纳米基因载体（精选7篇）
纳米基因载体 篇1
世界卫生组织发表的一项研究报告表明,全球癌症状况将日益严重,今后20年新患者人数将由目前的每年1000万增加到1500万,因癌症而死亡的人数也将由每年600万增至1000万,癌症已成为第一位致死疾病,因此攻克治疗癌症是目前科学研究者们的主要目标之一。
随着医药和纳米技术的发展,人类基因组研究已经从结构遗传学进入了功能遗传学研究,使基因治疗癌症成为可能。基因治疗是将外源目的基因通过载体或其它途径导入体内并在靶组织和靶细胞中显示出相应生物学效应而达到治疗疾病的一种方法。基因治疗的关键是获得高效、安全的基因转运载体。基因载体主要分为病毒型载体和非病毒型载体两种。目前,有近80%的一期临床实验仍采用病毒型载体[1]。病毒载体最大的优点是转染率高,一般可达90%以上,但其制备复杂,且存在一些关键的安全性问题,如内在毒性、短期或长期潜在的危险性(如对宿主的免疫原性及导致插入基因融合而激活癌基因[2]),而且其免疫原性和致瘤性迄今仍未彻底解决,这些缺点使病毒型载体的临床应用受到很大限制。非病毒型载体具有无免疫原性和致瘤性、无毒或极低毒性、运载量限制小、制备简易、易与DNA结合、不受DNA片段大小的限制、通过靶向修饰可以转运DNA到靶细胞等优点,很大程度上弥补了病毒型载体的缺陷,使基因治疗应用于临床成为可能。
目前已报道的非病毒型载体有裸DNA、脂质体、高分子多聚物、纳米载体等,其中裸DNA的操作复杂、转染率低以及存在对细胞的潜在损伤等限制应用的诸多因素。近年来有关脂质体的应用报道很多,但脂质体也存在稳定性差、难以保存、基因不能稳定长效表达、转染时需去除血清、阳离子脂质体的细胞毒性等问题。随着纳米生物技术的发展,应用纳米载体作药物及基因载体成为研究热点[3]。
1 无机纳米载体特性
无机纳米载体一般是指粒径为纳米量级(1~100nm)的无机微粒。随着载体粒径的减小,其比表面积增大,表面能也迅速增加,产生大量悬键和不饱和键,从而出现许多化学活性点。这些活性点易与有机物或基因发生相互作用,从而达到负载作用。而且,无机纳米载体易稳定分散、制备和贮存方便、装载量大,能穿过组织间隙并被细胞吸收,可通过人体最小的毛细血管和血脑屏障,且无免疫原性和致瘤性,低毒或无毒,这些特性使其在药物和基因输送方面具有许多优越性。
2 无机纳米载体负载与转染基因机制
无机纳米载体负载基因的方式主要是通过物理、化学等相互作用吸附或接枝上DNA或基因而成载体-DNA复合物。Parker A L等[4]研究发现,纳米载体-DNA复合物呈某些规则的形状,DNA的一级结构保持不变,二、三级结构发生了变化。而且不同形貌的纳米载体负载基因的形式不同,对于球状微粒,DNA或基因负载在其表面(如氧化铁,量子点等);对于多孔微粒,DNA或基因负载在其孔内;对于层状微粒,DNA或基因负载在其层内。负载有DNA或基因的无机纳米粒子穿过细胞膜,再到细胞核,将DNA或基因转运到生物体细胞中进行表达,目的基因的表达标志转染的成功。其具体转染过程如下:首先,负载有DNA或基因的载体进入细胞内并被释放,在该过程中,如果DNA不能及时从内涵体中逸出,就会被溶酶体酶降解(溶酶体中的pH值低于5)。此外,当DNA等被释放到细胞质中后,同样会有一些特定的酶(核酶等)降解DNA。其中载体-DNA复合物的入胞机制仍然不明确,主要存在内吞入胞、非内吞路径及直接穿入细胞膜等可能途径,但大多数学者更倾向于内吞入胞的机制[5]。其次,DNA等导入细胞核并表达。一般来说,分子都是通过核孔复合物进入细胞核。核孔复合物是一个插入到双层核膜中的蛋白质大分子,允许约9nm的溶质自由通过。生物大分子或纳米粒子要通过核孔则需要信号介导的转运分子:这些分子或纳米粒子必须携带核定位序列才能与转入子a结合,形成的复合物再触发结合转入子b,在GTP酶——Ran的协助下通过核孔复合物进入细胞核。尽管对核定位进行了大量研究,但仍无法确定DNA进入细胞核的途径。例如,人们对于DNA是单独进入细胞核还是与纳米粒子整合后一起进入细胞核仍无定论。尽管如此,人们主要倾向于两种主要理论:一种是纳米粒子在内涵体或细胞质中被溶解,然后释放DNA转运进核;另一种是携带DNA的纳米粒子直接到达细胞核表面,然后DNA转运进核。
载体DNA复合物被哺乳动物的细胞摄取的过程中大致要克服5个主要障碍[6]:pDNA的酶稳定性、载体DNA的入胞、DNA从内含体的释放、DNA在胞核的定位、目的基因的表达。多种研究报道表明,影响纳米载体转染效率的因素有:不同载体的类型、载体的组成、粒径大小、表面电荷、热力学性质、转染细胞类型、N/P比值、体外物理环境的干预(热、电、磁、超声等)等。
3 无机纳米载体
近几年来无机纳米基因载体已经成为研究负载药物与基因载体的热点。已经报道了多种载体,主要有二氧化硅、磷酸钙、碳纳米管、氧化铁、量子点和层状双氢氧化合物等。
与有机纳米载体相比,无机纳米粒子具有许多显著的优点:纳米粒子能包裹、浓缩、保护核苷酸,使其免遭核酸酶的降解;具有生物亲和性,易在表面偶联特异性的靶向分子;能使核苷酸缓慢释放,提高转染效率和转染产物的生物利用度;代谢产物少,副作用小,无免疫排斥反应等。
3.1 二氧化硅
二氧化硅纳米颗粒具有分散单一性和悬浮稳定性。超纯的二氧化硅纳米颗粒表面经阳离子氨基修饰后,不仅可以保护质粒DNA免于酶解,而且可转导细胞并表达相关蛋白质,与未加修饰的二氧化硅纳米颗粒相比,修饰后的二氧化硅纳米颗粒可以克服输送DNA过程中的诸多限制[7],如经亲水、疏水性修饰后形成的核-壳类胶束可以装载亲水或疏水药物或染料;修饰成分的基团可行再修饰以增加其靶向性;在离心、蒸发等操作中及有机溶液中不易被破坏;可经Si-C键的破坏而降解。Chen等[8]制备了粒径为10~100nm的硅纳米颗粒并用其转导HT1080细胞,结果显示其转导效率为70%,并且可以有效保护DNA不被降解,同时未见细胞毒性作用;另外通过研究SNAP在体内的分布表明SNAP可以通过血脑屏障、血前列腺屏障、血睾丸屏障。Li等[9]利用PLL对硅纳米粒进行化学修饰合成了PMS-NP。PMS-NP是一种可以经口服途径介导的基因治疗的新型载体,在胃小肠的黏液细胞中可观察到病毒基因的表达。Jiaofeng Peng等[10]制得有负载反义寡核苷酸(Antisense oligonucleotides)的氨基化二氧化硅纳米颗粒(Amino silica nanoparticles),其平均粒径为25nm,能保护反义寡核苷酸不被核酸酶分解,体外实验还表明,氨基化二氧化硅纳米颗粒可提高反义寡核苷酸的转染率,阻止癌细胞的分化与增殖,并具有很好的生物相容性和无毒性。上述研究结果表明硅纳米颗粒是基因治疗及药物输送等领域的一个很有潜力的载体。
Mobil首先合成了具有高表面积、高孔容量和可控孔径(2~30nm)的多孔二氧化硅颗粒(Mesoporous silica particle),此研究一经报道就引起了大量研究人员的注意,并将其作为催化剂、吸咐剂和主体材料等加以应用。近年来,随着方法与技术的进步,更多的多孔二氧化硅纳米颗粒被合成出来,经修饰后植入高分子、蛋白质、DNA等而用作基因载体。Fei Qin等[11]采用溶胶-凝胶法合成出高分散性、粒径为50~250nm的多孔二氧化硅纳米颗粒(Mesoporous silica nanospheres),经阳离子多聚物修饰后,通过静电作用吸附DNA分子,使DNA分子装入多孔二氧化硅的孔中,成功地实现了多孔二氧化硅负载DNA在细胞间的转运。另外,对于孔径较小的二氧化硅纳米颗粒,可用溶胀剂使其孔径胀大,从而实现植入DNA分子等。Mamoru Mizutani等[12]用溶胀掺入法制备出一种单分散多孔二氧化硅球,由于溶胀剂的掺入,多孔二氧化硅中的孔径由2.5nm变为5.0nm;溶胀后的二氧化硅再与Fe(NO3)3·9H2O和H2PtCl6·6H2O反应制得含有Fe与Pt的二氧化硅。该颗粒具有磁性和中间多孔结构,可植入量子点、酶、药物和DNA分子。Brian G.Trewyn等[13]合成了球形与管状的多孔二氧化硅纳米材料,通过转染癌细胞与非癌细胞的实验表明,其被细胞内吞作用吸收的效率不仅与其形态(聚集程度、粒径等)有关,还与细胞类型有关。多孔二氧化硅具有很好的生物相容性和高吸附量,是一种理想的基因载体,但现在还处在制备颗粒与负载分子阶段,对其吸附量、释放效果和机理还未有研究。
3.2 磷酸钙
