础。

参考文献

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[6]ZGURSKAYA Hi,NIKAIDO H.Multidrug resistance mechanisms:drug efflux across two membranes[J].Mol Microbiol,2000,37:219-225.

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胃癌细胞增殖与相关基因的表达 篇2

关键词：胃癌 细胞增殖 癌基因 抑癌基因

【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1008-1879（2012）11-0010-01

1 与胃癌相关的癌基因

癌基因是控制细胞生长和分裂的正常基因的一种突变形式，能引起正常细胞癌变。癌基因编码的蛋白主要包括生长因子、生长因子受体、信号转导通路中的分子、基因转录调节因子核细胞周期调控蛋白等几大类型。细胞信号转导是细胞增殖分化的基本调解方式，而信号转导通路中蛋白因子的突变是细胞癌变的主要原因。已知与胃癌相关的癌基因有：c-myc、ras、hst、c-erbB-2、K-sam、N-myc、met等。这些基因的突变在肿瘤的启动、促癌以及进展阶段具有重要意义，可引起正常胃粘膜上皮细胞转化并具有无限增殖的特性，最终导致胃癌的形成。

1.1 c-myc基因。原癌基因c-myc是c-myc基因家族的三大成员之一，c-myc基因位于第8号染色体（8q24），是一个具有多重功能的癌基因，具有转录因子活性，可诱导细胞凋亡抑制细胞分化，调节细胞周期并参与细胞凋亡，具有刺激细胞增殖和诱导细胞凋亡的双重作用。促进增殖和凋亡的c-myc蛋白功能在同一区，并且c-myc表达只提供一个启动细胞增殖和凋亡的信号。当某些抑癌基因存在或生长因子（如IGF-1、L-2等）缺乏时，c-myc蛋白可促进细胞增殖，使细胞“永生化”，从而加速细胞增殖，引发肿瘤。研究指出c-myc蛋白随着胃癌组织恶性转化，其阳性率逐渐升高，在胃癌中阳性率最高，表明c-myc蛋白过渡表达与胃癌组织恶性转化有密切关系，c-myc基因异常表达对胃癌凋亡起一个重要调控作用。

1.2 Ras基因家族。在人类基因中，Ras基因家族包括3个功能基因，即H-Ras、N-Ras、Ki-Ras基因，编码分子量为21kDa的蛋白质，称P21蛋白，P21蛋白在细胞质内合成，经翻译修饰后与类脂结合，然后从合成部分转移到质膜，定位在细胞膜的内表面。当Ras基因发生点突变而活化时，P21蛋白可为细胞生长传递持续性促有丝分裂信号，导致细胞不断增殖，从而诱发肿瘤的发生。Ras基因参与对细胞增殖的调控，P21蛋白在肠化、不典型增生的胃粘膜上皮中均有阳性表达，提示Ras基因的激活与细胞增长、增殖有关，特别是H-Ras基因与胃癌关系较为密切，其所编码的蛋白质RasP21具有调节细胞生长和生化的功能，它的异常表达对细胞恶变和胃癌的恶性表型起着重要的作用。

2 与胃癌相关的抑癌基因

细胞中存在的抑癌基因是正常细胞增值过程中的负调控因子，他编码的蛋白往往在细胞周期的检验点上起阻遏周期进程的作用，如果抑癌基因突变丧失细胞增殖的负调控作用，则导致细胞周期失控而过度增值。已知与胃癌有关的抑癌基因有Rb、P53、DCC、APC、MCC等等。P53基因是迄今发现的与人类肿瘤相关性最高的基因，定位于17号染色体短臂上。

2.1 p53基因。p53基因位于人类17号染色体短臂上，具有转录因子的活性，编码一个分子量为53KD的核磷酸蛋白，在控制细胞周期和细胞凋亡过程中发挥重要作用。p53基因分为两种类型：野生型和突变型。野生型p53基因参与细胞周期调控，阻止细胞从G1期进入S期，对细胞分裂与增殖起负调控作用，是肿瘤抑制基因，突变的p53蛋白不能引起细胞增殖的停滞或凋亡，导致细胞生长失控，肿瘤发生。野生型p53，其所表达的p53蛋白属于DNA结合蛋白家族，是细胞周期G1期检查点的关键成分，对DNA的复制起监视作用，当p53基因突变时，其球形构象发生改变，失去与细胞结合的特异位点，细胞即失去自身监视作用，因此突变型p53可抑制细胞凋亡的发生，为恶性细胞的形成提供良机。P73基因是近年发现的p53基因家族新成员，其产物与p53蛋白具有非常相似的结构和功能，被认为是一个候选的抑癌基因，但p73基因在胃癌发生中的真正作用尚需进一步研究来证实。

