基因载体论文

2024-06-02

基因载体论文（共12篇）

基因载体论文篇1

转基因方法是转基因动物制备的重要技术环节之一。当前, 转基因动物的制备主要有以下几种方法:显微注射法、精子载体法、逆转录病毒感染法、Es细胞介导法、体细胞核移植法。近十几年发展起来的精子载体法是以精子作为外源基因的载体, 在受精过程中将外源基因导入动物胚胎, 从而使外源基因进入子代的基因组中。这种方法一经问世就以其操作简便、成本低廉等优点而倍受关注。本文就这一领域的主要研究成果及发展作一综述。

1 精子载体介导基因转移的原理

1.1 精子具有吸收外源DNA的能力

Lavitrano和French发现, 成熟精子头部具有吸收外源DNA的能力。其吸收区域是具有特异性的, 该区域位于精子头部的顶体后区 (post-acrosomal region) , 即靠近精核的区域[1]。DNA分子与精子特异结合是一种离子作用, 这一过程不依赖特定的序列。而且除DNA外, 其它一些带负电的分子如肝素 (heparin) 、硫酸右旋糖苷 (dextransulphate) 及等电点低于7的蛋白都可以特异与这一区域结合。经分析发现, 精子头部蛋白抽提物中有一种30～35KD的蛋白质, 这种蛋白只存在于哺乳动物如小鼠、猪、牛、人以及鱼类和海胆纲动物中。通过GelShift分析发现, 纯化的30～35KD蛋白可与DNA形成DNA-蛋白复合体。

1.2 外源DNA的内化与整合

Ⅱ型主要组织相容性复合体分子 (MHCⅡ) 可能在精子-DNA结合中起作用, 其证据MHCⅡ基因敲除小鼠的精子细胞与DNA结合的能力比野生型小鼠精子的结合力低[2]。但是, 利用MHCⅡ单克隆抗体并不能在精子头部检测到MHCⅡ分子。因此, 精子细胞吸收外源DNA的能力是否依赖MHCⅡ分子还有待进一步证明。此外, CD4分子是T淋巴细胞的一种表面标识抗原, 免疫荧光和Western分析证明它也存在于野生型小鼠的精细胞表面。尽管CD4基因敲除小鼠的精子能结合外源DNA, 但外源DNA不能进入精子核内, 即失去进一步内化 (internalization) 的能力, 表明存在于精子表面的CD4分子能促进与精子结合的外源DNA内化[3]。

外源DNA的精子核内化过程是一个精密的过程, 有许多特定因素的参与。其大体过程如下:外源基因在无抑制因子Ⅰ的影响下与精子表面的30～35KD大小的DNA结合蛋白结合, 这一过程受精子发生过程中MHCⅡ表达的间接调控。然后, DNA-DNA结合蛋白复合物激活精子表面CD4抗原与之进一步结合形成复合物, DNA-DNA结合蛋白-CD4抗原复合物随后在某种未明机制下穿过质膜和核孔到达核基质。在这里DNA结合蛋白-CD4抗原复合物从DNA-DNA结合蛋白-CD4抗原复合物中释放, DNA整合到染色体之中, DNA结合蛋白-CD4抗原复合物重新回到精子质膜中进行新一轮的基因结合内化过程。

外源DNA进入精子细胞后, 紧密地与核支架结构 (nuclear scaffold) 结合, 并与精子基因组DNA整合重排[4]。整合过程并不是随机的, 而是有选择的。整合多在核基质区 (nuclear matrix-associated DNA, MAR) , 其次, 整合位点一端为拓扑异构酶II的识别序列[5]。这种酶识别序列与核支架区 (scaffold-associated regions, SARs) 的DNA序列同源, 而且拓扑异构酶Ⅱ优先选择与含SAR序列的DNA结合[6]。这不仅说明这种酶在非同源重组中可能起一定作用, 而且整合位点可能就在SAR区域[7]。

2 精子载体介导基因转移的途径

目前应用精子为载体介导基因转移获得转基因动物主要通过以下途径来实现的:体外精子转染法和体内精子转染法。体外精子转染法又可以分为精子与外源DNA直接共孵育法, 体外电穿孔导入法和脂质体介导转染法;体内精子转染法又可以分为输精管注射转染法、曲细精管注射转染法、睾丸注射转染法等。

2.1 体外转染法

2.1.1 恒温共孵法:

此法是精子载体法制备转基因动物最早使用的方法。大量研究表明动物精子具备自发结合和内化转运外源DNA的能力, 将精液与DNA直接混合37℃恒温共孵20～40 min, 采用这种直接孵育的方法使外源DNA结合并内化到精子中, 精子结合内化外源基因后仍保持很好的活力。此法最早于1971年由Brackett[8]发现, Bracket研究首次证实精子具有吸附结合外源DNA能力, 并将外源DNA在受精时携带进入卵母细胞。18年后, 意大利科学家Lavitrano[9]应用此法得到阳性转基因小鼠。之后Lavitrano又与美国波士顿大学合作使用该法, 在所进行的75批实验中, 转基因阳性率为7.4% (130/1755) [10]。该实验不仅从正面肯定了精子介导基因转移的可行性, 也从侧面证实了众多阴性结果存在的合理性。

2.1.2 体外电穿孔法和脂质体法:

由于精子质膜的特殊性, 适合一般细胞的转染方法, 为了提高转染效率有学者用体外电穿孔法和脂质体法直接将外源基因转移到精子内部。电穿孔法是利用核酸带电的特点, 通过外加一个瞬时高压, 使DNA瞬时加速后进入精子内部。电击对精子细胞的影响有两方面:一方面可短暂打开细胞膜上的某种通道, 有利于外源基因的进入, 但另一方面电击对精子细胞又是一种损伤, 当电击超过一定强度时, 就有可能对精子造成损伤甚至死亡, 进而影响精子的受精能力和胚胎的发育能力[11]。

脂质体法是将外源DNA用脂质体包裹好后, 精子与包裹外源DNA脂质体共孵育, 由于细胞膜是脂质双分子层, 因此细胞膜与脂质体发生融和, 使外源基因发生转移到精子内。阳离子脂质体是广泛应用的转移DNA的有效手段之一, 因其表面带有阳离子, 可与带负电的DNA形成脂质体一DNA复合物。阳离子脂质体一DNA复合物进入细胞的3种模式: (1) 通过与带负电荷的细胞质膜融合后, 释放出包裹的核酸分子; (2) 通过细胞内吞作用进入, 随后与核内体膜发生融合; (3) 通过细胞质膜上形成的小孔进入。与其它方法相比, 脂质体法有转染效率高、毒性小等优势[12,13,14]。

2.2 体内转染法

2.2.1 输精管内注射转染法:

输精管内注射转染法是将含目的DNA的重组质粒纯化后用脂质体包裹, 然后通过手术, 用微量进样器将DNA-脂质体复合物注入雄鼠输精管内, 再用阳性转染雄鼠与雌鼠交配。在转染过程中, 外源DNA能从注射部位扩散到输精管全长, 完成对成熟精子的转染。

该方法的主要优点是操作简便, 且对动物的交配不造成明显的影响, 但此法受精子存活时间的限制, 转染后必须短时间内交配, 否则携带外源DNA的精子会被来自附睾的精子所稀释从而降低转染效率。由于每次输精管注射只能产生一批转染精子, 而且被转染的是已失去增殖能力的成熟精子, 因此, 该法难以得到可长期产生阳性转染精子的雄性动物。此外, 研究人员发现精浆中被称为抑制因子Ⅰ的成分对转染有抑制作用, 因此输精管内注射法被认为是转染效率有限的方法。

2.2.2曲细精管内注射转染法:

对生殖细胞的修饰和改造是建立转基因动物最理想的一种方式, 而精原细胞便是其中最具潜力的一种途径。精原细胞 (spermatogonia) 是精子形成的前体细胞, 在睾丸微环境中可以像ES细胞一样具有增殖、分化潜能。在雄性动物出生后, 精原细胞一直处于不断分裂增殖状态, 不断地增殖和分化成精子细胞。通过合适的手段将外源基因导人精原细胞中, 就有可能将外源基因带入子代基因组中。例如, 在体视显微镜下, 将含有外源基因的转染液注入到曲细精管中, 或者注入后再结合电穿孔的方法, 通过转染精原细胞使成熟精子中携带有外源基因, 再利用转染的精子通过自然交配制备转基因动物。相对于ES细胞和显微注射方法更简便易行, 且不需要专用设备。目前已有通过该法建立转基因小鼠的多个报道[17]。

2.2.3 睾丸内注射转染法:

睾丸内注射转染法是在曲细精管注射转染法的基础上改进的一种更简捷、更有效的新途径, 其通过对睾丸组织的生殖干细胞和未成熟精子进行外源DNA转染后, 将动物进行自然受精, 产生出转基因动物。研究表明, 通过对睾丸进行多次打点注射, 能将外源基因转入曲细精管内, 并经渗透作用整合到精原细胞和精母细胞的染色体中, 从而获得大量的转染精子, 在附睾中积累后, 进一步提高了转染的成熟精子数量。与体外孵育相比, 在转染过程中, 外源DNA的导入既不会受到精浆中抑制因子I (IF一I) 的影响, 同时转染后的精子细胞在附睾中经生理状态调整后活力没有减弱, 又避免了体外孵育时, 因精子存活时间限制和外源DNA附着于精子头部等因素所导致精子活力下降和受精能力下降, 从而大大提高了获得转基因动物的机率。而且, 注射雄体的这种保持能力也很强, 注射后7个月, 仍可通过Southern的方法从睾丸、附睾及输精管中的精子里检测出外源基因。

3 精子载体转基因技术的应用

精子载体法介导基因转移技术因其操作简便、经济、易于推广等优点, 在医学、药物学、畜牧业等领域中显示出了诱人的开发价值。最近几年, 有许多研究人员借助该项技术建立了各种具有特定目的和用途的转基因动物。目前该技术在生物反应器制药、异种器官移植、建立转基因疾病动物模型、改善牛奶质量等方面显示出广阔的应用前景。

4 结束语

由于精子载体法在转基因动物的制备中具有简便易行、耗费低、转染率高和适应性广等特点, 吸引着众多研究者不断地进行探索改进。经过近20年的研究, 人们已不再争议这种转基因方法的可靠性。迄今为止, 精子载体法已在12种动物中获得了转基因后代[18], 其中包括小鼠、家兔、牛、猪和鸡等。但是不同试验之间转基因效率还存在很大的差异, 而且未能获得足够的数据对此作出解释。如能对此法作进一步的研究, 很有可能使转基因动物的商业化生产成为可能。

基因载体论文篇2

FUS1基因慢病毒载体的构建

目的:构建FUS1基因慢病毒载体,包装病毒,体外高效感染细胞.方法:采用PCR技术从人脐带来源的间充质干细胞中扩增出FUS1基因,并将其接入慢病毒载体pSL6-IRES-EGFP中,经PCR、酶切和测序鉴定后,与包装质粒共转染293T细胞,制备慢病毒.将病毒转染BEL7404和DLD-1细胞,观察病毒转染效果.结果:经过PCR测序鉴定,克隆了pSL6-FUS1-IRES-EGFP重组子;所包装的`病毒对细胞的感染效率＞90%.结论:成功地克隆FUS1基因于慢病毒载体,制备了高效感染细胞的慢病毒.