微米尺寸及纳米尺寸的磷酸钙粒子已被成功制备并用于载体系统及DNA疫苗的佐剂,以DNA双螺旋形成离子混合物,后者易通过细胞膜并被内含体介导通过离子通道入胞。磷酸钙进行体外转导已作为实验室研究的常规应用,但因磷酸钙易集聚的特点限制了其体内转导的应用。Bisht等[14]首次报道了应用磷酸钙纳米粒介导pGFP转染Hela细胞,结果发现其转导效率高于商品化转导剂PolyFect,表明磷酸钙纳米粒可以作为基因治疗中一种有效的非病毒型载体,但临床应用还存在一定的转染技术问题。Hamid等[15]用胰岛素分解软骨细胞,再将细胞分散在磷酸钙/核酸沉淀中,又将软骨细胞粘附在一起放置24h,从而使软骨细胞的转染率达到了80%。此方法还可应用于其他细胞基因治疗。Claudio等[16]优化吸附有DNA的磷酸钙纳米颗粒转染成骨细胞的实验,得出了影响其转染细胞的两个关键性因素,即Ca2+与Cl-的浓度与纳米颗粒的粒径。Ruchi Singh等[17]通过反相微乳液法合成了包裹pDNA的磷酸钙颗粒,通过凝胶电泳实验表明,包裹pDNA的磷酸钙没有被降解,且HEK-239细胞和肝细胞的体外转染与体内管内转运实验都表明,磷酸钙颗粒具有延长基因表达的重要作用,而且文章还指出,在临床应用上,包裹少量pDNA的磷酸钙具有更高的转染效率。Thomas等[18]成功地合成了包裹有机染料Cy3和药物神经酰胺的磷酸钙颗粒,其粒径为20~30nm。通过对有机染料Cy3发出荧光的检测,可反映出包裹药物的转染效率和纳米颗粒的在体内的吸收机制,并在体外将神经酰胺成功导入人体血管的平滑肌细胞,表明磷酸钙纳米颗粒可有效地用作染料与药物的运载,实现生物成像与潜在的干预治疗。另外,羟基磷灰石(Hydroxyapatite,HA)作为一种稳定的磷酸钙盐,由美国牙科医生Brown和Chow于1987年首先发现,是临床上最常用的骨修复材料,其粒径减小到纳米尺度时,可作为基因治疗或药物缓释系统的载体。Liu等[19]使用不同浓度的HA溶液静脉注入白兔体内观察其毒性反应及对兔血液中电解质、酶的影响,结果显示纳米羟基磷灰石没有累积毒性,对电解质浓度影响较小。另外经小鼠静脉注射HA纳米粒后发现在脑、肝、脾、肺、肾、胃、肠、前列腺、睾丸等器官均有纳米颗粒分布[20]。朱晒红等[21]通过电沉积-水热合成法制备了40nm左右的HA混悬液,用其与增强型绿色荧光蛋白基因结合体外转导SGC7901细胞,结果发现HA有良好的生物相容性,72h后转导效率为脂质体转导效率的80%,转染效率约为50%左右,充分证明了HA作为基因载体的可行性。孙虹等[22]采用HA纳米颗粒经体内、体外试验,成功地将神经营养素3和绿色荧光蛋白基因转导入内耳细胞并产生广泛表达,对Hela细胞的体外转导率约为15%。与硅纳米颗粒等相比,以上研究均证实HA与生物膜的良好相容性且可以与DNA结合并转运其通过细胞膜实现表达,但转染效率有待提高。HA纳米颗粒的最大优势在于其具有更好的生物相容性、强大的核酸吸附能力以及可以根据需要制备成相应口径、尺寸、三维结构等要求的载体材料。进一步探讨其转导机理、毒理及制备工艺以提高其转导率是促使HA纳米粒应用于基因治疗的关键之一。
3.3 碳纳米管
碳纳米管(Carbon nanotube,CNT)具有典型的层状中空结构特征,其管身部分由六边形碳环微结构单元组成,端帽是由含五边形的碳环组成的多边形结构。CNT按照结构与维数可分为单壁碳纳米管(Single-walled carbon nanotube,SWNT)和多壁碳纳米管(Multi-walled carbon nanotube,MWNT)。CNT具有许多优良的性质,如高导电性、高导热性、高强度和高韧性,已经被用在场致发射材料、储能材料、分子电子学和原子力电子显微镜等方面[23,24]。
近几年来,CNT又被应用于生物医学领域,Alberto Bianco等[25]报道了新型被修饰载体CNT可用于作氨基酸与多肽、抗原、药物与基因等的载体。Yanrong Wu等[26]成功地合成了一种负载有单链DNA探针的SWNT(DNA探针也进一步被高分子所修饰),它在细胞中有很好的生物稳定性。与没有修饰的相比,这种被DNA探针修饰的SWNT具有更高的自我运载能力与生物稳定性,因此,还可利用DNA探针来监测细胞内处于分子或离子水平的状态。Mingwu Shen等[27]将强酸处理的MWNT用聚乙烯亚胺(PEI)修饰,用乙酸酐和丁二酸酐与MWNT表面上PEI的胺基反应,分别得到表面不带电和带负电的MWNT;在体外将其导入FRO细胞(一种甲状腺癌细胞系)和KB细胞(表皮癌细胞系)都表明其生物相容性与其表面电荷有关,表面呈中性与带负电的MWNT在质量浓度达到100μg/mL时是无毒性的,而表面带正电的MWNT在质量浓度达到10μg/mL时就具有了毒性。Bifeng Pan等[28]用树状聚酰胺(PAMAM)修饰MWNT(dMWNT),再接上反义寡核苷酸(asODN),导入人体乳腺癌细胞系MCF-7细胞与MDA-MB-435细胞,肝癌细胞系HepG2细胞,与表面修饰有胺基的MWNT相比,第五代PAMAM修饰的MWNT-asODN具有最大的转染率,表明dMWNT有助于解决现在反义治疗中的难题,在基因和药物运载方面有很好的发展前景。由上所述,所有用作基因载体的CNT都经过了功能化与修饰,原因是未修饰的CNT不能溶于体液而具有毒性,而修饰后的CNT则具有良好的生物相容性并且无毒。所以,通过进一步研究CNT的功能化与修饰,可使CNT成为一种新型的具有潜力的非病毒型载体。
3.4 氧化铁
氧化铁包括三氧化二铁(γ-Fe2O3)和四氧化三铁(Fe3O4),由于具有磁性,在外加磁场的作用下可实现靶向性。为了增大其生物相容性,在Fe3O4表面修饰壳聚糖[29]、多聚赖氨酸[30]等可以改善其性能。应用外加磁场靶向导入是一种有效的体内外转导方法,不仅提高了转导效率,而且载体用量减少,明显减轻了毒性反应,降低了费用,转导时间也大大缩短,这种新型纳米载体有极大的应用前景。
氧化铁纳米载体经表面化学修饰后,可用于核磁共振成像、组织修复、免疫测定、细胞分离、药物运载和温热治疗等。为了更好地应用磁性纳米颗粒作为基因载体,必须解决好两个问题,一是负载物释放快速的问题,二是负载物被分解的问题。Mahmoudi等[31]为了解决这两个问题,合成了一种交错包覆聚乙二醇与富马酸氯酯共聚物(Poly(ethylene glycol)-co-fumarate,PGEF)的氧化铁纳米颗粒,与没有交错包覆的相比,这种颗粒能减慢药物,释放达21%,其生物相容性也大大超过其他聚合物修饰的颗粒。Kazumasa Kamei等[32]将腺病毒(Adenovirus,Ad)嫁接在金/氧化铁磁性纳米颗粒(Gold/iron-oxide MAgnetic nanoparticles,G/IO-MNP)上形成Ad-G/IO-MNP的运载系统,并将该系统转染小老鼠黑色素瘤细胞(B16BL6);与单独植入Ad相比,Ad-GoldMAN系统在磁场的作用下,其基因表达效率是前者的1000倍。Alke Petri-Fink等[33]分别用聚乙烯醇(PVA)、乙烯醇/聚乙烯醇(VA/PVA)、聚乙烯亚胺(PEI)来修饰超顺磁性氧化铁纳米颗粒(Superparamagnetic iron oxide nanoparticles,SPI-ONP)。这些系统在水与磷酸盐缓冲液中都是稳定胶体溶液,与同样浓度的VA/PVA相比,A/PVA-SPIONs具有更低的毒性;而与PEI和PEI-SPIONP相比,负载有DNA的PEI-SPIONs系统在转染实验中表现出无毒性。Kristi L Hultman等[34]报道了一种目标免疫超顺磁性氧化铁颗粒(Immunotargeted superparamagnetic iron oxide nanoparticles,ITSIONP)。ITSIONP能应用于磁共振诊断与作为潜在治疗肾脏疾病的基因载体;ITSIONP是以单分散的氧化铁作为核心,再用磷脂修饰其表面,使其具有靶向细胞表达来抗原的功能。Kievit等[35]报道了一种修饰有壳聚糠(Chitosan,CP)和PEI的SPIONP(CP-PEI-SPIONP),其是具有高效基因运载与高转染率的基因载体,由转染小鼠C6神经胶质瘤细胞(C6 rat glioma cells)实验显示,PEI-SPIONP具有的最高转染率为90%,但细胞生存率仅为10%,而CP-PEI-SPIONs也达到了50%,且细胞的生存率近100%。虽然CP-SPIONP转染率不到10%,但细胞生存率达到了100%,说明PEI-SPIONP有一定毒性,修饰上CP的CP-PEI-SPIONP就没有毒性了。Xiangyang Shi等[36]报道了用树状聚胺酯(PAMAM)3代修饰SPIONP,再在PAMAM上接上叶酸分子(FA),在体外将其导入KB细胞,尽管带负电荷的颗粒与表面带负电荷的细胞存在斥力,但FA-PAMAM-SPIONP还是可以被KB细胞吸收。上述研究表明,修饰后的氧化铁颗粒有良好的生物相容性、低毒、转染效率高和靶向性强。此种载体的独特性是可在外加磁场的作用下达到靶向释控作用,这是其他载体无法比拟的。
3.5 量子点
量子点(Quantum dots,QDs)是一种粒径为几个纳米的微小粒子,由Ⅱ-Ⅵ或Ⅲ-Ⅴ半导体组成,如CdSe、ZnSe、GaAs、InAs等。20世纪70年代末QDs就引起了物理学家、电子工程学家和化学家的注意,但直到20世纪90年代后期,随着QDs制备技术的不断提高,QDs才在生物、医学研究中展现出极大的应用前景。Timothy等[37]总结QDs在生物医学领域主要有如下7方面的应用:荧光能量共振转移、基因工程、荧光标记细胞蛋白、检测病原体与毒素、动物体内成像、体内载体和肿瘤生物学研究等。