2.2 PTEN基因。PENT基因是近几年新发现的肿瘤抑制基因，定位于染色体10q23.3，是一种肿瘤抑制基因。它一方面通过脂质磷酸酶活性抑制细胞生长和调节凋亡进程；另一方面通过其蛋白酪氨酸磷脂酶等，影响细胞的粘附、聚集，以及肿瘤细胞的侵袭和转移。PTEN基因表达缺失可促进胃癌血管生成，并在胃癌的进展和转移中起关键作用；其下调表达在胃癌的发生、进展、生长、分化和血管生长中起重要作用。

2.3 p21基因。P21基因定位于染色體6p21.2。它抑制多种细胞周期蛋白——周期蛋白依赖性激酶（Cyclin-CDK）的活性，从而使细胞生长停滞。研究表明p21表达缺失通过促进细胞增殖在胃癌的发生器重要的作用，与胃癌的分化、肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移、TNM分期、预后有关，有助于胃癌预后的判断。

3 讨论

胃癌的发生是一个复杂的分子生物学机制，涉及多种癌基因、抑癌基因等，胃癌的发生、发展中存在多癌基因的协同表达，肿瘤相关基因的改变和肿瘤恶性程度之间可能存在着某种相关性，其基因的改变有随肿瘤的恶性程度增加而增加的趋势。随着现代分子生物学技术的不断发展，越来越多的胃癌相关基因被发现，这些基因为阐明胃癌发生发展的分子机制奠定了基础，并为胃癌的发生风险评估、诊断、预后判断、基因治疗开辟了新的道路。因此，更多的与胃癌有关的基因尚需进一步发现与探讨，它们将为进一步阐明胃癌的发病机制及治愈胃癌提供新的希望。

参考文献

[1] 陈劲松，梁庆模.胃癌相关基因研究进展.现代医药卫生[J].2006（22）

基因表达与调控论文 篇3

氨基酸通过TOR信号调控蛋白质合成和细胞生长, 是最重要的功能性营养素, 尤其亮氨酸 (Leu) 在蛋白翻译起始和刺激蛋白质的合成中起着独特的作用, 可激活新生动物骨骼肌TOR, 但其对蛋白质合成的激活作用还依赖于其它氨基酸的有效性。肠上皮细胞 (Intestinal Epithelial Cell, IEC) 在营养素吸收、转运以及营养与生长信号整合方面发挥着重要作用, 而关于Leu对IEC中TOR信号活性的影响缺乏报道。本文旨在研究不同浓度亮氨酸对体外培养的肉鸡IEC中TOR信号m RNA表达的影响, 为探讨氨基酸调控蛋白质合成的作用机制及建立精确的营养供给技术提供理论基础和开创性思路。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

DMEM培养基、TRIZOL试剂购自Gibco (美国) ;胰蛋白酶、EDTA、亮氨酸购自Sigma (美国) ;同胎牛血清 (FBS) 购自Atlanta Biologicals (美国) ;RT-PCR试剂盒购自Fermentas, 其余试剂均为分析纯。CO2培养箱购自上海一恒公司 (BPN-150CRH中国) , PCR仪Techne (TC-412英国) 。

1.2 细胞分离与培养

选用发育正常的18日龄AA肉鸡胚胎20枚, 对照组和实验各组分别包括5枚鸡胚, 无菌摘取肠道组织, 分别分离并鉴定IEC。IEC细胞在37℃、10%CO2、90%O2、90%相对湿度的CO2培养箱中培养, 培养基为DMEM, 给予10%小牛血清, 100U/ml青霉素, 100U/ml链霉素。对照组不含Leu (0m M) 、实验I、II、III和IV组分别含Leu 50m M、100m M、150m M和200m M。原代IEC细胞与对照组和各实验组在37℃条件下共孵育2h (n=5) 后, 收集细胞。