作者：张宝霍霞彭琳齐宗利徐锡金李燕郑良楷丘波 ZHANG Bao HUO Xia PENG Lin QI Zong-li XU Xi-jin LI Yan ZHENG Liang-kai QIU Bo 作者单位：张宝,ZHANG Bao(汕头大学医学院中心实验室,广东,汕头,515041;南方医科大学生物化学教研室,广东,广州,510515)

霍霞,彭琳,齐宗利,徐锡金,李燕,郑良楷,丘波,HUO Xia,PENG Lin,QI Zong-li,XU Xi-jin,LI Yan,ZHENG Liang-kai,QIU Bo(汕头大学医学院中心实验室,广东,汕头,515041)

刊名：中华肿瘤防治杂志 ISTIC英文刊名：CHINESE JOURNAL OF CANCER PREVENTION AND TREATMENT 年，卷(期)：2008 15(4) 分类号：Q75 关键词：基因,肿瘤抑制基因,FUS1 慢病毒属转染

基因载体论文篇3

关键词：玉米；PEPC；基因克隆；序列分析；表达载体构建

中图分类号：Q786；S513.01文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）11-0026-04

根据CO2固定初始产物的不同，可将高等植物分成C3、C4、CAM这3类。以三碳化合物3-磷酸甘油酸为最初光合产物的光合途径为C3途径（或卡尔文循环），以四碳化合物草酰乙酸为最初光合产物的光合途径为C4途径。C4途径具有CO2浓缩机制，能高效利用大气中的CO2，使植物保持较高的光合效率[1-3]，因此人们大量开展了将C3植物转化为C4植物的研究，但是许多这类转化没有达到预期目的[4]。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）存在于所有能进行光合作用的有机体中，包括植物、绿藻和光合细菌等。根据其序列特征和功能结构，PEPC基因可划分为C4、C3-1、C3-23个亚族，其中C4型主要在叶肉细胞的胞质中表达，并且受光照调控，C3-1型主要在黄色叶片、茎等部位表达，C3-2型主要在根部表达；C4型的PEPC基因由C3型PEPC基因进化而来[5-7]。研究表明，将杂交玉米品种（GoldenCrossBantam）的C4型PEPC全长基因（包括自身的启动子）转入C3植物，PEPC酶活性提高了2～110倍，苹果酸浓度也提高了，光合速率在强光条件下明显提高。研究还发现，转玉米PEPC基因cDNA和水稻Cab启动子的嵌合基因的水稻仅能使光合作用效率提高数倍，而将完整的玉米PEPC基因（包括外显子、内含子及自身的启动子）转入水稻中则能数十倍或更高地提高其光合效率[8-17]。这说明以嵌合基因形式转化C3植物，即cDNA和组成型启动子CaMV35S或光诱导型Cab启动子，或采用C4全长基因和自身启动子进行转化，对基因更好地表达和作用的发挥是十分必要的。

另外，C4关键酶基因由于序列较长，即使成功克隆，也不容易连入表达载体。在传统载体构建方法中，需要将基因的2个末端经过酶切修饰后插入载体，不仅要寻找合适的酶切位点，而且操作复杂，通常还需要构建多个中间载体，并进行多次酶切连接转化，工作量较大而且构建效率较低，尤其不适合构建长片段、多片段拼接的复杂载体。In-Fusion是近年来发展起来的高效率载体构建技术，已应用于多基因融合和长片段克隆等方面[18]，运用该技术进行基因克隆和载体构建时，不需要借助T4DNA连接酶和补平DNA片段末端等操作步骤，只是在PCR引物设计中分别引入载体酶切位点两端的各15bp序列，在In-Fusion重组酶作用下将PCR产物和已经线性化的载体连接起来，从而完成载体构建。In-Fusion技术对目的片段和载体没有特殊的要求，可以将任何目的基因连接到线性化载体上。

玉米的C4型PEPC基因序列较长，同时还需要连入启动子，多片段连接表达载体存在困难。因此，本研究利用PCR技术扩增玉米C4型PEPC全长编码序列及其启动子序列，结合In-Fusion技术一步成功构建表达载体，并对克隆和载体构建中存在的问题进行讨论，以期为该类型基因的高效克隆及表达载体的构建提供参考，进而为C4型PEPC基因功能的研究和C3植物的遗传转化提供可用的基因序列。

1材料与方法

1.1植物材料、菌株和载体

玉米（ZeamaysL.）自交系郑58、pCAMBIA-1391Z植物表达载体（图1）由笔者所在实验室保存，E.coliHST08Premium菌株购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2主要试剂

PrimeSTARGXLDNAPolymerase（CodeNo.R050Q）试剂盒、TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.3.0试剂盒（CodeNo.9762）、In-FusionHDCloningKit试剂盒、高效感受态细菌制备试剂盒E.coliCompetentCellsHST08Premium（CodeNo.9128）、各种限制性内切酶、DNAmarker均购自宝生物工程（大连）有限公司；植物基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒（DP209）、质粒提取试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限公司；所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3引物设计

根据In-Fusion技术原理，利用NCBI上已经发表的玉米C4光合关键酶PEPC基因全长DNA序列（GenBank号：CM000785.3）和表達载体pCAMBIA-1391Z，设计并合成PEPC基因启动子及其全长编码序列的引物，详见表1。

1.4玉米C4型PEPC启动子及其全长编码序列的PCR扩增

采用以上引物和PrimeSTARGXLDNAPolymerase（CodeNo.R050Q）试剂盒，以玉米自交系郑58基因组DNA为模板，对PEPC基因启动子进行PCR扩增，50μLPCR总反应体系为：1μLDNA模板，10μL5×PrimeSTARGXLbuffer（Mg2+plus），4μLdNTPMixture（各2.5mmol/L），各0.5μL上下游引物（20pmol/μL），1μLPrimeSTARGXLDNAPolymerase（1.25U/μL），33μLddH2O。PCR扩增程序为：98℃变性10s，60℃退火15s，68℃延伸1min，共进行30个循环。同样，对PEPC基因全长编码序列进行PCR扩增，50μLPCR总反应体系为：1μLDNA模板，10μL5×PrimeSTARGXLbuffer（含Mg2+），4μLdNTPMixture（各2.5mmol/L），各0.5μL上下游引物（20pmol/μL），1μLPrimeSTARGXLDNAPolymerase（1.25U/μL），33μLddH2O。PCR扩增程序为：98℃变性10s，60℃退火15s，68℃延伸6min，共进行30个循环。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后切下目的条带，用胶回收试剂盒回收用于后续试验。同时取PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

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1.5植物表達载体的构建

分别用HindⅢ、RcoRⅠ双酶切植物表达载体pCAMBIA-1391Z。50μL酶切反应体系为：5μLpCAMBIA-1391Z，5μL10×Mbuffer，1.5μLHindⅢ（10U/μL），1.5μLEcoRⅠ（10U/μL），37μLddH2O，37℃完全酶切16h。用琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收目的片段，利用In-FusionHDCloningKit（ClontechCodeNo.639633）试剂盒将“1.4”节中经过测序验证正确并回收的PEPC基因全长编码序列、PEPC基因启动子片段和线性载体pCAMBIA-1391Z片段连接，连接反应体系为：1μLPEPC基因扩增回收片段（约80ng/μL），1μLPEPC基因启动子扩增回收片段（约80ng/μL），1μLpCAMBIA-1391Z酶切片段，2μL5×In-FusionHDEnzymePremix，5μLddH2O。取1μL连接产物，热转化至E.coliCompetentCellsHST08Premium中，涂布平板，37℃过夜培养，挑取阳性克隆、提质粒、测序验证，所得载体命名为pCAMBIA-1391Z-PEPC。

2结果与分析

2.1玉米基因组DNA的提取

使用植物基因组DNA提取试剂盒提取的玉米基因组DNA，由图2的0.8%琼脂糖凝胶电泳与紫外检测结果看出，D260nm/D280nm在1.8～2.0之间，表明模板质量较高，符合后续试验要求。

2.2玉米C4型PEPC启动子及其全长编码序列的克隆

2.2.1目的片段的获得以玉米自交系郑58叶片DNA为模板，通过PCR分别扩增出2条大小约为1200bp（图3）、6330bp的特异性条带（图4），利用琼脂糖回收试剂盒（DP209）进行胶回收并测序。

2.2.2PCR产物测序结果的比对通过BLAST将测序结果与玉米B73相关序列进行比对，PEPC启动子PCR扩增产物与玉米B73PEPC启动子的比对结果见图5，经分析相似度达到97.70%；PEPC基因全长编码序列PCR扩增产物与玉米B73PEPC基因的比对结果见图6，经分析相似度达到97.90%。

由以上结果可以看出，试验用的玉米自交系郑58C4型PEPC基因及其启动子序列与已注册的玉米B73的序列相似度都在90%以上，可以用作后续载体构建。

2.2.3PEPC基因植物表达载体的构建采用In-Fusion克隆技术，将载体pCAMBIA-1391Z经HindⅢ/RcoRⅠ双酶切，获得的片段检测结果见图7，可见片段大小为11000bp。线性化载体pCAMBIA-1391Z、PEPC基因全长及其启动子在In-FusionHDEnzymePremix作用下重组，成功获得重组质粒pCAMBIA-1391Z-PEPC。将重组质粒热转化至E.coliCompetentCellsHST08Premium中，挑阳性克隆测序，结果表明，PEPC基因全长及其启动子已经成功插入到载体pCAMBIA-1391Z之中，测序结果与预期结果一致（图8），表明成功构建了植物表达载体pCAMBIA-1391Z-PEPC。

3讨论与结论

植物表达载体的构建在植物基因工程研究中占据重要地位，直接关系到目的基因的表达效果，因此选择方便与快捷的载体构建方法具有重要的意义。目前，人们已经发明了多种表达载体构建的方法，例如传统酶切连接方法、一步克隆法、Gateway技术等[19-20]。在构建表达载体过程中，首先需要对表达载体进行选择，常用的植物表达载体有pBI121、pBI221、pCAMBIA系列载体（载体的骨架是pUC18）。根据本试验克隆的PEPC基因全长编码序列及其启动子，笔者选择了没有

启动子序列的植物表达载体pCAMBIA-1391Z。多个目的片段插入植物表达载体常常受到酶切位点的限制，操作复杂，费时费力。与传统的载体构建方法相比，In-Fusion技术可以减少中间载体的构建，减少连接、转化次数，重组效率高；相对于Gateway技术来说，In-Fusion技术更简单，更快速。本研究采用In-Fusion技术进行目的片段克隆时，引物5′端设计与线性载体同源的15bp序列，通过PCR实现多目的片段与表达载体重组连接。试验中分别用HindⅢ/EcoRⅠ进行双酶切，利用In-Fusion酶将线性载体与之前获得的2个PCR片段连接，成功构建pCAMBIA-1391Z-PEPC植物表达载体，测序结果与预期序列一致。

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GAPB基因原核表达载体的构建篇4

1 材料与方法

1.1 材料

哥伦比亚型拟南芥、大肠杆菌DH5α和BL21 (DE3) 由本实验室保存。胶回收试剂盒和质粒小量提取试剂盒购于上海华舜生物技术公司。PET28a (+) 质粒载体由四川大学遗传学重点实验室惠赠。所需引物由上海英俊生物技术有限公司合成。限制性内切酶Bam HI和Xho I、高保真酶Pfu以及T4 DNA连接酶购于MBI Ferments公司。

1.2 方法

1.2.1 拟南芥总RNA的提取

利用TRIZOL试剂盒提取哥伦比亚型拟南芥总RNA, 1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA产物。然后用反转录试剂盒将RNA反转合成c DNA, 作为扩增基因的模板。

1.2.2 引物的设计

利用Primer primer5.0根据GAPB的基因序列设计特异性引物, 引物含有Bam HI和Xho I酶切位点, 序列如下:

上游酶切位点为Bam HI, 下游酶切位点为Xho I, 引物由上海英俊公司合成。

1.2.3 PCR扩增和胶回收GAPB基因

以拟南芥c DNA为模板, 用PCR法扩增GAPB基因, 反应体系如下:10×PCR Buffer (含Mg Cl2) 2.5μL, (2.5 m M) d NTP 2μL, 上游引物 (F) 1μL, 下游引物 (R) 1μL, c DNA 0.5μL, Pfu酶0.2μL, dd H2O 17.8μL。PCR反应条件:94℃预变性3 min后进入以下循环, 94℃35 s, 59℃35 s, 72℃1 min30 s, 共进行30个循环, 最后72℃延伸10 min结束PCR反应, 扩增得到GAPB基因的全长。按胶回收试剂盒的说明回收GAPB基因片段。

1.2.4 PET28a (+) 质粒的提取

将PET28a (+) -DH5α菌株划线于含Kan的LB固体培养基中, 37℃培养过夜, 次日挑单菌落于含Kan的LB液体培养基中, 37℃培养过夜, 按照质粒小量抽提试剂盒说明书提取PET28a (+) 质粒。

1.2.5 目的基因和载体的双酶切

采用50μL酶切体系, 分别用Bam HI和Xho I双酶切PET28a (+) 载体和纯化的GAPB基因片段, 用胶回收试剂盒纯化回收酶切后的载体片段和基因片段, 取少量回收产物作1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.6 连接及重组质粒的转化

用T 4连接酶连接酶切纯化后的GA P B基因和PET28a (+) 载体片段, 连接体系为25μL, 16℃连接过夜。然后制备大肠杆菌DH5α感受态细胞, 将连接体系转化大肠杆菌DH5α。在转化时设置阳性和阴性对照, 阳性对照为未酶切的PET28a (+) 质粒, 用以检测转化效率;阴性对照为空的大肠杆菌感受态, 用以检测感受态细胞是否有污染。将转化产物涂布于含Kan的LB固体培养基中, 37℃过夜培养。