Ⅱ-Ⅵ和Ⅲ-Ⅴ半导体QDs(如CdSe、CdTe)存在其固有的毒性,而且Bharali DJ等[38]指出由于Ⅲ-Ⅴ半导体QDs以共价键结合,比Ⅱ-Ⅵ半导体QDs以离子键结合具有更低的毒性。QDs具有毒性的原因可能有两个:表面阳离子的存在(如Cd2+)和光自由基的形成。近3~4年来的研究表明,表面修饰能降低QDs的毒性,甚至报道还有完全无毒性,使得QDs也可用作基因载体。Akiyoshi Hoshino等[39]用ZnS涂层CdSe的QDs作为基因载体,其表面经过多重修饰后,再接上优化绿色荧光蛋白(eGFP)的核定位序列,并导入哺乳动物细胞,成功地实现了表达,转染率为8%左右。Lifeng Qi等[40]将Amphipol与QDs结合,产生了一种新的基因运载系统,其效果在无血清与完全细胞培养基中优于脂质体,且比聚乙烯亚胺(PEI)在基因沉默实验中具有更低的毒性。由于QDs固有发射荧光和优良光学属性,使得此运载系统广泛应用于SiRNA运载与体内体外成像。Cornelia Walther等[41]发现QDs表面经过修饰处理后,与多肽形成运载系统,在生物细胞中能稳定存在且没有毒性;并指出该系统能很好地运载RNA进入细胞。Li hua等[42]合成了CdS量子点,并用PEI修饰,在PEI/QDs数目比为200时,其粒径为24nm,Zeta电位为+15mV,并且表现出最大的转染效率(是PEI/QDs的数目比(20)的17倍),但少量降低了线粒体约30%的活性。现阶段对QDs的研究表明其转染率低,且具有一定毒性,但其固有发射荧光的优良光学属性,使QDs作为基因载体有很大的发展前景。
3.6 层状双氢氧化合物
层状双氢氧化合物(Layer double hydroxide,LDH)是带有正电荷的纳米两维结构的化合物,含有两种不同的金属阳离子,其结构通式为[M1-2+xMx3+(OH)2]x+(An-)x/nmH2O[43]。近年来的研究表明,由于LDH具有高生物相容性、高药物负载性、低毒性和可控形貌与粒径等,是潜在的高效非病毒载体[44]。Zhi Ping Xu等[45]通过控制其水热条件(时间、温度、浓度等),制得了粒径为40~300nm的LDH纳米颗粒,可用于细胞的药物和基因运载。Le′a Desigaux等[46]合成了一种LDH/DNA的杂交化合物,其中DNA分子作为模板,引导LDH的自组装沉积,处在LDH的中间夹层,其厚度为1.96nm,可被宫颈癌代传细胞(Hela cell)吸收,通过调节酸度,可控制DNA分子的释放。Zhi Ping Xu等[44]合成了两种不同形貌的Mg2Al-LDH,一种是典型六边形状(边长为50~150nm,厚为10~20nm),另一种是典型的杆棒状(宽为30~60nm,长为100~200nm),通过转染哺乳动物细胞发现,杆棒状的LDH能转移到细胞核中,而六边形的则仍保留在细胞质中,说明不同形貌的载体其运输效率也有差别。LDH作为纳米基因载体研究较少,但其对DNA分子等的吸附、低毒性及对药物释放的控制等优良性质,必将使得LDH成为一种潜在的基因载体。
4 结语
目前,对无机纳米粒子作为基因载体的研究,多在可控合成纳米粒子、表面修饰和体外与体内试验时期,还没有达到临床应用阶段。上述二氧化硅、磷酸钙、碳纳米管、氧化铁、量子点和层状双氢氧化合物等无机纳米基因载体的共性是生物相容性好、低毒甚至无毒、易制备且成体低,但转染率较低。多孔二氧化硅具有优良吸附性,但其尚处在制备颗粒与负载分子阶段,吸附量、释放效果与机理尚未涉及;磷酸钙及羟基磷灰石具有极好的生物相容性,且常可达到过细胞膜后进行表达;经修饰过后的氧化铁具有无毒性、靶向释控性,且能在小动物体内达到一定的转染率;量子点的独特光学性质,使其有利于体内外成像,便于机理研究;碳纳米管和层状双氢氧化合物具有较高的药物和基因运载能力,但其对基因的转染率提高有待进一步研究。前期的研究表明了纳米载体用于基因治疗的可行性,尤其是通过改变纳米载体的物理、化学、生物等性质来调节其作为基因载体的转运功能,使其转导效率有了很大提高。尽管纳米载体的转导效率仍没有达到令人满意的转染效果,有必要对其毒理、转导机制及长期的安全性评估进行深一步的研究。相信随着纳米生物技术、材料医学、生物医学等学科的飞速发展,一种安全、高效、智能化的纳米载体终将出现,一旦其转导水平达到临床应用水平,必将造福于无数基因治疗患者。
摘要：介绍了无机纳米基因载体的特性及其负载与转染机理,主要综述了二氧化硅、磷酸钙、碳纳米管、氧化铁、量子点和层状双氢氧化合物等的研究进展,分析了其研究现状,并提出了进一步的研究方向及发展趋势。
关键词：基因治疗,基因载体,无机纳米颗粒
纳米基因载体 篇2
1 材料与方法
1.1 试验试剂、仪器及用品
氯化钙、磷酸氢二钠、柠檬酸钠,购自成都科龙化学试剂厂;DMEM培养基,购自Gibvo公司;质粒基因、Pc DNA3.1-GFP质粒、HEK 293细胞,均由四川大学华西医学院生物治疗国家重点实验室保存。
磁力搅拌器,购自河南郑州南北仪器设备有限公司;粒度仪,购自英国马尔文公司;荧光倒置显微镜,购自ZEISS公司。以上仪器均由四川大学华西医学院生物治疗国家重点试验室提供。
1.2 试验设计
1.2.1 磷酸钙纳米颗粒的制备
10μg质粒与150μLCa Cl2溶液混匀,静置5 min,放在磁力搅拌器上搅拌,逐滴加入150μL Na2HPO4溶液,用柠檬酸铵调节p H值至7.2。根据搅拌时间分为1,2,3,4 h组。
1.2.2 纳米颗粒粒径和稳定性检测
1)粒径检测:使用粒度仪检测制备完成的纳米颗粒粒径大小;2)稳定性检测:将制备好的纳米颗粒于4℃过夜,观察溶液变化。粒径和稳定性检测试验重复3次,观察差异。
1.2.3 电泳试验对比上清液与沉淀纳米颗粒含量
取搅拌时间1 h组100μL溶液,800 g离心5 min,分别取上清液和沉淀,进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.4电泳试验对比不同搅拌时间组纳米颗粒含量
分别取搅拌时间为1,2,3,4 h组各100μL溶液,800 g离心5 min,取各组沉淀进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.5 荧光标记法检测纳米颗粒转染细胞量
取10μg Pc DNA3.1-GFP质粒制备磷酸钙载体,在磁力搅拌器上搅拌3 h。取HEK 293细胞,在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养,待细胞长至铺满培养皿面积约70%时铺于24孔板中,每孔细胞数为2×104个。将包裹完成的纳米颗粒按照每孔2μg质粒DNA的量加入到细胞中,同时加500μL全培养基;对照组每孔加入2μg没有包裹纳米颗粒的裸露Pc DNA3.1-GFP质粒,与试验组在相同试验条件下培养;转染12 h后更换培养基;转染48 h后,用荧光倒置显微镜检测两组细胞转染效率。
2 结果与分析
2.1 纳米颗粒的粒径及稳定性
见表1。
nm
磷酸钙纳米颗粒制备完成后,用纳米粒度仪检测纳米颗粒粒径,结果所有时间组磷酸钙纳米颗粒粒径均小于600 nm,属于易被细胞内吞范畴。1 h组制备的磷酸钙纳米颗粒粒径最小,为343.1 nm;3 h组制备的磷酸钙纳米颗粒粒径最大,超过2 h组和4 h组。说明在一定时间内磷酸钙纳米颗粒粒径大小与搅拌时间呈非线性关系。置于4℃过夜,溶液仍保持均匀透明,无颗粒生成,证明该纳米颗粒稳定性好。试验重复3次,结果一致。
2.2 电泳试验对比上清液与沉淀纳米颗粒含量结果
见图1。
A.1 h组沉淀;B.1 h组上清液。
由图1可知,纳米颗粒在沉淀中大量存在,而在上清液中没有发现纳米颗粒。
2.3 电泳试验对比不同时间组纳米颗粒含量结果
见图2。
A~D.1,2,3,4 h组沉淀。
由图2可知,各组沉淀都有大量质粒基因,1 h组载体包裹质粒基因最多、包封率最高。
2.4 荧光标记法检测纳米颗粒转染细胞结果对比
见图3。
将搅拌1 h制备好的纳米颗粒转染HEK 293细胞,48 h后在荧光显微镜下检测转染效率,每组细胞镜下随机选取5个视野,统计每个视野的转染效率。由图3可以看出,磷酸钙纳米颗粒包裹的荧光质粒Pc DNA3.1-GFP转染细胞的转染率约为20%;裸露的荧光质粒转染细胞,荧光显微镜下观测到微弱荧光,转染效率约为0.4%。
A.纳米颗粒包裹Pc DNA3.1-GFP转染;B.裸露的Pc DNA3.1-GFP转染。
3 讨论
基因转染技术已成为了解基因功能和调控机制、建立疾病模型、获得基因水平的免疫,进而探索当前无法治愈的各种先天遗传性疾病或后天获得性疾病(如癌症、糖尿病、血友病等)的基因治疗方法的途径。裸DNA分子由于尺寸较大,易被核酸酶降解,又因含有阴离子磷酸基团而具有的亲水性等原因,直接转染进入细胞,稳定性和转染效率均不高[3],人们一般用载体介导基因进入靶细胞。