1.3 RT-PCR扩增

对收集的细胞进行总RNA抽提, 并紫外分析检测所抽提RNA的纯度。根据Genbank登录的鸡TOR基因和鸡β-actin基因为模板, 采用Primer premier软件设计引物 (表1) 。采用两步法RT-PCR: (1) 逆转录反应获得细胞c DNA; (2) PCR反应, 采用内对照β-actin和目的基因TOR特异性引物, 以c DNA为模板, 进行PCR扩增。PCR产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳, EB染色, 照相。以β-actin为内参, 对各组基因扩增产物的电泳条带进行光密度扫描。

1.4 统计分析

定量数据为TOR基因与β-actin基因表达量的比值, 以均数±标准差表示。多组间均数比较采用单因素方差分析, 两两组间多重比较采用邓肯氏检验。采用SPSS 11.0软件进行统计分析。以P﹤0.05为差异具有显著性。

2 结果

用2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物, 电泳图条带清晰, 实验II组 (Leu, 100m M) 和III组亮度高, 实验I组 (Leu, 50m M) 和IV组 (Leu, 200m M) 条带亮度较低, 对照组条带几乎看不到, 表明实验II组和III组鸡胚IEC中TOR基因m RNA表达丰度较高, 而实验I组和IV组表达量较低。

根据鸡TOR基因m RNA扩增产物电泳带的光密度和内标基因β-actin光密度的比值, 得到TOR基因m RNA表达的相对量, 见图2。实验组Leu表达量相对比值均显著高于对照组 (P﹤0.05) 。4个实验组中, II组和III组显著高于I组和IV组 (P﹤0.05) , 但II和III组之间差异不显著 (P≥0.05) 。说明Leu能显著提高鸡IEC中TOR基因表达, 以100m M和150m M效果最好。

3 讨论

动物对生长信号和营养感应是通过一系列信号途径来整合的, 其中TOR信号是最重要的细胞信号, 该信号是在转录和翻译水平调节细胞生长和蛋白合成的中枢。TOR根据细胞环境的营养条件做出相应的应答, 参与调控蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶的活性, 从而控制与蛋白质合成和基因转录相关基因的表达。外界营养条件如碳源和氮源能刺激细胞的生长。在TOR作用条件下, 当营养物质或其他的生长刺激出现时, 细胞主动上调大分子物质的合成, 促进细胞生长;相反地, 为适应营养限制或其他应激, 细胞能够抑制大分子物质的合成和提高物质周转量。

营养因素对TOR活性具有显著的上调作用, 而抗营养因子对其具有下调作用。Du et al. (2005) 发现对奶牛限饲降低了骨骼肌细胞中TOR信号活性。Liu et al. (2008) 报道植酸显著下调了TOR在肉鸡小肠中的m RNA表达, 表明植酸降低了细胞的营养信号、蛋白合成以及细胞生长。Leu在蛋白翻译起始和刺激蛋白质的合成中发挥着重要作用。Wilson等 (2010) 研究表明长期静脉注射Leu激活了新生动物骨骼肌TOR, 但其对蛋白质合成的激活作用还依赖于氨基酸的有效性。

IEC起源于肠上皮干细胞的分化, 肠上皮干细胞位于陷窝基底部, 是一类具有自我更新、高度增殖、不对称性分裂和多向分化潜能的细胞。IEC是肠道内主要的功能细胞, 参与肠道食物的消化、吸收及内外分泌, 构成体内的免疫屏障, 调控体内免疫水平, 并阻止微生物及毒素对肠道的侵袭。因此, 促进IEC的分裂增殖, 在维持肠道粘膜正常结构、功能和代谢等方面具有重要的作用。但是, 关于营养介导的IEC中TOR信号活性的研究尚无报道。本研究中, Leu显著提高了TOR基因在体外培养IEC中的表达, 表明Leu促进了IEC的分裂增殖, 并且培养液中Leu的最佳浓度为100~150m M。但是, 由于体内环境的复杂性, 该浓度范围在体内研究中是否具有类似效果, 值得进一步研究。另外, Leu与肠道的功能物质谷氨酰胺和以小肠为主要代谢场所的精氨酸之间是否具有互作效应也值得进一步研究。

4 结论

组蛋白修饰与基因调控研究进展 篇4

组蛋白修饰与基因调控研究进展

组蛋白是染色体基本结构-核小体中的重要组成部分,其N-末端氨基酸残基可发生乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等多种共价修饰.组蛋白修饰对基因表达的调控有类似DNA遗传密码的.调控作用.组蛋白修饰的相关研究,对认识相关基因的功能、进一步了解基因的调控机制具有重要意义.