1.2.7 重组质粒阳性克隆的鉴定

在含有重组质粒的LB平板上随机挑取多个单菌落, 以其为模板分别作PCR扩增反应, 1%琼脂糖凝胶电泳检测是否有目的条带。同时将挑取的多个单菌落分别摇菌, 按质粒提取试剂盒的说明提取质粒, 并用Bam HI和Xho I双酶切质粒, 电泳检测酶切产物。

1.2.8 表达质粒的构建与鉴定

将双酶切鉴定正确的阳性克隆菌株送上海华大基因测序, 分析克隆基因的序列组成及其阅读框的正确性。测序正确后, 提取PET28a (+) -GAPB/DH5α阳性克隆的质粒, 将该质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3) 感受态细胞, 并挑取多个单菌落作PCR鉴定, 得到含有PET28a (+) -GAPB质粒的BL21 (DE3) 表达菌。

2 结果与分析

2.1 RNA纯度的测定

对提取的拟南芥总RNA进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测, 发现RNA产物条带清晰, 并且28S条带亮度是18S的2倍左右 (图1) 。紫外分光光度计分析显示, A260/A280=1.92, 表明获得的RNA纯度及浓度较高, 可以用于基因全长的扩增。

2.2 GAPB基因的扩增

利用设计的特异性引物作梯度PCR, 寻找扩增GAPB基因的最佳退火温度, 发现在59℃退火温度下, GAPB基因扩增的条带最好。电泳图 (图2) 显示大约在1344 bp左右有一目标条带, 说明已根据设计的引物克隆出所需要的基因片段。

2.3 PET28a (+) -GAPB重组质粒的PCR鉴定

选用PET28a载体上的T7上游引物与GAPB的下游引物配对, 进行菌落PCR筛选阳性克隆。通过1%的琼脂糖凝胶电泳检测, 大多数都得到与GAPB基因大小一致的片段 (图3) , 说明得到了重组质粒的阳性克隆。

2.4 PET28a (+) -GAPB重组质粒的双酶切鉴定

重组质粒经Bam HI和Xho I双酶切后出现2条带, 其中1条带大小约为1344 bp左右 (图4) , 与GAPB基因大小一致, 说明PET28a (+) -GAPB重组质粒构建正确。

2.5 转化BL21 (DE3) 重组质粒的鉴定

将重组质粒PET28a (+) -GAPB转化到大肠杆菌BL21 (DE3) 中, 经抗性筛选, 挑取单菌落, 作菌落PCR鉴定, 经1%的琼脂糖凝胶电泳检测到目的条带 (图5) , 说明转化成功。

3 讨论

在植物的糖酵解和糖异生途径中, 三磷酸-甘油醛脱氢酶 (GAPDH) 是关键酶, 参与糖酵解过程中第一个ATP的形成。由于GAPDH具有高度的保守性, 人们通过比较不同物种的该基因核酸序列和蛋白序列的异同, 对物种进行分类, 建立物种之间的系统发育关系[5]。在外界胁迫如热胁迫、渗透胁迫、缺氧胁迫或营养缺失条件下, 一些糖酵解相关基因的m RNA大量积累表达[6]。近年来, 有许多研究表明GAPDH基因的表达可能增强了植物抵抗胁迫的能力。Pillai等[7]将水稻幼苗进行干旱、淹没和脱落酸 (ABA) 处理, 结果表明GAPDH基因的转录水平显著提高。在植物中, 经H2O2诱导GAPDH的转录水平也可显著增加。Baek等[8]将GAPDH基因转化到拟南芥原生质体中, 发现该基因能强烈抑制热击时H2O2的产生和细胞的死亡。本研究以拟南芥c DNA为模板, 克隆出GAPB基因的全长, 并构建了原核表达载体PET28a (+) -GAPB, 为后续研究GAPB的功能提供了理论基础。

摘要：以拟南芥cDNA为模板, 用PCR扩增出GAPB的基因全长, 然后将GAPB基因片段连接到PET28a (+) 载体上, 构建重组质粒并转化大肠杆菌DH5α, 经菌落PCR和酶切鉴定筛选出阳性克隆, 测序正确后, 再将阳性克隆的质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3) 。结果表明:成功构建了原核表达载体PET28a (+) -GAPB, 为后续的GAPB融合蛋白的表达以及纯化奠定了基础。

关键词：GAPB,大肠杆菌BL21,PET28a (+) ,融合蛋白

参考文献

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[2]鲁国东, 郑学勤, 谢联辉.稻瘟病菌3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆及序列分析[J].热带作物学报, 1998, 19 (4) :83-89.

[3]朱华, 李珅, 赵瑞强, 等.三七植物GAPDH基因克隆及序列分析[J].西北植物学报, 2006, 26 (7) :1316-1319.

[4]刘志华, 杨谦.球毛壳菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因克隆及特性分析[J].微生物学报, 2005, 45 (6) :885-889.

[5]于丽丽, 高彩球, 王玉成, 等.柽柳甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的克隆和表达分析[J].东北林业大学学报, 20010, 38 (7) :105-108.

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[7]Pillai M A, Lihuang Z, Akiyama T.Molecular cloning, characterization, exp ression and chromosomal location of OsGAPDH, a submergence responsive gene in rice (Oryza sativa L.) [J].Theor Appl Genet, 2002, 105 (1) :34-42.

基因载体论文篇5

通过RT-PCR方法扩增β-酪蛋白基因,扩增产物插入质粒载体pET-28a中构建成表达载体,转化入大肠杆菌BL-21,经IPTG诱导表达.利用限制性内切酶酶切图谱分析、DNA序列测定及SDS-PAGE,结果表明,成功地用RT-PCR方法从小鼠乳腺组织中克隆出β-CN基因并构建了重组β-CN的表达载体,并在大肠杆菌获得表达.

作者：董琼珠李素萍秦宜德方敏 DONG Qiong-zhu LI Su-ping QIN Yi-de FANG Ming 作者单位：安徽医科大学生物化学与分子生物学教研室,合肥,230032 刊名：安徽农业大学学报 ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF ANHUI AGRICULTURAL UNIVERSITY 年，卷(期)：2006 33(2) 分类号：Q78 R-332 关键词：β-酪蛋白 RT-PCR 构建

★ 携带人TGF-β1腺病毒载体的构建及鉴定

★ 大鼠CD40基因RNA干扰真核表达载体的构建及鉴定

基因载体论文篇6

关键词：CD147基因 RNA干扰重组表达载体短发夹RNA

【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1008-1879(2012)03-0011-02

CD147，又被称为促细胞外基质金属蛋白酶因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer,EMMPRIN）或者basigin，其高度表达在肿瘤细胞的表面，刺激肿瘤细胞周围的成纤维细胞分泌基质金属蛋白酶。在多种肿瘤中发现CD147高表达，同时MMP 活性增加,与肿瘤的浸润和转移密切相关。

RNAi技术具有特异性和高效性,已经成为研究基因功能的重要工具。RNAi技术是通过导入细胞19 nt-23 nt的小分子干扰RNA(small interference RNA,siRNA),降解同源mRNA,高效、特异性阻断目的基因表达［1］。

1 材料和方法

1.1 材料。含有人U6启动子的pSilencerTM4.1-CMV neo质粒购买于美国ambion公司，克隆用大肠杆菌DH5α购买于大连宝生物公司,限制性内切酶(Bam HⅠ，HindⅢ)及T4 DNA连接酶购买于美国NEB公司,核酸分子质量标准购于宝生物公司,质粒小量抽提试剂盒为天为时代公司产品,胶回收试剂盒购买于广州美津生物公司,DH5α大肠杆菌感受态细胞冻存于-70℃备用。

1.2 SiRNA的制备。根据GenBank中报道的CD147基因核苷酸序列(NM_198589),输入Ambion公司的在线siRNA设计软件,软件将自动分析和显示候选siRNA。据报道的siRNA设计原则和经验,进一步在候选siRNA中筛选最佳者,并在基因库表达序列标签（EST)数据库中用BLAST对靶序列进行同源性分析,排除siRNA非特异性抑制其它基因片段的可能。设计的siRNA由上海吉凯基因化学技术有限公司合成，引物序列见正义链：5- AGCTTAAGACCTTGGCTCCAAGATACTCT CTTGAAGTATCTTGGAGCCAAGGTCG-3，反义链：5-GATCCGACCTTGGCTCCAAGATACTC AAGAGAGTATCTTGGAGCCAAGGTCTTA -3。

1.3 CD147/SiRNA表达载体的构建及鉴定。将DNA Oligo分别用TE(pH8.0)溶解,浓度为100 μmol/L.取相应的正义链和反义链Oligo溶液,退火体系:50 μL = 5 μL(正义链)+5 μL(反义链)+5 μL退火Buffer+35 μL无菌水,在PCR仪上按照如下程序进行退火处理:95℃ 5 min,85℃5 min,75℃ 5 min,70℃ 5 min,4℃保存。退火处理后得到浓度为10μmol的shRNA模板。将所得模板溶液稀释500倍,终浓度为20 nmol/L,用于连接反应，将退火片段与线性载体按摩尔比3∶1的比例进行连接反应,将连接产物分别接种于100 μL的DH5α感受态细胞中进行

转化,涂布于含氨苄青霉素抗性(终浓度为20 mg/L)的LB平板上,37℃恒温箱培养过夜.从每个培养皿上各挑取3个单克隆菌落接种于3 mL含氨苄青霉素抗性(终浓度为20 mg/L)的LB培养液中,37℃恒温摇床培养过夜.用质粒小量抽提试剂盒小量提取质粒后,载体CD147/SiRNA经BamHⅠ和HindⅢ双酶切，12%聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，样本送检行DNA测序,测序公司为大连宝生物有限公司，DNA marker购于北京天根公司。

2 结果

2.1 重组载体的鉴定。HindⅢ和BamHⅠ双酶切重组载体，12%聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳，可见55bp处均有明显条带，相应部位测序后碱基序列和设计序列一致（图1）。

2.2 重组质粒测序鉴定 2个重组质粒shRNA编码序列与设计的片段完全一致,表明载体构建正确(图2)。

3 讨论

目前在研究哺乳动物细胞的基因功能方面,产生RNAi效应主要应用的方法有两类:一类为体外转录或化学合成siRNA经脂质体或逆转录病毒载体等转染细胞后介导RNAi,另一类为发夹式siRNA表达载体转染细胞后表达的发夹式siRNAs诱导RNAi.化学合成的siRNAs抑制作用时间短,合成成本昂贵,并且易于污染RNA酶而降解,因此限制其应用.而发夹式siRNAs表达载体转染细胞后表达发夹式s iRNAs成本较低,可以在细胞内RNA酶的作用下被切割成与体外合成的siRNA相同的序列与结构,诱导RNAi效应。

基因载体论文篇7

关键词：银杏,CONSTANS基因,表达载体构建,转化

CONSTANS (CO) 基因属于光周期途径基因[1], 光周期是影响植物花发育的重要环境因[2], 在植物营养生长阶段, CO在叶和茎顶端开始表达, 它转录的mRNA呈渐进方式积累, 当达到一定域值时, 通过激活其下游靶基因使植物由营养生长向生殖发育转变, 开始植物花的发育[3]。CO影响植物的成花过程, 对花发育有直接和间接促进作用, 成花的早晚主要由CO基因所控制[4]。CO基因可以将光信号转换为开花信号传递给FLOWERING LOCUST (FT) 基因, 它和FT基因都是光周期途径中的关键基因[5,6,7]。

银杏 (Ginkgo biloba) 又名“公孙树”, 为我国独存的珍稀名贵树种, 广泛应用于园林景观、医药、食品、保健等领域;是一种童期特别长的中生代孑遗裸子植物。一般实生苗种植15-20年后才能开花结果, 这给银杏优良品种的选种带来了严重的障碍。

近年来, 通过植物基因工程技术对开花相关基因的遗传改造, 在缩短木本植物的童期研究中已经取得了一定成效。但有关CO基因在木本植物中遗传改造的研究较少。本研究构建了GbCO正义链和反义链的植物表达载体pCAMBIA 1304-GbCOs和pCAMBIA 1304-GbCOa, 可用于GbCO基因的转基因功能研究, 为利用CO基因进行银杏等木本植物的遗传转化创造条件。

1 材料和方法

1.1 材料

植物表达载体pCAMBIA 1304、大肠杆菌 (Escherichia coli) TOP10、农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens) LBA4404, 为作者实验室保存。