在基因载体中,由于病毒带有感染特定细胞的特性,因此病毒载体的转染效率最高[4]。虽然为了保证安全性,几乎所有介导基因进入靶细胞的病毒都会被删除某些致病基因,导致其具有选择复制缺陷,比如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒和单纯疱疹病毒[5];但这些病毒载体仍然具有比较强的免疫原性。复制缺陷型病毒复制产生的病毒蛋白可引起机体的免疫反应,使靶细胞受损、减少,导致目的基因表达的持续时间减少[6]。这些病毒的残留基因片段还会引起插入突变[7]。此外,病毒载体还有较低的外源基因携带量、致癌性等缺点[8]。
病毒载体具有的诸多难以修正的缺陷,迫使人们开始更多地关注非病毒载体。在非病毒载体中,磷酸钙粒子对比难以制备的金属粒子或金属复合物和仍受限于安全问题的碳纳米管,具有巨大的优势,如低成本、多功能性、应用广泛性、潜能巨大的装载基因量、可控的基因释放等。而且,磷酸钙遍布身体各处,如骨骼和牙齿,所以磷酸钙载体具有极好的生物相容性和生物可降解性,体内的磷酸钙浓度甚至可以由肾脏调控[9]。
本试验通过电泳及荧光标记法找出最优的磷酸钙纳米基因载体制备条件,为以后基因转染试验中制备磷酸钙纳米基载体的制备条件提供及另一种选择。
但是如果只是优化制备条件的话,磷酸钙基因载体的一些不足之处仍难以改变。许多研究人员在优化制备条件之外,还使用各种方法改造磷酸钙纳米颗粒,使其稳定性增强,粒子粒径减小,转染效率提高。Y.Liu等[10]利用改进过的硫酸鱼精蛋白修饰磷酸钙纳米颗粒,结果稳定性增强,可以抑制其粒径增长。研究发现,钙磷比在100~300之间、纳米粒径在25~50 nm之间时,纳米载体在宫颈癌细胞和小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1中转染效率最高。S.Bisht等[11]和I.Roy等[12]在反相微乳液环境中制备磷酸钙纳米粒子,得到100~120 nm粒径的颗粒。这些磷酸钙纳米颗粒的体外转染效果高于商用的阳离子脂质体。X.Yang等[13]使用磷酸钙纳米颗粒作为基因载体,诱导鼠牙髓干细胞中骨成形素蛋白2的转染,结果转染效率很高。
在接下来的后续试验中,将对磷酸钙纳米基因载体进行更加深入的研究,不仅优化条件,还要对其附加一定的修饰改造。相信随着研究的深入,它终将成为理想的基因治疗载体而获得持续发展。
摘要：为了优化磷酸钙纳米基因载体制备条件,提高磷酸钙纳米载体的转染效率,试验采用普通磷酸钙纳米基因载体制备方法,根据搅拌时间(1,2,3,4 h)分为4组,通过电泳测定上清液和沉淀中载体含量和纳米颗粒含量,最后使用荧光标记法检测磷酸钙纳米基因载体转染效率。结果表明:纳米颗粒在沉淀中大量存在,而在上清液中没有发现纳米颗粒;搅拌1 h制备的纳米颗粒粒径最小,且沉淀中拥有最多的纳米颗粒含量,使用此组载体转染细胞效率为20%。说明搅拌1 h为磷酸钙纳米基因载体的最佳制备条件。
纳米基因载体 篇3
1 资料与方法
1.1 一般资料
用于治疗的聚合物纳米体系主要包括理性设计的聚合物药物、聚合物-蛋白质偶连体、聚合物-药物偶连体、连接药物的聚合物胶束以及聚合物-基因复合物等类型, 以聚合物为基础的治疗药物的粒径大多在几纳米与几百纳米之间。
1.2 方法
纳米控释系统是一种有前途的控释系统, 我们对它的研究越来越深入和透彻, 当然控释系统的医学用途也越来越广泛。近年来纳米控释使得我们在肿瘤组织和肿瘤细胞两个水平有了显著的提高。除此之外, 研究者们对近年来纳米控释系统在肿瘤治疗等方面的应用研究有了进一步的发展与提高。只要传统的纳米粒子进入人体的血液之中, 马上就会受到某些固定的单核吞噬细胞系统各器官中的巨噬细胞的迅速的调理反应, 这个速度是超级快的, 还没等到我们反应过来, 该调节作用已经完毕, 这样的结果就是大部分的传统的纳米粒子将巨噬细胞扫荡一空。当研究者们运用传统纳米粒子的这一特性进行运载抗肿瘤药物进行治疗这一工作时, 单核的吞噬细胞系统的以上特性将毋庸置疑地可以帮助使得抗肿瘤药物对位于单核吞噬细胞系统的肿瘤化疗效果明显得到提高。众所周知的是纳米粒子并不会迅速地被毛细血管壁所吸收然后进入血液循环之中, 而是渗透进入到注射部位周围的细胞间隙, 并渐渐地被毛细淋巴管吸收然后进入淋巴系统中。
然而为了更好地了解聚合物纳米体系在药物和基因载体中的应用, 我们还需要探讨两亲多糖纳米胶束作为药物的缓释载体的制备和释药研究, 医用纳米控释系统在治疗肿瘤方面的应用, 基因治疗在医学上的贡献等等。
探讨两亲多糖纳米胶束在药物缓释方面的应用, 使用动态光散射仪来观察两亲多糖纳米胶束的有效粒径的微小变化, 并且利用体外药物释放实验来考察研究它对不同水溶性药物的缓释作用效果。多糖材料具有可生物降解和生物相容性好等庞大的无可比拟的优势, 可有效避免或者降低纳米载体潜在的毒性的有效作用, 在相关实验中我们把源自天然的可生物降解的葡聚糖作为最优原料。纳米微粒在传递与控制释放系统的载体内降解较为缓慢或难以降解, 这一观点已经受到了人们的关注且在医学上做出了很大的贡献。纳米材料的这种特种材料的生物安全性是近年来备受关注的研究领域, 我们必须清楚地认识到良好的生物相容性是纳米材料运用于医药领域之中的首要条件。通过相关的试验来达到初步了解载药纳米胶束对不同水溶性药物的缓释规律的目的。使用溴化钾压片法进行制样的工作, 采用红外光谱法分别测定多个批样, 使用紫外分光光度计来完成测定胶束的透析液在EZQ 45波长处的吸光度并且还需要根据G, +DE溶液的标准曲线计算透析液中G, +DE的含量。求得它的胶束的药物在药物总量中所占的比重。
基因治疗正成为当今医学研究领域的热门课题, 随着当今多种纳米材料的涌现和近几年纳米生物技术的发展, 以纳米颗粒为基础的非病毒基因载体受到研究者的普遍推崇。基因治疗的成功除了需要特异的有效的目的基因外, 还不可缺少高效、安全和靶向的基因导入载体。
2 结果
理想的有效药物缓释制剂不仅可以减少给药次数, 而且还可保证给药间期平稳的血药浓度, 药物载体的研究有待于继续深一步的开展。因为纳米粒子被局部注射之后具有对淋巴系统的靶向特异性, 所以它可以作为针对淋巴系统原发肿瘤或转移瘤的一种化疗手段。我们不得不承认纳米控释系统在肿瘤的治疗方面将会被发扬光大, 它的生物相容性对人体无毒副作用。近几年来研究者们已开始将其与抗生素、抗肿瘤药物等结合制成药物缓释载体, 从而实现基因治疗的主动靶向性。
3 讨论
值得我们注意的是, 对生物相容性及其潜在的毒副作用的研究较少, 要达到最终的临床应用, 还需在这方面加强研究。以磁性纳米颗粒作为其靶向性和转染效率, 积极开发各种新型载体, 基因载体在基因治疗 (特别是肿瘤治疗) 中的应用是摆在我们面前亟待解决的问题。深入研究纳米载体转运机制, 提高纳米颗粒的磁性导航, 使基因转移至靶向部位, 达到定向基因治疗的目的。纳米控释系统作为一种新型的药物与基因的载体, 有着缓释、靶向、提高生物利用度等一系列的特点, 仅仅还只对一些肿瘤的动物模型有着极其好的疗效。但想要运用于人们的医疗事业中还需一些深入的研究, 这种现状是因为目前大多数的有关方面的研究还处在体外和动物体内的实验阶段, 要想成为临床常用剂型还需大量人体实验。纳米聚合物还有助于增大药物的药代动力学, 有着可以直接应用于药物治疗的潜力, 它将是未来新药的设计方向与发展趋势。
摘要：目的:探讨聚合物纳米体系在药物和基因载体中的应用。方法:含有共价结合药物的纳米聚合物在结构上更接近于一个化学体, 可以借助聚合物以共价键连接, 有利于实现定位、定时的释放, 因而在药物释放前不会对人体产生伤害。结果:对病人的损伤达到较小;多功能聚合物还可以隐蔽生物活性物质比如蛋白质多肽等, 使其具有EPR效应, 使其可以进入到带有疾病部位的血管或者是炎症组织处且不影响到正常的组织。结论:药物在带有疾病处释放, 能够减少副作用的发生。
纳米基因载体 篇4
1 材料和方法
1.1 动物和细胞
1.1.1 动物
雄性SCID小鼠,4～6周龄,体重16～21g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司(许可证编号SCXK(京)2007-0001合格证号0101498),无菌条件下饲养。
1.1.2 细胞
(1)HepG2细胞株购自中国典型培养物保藏中心(中国武汉市),用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液常规培养,用PBS重悬细胞并调细胞密度为1×107/mL。(2)HA纳米载体介导GM-CSF基因转染HepG2细胞株,参照文献[2]的方法由本实验室制备。用含12%小牛血清的RPMI-1640培养液常规培养,PBS重悬细胞并调细胞密度为1×107/mL。(3)人外周血淋巴细胞的分离[3],健康女性志愿者的静脉血由衡阳市中心血站提供。
1.2 主要试剂和仪器
Ficoll-Hypague淋巴细胞分离液购自北京鼎国生物技术有限责任公司FITC标记的鼠抗人CD3+单抗、SP试剂盒购自博士德公司,RPMI-1640培养液购自长沙瑞晶,钴60机由南华大学附属南华医院提供。
1.3 疫苗的制备[4]