作 者：阚盛 翟晓巧 KAN Sheng ZHAI Xiao-qiao  作者单位：阚盛,KAN Sheng(河南农业大学,郑州,450002)

翟晓巧,ZHAI Xiao-qiao(河南农业大学,郑州,450002;河南省林业科学研究院,郑州,450008)

刊 名：河南林业科技 英文刊名：JOURNAL OF HENAN FORESTRY SCIENCE AND TECHNOLOGY 年，卷(期)： 29(1) 分类号：Q342+.3 关键词：组蛋白修饰   基因调控  

基因表达与调控论文 篇5

1实验材料

1.1 药材

甘草 (Glycyrrhiza uralensis Fisch.) 药材经南京中医药大学王春根教授鉴定, 称取甘草干燥药材20g, 粉碎后加10倍水浸泡30分钟, 煎煮40分钟, 滤出初滤液, 再加10倍水继续煎40分钟, 合并两次滤液, 制成浸膏。准确称取甘草浸膏0.0023g, 用1ml生理盐水定容浓度为2mg/ml。

1.2 细胞株

人正常肝细胞L-02:南京中医药大学药理毒理实验室提供。

1.3 主要试剂和仪器

Real-time PCR芯片:美国Super Array公司;Super Array PCR master mix (Cat.No.PA-112) ;REAL-TIME PCR Array First Strand Kit-CO3;RNeasy®MinEluteTM纯化试剂盒:Qiagen;Trizol试剂:Invitrogen life technologies;其它试剂购自上海化学试剂有限公司。ABI PRISM®7700 system;Nano Drop®ND-1000:美国应用生物系统公司。

2实验方法

2.1 实验分组

在25cm2培养瓶中常规培养L-02细胞, 细胞生长至对数生长期时分两组处理。甘草组:去除培养液, 加入4.5ml RPMI 1640, 再将0.5ml 2mg/ml甘草水提液加入细胞培养液中, 使甘草水提液终浓度达到200μg/ml;空白组不做给药处理。继续培养48小时后收获细胞。

2.2 基因芯片检测

2.2.1 RNA抽提、纯化与质量检测

采用Trizol试剂一步法提取总RNA;然后使用RNeasy®MinEluteTM纯化试剂盒纯化RNA;应用紫外吸收测定法检测RNA纯度, 使用变性琼脂糖凝胶电泳检测其纯度及完整性。

2.2.2 合成cDNA模板

按照Real-time PCR Array First Strand Kit-CO3使用说明配制混合物, 42℃水浴5分钟后, 冰上放置至少1分钟。短暂离心后, 在离心管中依次加入BC3、P2、RE3以及H2O, RNase free, 移液枪轻轻吸打几次混匀, 42℃温育15分钟。95℃温育5分钟使酶失活。每20μlcDNA加9lμl灭菌水混匀, 置冰浴待用或-20℃保存。

2.2.3 实时定量PCR

将SuperArray PCR master mix 1275μl、已稀释的cDNA 102μl以及ddH2O 1173μl混匀制成混合液。取25μl混合液到PCR Array对应的每个孔中置于冰上, 设置实时定量PCR程序为10分钟95℃, 15秒95℃, 1分钟60℃, 将PCR Array置于实时定量PCR仪进行PCR反应。于40cycles后收获荧光。

2.3 数据处理

利用ABI PRISM®7700 system配套软件计算各张PCR芯片中每个基因的Ct值。最后采用ΔΔCt方法比较相应基因的表达量的变化。

3结果

3.1 总RNA抽提结果

抽提的RNA用分光光度计检测A260/A280的比值范围均在1.8～2.1;凝胶电脉结果显示28S和18S核糖体RNA的条带清晰, 比例约为2∶1, 说明RNA纯度已达到要求, 见表1。比较甘草组与空白组的基因谱, 绘制甘草组/空白组基因表达差异倍数散点图, 见图1, X轴为空白组数据值, Y轴为甘草组数据值, 黑色细线表示基因差异倍数在1左右, 黑色粗线表示倍数在2。

3.2 基因芯片检测结果

在84条被检测基因中, 甘草组与空白组比较, 共有10条基因发生差异表达。其中, 有5条基因表达上调, 占全部差异表达基因的50%;而表达下调的基因也有5条, 占全部差异表达基因的50%。见表2～3。