限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ, T4 DNA连接酶均购自New England BioLabs (NEB) 公司。PCR体系包括 (Taq酶) 及PCR耗材购自Promega公司。胶回收试剂盒为AxyGen Biosciences产品;pMD-18T Vector 购自TaKaRa 生物工程 (大连) 有限公司;卡那霉素、氨苄青霉素钠盐等购自上海生工有限公司;引物由上海生工有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 GbCO基因酶切位点的引进

以含有GbCO的载体pMD-18T-GbCO菌液为模板 (前期实验获得) , 用加上保护碱基和酶切位点的引物进行PCR扩增 (正义链引物GbCOS-FP 5′-GGAATTCATGAGTATGCCAAAGCTATGTGAT-3′;GbCOS-RP 5′-CGGGATCCTTAAAAAGATGGAACAATCCCATA-3′。反义链引物GbCOA-FP 5′-GGAATTCTTAAAAAGATGGAACAATCCCATA-3′;GbCOA-RP 5′-CGGGATCCATGAGTATGCCAAAGCTATGTGAT-3′) , PCR反应程序:94℃ 3 min, 94℃ 1 min, 62℃ 30 s, 35 cycles, 72℃ 3 min, 72℃ 10 min, 电泳检测扩增目的条带, 分别切胶回收富集正义链和反义链。

1.2.2 GbCO基因植物表达载体的构建及鉴定

植物表达载体pCAMBIA 1304, 正义链和反义链的双酶切反应按照试剂公司提供的酶切体系进行, 37℃水浴保温16h, 取2μL电泳检测酶切效果。

酶切后的正义链和反义链分别与植物表达载体pCAMBIA 1304酶切后的直链进行连接反应, 体系为 (总体积10μL) :pCAMBIA 1304直链1μL, 酶切后正义链/反义链3μL (视片段浓度而定) , 10×Ligation Buffer 1μL, T4 DNA Ligase 1μL, 双蒸水4μL, 16℃水浴连接过夜。

将带有正义链和反义链的植物表达载体pCAMBIA 1304转化到大肠杆菌中, 接种于含有Kan (50 μg/mL) 的LB固体培养基上, 平板倒置于37℃恒温培养箱中培养12～18 h。挑取单菌落检测。

参照《分子克隆实验指南 (第3版) 》质粒提取方法提取pCAMBIA1304-GbCO质粒DNA[8]。

1.2.3 GbCO基因植物表达载体转化农杆菌

参照朱锦辉、权军利等人[9]方法, 挑取根癌农杆菌LBA4404单菌落于YEP液体培养基 (含Rif 40μg/mL) 中, 28℃振荡培养至OD600为0.5左右, 制备农杆菌感受态细胞, 把pCAMBIA1304-GbCO质粒DNA转化到农杆菌感受态细胞, 接种于含有50μg/mL Kan和40μg/mL Rif的YEP固体平板上, 28℃培养约48h, 挑单菌落, 接种于YEP液体培养基中, 28℃振荡培养过夜。以GbCO基因特异性引物进行PCR扩增, 进行菌落PCR检测, 电泳检测目的条带。同时提取pCAMBIA1304-GbCO质粒DNA, 进行BamHⅠ和HindⅢ双酶切, 37℃反应过夜, 电泳检测酶切结果, 进一步进行酶切鉴定。

2 结果与分析

2.1 GbCO基因植物表达载体的构建策略

GbCO基因ORF上没有的限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ两个酶切位点, 而植物表达载体pCAMBIA 1304上有这两个酶切位点, 通过设计引入酶切位点及保护碱基引物, 扩增GbCO基因正义链和反义链, 使其两端含有BamHⅠ和HindⅢ两个酶切位点。利用双酶切和连接重组技术, 把GbCO基因正义链和反义链通过酶切位点BamHⅠ和HindⅢ插入植物表达载体pCAMBIA 1304, 从而构建正义表达载体pCAMBIA 1304-GbCOs和反义表达载体pCAMBIA 1304-GbCOa。

2.2 GbCO基因植物表达载体的构建及鉴定

以含有GbCO的载体pMD-18T-GbCO菌液为模板, 使用引入BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的正义引物、反义引物扩增得到了基因两端带有相应双酶切位点的GbCO基因片段, 测序结果表明正确引入了BamHⅠ和HindⅢ酶切位点。

对植物表达质粒pCAMBIA 1304和克隆扩增得到的带有BamHⅠ和HindⅢ双酶切位点的目的基因片段双酶切。酶切电泳结果如图2, 图2 (a) 显示植物表达质粒pCAMBIA 1304经过酶切后, 由原来的环形或超螺旋结构变成了单一的线性结构, 酶切完全;由图2 (b) 可见GbCO基因酶切后基因条带大小与酶切前的一致, 说明基因未被酶切弥散, 可以进行载体构建连接反应。

将分别酶切后的载体和片段进行连接反应, 转化TOP10感受态细胞, 在含有卡那霉素 (50mg/L) 的LB培养基上筛选转化菌落, 挑取单菌落进行菌落PCR鉴定。PCR产物电泳可见大小约1 200bp的特异条带 (图3, a) , 与预期大小一致, 初步说明pCAMBIA 1304-GbCO植物表达载体构建成功。对PCR为阳性的单菌落进行摇菌培养后提取质粒, 用BamHⅠ和HindⅢ双酶切再次鉴定, 电泳可见两条大小约1.2kb和3.0kb的目的条带 (图3, b) , 证明pCAMBIA 1304-GbCO植物表达载体构建准确。构建的表达载体送往上海生工测序, 结果表明克隆的重组质粒是研究所需的植物表达载体pCAMBIA 1304-GbCO。

(a) 为pCAMBIA 1304载体双酶切图 (ck为双酶切前的载体, 1、2、3为双酶切后的载体) 。 (b) 为GbCO基因正义和反义ORF片段的双酶切图 (M为DNA marker DL2000, 1、2为酶切后, 3、4为酶切前;1、3为正义链, 2、4为反义链) 。

a为菌落PCR结果电泳, b为pCAMBIA 1304-GbCO质粒酶切。

2.3 GbCO基因植物表达载体转化农杆菌

pCAMBIA 1304-GbCO重组质粒转化农杆菌LBA4404感受态细胞, 涂布YEP平板上培养长菌后, 挑取单菌落进行PCR鉴定。选择GbCOS-FP和GbCOA-FP为单菌落检测的上游引物, 通用引物M13 pM4:GTTTT CCCAG TCACG AC为下游引物。得到约1 200bp的特异条带 (图4) , 证明pCAMBIA 1304-GbCO重组质粒已经被成功转入农杆菌LBA4404感受态细胞中, 命名pCAMBIA 1304-GbCO/LBA4404菌落, 可以作为转基因等后续研究之用。

其中, M为DL2000分子量标记;+1为正义链阳性菌落;+2为正义链阴性对照;-1～-3为反义链阴性对照;-4为反义链阳性菌落。

3 讨论

近年来, 关于光周期的研究已有大量报道[10]。光合周期变化是一种诱导植物开花的环境因子之一。在拟南芥光合周期途径中, 现已证明FT、CO和SOC1等基因的表达均受到光合周期节律的调节[11,12,13]。Koornneef M等人通过光周期失活的拟南芥突变体首先筛选得到CO基因[14], 进而对其结构研究证明, CO基因编码一个转录因子调控植物对光合周期的响应, CO是植物光周期途径中的关键基因。

基因载体论文篇8

作者实验室根据植物偏爱的密码子，按照透明颤菌血红蛋白(VHb)的氨基酸序列，对透明颤菌血红基因(vgb)进行优化改造，人工合成了全长的450bp的透明颤菌血红蛋白基因(以下称之为vgb M)[6]。

本研究把vgb M和融合杀虫基因(GFMCry IA与Cp TI)构建成双价基因植物表达载体，导入烟草。期望通过分子育种培育探索高产、多抗虫谱的转基因植物，探索一条分子植物育种新途径。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

大肠杆菌DH5α感受态细胞购自北京天为时代公司，根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404(作者实验室保存);质粒p GBI4FABC、p GSVHB、p G4AB均由作者实验室构建;烟草(Nicotiana tabacum)Nc89无菌苗叶片作为转化用外植体;转基因烟草叶片杀棉铃虫实验采用3日龄棉铃虫(Heliothisarmigera)。

1.1.2 试剂

DNA限制性核酸内切酶，T4DNA连接酶购自MBI公司，DNA Marker和蛋白质Marker系鼎国公司和MBI生产，酶切片段的回收试剂盒购自鼎国公司试剂盒，探针标记采用Promega公司试剂盒。

1.1.3 引物

检测融合杀虫基因的引物

引物1:5′-CCATACAACTGCTTGAGTAACCCA-3′

引物2:5′-CTCA TCA TCTTCA TCCCTGG-3′

检测vgb M基因的引物

引物3:5′-CATGCCATGGGCCTTGATCAACAGACTATC-3′

引物4:5′-CCCAAGCTTACTCAACAGCTTGAGC-3′

1.2 方法

载体构建过程中的的DNA操作技术，如质粒DNA的提取、酶切、酶切产物连接、转化及重组子的筛选参照文献[7];烟草基因组DNA的提取参照文献[5];植物表达载体转化农杆菌及对烟草的转化参照文献[8];转基因烟草的分子检测PCR及Southern blot检测方法参照文献[8]，转基因烟草植株叶片杀棉铃虫试验见文献(Cui HZ,et al.，1998)。转基因烟草实验组方案设计参见文献[6]。

2 结果与分析

2.1 含vgb M基因的中间载体(p G4ASVHB)的构建

PstⅠ和SacⅠ酶切p GSVHB，得到vgb M基因片段并将vgb M克隆到p G4AB上以替换Bt基因，这样利用Bt基因表达盒的启动子和终止子以及增强表达的调控元件，构建了质粒p G4ASVHB。HindⅢ酶切鉴定质粒p G4ASVHB，出现2.82kb和1.58kb的片段(见图1)。

Lane 1:1kb DNA ladder;Lane 2:p G4ASVHB/HindⅢ+Eco RⅠ.

2.2 植物高效表达载体(p GBIF4ABCVHB)的构建

p G4ASVHB上有两个HindⅢ位点，故先用Eco RⅠ完全酶切质粒p G4ASVHB，然后再用HindⅢ酶切，回收1.58kb大小的vgb M基因表达盒片段。HindⅢ酶切p GBIF4ABC，回收13.5kb载体片段，然后将vgb M基因表达盒克隆至载体p G-BIF4ABC上，即可获得含vgb M基因表达盒和融合杀虫基因的植物表达载体p GBIF4ABCVHB，该质粒的酶切鉴定结果与理论相符。p GBIF4ABCVHB的酶切鉴定图谱见图2，其质粒图谱见图3。

1:p GBIF4ABC/HindⅢ;2:pG4ASVHB/HindⅢ;3:pGBIF4ABCVHB/HindⅢ;M:marker.

新构建的植物表达载体p GBIF4ABCVHB中含有融合杀虫基因和vgb M基因表达盒。vgb M基因表达盒中包含有2个增强子的35S启动子、Ω前导序列、Kozak序列、多联终止密码子及Nos终止子;融合杀虫基因表达盒中，除含有以上提高转录和翻译的调控元件外，还包含有正确切割、加工序列、Poly(A)信号序列。融合杀虫基因和vgb M基因各带有自己的能增强转录和翻译的调控元件，这些顺式作用元件将有利于外源基因在受体植物中的高效表达(见图3)。

2.3 融合杀虫基因和VHb基因导入烟草的初步研究

2.3.1 vgb M基因的Western blot检测

通过根癌农杆菌介导的叶盘法转化烟草，获得了卡那霉素抗性植株。将PCR和Southern blot检测的阳性植株作为待测对象。Western blot检测表明在这些转基因烟草中，vgb M基因全部表达出了目的蛋白，图4是部分转基因烟草蛋白提取物的Western blot结果。

2.3.2 杀虫基因表达产物的生物学检测

转基因烟草植株的叶片杀棉铃虫实验结果表明，在32株转基因烟草中，15株具有极高或高抗性，16株具有中等抗性，4株低抗性。

3 讨论

转基因中外源基因的表达受顺式作用元件和细胞内的反式作用因子调控[9,11]，本实验的基因的表达盒中含有如下的表达调控元件:5′端Ca MV35S启动子及增强子加倍元件、5′端Ω序列和Kozak序列、3′端的多腺苷酸序列poly(A)、切割序列和加工序列、3′端多联终止密码子序列及Nos终止子，这些元件有利于外源基因在受体植物中高效表达。融合杀虫基因不但可以减少由于同源性造成的反式失活现象，而且可以使不同基因同时等量表达，一旦融合基因插入植物基因组中有利于转基因高效表达的位点，几个基因就可以同时发挥作用，从而减缓昆虫对转基因产生抗性的进程，也扩大了抗虫基因的杀虫谱[4,11]。

1,positive control;2,nontransgenic group;3-7,the transgenic tobacco plants;M,marker.