将体外培养的转入GM-CSF基因的HepG2细胞和未转入GM-CSF的HepG2细胞分别给予总剂量为80Gy和40Gy的60Co照射,照射方法为20Gy每天1次,连续进行直到完成总剂量成为疫苗。辐射后的细胞株由对数生长期转变为静止期。
1.4 人HCC-PBL-SCID鼠复合模型的建立[5]
取雄性SCID鼠20只,首先每只SCID鼠给予100mg/kg的环磷酰胺腹腔注射。然后每只鼠腹腔内注射1×106个人PBL。最后每只SCID鼠背部皮下接种2×106个HepG2细胞。当皮下移植瘤长至体积约为100mm3时,将20只SCID鼠随机分成生理盐水组、60Co照射未转入GM-CSF基因的HepG2细胞组、转入GM-CSF基因的HepG2细胞组、60Co照射转入GM-CSF基因的HepG2细胞组。分别予以①将生理盐水作为空白对照。②60 Co照射的未转入GM-CSF基因的HepG2细胞悬液(1×107/mL) SCID小鼠背部皮下注射0.2mL/只。③转入GM-CSF基因的HepG2细胞悬(1×107/mL)SCID小鼠背部皮下注射0.2mL/只。④60Co照射的转入GM-CSF基因的HepG2细胞悬液(1×107/mL)背部皮下注射SCID小鼠0.2mL/只。测量SCID小鼠皮下移植瘤体积,观察SCID小鼠状态和死亡等情况。
1.5 免疫组化染色
免疫组化检测SCID鼠肿瘤组织中人CD3+T细胞[6]:取鼠皮下移植瘤组织,以常规SP免疫组化检测人CD3+T细胞。
1.6 病理形态学检查
取SCID小鼠肿瘤组织做常规病理检查。
1.7 统计学方法
各组数据以s表示,用SPSS15.0软件包建立数据库,以One Way ANOVA方式行方差分析;多组比较采用SNK方法,以P<0.05为统计学意义显著性标准。
2 结果
2.1 免疫重建后,小鼠成瘤率和6周存活率
免疫重建的SCID小鼠背部皮下接种HepG2细胞后,20只小鼠全部成瘤,成瘤率是100%;疫苗接种后,60Co照射转入GM-CSF基因的HepG2细胞组、转入GM-CSF基因的HepG2细胞组肿瘤生长明显较生理盐水组缓慢,其中转入GM-CSF基因的HepG2细胞组、60Co照射未转入GM-CSF基因的HepG2细胞组和生理盐水组有6只小鼠分别因恶病质,肿瘤转移至重要脏器死亡。其中60Co照射的转染GM-CSF基因的HepG2细胞腹腔注射的小鼠的6周存活率(100%)高于转入GM-CSF基因的HepG2细胞组(80%)和生理盐水组(60%)、单纯60 Co照射的HepG2细胞组(40%)。
2.2 HA纳米载体转GM-CSF基因制备自体肿瘤疫苗对人HCC-PBL-SCID鼠复合模型的皮下移植瘤生长的影响
60Co照射的转入GM-CSF基因组的瘤体积与其他三组存在差异,对瘤体积分别进行不同治疗的多组比较,结果显示,按a=0.05水准,P值为0.000,小于0.05,认为瘤体积大小的总体均数间差异具有统计学意义,即HA纳米载体转GM-CSF基因制备自体肿瘤疫苗抑制人肝癌PBL-SCID嵌合模型的皮下移植瘤生长的作用。根据瘤体积计算抑瘤率[7],抑瘤率达89%(表1)。
*:示与生理盐水组比较P <0.001
2.3 人HCC-PBL-SCID鼠复合模型的移植瘤组织浸润CD3+T细胞的分布
免疫组化染色检测结果显示:人HHC-PBL-SCID鼠复合模型小鼠的皮下移植瘤组织有CD3+T细胞浸润(图1)。
2.4 各组小鼠肝癌移植瘤病理学检查结果
各组小鼠移植瘤边界清楚,似有包膜。肿瘤表面凹凸不平成多个结节融合状。光镜下肝癌移植瘤生长旺盛,肿瘤细胞核大异形,呈多边形,形成癌巢。核分裂象明显。60Co照射的未转入基因组、转入基因组可见部分细胞变性坏死。60Co照射转入基因组可见大量细胞核固缩,细胞变性和坏死(图2～5)。
3 讨论
SCID小鼠是一种严重联合免疫缺陷小鼠,其免疫学特点是无T和B淋巴细胞,细胞免疫和体液免疫均缺乏。在此种小鼠体内植入人外周血淋巴细胞,是一种目前最好的评估生物疗效的实验模型[3]。本研究通过建立稳定的同时具有人免疫系统和人肝癌的复合动物模型,从而可为肝癌自体疫苗的免疫治疗研究提供可靠的体内实验模型。
本文制备的自体肿瘤疫苗为HA纳米载体介导GM-CSF基因转染HepG2细胞经辐射后制备而成。本研究采用的HA纳米载体是羟基磷灰石[2],HA纳米载体是一种新型的纳米生物材料和纳米基因导入载体,作为一种非病毒型基因导入载体,它具有无免疫原性、低毒、装载容量大、置备容易等优点。以与抗原共轭的纳米颗粒为内核的抗肿瘤药物缀合是一种新的疫苗设计方案,这种疫苗引导的抗体滴度明显高于一系列目前使用的佐剂(明矾,基拉,单磷酰脂A)[8]。纳米粒径的药物容易穿透组织间隙,生物利用度高。而且抗肿瘤药物的纳米制剂具有输送靶向性和控释特性,因此此疫苗可以在保证药物作用的前提下,尽可能减少用药剂量,以减轻或避免药物的毒副作用。
目前,世界上调查体外静脉注射自体成熟树突状细胞(DC)与肝肿瘤细胞裂解液(肝癌)治疗晚期肝细胞癌(HCC)的安全性和有效性的实验已经进行到第二临床阶段[9]。而GM-CSF是至今为止所评价的33个基因产物中效力最强的细胞因子之一,可增强抗原递呈细胞的成熟和功能,尤其树突细胞。树突状细胞是免疫激活的核心环节,是已知体内功能最强的抗原提呈细胞,它具有激活静止期T细胞、初始型T细胞和向T细胞提呈抗原的功能,它提高患者体内淋巴细胞主要是T淋巴细胞的分泌,使体内免疫机制增强[10]。本实验虽未对SCID鼠的免疫渗漏进行检测,但人外周血淋巴细胞移植前,已用环磷酰胺消除SCID鼠体内NK细胞和巨噬细胞活性,提高植入成功率。从免疫组化显示SCID鼠肿瘤组织人CD3+T淋巴细胞浸润的结果可以看出,将人外周血T淋巴细胞植入SCID小鼠腹腔内后,使SCID小鼠具备一定抗肿瘤细胞免疫能力。转入基因60Co照射组小鼠6周存活率达到100%,其他各组均有不同的死亡率。另外60Co照射转入GM-CSF基因的HepG2细胞组的肿瘤体积明显小于其他组,抑瘤率达89%。而且60Co照射转入基因组可见大量肿瘤细胞核固缩,细胞变性和坏死说明自体肝癌疫苗抑制了肿瘤的生长,增加了小鼠对肿瘤的抵抗力,延长了小鼠的生存期。通过提高细胞免疫能力,增加对恶性肿瘤的抵抗,延长生存期、提高生活质量等方面起到一定作用,这将使不能切除的肝癌重获手术切除机会,并在降低术后复发和转移产生新的突破,并有可能成为有希望的肝癌治疗手段。
本研究结果表明:自体肿瘤疫苗是治疗癌症的可行之路,HA纳米载体介导转基因表达GM-CSF的自体肿瘤疫苗能有效增加自体肿瘤疫苗的抗癌效用,具有很大的临床应用潜力。
摘要：目的:观察自体肿瘤疫苗对人肝癌PBL-SCID嵌合模型的治疗效果。方法:SCID小鼠20只腹腔内注射健康志愿者外周血淋巴细胞(2×106/mL)0.5 mL,同时背部皮下接种人肝癌HepG2细胞(1×107/mL)0.2mL。当皮下移植瘤体积长至100mm3时,随机分4组:Ⅰ组,生理盐水组;Ⅱ组,60Co照射的HepG2细胞组;Ⅲ组,转染GM-CSF基因的HepG2细胞组;Ⅳ组,60Co照射的转染GM-CSF基因的HepG2细胞组即自体肿瘤疫苗组,每组5只。结果:自体肿瘤疫苗组6周存活率(100％)高于生理盐水组(60％)和单纯60Co照射的HepG2细胞组(40％);自体肿瘤疫苗腹腔注射抑制皮下移植瘤生长,其肿瘤生长抑制率为89％;免疫组化检测发现人淋巴细胞分布于小鼠移植瘤组织中。病理切片见移植瘤细胞变性和死亡。结论:HA纳米载体转GM-CSF基因制备的自体肿瘤疫苗具有抑制人肝癌PBL-SCID嵌合模型的皮下移植瘤生长作用,并诱导有效的抗肿瘤免疫反应。
关键词：HA纳米载体,GM-CSF基因,自体肿瘤疫苗,免疫重建,Hu-PBL-SCID 鼠,复合动物模型
参考文献
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碳纳米管药物载体的研究进展 篇5
根据世界卫生组织的统计, 2008年世界范围内的肿瘤出现了1240万种新类型, 而且有760万人死于这类疾病[1]。根治性切除肿瘤是早期治疗肿瘤的唯一方法。但是, 大多数病人还会出现局部感染和远端转移, 仅有极少数的人能得到根治。对于那些无法切除肿瘤的病人及接受了姑息性手术的病人还需要做放疗和化疗。可是大多数药物由于缺乏对肿瘤细胞特异性的了解, 采用常规治疗剂量就会对正常细胞产生显著的毒副作用。因此, 为了克服或改善传统给药的某些缺点, 如溶解度低、组织分布差、缺少选择性、对全身细胞具有毒副作用等, 需要开发一种新型的载药系统, 用以提高药物的动力学和治疗效果, 能使药物直接地靶向肿瘤细胞而不影响正常细胞。
靶向给药系统 (Targeted drug delivery system, TDDS) 是利用具有一定特异性的载体将药物或其他杀伤肿瘤细胞的活性物质定向作用于肿瘤组织, 而不影响正常组织细胞功能, 从而提高疗效、减少毒副作用的一种给药系统。靶向治疗可使病变部位的药物浓度明显提高, 从而减少用药量并使治疗费用降低。从发展趋势看, 肿瘤靶向给药系统的研究目前已取得了较大进展, 从第一种靶向药物用于临床起, 便显示了在肿瘤治疗方面的巨大潜力。