3.3 表达差异基因的生物学功能分类

本实验结果表明, 甘草水提物对于人正常肝细胞L-02基因表达的调控作用全部发生在I相代谢中的氧化反应。其中, 上调作用主要体现对于非肝微粒体混合功能氧化酶系催化的氧化反应, 其上调基因数占总上调基因60%;而对肝微粒体混合功能氧化酶系催化的氧化反应主要呈下调状态, 占总下调基因的60%。分类见表4。

在上调的基因中, 醇脱氢酶和CYP450酶相关基因占优势, 各占40%;下调基因则CYP450酶占优势, 比例达到60%。基因功能分类及基因差异表达见表5。

4讨论

药物代谢可以显著改变药物的药理活性, 抑制或诱导药物代谢酶是药物相互作用的主要机制。药物的代谢一般可分为两阶段, 即通常所说的“I相代谢反应”, 又称生物转化和“II相代谢反应”, 或称结合反应。药物的I相代谢是II相代谢的前奏, 大多数毒物、药物等进入肝细胞后, 常先进行氧化反应, 有些可被水解, 少数物质被还原。经过氧化、还原和水解作用, 一般能增加非极性化合物的水溶性以便于排泄, 同时也可能改变了药物或毒物分子原有的某些功能基团, 或产生新的功能基团使毒物解毒或活化, 使某些药物的药理活化发生变化, 使某些致癌物质活化或灭活。

氧化作用是I相代谢的主要反应, 在肝细胞的微粒体、线粒体及胞液中含有参与生物转化的不同的氧化酶系, 包括加单氧酶系 (混合功能氧化酶) 、胺氧化酶系和脱氧酶系。而氧化反应主要分为两类, 即肝微粒体混合功能氧化酶系催化的氧化反应和非肝微粒体混合功能氧化酶系催化的氧化反应。存在于微粒体中的以细胞色素P450为重要成分的加单氧酶系, 是生物体的主要I相代谢酶, 参与多种内、外源物的代谢转化。在药物代谢相互作用中, 酶抑制引起的药物相互作用占全部相互作用的70%, 酶诱导引起的相互作用约占23%, 其它则占7%[4], 具有十分重要的生理意义。美国Super Array公司药物代谢I相反应酶系PCR基因芯片, 包含药物代谢I相反应酶系相关基因84个, 其中肝微粒体混合功能氧化酶系细胞色素P450主要基因42个, 非肝微粒体混合功能氧化酶系醇脱氢酶、醛脱氢酶、黄嘌呤氧化酶、胺氧化酶等相关基因42个。芯片特异性好, 能定量检测相关基因mRNA表达, 其精度达实时定量PCR水平。本实验筛选出的甘草水提物诱导人正常肝细胞I相代谢反应相关10条差异基因中, 有关CYP450的基因就有5条, 分别为CYP2C8、CYP4A22、CYP4F3、CYP11B1、CYP24A1, 占全部有差异显著性基因的50%。此外, 还有醇脱氢酶、醛脱氢酶、黄嘌呤氧化酶、胺氧化酶等, 他们主要参与内源性物质的代谢。已筛选出的差异基因中ADH4、ADH7均参与醇脱氢反应, ALDH1A1、ALDH8A1则涉及到醛的氧化反应, XDH参与的黄嘌呤氧化反应, 黄嘌呤氧化酶用于代谢含有黄嘌呤基因和嘌呤类似物, 氧化反应是对应的尿酸衍生物。本实验初步从分子水平上, 提示了甘草影响药物I相代谢的作用机制及主要途径。然而, 甘草化学成分众多, 已有研究表明[5]甘草提取物18α-2甘草酸二铵可以显著诱导II相酶活性, 加快毒物和致癌物的排泄;一方面又可以抑制“增毒”的CYP450同功酶活性, 减少毒物和致癌物的代谢活化。因此, 以本研究模式筛选甘草主要化学成分对I相代谢反应基因的调控作用将是我们下一步研究的方向之一。

甘草为临床常用中药, 在预防药物中毒, 调和药性方面应用十分广泛, 但长期临床应用是按中医理论和经验用药, 关于甘草的减毒作用机制目前主要集中在化学成分、药理作用方面, 缺乏药物代谢和药物相互作用等深入的机理研究, 对其作用机制的内涵以及与物质基础的关系认识还相当模糊。药物代谢过程是影响药物发挥作用及产生毒性的过程。中药的配伍变化会直接导致药效成分在体内的代谢发生变化。因此, 对甘草解毒作用及机制尤其从药物代谢方向进行深入研究, 对指导临床合理用药以及中药安全性研究意义深远。

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[4]千叶宽, 小林力.代谢过程.药局 (日) , 1998, 49 (1) :53.