邓肯新复极差测验:*,差异显著水平(P<0.05);,极显著水平(P<0.001)。

Duncan's test(LSR):*,significance at P<0.05 lever;,extreme significance at P<0.001 level.

透明颤菌能合成血红蛋白以适应在贫氧的环境生活，它具有结合氧的特性，具有增强光合作用，可大幅提高植物生物量[6]，本实验首次将VHb基因和融合杀虫基因，构建成双价基因植物表达载体，导入烟草中的研究表明:可通过分子育种培育作物抗虫，稳产新品种，该双价基因表达载体在生产应用中具有潜在的应用价值，也为本实验室通过分子育种培育高产，稳产抗虫棉花新品种奠定了技术基础。

参考文献

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[10]王丽冰,刘立军,颜亨梅.转Bt抗虫基因水稻的研究进展和生物安全性及其对策[J].生命科学研究,2009,13(02):48-55.

基因载体论文篇9

大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)是大豆的主要抗营养因子。STI主要分为Kunitz类抑制剂(KTI)和Bowman—Birk类抑制剂(BBI)两类。其中KTi型起主要的抗营养作用，含量为1.4%左右，BBi含量为0.6%左右。随着分子生物学的发展，人们对大豆胰蛋白酶抑制剂的发育调控和遗传组成进行了大量研究。结果表明：KTi家族由多基因编码，在大豆的基因组中至少存在10个不同的KTi基因，其中，KTi3编码大豆种子主要的胰蛋白酶抑制剂，在幼胚及种子中高水平的表达。目前，大豆胰蛋白酶抑制剂抗营养作用主要表现在抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性、降低动物对蛋白质的消化吸收和造成动物胰腺肿大两个方面。

大豆凝集素(SBA)也是大豆的主要抗营养因子之一。1974年，Lotan等人测定了大豆凝集素的氨基酸组成，大豆凝集素亚基完整的基因序列已经被测出。SBA在成熟的种子中其含量高达蛋白质总量的10%左右，属于热敏感性抗营养因子，但在加热处理后，其残存量仍然很大，在饲料原料中仍含有一定量的大豆凝集素。它不仅影响饲料的适口性，抑制动物生长，而且对其内脏器官、肠道免疫系统、肠道菌群及刷状缘酶活性等都产生影响，限制了大豆的利用效率。大豆凝集素抗营养作用的关键在于它能破坏小肠正常结构，引发全身性的反应。近年来，国外直接利用不含凝集素和Kunitz型胰蛋白酶抑制剂的大豆粉饲喂畜禽(牛、鸡)收到了良好效果。

近年来，RNAi (RNA interference)技术为植物的遗传改良提供了一个强有力的手段。因此，本研究利用RNAi技术，结合种子特异性启动子，构建了同时具有KTi基因和SBA基因反向重复结构的双价RNAi种子特异性表达载体pCAMBIA3301-KTi-SBA (pKTi-SBA)，为通过RNAi的抑制作用降低大豆种子种胰蛋白酶抑制剂和凝集素的含量，改良大豆品质奠定基础。

1 材料与方法

本试验在吉林农业大学生物技术中心试验室完成。

1.1 材料

1.1.1 植物材料和质粒

大豆品种‘吉农28’由吉林农业大学生物技术中心试验室提供;大肠杆菌DH5α、种子特异性表达载体p7αP-GFP(本试验前期已构建成功)均由吉林农业大学生物技术中心试验室保存;pMD18-T Vector克隆载体购自TaKaRa公司。

1.1.2 酶和试剂

Taq DNA聚合酶、dNTP、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、去磷酸化酶CIAP、DNA Marker、Agarose Ge DNA Purification Kit、质粒小量抽提试剂盒均购自TaKaRa和MBI公司，引物由北京三博远志生物技术有限公司合成;其他常规试剂采用进口分装或国产分析纯AR级。

1.2 方法

1.2.1 大豆总RNA的提取及cDNA的合成利用

RNAiso Reagent试剂盒从未成熟的大豆种子中提取大豆总RNA，并反转录成c DNA。

1.2.2 RNAi载体各部分片段的获得及克隆测序

根据已知的大豆胰蛋白酶抑制剂KTi3基因的cDNA序列(GenBank:S45092)、大豆凝集素SBA基因(le2)的cDNA序列(GenBank AY342213)，应用Primer 5.0软件分别设计KTi和SBA基因的特异引物。KTi引物为：KS:5′TTT CTG CAG GTCAGACATAACAGCAT 3′(PstⅠ);KAS:5′TTT GTC GAC TTCATCATCAGAAACTC 3′(SalⅠ);SBA引物：Ls1:5′TTT GTC GAC ATCCA-CATTTGGGACAGC 3′(SalⅠ);Las:5′GGG TCT AGA TGGCAAATTGGAAGAAAA 3′(XbaⅠ);以上述cDNA为模板，通过RT-PCR扩增KTi和SBA。其中KTi基因片段PCR扩增条件为：94℃预变性5min;94℃变性40s, 48℃退火40s, 2℃延伸50s, 28个循环，72℃后延伸10min;SBA基因片段PCR扩增条件为：94℃预变性5min;94℃变性30s, 48℃退火30s, 72℃延伸40s, 30个循环，72℃后延伸10 min。PCR产物经电泳分离，回收后与pMD18-T载体连接得到克隆载体pMD18-T-KTi和pMD18-T-SBA，转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆测序。

1.2.3 RNAi载体的构建

(1) KTi与SBA连接成双片段KTi-SBA。利用限制性内切酶PstⅠ和SalⅠ双酶切克隆载体pMD18-T-KTi，以及利用SalⅠ和XbaⅠ双酶切克隆载体pMD18-T-SBA，得到KTi和SBA基因，将两段基因片段做T4连接，以连接产物为模板，设计一对特异性引物[2ks-dj:5′GGGAGA TCT GTC AGA CAT AACAGC AT 3′ (BglⅡ) 和2lasdj:5′TTG GGT TACC TG-GCAAATTGGAAGAAAA 3′ (BstEⅡ)]，扩增得到的片段连入pMD18-T载体，得到重组克隆载体pMD18-KTi-SBA。

(2)正义表达载体pCAMBIA3301-KTiZ-SBAZ的构建。将KTi-SBA双片段利用限制性内切酶PstⅠ和XbaⅠ正向连入种子特异性表达载体p7αP-GFP，构建成正义表达载体pCAMBIA3301-KTiZ-SBAZ。

(3)双价RNAi载体pKTi-SBA的构建。利用限制性内切酶BglⅡ和BstEⅡ，将KTi-SBA双片段反向插入表达载体pCAMBIA3301-KTiZ-SBAZ中，构建成双价RNAi表达载体pKTi-SBA。构建成功的双价RNAi表达载体pKTi-SBA的RNA干扰构件结构如图1所示。

2 结果与分析

2.1 KTi和SBA基因片段的PCR检测

以获得的cDNA为模板，通过KTi和SBA的引物分别PCR扩增KTi和SBA基因片段，扩增产物电泳后(图2)，分别得到与预期大小一致的目的片段。测序结果表明：KTi基因片段为324bp, SBA基因片段为515bp片段，与Genebank中报道的序列同源性达到100%(测序由北京三博远志公司完成)。将PCR扩增得到的KTi和SBA基因片段插入到克隆载体中，构建得到重组克隆载体pMD18-KTi和pMD18-SBA，以其质粒为模板，进行PCR和酶切鉴定，电泳后，得到与预期大小相符的特异条带(图2)。

2.2 RNAi载体的构建与鉴定

(1)重组克隆载体pMD18-KTi-SBA的构建及鉴定。对构建成功的pMD18-KTi-SBA载体进行PCR和酶切鉴定，鉴定结果如图3所示，均得到大小约为841bp的片段。再对pMD18-KTi-SBA质粒进行测序，同源性达到100%，表明重组克隆载体pMD18-KTi-SBA构建成功。

A.PCR产物;B.PCR鉴定结果;C.双酶切产物;M.DNA Marker DL-2000;1.KTi基因;2.SBA基因

M.DNA Marker DL-2000;1.PCR产物;2.BglⅡ/BstEⅡ双酶切

(2)正义表达载体pKTiZ-SBAZ的构建及鉴定。对构建成的pCAMBIA3301-KTiZ-SBAZ载体进行PCR和酶切鉴定。鉴定结果如图4所示，PCR和酶切都得到了大小约为841bp的条带，与预期结果一致。对鉴定成功的p CAMBIA3301-KTiZ-SBAZ质粒测序，测序结果同源性达到100%，表明正义表达载体pCAMBIA3301-KTiZ-SBAZ构建成功。

M.DNA Marker DL-2000;1.PCR产物;2.BglⅡ/BstEⅡ双酶切

(3)双价RNAi载体pCAMBIA3301-KTi-SBA的构建及鉴定。对构建成的双价RNAi表达载体pCAMBI-A3301-KTi-SBA进行PCR和酶切鉴定。分别用KTi基因、SBA基因、KTi-SBA双片段的特异性引物对RNA表达载体。

M.DNA Marker DL-2000;1.KTi基因;2.SBA基因;3.KTi-SBA基因

(4) RNAi表达载体p KTi-SBA的构建及鉴定。将KTi-SBA双片段反向插入表达载体pCAMBIA3301-KTiZ-SBAZ中，构建成RNAi表达载体pKTi-SBA。对p KTiSBA做PCR鉴定的结果如图5A所示，都得到与预期大小相符的片段。对pKTi-SBA做酶切鉴定的结果如图5B所示，用PstⅠ和SalⅠ双酶切，得到一条大小约为324bp的片段;用SalⅠ和XbaⅠ双酶切该质粒，得到一条大小约为517bp的片段;用BglⅡ和BstEⅡ双酶切该质粒，得到一条大小约为841bp的片段，根据PCR和双酶切鉴定的结果初步表明双价RNAi表达载体pKTi-SBA构建成功。然后对其进行测序，结果表明双价RNAi表达载体p KTi-SBA构建成功。

3 讨论

近年来RNA干扰技术迅猛发展，并已在水稻、玉米、小麦、大麦、马铃薯等多种作物中得到成功应用。研究表明：高效利用RNAi技术的关键问题在于构建方便有效的RNAi表达载体。本研究根据RNA干扰载体构建原则，构架了同时含有大豆胰蛋白酶抑制剂(KTi)和凝集素(SBA)基因的双价ihpRNA种子特异性表达载体，以期能在大豆种子中同时沉默KTi和SBA基因的表达。

3.1 双价RNAi表达载体pKTi-SBA启动子的选择

pKTi-SBA启动子来源于大豆7S蛋白α亚基基因，属种子特异性启动子，具有在种子中特异、高效表达的特性，能够使KTi和SBA基因在大豆种子中特异表达与调控。

3.2 两个干扰片段的克隆

研究发现较短的片段效率较低，较长的发夹结构在寄主细菌中容易重组。Helliwell建议采用300～600bp大小的片段更容易获得比较有效的基因沉默。所以本试验应用的两个干扰片段大小均在此范围内。并将这两个干扰片段连接成一个大片段，只运用一对引物将此大片段克隆出来，打破了传统的设计多对引物克隆目的片段，降低了工作量。目前还有另外一种克隆技术GatewayTM技术，应用该技术构建植物RNA干扰表达载体既简便又快捷，但是此方法成本过高，适合高通量、大批量的研究工作，并不适合于本试验的研究。因此，本试验采取上述方法，既降低了工作量，又减少了成本。

3.3 转基因植株的活性检测

经酶切及测序证实，本试验已经成功构建成大豆胰蛋白酶抑制剂(KTi)和凝集素(SBA)基因的双价干扰RNAi载体。目前，已通过农杆菌介导的方法对大豆进行了遗传转化试验，通过Bar基因筛选，目前已经得到抗性苗8株。有关双干扰载体是否能真实抑制KTi和SBA两个基因的表达，还有待进一步的RT-PCR检测和酶活检测等结果的验证。本载体若能成功实现其抑制目的基因的功能，则可以为大豆的品质改良奠定基础。