靶向给药系统按不同的作用方式分为被动靶向给药系统、物理化学靶向给药系统和主动靶向给药系统。被动靶向给药系统是指通过减少与非靶器官、组织及细胞的非特异性相互作用来增加靶部位/非靶部位的药物水平比率的给药系统。属于被动靶向的载体主要有纳米粒、微球、乳剂、脂质体等, 注射后能选择性地浓集于肝、脾、肺、淋巴组织以及肿瘤细胞并释放药物, 发挥疗效。物理化学靶向给药系统是应用某些物理化学方法可使靶向制剂在特定部位发挥药效的给药系统, 主要包括磁性靶向给药系统、热敏靶向给药系统、光敏靶向给药系统和pH靶向给药系统。主动靶向给药系统即利用肿瘤细胞表面的特异性抗原或受体作为作用靶点的给药系统, 主要有受体介导内化的、抗体介导的和前体药物的肿瘤靶向给药系统。抗体和配体介导的给药系统为肿瘤细胞的主动靶向给药提供了有效手段, 但还有许多问题有待改进, 如工艺复杂、载药量小、稳定性差;受体在正常细胞中也有少量的表达, 可能引起不良反应;配体的修饰率不高等;抗体治疗要求抗体的剂量大、纯度高, 生产成本和价格非常昂贵等。物理化学靶向给药系统中存在的问题有:体外磁场的选取, 包括磁场强度、磁场梯度、磁场使用时间及立体定位等问题, 否则难以使磁性药物稳定停留在靶器官;高温释药时过高的温度会对正常细胞产生损伤;药物的包封率低, 容易发生药物泄漏等。与主动靶向给药系统和物理化学靶向给药系统相比, 被动靶向给药系统的重要性如下: (1) 生物体的绝大部分属于非靶部位, 例如尽管肝脏是最大的靶部位之一, 但是其质量仅占体重的2%, 说明人体内98%的部位可被认为是非靶区。这样, 被动靶向给药系统在给药的过程中占据的比例更大一些。 (2) 除对血管内淋巴细胞及血管内皮细胞靶向外, 由于多数靶部位位于血管外, 药物载体首先必须透过血管内皮, 随后在组织间质中逐渐渗透才能到达血管外靶部位。即使对于特异性高的主动靶向系统, 如对细胞表面肿瘤特异性抗原等生物特异性受体导向的药物载体, 也必须首先被动性透过血管内皮, 因此药物载体的被动转运比载体与生物体特异性的相互作用更重要。 (3) 当主动靶向载体携带药物时, 一些被动性因素的影响可能变得非常重要。对于药物-抗体交联物而言, 交联的药物会对抗体特异性产生不良的物理化学相互作用, 如抗体特异性降低及药物-抗体交联物被非特异性摄取量增加等, 而且这一不良作用将随交联药物剂量的增加而增强。当这种不良作用决定并抑制药物与抗体的特异性相互作用时, 就难以实现定位给药。
在此, 着重讨论被动靶向给药系统, 该系统中的碳纳米材料以碳纳米管 (CNTs) 为代表, 近年来在生物医学领域的应用得到了广泛的研究和重视[2]。作为生命元素, 碳元素构成的纳米材料与其它无机纳米材料相比具有相对更好的生物可兼容性。结果表明, 经过良好表面修饰的碳纳米管在动物体内没有明显毒性, 并能被缓慢地排除体外[3]。碳纳米管主动进入细胞的能力, 被广泛用于小分子药物和生物大分子如蛋白质、DNA、RNA等的跨细胞膜药物输送。
1 用作药物载体的碳纳米管
碳纳米管作为纳米材料, 由于具有细胞膜穿透性并且其管壁及顶端可以容纳生物特异性分子及药物, 因此可将一些细胞穿透性较差的生物大分子 (蛋白、核酸等) 及药物吸附或偶联到碳纳米管上穿过细胞膜[4,5]进入细胞或组织[6]。
未加修饰的碳纳米管因其表面疏水性强, 在细胞中易聚集, 会对细胞产生毒性, 并不适合用于药物载体。为此, 开展了一系列的碳纳米管改性的研究。对碳纳米管改性及功能化的方法分为两大类:第一类是非共价结合表面活性剂、核酸、多肽、多聚物或寡聚体等;另一类方法是碳纳米管的共价功能化, 通过浓酸氧化截短或环加成作用在其表面或顶端连接有机分子, 通过侧链分子间的相互排斥作用使其分散[7]。
将功能化后的碳纳米管应用于癌症的治疗, 在生物医学领域具有广泛的应用。Feazell等[8]将顺铂的前体铂 (Ⅳ) 复合物通过肽链连接到胺基化的碳纳米管上, 以胺基化碳纳米管为载体并通过细胞的内吞作用, 铂 (Ⅳ) 复合物能进入睾丸癌细胞。连接于功能化碳纳米管表面的铂 (Ⅳ) 复合物对癌细胞的细胞毒性是游离复合物的100多倍, 为提高肿瘤化学治疗药物的敏感性提供了一条新途径。另外, 碳纳米管较高的长径比使在同一根碳纳米管可以同时连接不同作用的分子成为可能 (如靶向分子、药物、增敏分子等) 。Wu等[9]将荧光标记物FITC和抗真菌药物两性霉素B同时连接于功能化碳纳米管, 前者可以作为细胞摄取碳纳米管的追踪剂, 后者搭载碳纳米管很容易进入细胞并保留了较强的抗真菌活力。Zhu等[10]发现碳硼烷修饰的水溶性碳纳米管静脉注射后可以选择性地在肿瘤组织中浓聚、滞留, 静脉应用48h后肿瘤组织中的浓度为血液中浓度的3.12倍, 所以碳纳米管可以成为硼中子俘获疗法治疗肿瘤的载体。Pastorin等[11]以1, 3-亚甲胺叶立德对多壁碳纳米管 (MWNTs) 偶极环加成, 然后以异硫氰酸荧光素及氨甲喋呤 (Methotrexate, MTX) 功能化得到MWNT-MTX, 发现利用MWNT-MTX靶向肿瘤细胞, 可大大增加MTX被癌细胞摄取的量, 使抗癌效果得到改善。碳纳米管同时偶联多种生物分子是碳纳米管在载体领域应用的新方向。
最近, 新的碳纳米管基肿瘤靶向药物载运系统得到了广泛的研究, 该载运系统主要包括3个部分:功能化碳纳米管、肿瘤靶向配体和抗癌药物。当药物载运系统与癌细胞接触时, 它们能够识别癌细胞表面的受体然后诱导受体介导的内吞作用。已经证明, 该复合体可以被癌细胞有效地摄取, 进而在胞内释放药物, 与未经靶向输运的药物相比更能有效地抑制癌细胞的增殖。同时, 该运载系统的细胞毒性在某种程度上[12]有所降低, 各种毒副作用也有可能避免。McDevit等[13]以肿瘤靶向单克隆抗体、放射性同位素离子配体及荧光素探针等修饰了水溶性碳纳米管, 将其用于治疗肿瘤, 并采用体外流式细胞计和免疫反应性分析法观察它们的体外活性, 以淋巴瘤异种移植小鼠模型评估它们在生物体内的分布情况, 发现此类功能化碳纳米管是高效的靶向载体。虽然Liu Z.等[14]的研究中并没有用到靶向分子, 但是碳纳米管-紫杉醇复合物同样有效地抑制了肿瘤细胞的生长, 这是由于它们延长了在血液中的循环时间及增强渗透滞留效应。与传统的脂质体和树枝状药物载体[15]相比, 较高的比表面积使碳纳米管具有较高的药物负载率, 碳纳米管固有的稳定性和结构柔性也可能延长循环时间以及改进结合的药物分子[16]的生物利用度。总体而言, 这些结果明显表明了碳纳米管在药物载体方面的发展潜力。
2 基于磁向导性的碳纳米管-磁性纳米颗粒
磁性纳米粒子在先进材料方面是最活跃的研究领域。当它们的直径小于20nm时, 会显示出超顺磁性, 在外磁场作用下能达到磁饱和;当撤去磁场时, 净磁矩又会变为零。它们对外磁场的响应使得生物分子可以被磁性示踪和检测, 从而应用于生物分离、生物监测和靶向药物运输[17,18,19,20,21]等方面。
目前无机磁性微粒的种类很多, 较常用的有金属合金 (Fe、Co、Ni) 、氧化铁 (γ-Fe2O3 、Fe3O4) 、铁氧体 (CoFe2O4、BaFe12O19) 、氧化铬 (CrO2) 和氮化铁 (Fe4N) 等。由于Fe3O4具有较好的磁性、低污染性, 并且在不超过贫血病人常规补铁总量的基础上还可达到补铁的效果, Fe3O4在生物技术和药学领域的应用得到了广泛关注。在药物载体领域, 有许多关于CNTs表面修饰磁性纳米粒子的报道[22]。利用碳纳米管的细胞穿透能力及Fe3O4的靶向作用, 携带目标药物活性分子进入细胞, 该新型载体弥补了碳纳米管或磁性粒子各自作为肿瘤药物载体所存在的不足, 进一步提高了肿瘤药物的生物利用度。
Georgakilas[23]利用非共价改性的方法合成了Fe3O4修饰的碳纳米管, 发现此种碳纳米管在有机介质中具有高的溶解度。Gao[24]利用Fe3O4修饰的碳纳米管控制绵羊的红细胞, 结果显示结合了磁性碳纳米管或非磁性碳纳米管的血细胞能够被外磁场选择性地控制, 证明该复合物有可能在生物工程、单体技术和生物医学疗法方面具有广泛的应用。Korneva等[25]用Fe3O4填充自制的碳纳米管 (平均外径为300nm) , 并且在外磁场中使之很容易定向。Xiao等[26]用碳纳米管与氯化铁在二甘醇溶液中的水热反应, 即一锅法制备了Fe3O4修饰的碳纳米管, 该材料可定向载运药物用于肿瘤的治疗。Jiang等[27]采用溶剂热的方法制备了磁性四氧化三铁/碳纳米管复合材料, 并研究了复合材料的电性能。Correa-Duarte等[28]采用聚合物包覆和层-层组装技术合成出氧化铁纳米颗粒包覆的碳纳米管功能材料, 复合材料表现出超顺磁行为。
在过去的10年中, 合成的纳米材料由于具有生物相容性成为一个研究热点, 并且在癌症的治疗方面[29]具有潜在的应用。因此可以预测, 磁性纳米粒子/碳纳米管纳米复合材料作为一种新的磁性材料, 也将具有广阔的应用前景。
3 基于示踪的碳纳米管-量子点荧光纳米粒子
药物经载体的运载后是否已达到目标靶点, 需要对其进行示踪, 量子点 (QD) 作为一种新兴的纳米荧光示踪剂, 为实时监控提供了崭新的手段, 在生物医药研究领域应用前景广阔。