基因表达与调控论文 篇6

1 材料

选用年龄1岁左右、体重40 kg左右、身体健康的杂交母羊(陶塞特♂×蒙古羊♀)15只,采用单因子试验设计分为3个处理组:A组为对照组,饲喂基础日粮;B组为基础日粮+4 g赖氨酸盐酸盐组;C组为基础日粮+10 g赖氨酸盐酸盐组。每组5个重复。

饲粮按照《中国美利奴羊营养需要量及饲料营养价值》[5]中育成母羊(体重40 kg,日增重100 g)营养需要配制。试验日粮的组成及营养水平见表1。

注:预混料为每千克日粮风干物提供Na H2PO43 700 mg,Fe SO4·7H2O 149 mg,Zn SO4·7H2O 110 mg,Cu SO4·5H2O 29 mg,Mn SO4·H2O 77 mg,KI 0.39 mg,Na2Se O30.28 mg,Co Cl2·6H2O 0.40 mg,维生素A 2 000 IU,维生素D3360 IU,维生素E 20 IU。代谢能、中性洗涤纤维和赖氨酸为计算值,其余为实测值。

2 方法

2.1 样品的采集

试验羊于消化代谢笼中单笼饲养。试验期间分别在9:00和17:00各等量饲喂1次,各组每次于少量玉米秸秆粉中分别添加赖氨酸盐酸盐0,2,5 g,等试验羊吃完后再添加剩余饲料。自由饮水。预试期为7 d,正试期为28 d。正试期末屠宰试验羊,取肝脏右肝叶中部组织和背最长肌样品置于灭菌冻存管中,立即放入液氮中保存,备用。

2.2 RNA的提取

采用Invitrogen公司生产的Trizol Reagent试剂盒提取总RNA,溶于用DEPC处理的超纯水中,于-70℃保存,备用。用紫外分光光度计检测其纯度。

2.3 RNA的反转录

按反转录试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司]说明书配制。10μL反转录反应体系(含总RNA1μg):5×Primescript Buffer 2μL、Primescript RT Enzyme MixⅠ0.5μL、Oligo d T Primer(50 mmol/L)0.5μL、Random 6 mers(100 mmol/L)0.5μL,加DEPC水至10μL。反转录条件:37℃15 min,85℃5 s。

2.4 PCR引物的设计与合成

选择GAPDH作为内参基因,根据NCBI登记的绵羊GHR、IGF-Ⅰ和GAPDH基因序列设计引物[由宝生物工程(大连)有限公司合成],序列见表2。

2.5 PCR扩增

按PCR试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司生产]说明书配制。50μL PCR反应体系(含RT产物1μL):Ta Ka Ra Taq(5 U/μL)0.25μL,10×PCR Buffer(Mg2+)5μL,d NTP Mixture(各2.5 mmol/L)4μL,上、下游引物(20μmol/L)各1μL,加灭菌水至50μL。

PCR反应条件:95℃5 min;95℃30 s,58.5℃(GHR)/55.5℃(GAPDH)/57℃(IGF-Ⅰ)30 s,72℃30 s,共35个循环;72℃7 min。

2.6 荧光定量PCR(两步法PCR)

按荧光定量PCR试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司生产]说明书在0.2 m L八联管中配制10μL荧光定量PCR反应体系(含RT产物c DNA 1μL):SYBR Premix EX Taq(2×)5μL,ROX 0.2μL,上、下游引物各1μL,加灭菌双蒸水至10μL。

荧光定量PCR反应条件:95℃10 s;95℃10 s,60℃31 s,共40个循环。所测每个样品做3个重复。

2.7 数据分析

数据用SPSS 11.5统计软件进行单因素方差分析和显著性检验。

3 结果

3.1 总RNA的提取及检测结果

取2μL总RNA,经3%琼脂糖凝胶电泳后检测m RNA的完整性,部分总RNA的电泳结果见图1。用紫外分光光度计测定各样品OD260/OD280值在1.8~2.0之间。