摘要：本研究采用RT-PCR技术克隆大豆KTi和SBA基因的核心保守序列, 序列分析表明, KTi基因片段为324bp, SBA基因片段为515bp;利用RNAi技术, 结合种子特异性启动子, 构建同时具有KTi基因和SBA基因反向重复结构的双价RNAi种子特异性表达载体pCAMBIA3301-KTi-SBA (pKTi-SBA) 。通过酶切检测及测序, 证明双价RNAi种子特异性表达载体构建成功。本研究为通过RNAi技术同时降低大豆种子中胰蛋白酶抑制剂和凝集素含量, 改良大豆品质奠定基础。

关键词：大豆,胰蛋白酶抑制剂KTi基因,凝集素SBA基因,RNAi表达载体

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基因载体论文篇10

1 材料

1.1 载体与菌株

表达载体pBI121,由中国科学院青岛生物能源与工程研究所惠赠;大肠杆菌感受态细胞DH5α,由青岛农业大学遗传实验室保存;质粒pMD19-T-H、pMD19-T-F、pMD19-T-H-KDEL、pMD19-T-MAR、pMD19-T-GFP[6],由青岛农业大学遗传实验室构建。

1.2 酶及试剂

限制性内切酶、DL-2 000 Marker、DL-15 000 Marker,购自宝生物工程(大连)有限公司;PCR试剂、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒,购自上海生工生物工程技术服务有限公司;PCR引物,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成;其他化学试剂均为国产分析纯。

1.3 引物

GFP引物为P1(F 5′-CGCGGATCCATGTCGAAGGGCGAGGAGC-3′,R 5′-GCGCCCGGG-CTTGTACAGCTCGTCCAT-3′,其中斜体、加粗部分为酶切位点,内切酶分别为BamHⅠ、SmaⅠ),MAR引物为P2(F 5′-CAGATCGATTCGATTAAAAATCCCAATTATTGCG-3′,R 5′-GTGATCGATAGGAAGAAGTTCCCAATCTTGAAA-3′,其中斜体、加粗部分为HindⅢ酶切位点)。

pBI121-GFP-MAR中MAR序列正、反向连接验证引物分别为P3(F 5′-GACGCTAAAGGCCTTGATTCTG-3′,R 5′-GAGGACCTACAATACATAACCCACT-3′)、P4(F 5′-GACGCTAAAGGCAAACTTGATTCTG-3′,R 5′-GGTTAGAATCATCAAAAGGCAAGTT-3′)。

F、H、H-KDEL引物分别为P5(F 5′-CTGCAGCTGATGACACGGGTCGCAATCT-3′,R 5′-CTGCCAGAGCTCTGGCTACAGTGATCTCACGTACG-3′,其中斜体、加粗部分分别为SmaⅠ、BstⅪ酶切位点)、P6(F 5′-CTTCCCGGGATGTCCGCACAAAGGGAAAG-3′,R 5′-CGTCCACAGCTGTGGCTAGACTGGATTACATGTT-3′,其中斜体、加粗部分分别为PvuⅡ、BstⅪ酶切位点)、P7(F 5′-CTTCCCGGGATGTCCGCACAAAGGGAAAG-3′,R 5′-CCTCCACAGCTGTGGAAGCTCGTCCTTCTAGACTGGAT-3′,其中斜体、加粗部分分别为SmaⅠ、SstⅪ酶切位点)。

2 方法

2.1 中间表达载体pBI121-GFP的构建

1)用限制性内切酶BamHⅠ和SmaⅠ分别双酶切pBI121和pMD19-T-GFP。酶切体系:pBI121与pMD19-T-GFP 15 μL,10×T Buffer 5 μL,1% BSA 5 μL,2种内切酶各1 μL,ddH2O 26 μL,总反应体积为50 μL。在30 ℃条件下酶切3 h,用1%琼脂糖凝胶电泳40 min,DNA凝胶回收试剂盒纯化、回收pBI121的大片段,记为片段1,回收pMD19-T-GFP的小片段,记为片段2。

2)片段1和片段2的连接。连接体系:片段1 1 μL,片段2 2 μL, 10×T4 DNA连接酶Buffer 1 μL,T4 DNA连接酶1 μL,ddH2O 5 μL,总反应体积为10 μL,在16 ℃条件下连接4 h。

3)转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,挑取单菌落后提取质粒酶切验证。

2.2 植物表达载体pBI121-GFP-H、pBI121-GFP-H-KDEL的构建

1)用SmaⅠ和SacⅠ双酶切质粒pBI121-GFP,用SmaⅠ和BstⅪ分步双酶切质粒pMD19-T-H和pMD19-T-H-KDEL。

2)进行分步酶切,SmaⅠ酶切体系:质粒15 μL, 10×T Buffer 5 μL,1%BSA 5 μL,SmaⅠ 1 μL, ddH2O 24 μL,总反应体积为50 μL。在30 ℃条件下酶切2 h。加入2.5倍体积预冷的无水乙醇,-20 ℃保冷30～60 min,12 000 r/min离心5 min,用70%乙醇洗沉淀后进行BstⅪ酶切。BstⅪ酶切体系:质粒5 μL,10×H Buffer 2 μL,BstⅪ 1 μL,ddH2O 12 μL。在45 ℃条件下酶切2 h。

3)用1%琼脂糖凝胶电泳40 min,DNA凝胶回收试剂盒纯化、回收pBI121-GFP的大片段,记为片段3,回收pMD19-T-H和pMD19-T-H-KDEL的小片段,记为片段4和片段5。

4)将片段3和片段4、片段3和片段5分别用T4 DNA连接酶连接,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,挑取单菌落后提取质粒酶切验证。

2.3 中间表达载体pBI121-GFP-MAR的构建

1)用HindⅢ酶切质粒pBI121-GFP和pMD19-T-MAR,在37 ℃条件下酶切2 h,电泳后用pBI121-GFP回收大片段,用pMD19-T-MAR回收小片段。

2)对pBI121-GFP电泳回收的线性载体进行去磷酸化处理。

3)将去磷酸化处理后的载体与pMD19-T-MAR酶切后回收的小片段连接,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,获得载体pBI121-GFP-MAR,使用MAR序列正、反向连接引物验证,筛选正向连接产物。

2.4 植物表达载体pBI121-GFP-MAR-H、pBI121-GFP-MAR-H-KDEL的构建

用SmaⅠ和SacⅠ双酶切质粒pBI121-GFP-MAR,用SmaⅠ和BstⅪ分步双酶切质粒pMD19-T-H和pBI121-GFP-MAR12-H-KDEL。电泳后用pBI121-GFP-MAR回收大片段,pMD19-T-H回收小片段,连接、转化大肠杆菌感受态细胞DH5α后提取质粒,PCR鉴定。

2.5 植物表达载体pBI121-GFP-MAR-F的构建

用SmaⅠ和SacⅠ双酶切质粒pBI121-GFP-MAR,用PvuⅡ和BstⅪ分步酶切质粒pMD19-T-F。电泳后用pBI121-GFP-MAR回收大片段,pMD19-T-F回收小片段,连接、转化大肠杆菌感受态细胞DH5α后提取质粒,PCR鉴定。

3 结果与分析

3.1 植物表达载体pBI121-GFP-H、pBI121-GFP-H-KDEL的构建(结果见图1)

M1.DL-15 000 Marker;1.pBI121 HindⅢ酶切产物;2.pBI121- GFP BmHⅠ、SmaⅠ酶切产物;3～5.pBI121-GFP、pBI121- GFP-H、pBI121-GFP-H-KDEL HindⅢ酶切产物;6～7.pBI121- GFP-H、pBI121-GFP-H-KDEL EcoRⅠ酶切产物;M2.DL- 2 000 Marker。

由图1可知,pBI121大小约为14 800 bp;pBI121-GFP双酶切后产生了大小为750 bp的条带,单酶切后产生了大小约为15 500 bp的条带;pBI121-GFP-H和pBI121-GFP-H-KDEL单酶切后产生大小约为17 400 bp的条带;经测序,在H和H-KDEL序列内含有EcoRⅠ酶切位点,由于在pBI121上有EcoRⅠ酶切位点,所以用EcoRⅠ酶切后会产生2条带,小片段大小约为1 800 bp。上述结果与预期结果相同。表明植物表达载体pBI121-GFP-H和pBI121-GFP-H-KDEL构建成功。

3.2 中间表达载体pBI121-GFP-MAR的构建(结果见图2)

M1.DL-2 000 Marker;1～2.pBI121-GFP-MAR 的P1、P2扩增产物;3～4.pBI121-GFP-MAR的P3和P4正、反向验证产物; 5.pBI121-GFP-MAR BamHⅠ、SmaⅠ酶切产物;6.pBI121- GFP-MAR HindⅢ酶切产物;M2.DL-15 000 Marker。

由图2可知,pBI121-GFP-MAR中间表达载体用PCR方法分别扩增GFP、MAR序列、MAR正向连接验证引物、MAR反向连接验证引物,得到的条带大小分别为750 bp、1 000 bp、807 bp、0,用GFP两端的酶双酶切后得到的条带大小为750 bp,用MAR两端的酶单酶切后得到的小条带大小为1 000 bp。上述结果与预期结果相同,表明中间表达载体pBI121-GFP-MAR构建成功。

3.3 植物表达载体pBI121-GFP-MAR-H、pBI121-GFP-MAR-F和pBI121-GFP-MAR-H-KDEL的构建(结果见图3)

M.DL-2 000 Marker;1～2.pBI121-GFP-MAR-H的P1、P2扩增产物;3～5.P6、P5、P7分别扩增pBI121-GFP-MAR-H、 pBI121-GFP-MAR-F、pBI121-GFP- MAR- H-KDEL 的产物。

由图3可知,pBI121-GFP-MAR-H、pBI121-GFP-MAR-F、pBI121-GFP-MAR-H-KDEL 3种植物表达载体用PCR方法分别扩增GFP、MAR正向,得到的片段大小都分别为750 bp、807 bp;用pBI121-GFP-MAR-H、pBI121-GFP-MAR-F、pBI121-GFP-MAR-H-KDEL分别扩增PPRV-H、PPRV-F、PPRV-H-KDEL,得到的片段大小约为1 800 bp、1 700 bp、1 800 bp。上述结果与预期结果相同,表明植物表达载体pBI121-GFP-MAR-H、pBI121-GFP-MAR-F、pBI121-GFP- MAR- H-KDEL构建成功。

4 讨论

pBI121载体的特异性酶切位点较少[7],构建表达载体时,选用SmaⅠ和SacⅠ酶切表达载体和外源基因,将GUS基因切掉,插入目的基因,可是根据PPRV-H和PPRV-F基因的测序结果,PPRV-H序列内有SacⅠ酶切位点,PPRV-F内有SmaⅠ和SacⅠ酶切位点,如果使用SmaⅠ和SacⅠ酶切会将目的基因切成几个片段,因此用同尾酶BstⅪ代替SacⅠ,同尾酶PvuⅡ代替SmaⅠ酶切目的基因,产生与pBI121酶切相同的末端,再进行连接。

GFP基因作为新一代活体检测目的基因的理想报告基因,其荧光性质比较特殊,具有易于检测、灵敏度高、荧光性质稳定等诸多优点,克服了植物分子生物学研究中传统报告基因的不足之处[8]。在PPRV-H下游引物终止密码子前,引入内质网驻留蛋白信号序列(KDEL),其信号在高尔基体各部分的膜上都有相应受体[9]。

MAR(matrix attachment region)序列是存在于真核细胞染色质中的一段与核基质特异结合的DNA序列。研究表明,将MAR序列构建到外源基因表达框两侧,对转基因表达具有很强的增强作用[10],或者可以降低不同转基因个体间表达水平的差异,抑制转基因沉默[11]。

武冬梅等[12]使用ClaⅠ和HindⅢ、MunⅠ和EcoRⅠ双酶切将MAR置于目的基因表达框的两侧,增强基因的表达效率,试验在连接MAR时发现,不能在目的基因两侧同时连接MAR序列,只能单侧连接,即在连接第2段MAR时,之前连接的MAR会从载体上脱落,这种现象目前无法解释。黄慧珍等[13]应用从烟草基因组中克隆到的MAR片段,分别构建植物表达载体pCAMBIA2301 GUS(uidA)基因表达盒的一侧及两侧,再通过农杆菌介导转化烟草。结果表明,表达载体上uidA基因一侧或两侧连接有MAR的转化烟草中,GUS的表达水平与对照组相比都有明显提高,而uidA基因两侧连接有MAR的载体提高表达水平的效果优于一侧连接有MAR的载体。