与传统的有机荧光染料和荧光蛋白相比, 荧光量子点具有极其优良的特性, 主要表现在: (1) 发射光谱可调。量子点的发射波长可通过控制它的粒径和组成来“调谐”, 而且单一种类的量子点就能够按尺寸变化产生一个发射波长不同、颜色分明的标记物家族, 这是染料分子根本无法实现的。 (2) 激发光谱范围宽。由于量子点具有显著的尺寸效应, 可吸收波长小于量子限域峰对应波长的几乎所有的光, 因而采用单个激发波长的光就可同时激发不同发射波长的荧光量子点。单个有机染料分子只有在吸收了合适能量的光子后才能从基态跃迁到激发态, 所用的激发光源必须具有精确的波长或颜色, 因此激发不同的荧光染料分子通常需要采用不同波长的光。 (3) 具有荧光量子产率高、光稳定性好、不易发生光漂白等优点。在高强度激光长时间照射下, 光学特性不会有明显变化, 这种特点非常适合于对标记对象进行高灵敏、长时间、实时动态观测, 而有机荧光染料则易分解、易发生光漂白等。 (4) 具有空间兼容性。一个量子点可以偶联2种或2种以上的生物分子或配体, 从而使制备多功能检测及成像探针成为可能。
量子点作为一类新型的纳米荧光示踪剂, 在纳米药物研究中引起了科学家的广泛关注, 并且已取得了可喜的进展。近来, 已有人将碳纳米管和量子点这两种无机纳米材料相结合, 开发出了新型的纳米药物载体并应用于活体的研究。
Jia等[30]首先用CdTe量子点共价标记基因治疗药物反义寡核苷酸 (ASODNs) , 并借助聚乙烯亚胺 (PEI) 阳离子聚合电解质修饰羧基化的碳纳米管, 然后将ASODNs-CdTe和功能化的碳纳米管以静电作用方式结合, 形成荧光标记的碳纳米管载药系统。实验通过共聚焦荧光成像等手段比较了PEI修饰前后碳纳米管对HeLa细胞毒性和ASODNs输送效率, 发现羧基化碳纳米管在经过聚合物修饰后毒性降低, 而细胞核靶向传送药物的效率明显提高。Shi等[31]采用直接以量子点共价标记碳纳米管的方法研究其在动物体内的转运分布行为。他们将表面羧基化的碳纳米管和表面氨基化的QD (CdSe/ZnS) 偶联生成CNTs-QD纳米药物载体。将CNTs-QD皮下注射至裸鼠背部和腹部, 通过活体荧光监测系统发现明显的荧光信号。该小组进一步选择发射波长更长的近红外QD (CdSeTe/ZnS) , 以相同的方式标记碳纳米管, 并在空腔内装载抗肿瘤药物紫杉醇。将该复合体通过尾静脉注射至裸鼠体内, 近红外活体成像发现肝、肾、胃和小肠部位显示明亮荧光, 表明CNTs纳米药物载体可以携带药物到达这些脏器[32], 与通过ICP-MS测定组织内镉元素含量的结果相吻合。
4 结语
精子载体转基因技术的研究 篇6
1 精子载体介导基因转移的原理
1.1 精子具有吸收外源DNA的能力
Lavitrano和French发现, 成熟精子头部具有吸收外源DNA的能力。其吸收区域是具有特异性的, 该区域位于精子头部的顶体后区 (post-acrosomal region) , 即靠近精核的区域[1]。DNA分子与精子特异结合是一种离子作用, 这一过程不依赖特定的序列。而且除DNA外, 其它一些带负电的分子如肝素 (heparin) 、硫酸右旋糖苷 (dextransulphate) 及等电点低于7的蛋白都可以特异与这一区域结合。经分析发现, 精子头部蛋白抽提物中有一种30～35KD的蛋白质, 这种蛋白只存在于哺乳动物如小鼠、猪、牛、人以及鱼类和海胆纲动物中。通过GelShift分析发现, 纯化的30～35KD蛋白可与DNA形成DNA-蛋白复合体。
1.2 外源DNA的内化与整合
Ⅱ型主要组织相容性复合体分子 (MHCⅡ) 可能在精子-DNA结合中起作用, 其证据MHCⅡ基因敲除小鼠的精子细胞与DNA结合的能力比野生型小鼠精子的结合力低[2]。但是, 利用MHCⅡ单克隆抗体并不能在精子头部检测到MHCⅡ分子。因此, 精子细胞吸收外源DNA的能力是否依赖MHCⅡ分子还有待进一步证明。此外, CD4分子是T淋巴细胞的一种表面标识抗原, 免疫荧光和Western分析证明它也存在于野生型小鼠的精细胞表面。尽管CD4基因敲除小鼠的精子能结合外源DNA, 但外源DNA不能进入精子核内, 即失去进一步内化 (internalization) 的能力, 表明存在于精子表面的CD4分子能促进与精子结合的外源DNA内化[3]。
外源DNA的精子核内化过程是一个精密的过程, 有许多特定因素的参与。其大体过程如下:外源基因在无抑制因子Ⅰ的影响下与精子表面的30～35KD大小的DNA结合蛋白结合, 这一过程受精子发生过程中MHCⅡ表达的间接调控。然后, DNA-DNA结合蛋白复合物激活精子表面CD4抗原与之进一步结合形成复合物, DNA-DNA结合蛋白-CD4抗原复合物随后在某种未明机制下穿过质膜和核孔到达核基质。在这里DNA结合蛋白-CD4抗原复合物从DNA-DNA结合蛋白-CD4抗原复合物中释放, DNA整合到染色体之中, DNA结合蛋白-CD4抗原复合物重新回到精子质膜中进行新一轮的基因结合内化过程。
外源DNA进入精子细胞后, 紧密地与核支架结构 (nuclear scaffold) 结合, 并与精子基因组DNA整合重排[4]。整合过程并不是随机的, 而是有选择的。整合多在核基质区 (nuclear matrix-associated DNA, MAR) , 其次, 整合位点一端为拓扑异构酶II的识别序列[5]。这种酶识别序列与核支架区 (scaffold-associated regions, SARs) 的DNA序列同源, 而且拓扑异构酶Ⅱ优先选择与含SAR序列的DNA结合[6]。这不仅说明这种酶在非同源重组中可能起一定作用, 而且整合位点可能就在SAR区域[7]。
2 精子载体介导基因转移的途径
目前应用精子为载体介导基因转移获得转基因动物主要通过以下途径来实现的:体外精子转染法和体内精子转染法。体外精子转染法又可以分为精子与外源DNA直接共孵育法, 体外电穿孔导入法和脂质体介导转染法;体内精子转染法又可以分为输精管注射转染法、曲细精管注射转染法、睾丸注射转染法等。
2.1 体外转染法
2.1.1 恒温共孵法:
此法是精子载体法制备转基因动物最早使用的方法。大量研究表明动物精子具备自发结合和内化转运外源DNA的能力, 将精液与DNA直接混合37℃恒温共孵20～40 min, 采用这种直接孵育的方法使外源DNA结合并内化到精子中, 精子结合内化外源基因后仍保持很好的活力。此法最早于1971年由Brackett[8]发现, Bracket研究首次证实精子具有吸附结合外源DNA能力, 并将外源DNA在受精时携带进入卵母细胞。18年后, 意大利科学家Lavitrano[9]应用此法得到阳性转基因小鼠。之后Lavitrano又与美国波士顿大学合作使用该法, 在所进行的75批实验中, 转基因阳性率为7.4% (130/1755) [10]。该实验不仅从正面肯定了精子介导基因转移的可行性, 也从侧面证实了众多阴性结果存在的合理性。
2.1.2 体外电穿孔法和脂质体法:
由于精子质膜的特殊性, 适合一般细胞的转染方法, 为了提高转染效率有学者用体外电穿孔法和脂质体法直接将外源基因转移到精子内部。电穿孔法是利用核酸带电的特点, 通过外加一个瞬时高压, 使DNA瞬时加速后进入精子内部。电击对精子细胞的影响有两方面:一方面可短暂打开细胞膜上的某种通道, 有利于外源基因的进入, 但另一方面电击对精子细胞又是一种损伤, 当电击超过一定强度时, 就有可能对精子造成损伤甚至死亡, 进而影响精子的受精能力和胚胎的发育能力[11]。
脂质体法是将外源DNA用脂质体包裹好后, 精子与包裹外源DNA脂质体共孵育, 由于细胞膜是脂质双分子层, 因此细胞膜与脂质体发生融和, 使外源基因发生转移到精子内。阳离子脂质体是广泛应用的转移DNA的有效手段之一, 因其表面带有阳离子, 可与带负电的DNA形成脂质体一DNA复合物。阳离子脂质体一DNA复合物进入细胞的3种模式: (1) 通过与带负电荷的细胞质膜融合后, 释放出包裹的核酸分子; (2) 通过细胞内吞作用进入, 随后与核内体膜发生融合; (3) 通过细胞质膜上形成的小孔进入。与其它方法相比, 脂质体法有转染效率高、毒性小等优势[12,13,14]。
2.2 体内转染法
2.2.1 输精管内注射转染法:
输精管内注射转染法是将含目的DNA的重组质粒纯化后用脂质体包裹, 然后通过手术, 用微量进样器将DNA-脂质体复合物注入雄鼠输精管内, 再用阳性转染雄鼠与雌鼠交配。在转染过程中, 外源DNA能从注射部位扩散到输精管全长, 完成对成熟精子的转染。
该方法的主要优点是操作简便, 且对动物的交配不造成明显的影响, 但此法受精子存活时间的限制, 转染后必须短时间内交配, 否则携带外源DNA的精子会被来自附睾的精子所稀释从而降低转染效率。由于每次输精管注射只能产生一批转染精子, 而且被转染的是已失去增殖能力的成熟精子, 因此, 该法难以得到可长期产生阳性转染精子的雄性动物。此外, 研究人员发现精浆中被称为抑制因子Ⅰ的成分对转染有抑制作用, 因此输精管内注射法被认为是转染效率有限的方法。