3.2 PCR扩增结果

GAPDH、GHR和IGF-Ⅰ基因RT-PCR产物分别经3%琼脂糖凝胶电泳,发现120~140 bp、80~100 bp、140~160 bp之间各有1条带(见图2),与预期产物(GAPDH、GHR和IGF-Ⅰ基因的产物分别为127,96,143 bp)大小相符。

从图2可以看出,各对引物PCR扩增后的条带清楚,无杂带,并且片段大小符合引物设计要求,进一步说明反转录效果良好,合成的c DNA可以用来进行荧光定量PCR反应。在实时荧光定量PCR中,对整个PCR反应扩增出的相关的荧光信号进行了实时监测和连续分析。

3.3 不同赖氨酸水平对肝脏和背最长肌GHR m R-NA相对表达量的影响

为了使样品之间的表达量更容易进行比较,将对照样品的表达量设为“1”,根据Livak K J等[6]设计的2-△△Ct方法计算基因的相对表达量。

将2-△△Ct相对定量结果用SPSS11.5进行统计学分析(结果见表3)可知:肝脏组织中C组GHR相对表达量极显著高于B组(P<0.01),B组极显著高于A组(P<0.01);背最长肌组织中C组GHR基因的相对表达量与B组之间差异不显著(P>0.05),C组和B组GHR基因的相对表达量都极显著高于A组(P<0.01)。

3.4 不同赖氨酸水平对肝脏和背最长肌IGF-Ⅰm RNA相对表达量的影响

将2-△△Ct相对定量结果用SPSS11.5进行统计学分析(结果见表4)可知:随着赖氨酸添加量的增加,C组肝脏组织中IGF-Ⅰ基因的相对表达量极显著高于B组(P<0.01),B组极显著高于A组(P<0.01);随赖氨酸添加量的增加,背最长肌组织中IGF-Ⅰ基因的相对表达量也逐渐增加,C组极显著高于B组(P<0.01),B组极显著高于A组(P<0.01)。

注:同列数据肩标小写字母不同表示差异极显著(P<0.01);相同表示差异不显著(P>0.05)。

注:同列数据肩标小写字母不同表示差异极显著(P<0.01)。

4 讨论

4.1 总RNA的提取

研究采用传统的Trizol法提取绵羊肝脏和背最长肌组织中的总RNA,提取的总RNA 5 S、18 S和28 S 3条带清晰,无杂带,样品符合后续试验要求。

4.2 PCR扩增

将提取的RNA反转录成c DNA,再用设计好的GHR、IGF-Ⅰ和GAPDH基因的上、下游引物扩增,分别获得了符合试验要求的清晰的目的基因PCR产物,且与设计的产物片段大小相同。说明了反转录产物c DNA样品和所设计的3对引物都符合试验要求,为下一步荧光定量PCR做好了准备。

4.3 不同赖氨酸水平对绵羊肝脏和背最长肌GHR基因表达量的影响

动物生长主要是受到神经内分泌的调控,其中起决定性作用的是生长轴[7]。GH处于生长轴的中心环节,对动物的生长发育、生殖泌乳等有非常重要的作用。GH与靶器官细胞膜上GHR结合从而激发一系列细胞内机制,启动基因表达,促使蛋白质合成和细胞分裂。GH调节组织器官生长发育的途径是多方面的:通过与肝脏组织中GHR结合介导产生IGF-Ⅰ,IGF-Ⅰ以内分泌的形式促进各组织器官的生长发育;GH直接作用于肝外组织,与GHR结合介导产生IGF-Ⅰ,IGF-Ⅰ以旁分泌和自分泌方式促进组织的生长发育。

试验通过Real-time PCR方法研究了不同赖氨酸水平条件下绵羊肝脏和背最长肌组织中GHR基因的表达规律,表明GHR基因在绵羊肝脏组织中的相对表达量随日粮中赖氨酸水平的增加而升高,C组(10 g赖氨酸组)GHR基因相对表达量极显著高于B组(4 g赖氨酸组)(P<0.01),B组(4 g赖氨酸组)GHR基因相对表达量极显著高于对照组(P<0.01)。B组和C组(4 g和10 g赖氨酸组)背最长肌组织中GHR基因相对表达量均极显著高于A组(对照组)(P<0.01),C组(10 g赖氨酸组)与B组(4 g赖氨酸组)间差异不显著(P>0.05)。说明在日粮中添加一定量的赖氨酸,可通过一定调节方式促进GHR在组织中的分泌,由于肝脏和肌肉中GHR m R-NA水平与生长率呈正相关,因而可以进一步促进肝脏、肌肉等组织的生长发育。