试验只在表达载体外源基因的一侧连接MAR序列。酶切时,EcoRⅠ酶切效果好,而MunⅠ的酶切效果较差。因此,试验在连接MAR时使用了EcoRⅠ单酶切,为了防止载体自连,对酶切后的载体进行了去磷酸化处理。另外,为了取得MAR的正向连接,在载体pBI121上设计1条引物,MAR序列上设计正、反向连接验证引物,PCR鉴定MAR的连接方向,最后选择正向连接。

5 结论

基因载体论文篇11

关键词：复制酶基因；黄化曲叶病毒；番茄；遗传转化；表达载体

中图分类号：S436.412.1+1 文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）02-0041-04

收稿日期：2014-03-19

基金项目：国家大宗蔬菜产业技术体系建设专项（编号：CARS-25）；山东省高等学校科技计划（编号：J07WG06、J09LC59、J10LC73、J12LE56）；潍坊科技学院校级课题（编号：W13K029、W13K033、W13K051）；山东半岛蓝色工程研究院科研计划（编号：sdlgy2013y014）。

作者简介：裴华丽（1978—），女，山东潍坊人，硕士，讲师，主要从事蔬菜分子育种研究。E-mail：peihuali2@163.com。

通信作者：刘永光，硕士，讲师，主要从事植物病理方面的研究。E-mail：ygliu425@163.com。番茄在中国各蔬菜产区均有大面积的种植，在我国蔬菜周年供应中占有非常重要的地位。随着温室大棚的推广及蔬菜反季节栽培效益的提高，温室番茄栽培面积连年增长，其病害的发生也呈现逐步加重的趋势。近年来，在番茄主产区相继发现的番茄黄化曲叶病毒，对番茄植株的生长、开花、坐果等方面均产生严重的危害，给当地的番茄生产带来巨大的经济损失[1-6]。番茄黄化曲叶病毒（tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）属双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）[4-7]，是一类世界范围内广泛发生的单链环状DNA病毒。自1986年首次将烟草花叶病毒（ TMV）外壳蛋白（ coat protein，CP）基因导入烟草培育出抗TMV植株以来，利用病毒本身的基因导入植物获得抗病毒植株已成为抗病毒基因工程的重要手段。在番茄转基因抗病毒育种中，主要利用病毒的外壳蛋白基因和复制相关蛋白（replication-associated protein，Rep）基因。

复制酶是指由病毒编码的，能特异合成病毒正负链RNA的RNA聚合酶，其核心功能是合成全长的病毒基因组RNA。在病毒编码的复制酶组分中存在多个保守序列，这些序列对聚合酶的活性必不可少[8]。自1990年Golemboski等将TMV U1株编码的复制酶的一部分基因序列转入烟草中，得到了高抗的烟草植株[9]以来，人们已对许多病毒的复制酶基因介导的抗病性及其抗性机制开展了深入研究[10-13]。但利用转番茄黄化曲叶病毒的复制酶基因来获得番茄抗黄化曲叶病毒的实例还未见报道。本研究从番茄黄化曲叶病毒株中克隆黄化曲叶病毒的复制酶基因，并将其转入番茄中以期获得抗番茄黄化曲叶病毒植株，从根本上解决当前番茄普遍存在的病害问题，尽快培育出适合山东乃至国内主要番茄种植区的抗番茄黄化曲叶病毒株系，以满足目前番茄产业的需求。

1材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1植物材料植物受体番茄品种菜都六号购于山东省寿光市金田种苗有限公司。TYLCV病毒样品采自山东省寿光市，番茄植株上部卷曲黄化及矮缩等具有感染番茄黄花曲叶病毒典型症状的叶片。

1.1.2菌株与试剂限制性内切酶BglⅡ、Eco 911、T4-DNA连接酶、DNA Marker均购自MBI公司，Taq DNA聚合酶、碱性磷酸酶购自宝生物工程有限公司，植物基因组DNA提取试剂盒、凝胶快速纯化试剂盒、质粒小量提取试剂盒等均购自北京全式金公司。植物表达载体pCAMBIA1304、农杆菌LBA4404由山东农业大学竺晓平老师惠赠。大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α、BL21由笔者所在实验室保存。琼脂糖、胰蛋白胨、酵母提取物、氨苄青霉素（Amp）、卡那霉素（Kan）、头孢霉素（Cef）、潮霉素（Hyg）、乙酰丁香酮（AS）、利福平（Rif）、链霉素（Str）、6-苄氨基嘌呤（6-BA）、3-吲哚乙酸（IAA）均购自Sigma公司，其他试剂为国产分析纯。引物均由北京华大基因科技有限公司合成，其序列如表1所示。

1.1.3培养基基本培养基为MS培养基，各培养基附加蔗糖30 g/L、琼脂7.5 g/L，pH值调至5.8。种子发芽的培养基为1/2MS；预培养基为MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L；共培养基为MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 005 mg/L；选择培养基为MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L+Hyg 10 mg/L+Cb 400 mg/L；生根培基为1/2MS+NAA 0.05 mg/L+Hyg 10 mg/L+ Cb 200 mg/L。

1.2试验方法

1.2.1TYLCV-Rep基因的克隆用植物基因组DNA提取表1供试引物的序列情况

试剂盒提取番茄病叶总DNA，根据GenBank中双生病毒序列设计引物Rep-F和Rep-R，以提取的番茄病叶总DNA为模板，进行PCR扩增，反应体系如下：2×Taq MasterMix 125 μL，Rep-F（10 pmol/L）1.0 μL，Rep-R（10 pmol/L）1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，加ddH2O至终体积25.0 μL。反应条件为：94 ℃变性45 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃继续延伸10 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.2TYLCV-Rep基因片段的回收及克隆载体的连接、转化用凝胶快速纯化试剂盒对符合预期大小的片段进行回收、纯化。采用冻融法将连接产物转入Trans1-T1感受态细胞中，将菌液涂布于LB+Tet 100 mg/L+Amp 50 mg/L的平板上，室温放置1 h，待菌液完全被吸收后，倒置平板放于 37 ℃ 培养过夜。

1.2.3转化子的鉴定从转化平板上挑取白色菌斑，用含有50 mg/L氨苄青霉素的液体培养基于37 ℃振荡培养箱中培养6 h，用质粒小量提取试剂盒提取质粒，用引物Rep-F、Rep-R 进行PCR检测，限制性内切酶BglⅡ和SpeⅠ进行双酶切鉴定阳性克隆的正确性，将含有的重组质粒阳性克隆命名为pT-Rep-1，并送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.2.4植物表达载体的构建按照图1所示基因图谱构建植物表达载体。用BglⅡ和SpeⅠ将TYLCV-Rep基因从克隆载体pT-Rep-1上切下，然后与同样双酶切的植物表达载体pCAMBIA1304连接后，转化至大肠杆菌中，在含有50 mg/L Kan抗性的平板上进行培养。挑取阳性克隆进行PCR及BglⅡ、SpeⅠ双酶切鉴定。将连接正确的重组质粒命名为1304-Rep，并送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.2.5番茄外植体材料的获得选取饱满、大小一致、新鲜的番茄种子用清水反复冲洗数次，先后用75%乙醇对番茄种子消毒30 s、20%次氯酸钠消毒10 min，无菌水冲洗4～5遍，无菌滤纸吸干后，接种于种子发芽培养基中。暗培养至大多数种子发芽露白后，将其放到光照16 h/d、光照强度 1 600～1 800 lx、温度（24±2） ℃的条件下培养1周后，取番茄无菌苗的子叶，切去叶尖、叶柄，其余部分切成0.5 cm×05 cm大小的叶块，子叶正面向上接种至诱导愈伤的培养基上进行预培养。

1.2.6农杆菌介导Rep基因转化番茄采用冻融法将重组质粒1304-Rep转入农杆菌（LBA4404）中，于YEB+Rif 30 mg/L+Str 30 mg/L+Kan 50 mg/L平板上28 ℃培养 48 h。挑取含有重组质粒1304-Rep转入农杆菌（LBA4404）单菌落，接种到加Str和Kan的10 mL液体YEB中，28 ℃、200 r/min 振蕩培养过夜，以1 ∶40加入到新鲜的无任何抗生素的YEB培养基中，于28 ℃恒温摇床振荡培养3～4 h，取液体MS培养基稀释20倍后用于侵染。收集预培养基上的子叶放在培养皿中，倒入稀释好的菌液，轻轻摇匀使外植体和菌液充分接触，侵染10 min后，取出子叶，置于无菌滤纸上吸去多余菌液，接种到共培养基上28 ℃暗培养3 d。经共培养的外植体，转入抑菌培养基上培养7 d后转接于筛选培养基中，每2周更换新鲜培养基，并逐渐降低Carb浓度至200 mg/L。经筛选再生的抗性芽长至1.5～2 cm时，将其切下并剔净基部附着的愈伤组织，接种到生根培养基上进行生根培养，待幼苗生长至3～4张真叶时，进行炼苗，移栽至营养钵中。

1.2.7潮霉素筛选浓度试验在筛选培养基中分别添加0、2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20 mg/L Hyg，每个浓度筛选培养基接种10～15个外植体；在（25±2） ℃、光照约16 h/d、光照强度3 000 lx条件下培养，20 d后观察生长情况。

统计愈伤组织诱导率和不定芽分化率。

1.2.8番茄抗性植株的检测

1.2.8.1抗性植株的PCR检测再生番茄植株的基因组DNA采用SDS法微量提取[14]。以质粒1304-Rep作阳性对照，以未转基因的番茄基因组DNA为阴性对照，利用引物Rep-1304-F和Rep-1304-R进行PCR扩增，扩增条件同“1.2.3”节，PCR产物经10 mg/mL琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.8.2抗性植株的Southern Blot检测对以上扩增的PCR产物进行Southern Blot检测，用生物素地高辛标记的Rep基因杂交探针、Southern转膜、预杂交、杂交、洗膜、检测等方法均按Roche 公司“DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I”中的说明进行。

1.2.8.3转基因番茄T1代植株的PCR检测待转基因番茄T1代植株长至2叶1心时，采取尚未脱落的子叶提取基因组DNA。利用TYLCV-Rep基因上对应的特异引物进行目的基因的PCR扩增，扩增条件同“1.2.3”节，PCR产物经 10 mg/mL 琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.8.4转基因番茄T1代植株的抗病性鉴定2013年3月在潍坊科技学院蔬菜育种基地将转基因T1番茄种子及同品种的非转基因番茄种子播种于托盘中，当待测番茄植株长到3～4张真叶时，分别移栽于温室大棚及繁殖保存烟粉虱的防虫温室，每个番茄材料设计3个重复，每个重复10株，植株随机排列，常规管理，分别于移栽后7、14、21、42 d观察叶片感病情况。

对病情调查及抗性评价时，由病级计算病情指数（DI）。根据Hanson等的分级方法[15-16]进行病级分级。本研究以42 d 时调查的病情指数为鉴定依据。

病情指数（DI）=[（各级发病株数×病级数）/（最高发病级数×调查株数）]×100。

按病情指数（DI）分别划分为免疫，不侵染，DI=0；高抗（HR），0

2结果与分析

2.1TYLCV-Rep基因的PCR扩增

以F-Rep和R-Rep为引物，番茄病叶总DNA为模板进行PCR扩增，得到约1 200 bp的特异性扩增带，与预期结果一致（图2）。以经过PCR检测的重组质粒为模板，用Rep-1304-F和Rep-1304-R为引物进行PCR扩增，均得到约 1 100 bp 的片段。

2.2基因序列测定及分析

将所得DNA序列输入GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）进行Blast检索，选择并下载相应序列，采用DNASTAR、DNAMAN和MEGA 3.1软件对所得到的核苷酸序列与GenBank中收录的相应基因的核苷酸序列进行比较和分析。结果证明，番茄黄化曲叶病毒复制酶基因核苷酸序列 1 074 bp，编码357个氨基酸，与GenBank中相应的复制酶基因序列一致。

2.3植物表达载体的构建及其转化

将构建好的1304-Rep转化至农杆菌，提取重组质粒DNA，并以此为模板进行PCR扩增，分别得到约1 100 bp特异性扩增带（图3），片段大小与预期结果一致；经SpeⅠ和BglⅡ进行双酶切均得到1条约1 100 bp的条带（图4），测序结果表明，1 074 bp的不含终止密码的TYLCV的Rep基因序列已正向插入pCAMBIA1304载体中，没有发生移码，碱基没有改变，与GenBank中报道的序列完全一致。