4.4 不同赖氨酸水平对绵羊肝脏和背最长肌IGF-Ⅰ基因表达量的影响

IGF-Ⅰ是由70个氨基酸残基组成的具有内分泌、自分泌及旁分泌特性的碱性单链多肽,是一种广谱性的促生长因子,它能够诱导细胞分化,促进DNA合成和细胞分裂,从而导致蛋白质合成增加和生长速度加快。日粮氨基酸的供给影响IGF-Ⅰ基因的表达。Brameld J M等[8]在研究猪肝细胞培养技术时发现,培养基中去除赖氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、苏氨酸均降低IGF-Ⅰ基因的表达,但不存在剂量依赖性。日粮氨基酸的组成和比例亦影响IGF-Ⅰ的表达。丁玉华等探讨了色氨酸对仔猪生长轴功能IGF-Ⅰ基因表达的影响,发现低色氨酸降低循环IGF-Ⅰ和GH浓度及不同组织IGF-Ⅰ的表达。Kanamoto R等[9]对生长鼠分别饲喂24%酪蛋白、24%玉米蛋白、无蛋白日粮或禁食,3 d后测定肝组织中IGF-Ⅰm RNA的含量,发现其含量按下列次序递减:酪蛋白(100%)、玉米蛋白(52%)、无蛋白(27%)、禁食(24%)。

本试验结果表明,IGF-Ⅰ基因在绵羊肝脏和背最长肌组织中的相对表达量随日粮中赖氨酸水平的增加而升高,两种组织中C组(10 g赖氨酸组)相对表达量均极显著高于B组(4 g赖氨酸组)(P<0.01),B组(4 g赖氨酸组)极显著高于A组(对照组)(P<0.01),结果与前人的研究结果(氨基酸缺乏能够负调控IGF-Ⅰ基因表达)一致。分析其原因可能是随赖氨酸添加量的增加,肝脏和背最长肌中GHR基因和IGF-Ⅰ基因表达量增加,从而增加了肝脏和背最长肌GHR、IGF-Ⅰ的合成和分泌,导致更多的GHR、IGF-Ⅰ进入循环系统作用于其他组织,调控了动物的生长发育。然而赖氨酸导致肝脏和背最长肌GHR、IGF-Ⅰm RNA表达量变化的具体原因目前国内外未见相关研究的报道,还有待于进一步进行深入细致的研究。

综合分析本试验结果,日粮赖氨酸对绵羊肝脏和背最长肌中GHR、IGF-Ⅰ的基因表达均有不同程度影响。

5 结论

IGF-Ⅰ和GHR基因在绵羊肝脏和背最长肌组织中的相对表达量随日粮中赖氨酸水平(0~10 g)的增加而升高,说明添加一定量的赖氨酸可以调节绵羊组织的生长发育。

摘要：为了研究赖氨酸对绵羊组织生长的影响,试验选用15只年龄、体重相近的杂交母羊(陶塞特♂×蒙古羊♀)随机分为3组,于基础日粮中分别添加不同水平的赖氨酸(0,4,10 g),采用Real-time PCR方法检测日粮不同赖氨酸水平对绵羊肝脏和背最长肌中GHR和IGF-ⅠmRNA表达的影响。结果表明:日粮赖氨酸水平影响绵羊肝脏和背最长肌中GHR和IGF-Ⅰ基因的表达,随日粮赖氨酸水平的提高肝脏GHR和IGF-ⅠmRNA及背最长肌IGF-ⅠmRNA表达量相应增加;背最长肌中4 g和10 g赖氨酸组GHR基因相对表达量均极显著高于对照组(P<0.01),10 g赖氨酸组的GHR基因相对表达量与4 g赖氨酸组间差异不显著(P>0.05)。说明添加一定量的赖氨酸可以调节绵羊组织的生长发育。

关键词：绵羊,赖氨酸,GHR基因,IGF-Ⅰ基因,表达

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