2.4潮霉素濃度筛选试验

如图5所示，番茄子叶对潮霉素较敏感，当潮霉素浓度为10 mg/L时，尽管仍然存在子叶增厚的现象，但愈伤组织诱导率急剧下降。当潮霉素浓度为12.5 mg/L时，只有少数子叶加厚，极少诱导出愈伤组织。当潮霉素筛选浓度达到 15 mg/L 时，无外植体愈伤组织长出，也无外植体膨大、加厚，外植体在4～6 d内相继黄化死亡。为了抑制杀死非转化细胞，同时又保证转化细胞能正常生长，所以选择潮霉素浓度为12.5 mg/L作为番茄转基因材料的筛选浓度。

2.5番茄抗性植株的检测

2.5.1番茄抗性植株的PCR检测将潮霉素筛选呈阳性的21株番茄植株组培苗移栽到营养钵中，提取21株（TYLCV-Rep）潮霉素抗性番茄植株叶片及阴性对照的DNA，以相应质粒DNA为阳性对照，进行PCR扩增，扩增产物用10 mg/mL琼脂糖凝胶电泳检测（图6）。结果发现，21株抗性植株中，有3株能扩增出与质粒DNA大小一致的1 200 bp左右的条带，而阴性对照和另外18株均未扩增出任何条带，说明TYLCV-Rep基因已整合到番茄基因组中，阳性率为14.3%。

2.5.2转基因番茄植株的Southern Blot 检测选取PCR反应呈阳性的转基因番茄植株和非转基因番茄植株叶片的总DNA，以非转基因番茄植株叶片总DNA为阴性对照，以质粒酶切产物为阳性对照，分别经SpeⅠ和BglⅡ进行双酶切后的酶切产物进行Southern Blot杂交。结果表明，质粒及转基因番茄植株出现了相应的杂交信号，而未转基因番茄植株则没有相应的杂交信号（图7）。说明TYLCV-Rep基因都已经整合进番茄的基因组中。

2.5.3转基因番茄T1代的PCR检测转基因番茄T1代植株长至2叶1心时，采取尚未脱落的子叶提取基因组DNA。利用TYLCV-Rep基因上对应的特异引物进行目的基因的PCR扩增，扩增片段长度分约为1 200 bp，部分样品的电泳结果见图8。转基因番茄T1代植株分别检测到45个阳性植株，显示TYLCV-Rep基因可以在后代中稳定遗传。

2.5.4转基因番茄T1代的抗病性鉴定利用烟粉虱对转基因番茄进行侵染试验。用PCR反应为阳性的转TYLCV-Rep基因的番茄抗性植株做侵染试验，以非转基因植株作对照，防虫温室中植株表现如表2所示，非转基因植株对TYLCV表现高感（HS），而转基因植株对TYLCV表现出抗性（R）。田间抗病性观察发现，侵染7 d后转基因及非转基因植株叶片均未发现有异常变化；14 d后发现非转基因番茄植株叶片出现轻微黄化，转基因植株叶片未发现有异常变化；21 d后非转基因番茄植株叶片表现出典型的黄化卷曲症状，转基因植株叶片未发现有异常变化；42 d后非转基因番茄植株叶片表现出典型的严重黄化卷曲症状，转基因植株叶片未发现有异常变化（图9）。表明转基因番茄植株的抗病性较非转基因植株明显增强。

表2番茄黄化曲叶病毒病抗性鉴定结果

品种侵染接种鉴定病情指数抗级田间鉴定抗级转基因番茄6.8RR非转基因番茄52.3HSHS

3结论与讨论

与传统育种方式相比，通过转基因手段获得抗性更具优越性，转基因操作将有效单基因转入优良的栽培品种中，避免了常规杂交育种中，受多基因控制及数量性状遗传等复杂性，从而使植株有效获得相应的抗性。本研究TYLCV-Rep的全长序列通过构建相应的植物表达载体将其转入番茄中，获得了抗病性明显增强的转基因株系，该结果与Carr等的研究结果[17-18]一致。

在植物对病毒产生抗性的过程中可能涉及到一系列基因的表达，有些膜上基因的优先表达在植物的防御机制中起非常重要的作用。Carr等认为，转基因植物表达的复制酶在病毒的侵染过程中作为一种调节蛋白发挥功能，打破了病毒正链和负链复制的平衡[19]；而Baulcombe则认为，复制酶基因是在RNA水平上介导对病毒的抗性[20]。利用这些与抗性表达有关的关键基因通过生物工程手段来提高番茄抗性的调控机理，仍需进一步研究；另外，对获得相应抗性的番茄在某些条件下（如高温）会部分丧失抗性的原因，也将是番茄抗病育种的研究内容之一。

本研究成功克隆了番茄黄化曲叶病毒的复制酶基因，通过基因工程手段，将抗病基因导入番茄基因组，获得了抗病性增强的转基因番茄植株，通过PCR、Southern-blot检测表明该复制酶基因已成功转入番茄基因组中，烟粉虱侵染的抗性鉴定结果表明转基因番茄对TYLCV的抗性明显增强。本研究为培育番茄抗黄化曲叶病毒的抗病品种提供了可靠的理论依据和相应的技术保障。

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基因载体论文篇12

随着植物基因工程技术的发展,适合于不同研究目的各种载体系统应运而生,其中在转基因植物中最常用的是质粒载体。在为某种特定的植物构建表达载体时,为了使外源基因高效、安全表达,或由于特定的要求,需要构建新载体或改造已有载体,而选择一种合适的载体构建方法,从而达到方便、快捷的目的就显得十分重要。鉴于目前还没有关于对载体构建技术方面的总结,在收集整理前人工作的基础上,本文选择介绍了其中几种具有代表性的策略,对其适用的情况作了阐述,进而指出它们的应用潜力和主要应用领域,期望对实际操作起到借鉴作用。

1 载体构建方法

1.1 传统的载体构建方法

质粒载体DNA在体外经限制性内切酶酶切,然后在DNA连接酶的作用下同目的基因结合成环,最终得到转化载体。在此过程中,一般的步骤是,先在具有多克隆位点的初步载体上寻找合适的酶切位点,得到入门载体。为了与合适的启动子、选择性标记基因等序列元件连接,中间还需要转换多个载体和一系列的酶切、连接、转化、回收等工作,因此,传统的载体构建方法在构建多片段拼接的复杂载体时,其路线设计和实际操作往往比较麻烦,通常需要构建多个中间载体,费时费力。但是,在没有更便捷的方法之前或者构建的载体比较简单时,采用传统的构建方法还是一种比较安全、稳妥的选择,而且能够获得预期的结果。

1.2 Gateway技术

Gateway是Invitrogen公司开发的一项基因克隆和表达的新技术,它利用位点特异重组构建入门载体(entry clone)后,不再需要使用限制性内切酶和连接酶,而且一旦拥有了一个入门载体,就可以利用它将目标基因多次转移到各种不同的表达载体(目的载体,destination vector)上。此外,由于在重组时DNA片段的阅读框和方向保持不变,因而不会影响不同基因的测序结果,因而每当使用一种新的表达系统时,可以节省大量时间。Gateway技术是一种通用性的克隆方法,利用该技术可以快速、高效地将目的基因同时构建到多种与Gateway技术兼容的载体系统中,用于基因的蛋白质表达和功能分析[3]。

Gateway 技术以λ噬菌体的位点特异性重组体系为基础,只需BP和LR两个反应就可以完成载体的构建。BP反应旨在将目的基因从目的载体或PCR产物重组进入供体载体(donor vector)。创建入门克隆,通过PCR或传统的克隆方法将目的基因插入门载体,然后混合含有目的基因的入门克隆与合适的目的载体,以及Gateway LR Clonase酶,得到所需的表达克隆载体,在合适的宿主中,表达克隆就可以用来进行蛋白的表达和分析。

如图1所示,获得目的基因PCR片段后,在PCR产物的5'端加入attB1位点,3'端加入attB2位点,供体载体两端具有attP1和attP2位点,attB-PCR产物和供体载体在BP反应酶催化下,通过同源重组形成新的位点attL1和attL2,同时生成含有目的基因的入门克隆,而LR反应用于将目的基因从入门克隆重组进入目的载体,反应由LR反应酶混合物催化。入门克隆基因两端具有attL1和attL2位点,目的载体上含有attR1和attR2位点,在LR反应酶作用下发生定向重组,形成新的位点attB1和attB2,从而将目的基因转移到目的表达载体中,具体工作原理见图1[4,5]。

由此可见,Gateway的优势有以下几个方面:(1)简单快速的反应:在室温60min后即可转化E.coli;(2)克隆效率高:>90%甚至>99%的克隆是目标克隆;(3)快速直接克隆PCR产品;(4)特异性反应:保持阅读框架和基因的位置不变。目前,Gateway技术已经应用在许多领域中,如构建RNAi载体时优先考虑使用此技术。杨美英等[6]构建了番茄茄红素β-环化酶基因高效沉默载体;徐化学等构建了水稻OsDAD1基因的RNA干涉载体[4],也有的研究者将Gateway技术和TA载体构建相结合,得到实用、廉价与兼容的TA载体[7]。

1.3 含三段T-DNA载体

抗生素筛选标记基因是目前转基因植物安全性的隐患之一,很多植物转基因材料因此而不能获准商品化生产。现在有几种无筛选标记的植物转基因技术,包括共转化法(co-transformation)[8]、定位重组体系(site-specific recombination)[9]、多元自动转化载体系统(mult-auto-transformation vector)[10]、转座子系统( transposition system)[11]和同源重组体系(homologous recombination)[12]等,但只有共转化法的应用最为成功。共转化法就是利用基因枪介导将分别携带目的基因和标记基因的二个质粒载体混合转入受体细胞中,之后即可在T1或T2的分离后代中获得无筛选标记的转基因植株,不足的是转化频率比较低[13]。利用分别含有不同双元表达载体的农杆菌混合侵染植物细胞[8],同时含有二个不同双元表达载体的农杆菌侵染植物细胞[11]或含有二段T-DNA双元表达载体的农杆菌侵染植物细胞[14,15]。由于目标基因和选择标记基因位于不同载体或不同T-DNA上,后代中能够获得无标记转基因植株,获得频率同样比较低。如图2所示,叶兴国等研究构建了包含三段T-DNA的双元表达载体,其中的一段T-DNA区域含标记基因,另外二段T-DNA区域含目标基因,用其转化大豆后较高频率获得了无标记转基因植株[16]。

1.4 一种通用高效的复杂载体构建新方法

传统的载体构建方法在构建多片段拼接的复杂载体时,往往操作步骤繁琐,通常要构建多个中间载体,这里以陆云华等[17]构建质体定点表达载体pRSMGA为例,介绍一种通用高效的复杂载体构建新方法,它属于多片段拼接的水稻单交换表达载体,是一种简便、通用、高效的复杂载体构建方法。此法在引物设计时,在目的片段5’端加上随机设计的接头,利用PCR克隆目的片段,再用T4 DNA聚合酶3’-5’外切酶活性处理PCR克隆目的片段,产生多个首尾相匹配的粘性末端,进行多片段定向连接、转化、重组子鉴定。七个片段拼接的表达载体pRSMGA的构建,只需做两次连接转化就可以完成,且其重组转化效率高。陆云华等已经用这种方法构建了几十个载体,证明这是一种简便、通用、高效的复杂构建载体的方法。具体见图3。

1.5 一步克隆法

欧阳平等[18]以四片段拼接的水稻单交换质体载体pSMGA(pBluescript Ⅱ SK(+)-man-gfp-aadA) 的构建为例(图4),介绍了一种通用、高效的载体构建的方法,简称一步克隆法。它适合构建大小为6kb以下的载体。

此新方法是在PCR引物设计时,相连片段设计15bp的同源序列,PCR克隆目的片段后,产生多个首尾具同源末端的片段,然后进行多片段定向连接、转化和重组子鉴定。四个片段拼接的质体载体pSMGA,应用此法构建仅需做一次连接、转化即可。该方法设计操作相对简便,无需中间载体的构建,减少连接和转化次数。作者利用该法构建了多个载体,证明这是一种简便、通用、高效并值得推广的构建小载体的方法。

2 结语

本文简要介绍了目前已经成熟的几种载体构建技术的原理、特点和应用,并对几种载体构建方法做了一个综合评价,表1中比较了5种不同载体构建方法的特点。指出了这些方法的应用领域和潜力,其中尤其以Gateway技术和一步克隆法最具代表性,是目前载体构建的主流手段,而今后的发展趋势是多种方法与Gateway技术结合起来的共同应用[19,20]。随着植物基因工程技术的不断更新,转基因植物载体构建将朝着设计操作简便、安全、通用、高效、经济的方向发展。已经有报道证明,目前能够实现两个片段的无酶连接[21],而实现多片段

无酶连接则是今后载体构建中最理想的一种思路和方法。

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