2.2.2曲细精管内注射转染法:
对生殖细胞的修饰和改造是建立转基因动物最理想的一种方式, 而精原细胞便是其中最具潜力的一种途径。精原细胞 (spermatogonia) 是精子形成的前体细胞, 在睾丸微环境中可以像ES细胞一样具有增殖、分化潜能。在雄性动物出生后, 精原细胞一直处于不断分裂增殖状态, 不断地增殖和分化成精子细胞。通过合适的手段将外源基因导人精原细胞中, 就有可能将外源基因带入子代基因组中。例如, 在体视显微镜下, 将含有外源基因的转染液注入到曲细精管中, 或者注入后再结合电穿孔的方法, 通过转染精原细胞使成熟精子中携带有外源基因, 再利用转染的精子通过自然交配制备转基因动物。相对于ES细胞和显微注射方法更简便易行, 且不需要专用设备。目前已有通过该法建立转基因小鼠的多个报道[17]。
2.2.3 睾丸内注射转染法:
睾丸内注射转染法是在曲细精管注射转染法的基础上改进的一种更简捷、更有效的新途径, 其通过对睾丸组织的生殖干细胞和未成熟精子进行外源DNA转染后, 将动物进行自然受精, 产生出转基因动物。研究表明, 通过对睾丸进行多次打点注射, 能将外源基因转入曲细精管内, 并经渗透作用整合到精原细胞和精母细胞的染色体中, 从而获得大量的转染精子, 在附睾中积累后, 进一步提高了转染的成熟精子数量。与体外孵育相比, 在转染过程中, 外源DNA的导入既不会受到精浆中抑制因子I (IF一I) 的影响, 同时转染后的精子细胞在附睾中经生理状态调整后活力没有减弱, 又避免了体外孵育时, 因精子存活时间限制和外源DNA附着于精子头部等因素所导致精子活力下降和受精能力下降, 从而大大提高了获得转基因动物的机率。而且, 注射雄体的这种保持能力也很强, 注射后7个月, 仍可通过Southern的方法从睾丸、附睾及输精管中的精子里检测出外源基因。
3 精子载体转基因技术的应用
精子载体法介导基因转移技术因其操作简便、经济、易于推广等优点, 在医学、药物学、畜牧业等领域中显示出了诱人的开发价值。最近几年, 有许多研究人员借助该项技术建立了各种具有特定目的和用途的转基因动物。目前该技术在生物反应器制药、异种器官移植、建立转基因疾病动物模型、改善牛奶质量等方面显示出广阔的应用前景。
4 结束语
由于精子载体法在转基因动物的制备中具有简便易行、耗费低、转染率高和适应性广等特点, 吸引着众多研究者不断地进行探索改进。经过近20年的研究, 人们已不再争议这种转基因方法的可靠性。迄今为止, 精子载体法已在12种动物中获得了转基因后代[18], 其中包括小鼠、家兔、牛、猪和鸡等。但是不同试验之间转基因效率还存在很大的差异, 而且未能获得足够的数据对此作出解释。如能对此法作进一步的研究, 很有可能使转基因动物的商业化生产成为可能。
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纳米基因载体 篇7
关键词：银杏,CONSTANS基因,表达载体构建,转化
CONSTANS (CO) 基因属于光周期途径基因[1], 光周期是影响植物花发育的重要环境因[2], 在植物营养生长阶段, CO在叶和茎顶端开始表达, 它转录的mRNA呈渐进方式积累, 当达到一定域值时, 通过激活其下游靶基因使植物由营养生长向生殖发育转变, 开始植物花的发育[3]。CO影响植物的成花过程, 对花发育有直接和间接促进作用, 成花的早晚主要由CO基因所控制[4]。CO基因可以将光信号转换为开花信号传递给FLOWERING LOCUST (FT) 基因, 它和FT基因都是光周期途径中的关键基因[5,6,7]。
银杏 (Ginkgo biloba) 又名“公孙树”, 为我国独存的珍稀名贵树种, 广泛应用于园林景观、医药、食品、保健等领域;是一种童期特别长的中生代孑遗裸子植物。一般实生苗种植15-20年后才能开花结果, 这给银杏优良品种的选种带来了严重的障碍。
近年来, 通过植物基因工程技术对开花相关基因的遗传改造, 在缩短木本植物的童期研究中已经取得了一定成效。但有关CO基因在木本植物中遗传改造的研究较少。本研究构建了GbCO正义链和反义链的植物表达载体pCAMBIA 1304-GbCOs和pCAMBIA 1304-GbCOa, 可用于GbCO基因的转基因功能研究, 为利用CO基因进行银杏等木本植物的遗传转化创造条件。
1 材料和方法
1.1 材料
植物表达载体pCAMBIA 1304、大肠杆菌 (Escherichia coli) TOP10、农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens) LBA4404, 为作者实验室保存。
限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ, T4 DNA连接酶均购自New England BioLabs (NEB) 公司。PCR体系包括 (Taq酶) 及PCR耗材购自Promega公司。胶回收试剂盒为AxyGen Biosciences产品;pMD-18T Vector 购自TaKaRa 生物工程 (大连) 有限公司;卡那霉素、氨苄青霉素钠盐等购自上海生工有限公司;引物由上海生工有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 GbCO基因酶切位点的引进
以含有GbCO的载体pMD-18T-GbCO菌液为模板 (前期实验获得) , 用加上保护碱基和酶切位点的引物进行PCR扩增 (正义链引物GbCOS-FP 5′-GGAATTCATGAGTATGCCAAAGCTATGTGAT-3′;GbCOS-RP 5′-CGGGATCCTTAAAAAGATGGAACAATCCCATA-3′。反义链引物GbCOA-FP 5′-GGAATTCTTAAAAAGATGGAACAATCCCATA-3′;GbCOA-RP 5′-CGGGATCCATGAGTATGCCAAAGCTATGTGAT-3′) , PCR反应程序:94℃ 3 min, 94℃ 1 min, 62℃ 30 s, 35 cycles, 72℃ 3 min, 72℃ 10 min, 电泳检测扩增目的条带, 分别切胶回收富集正义链和反义链。
1.2.2 GbCO基因植物表达载体的构建及鉴定
植物表达载体pCAMBIA 1304, 正义链和反义链的双酶切反应按照试剂公司提供的酶切体系进行, 37℃水浴保温16h, 取2μL电泳检测酶切效果。
酶切后的正义链和反义链分别与植物表达载体pCAMBIA 1304酶切后的直链进行连接反应, 体系为 (总体积10μL) :pCAMBIA 1304直链1μL, 酶切后正义链/反义链3μL (视片段浓度而定) , 10×Ligation Buffer 1μL, T4 DNA Ligase 1μL, 双蒸水4μL, 16℃水浴连接过夜。
将带有正义链和反义链的植物表达载体pCAMBIA 1304转化到大肠杆菌中, 接种于含有Kan (50 μg/mL) 的LB固体培养基上, 平板倒置于37℃恒温培养箱中培养12～18 h。挑取单菌落检测。
参照《分子克隆实验指南 (第3版) 》质粒提取方法提取pCAMBIA1304-GbCO质粒DNA[8]。
1.2.3 GbCO基因植物表达载体转化农杆菌
参照朱锦辉、权军利等人[9]方法, 挑取根癌农杆菌LBA4404单菌落于YEP液体培养基 (含Rif 40μg/mL) 中, 28℃振荡培养至OD600为0.5左右, 制备农杆菌感受态细胞, 把pCAMBIA1304-GbCO质粒DNA转化到农杆菌感受态细胞, 接种于含有50μg/mL Kan和40μg/mL Rif的YEP固体平板上, 28℃培养约48h, 挑单菌落, 接种于YEP液体培养基中, 28℃振荡培养过夜。以GbCO基因特异性引物进行PCR扩增, 进行菌落PCR检测, 电泳检测目的条带。同时提取pCAMBIA1304-GbCO质粒DNA, 进行BamHⅠ和HindⅢ双酶切, 37℃反应过夜, 电泳检测酶切结果, 进一步进行酶切鉴定。
2 结果与分析
2.1 GbCO基因植物表达载体的构建策略
GbCO基因ORF上没有的限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ两个酶切位点, 而植物表达载体pCAMBIA 1304上有这两个酶切位点, 通过设计引入酶切位点及保护碱基引物, 扩增GbCO基因正义链和反义链, 使其两端含有BamHⅠ和HindⅢ两个酶切位点。利用双酶切和连接重组技术, 把GbCO基因正义链和反义链通过酶切位点BamHⅠ和HindⅢ插入植物表达载体pCAMBIA 1304, 从而构建正义表达载体pCAMBIA 1304-GbCOs和反义表达载体pCAMBIA 1304-GbCOa。
2.2 GbCO基因植物表达载体的构建及鉴定
以含有GbCO的载体pMD-18T-GbCO菌液为模板, 使用引入BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的正义引物、反义引物扩增得到了基因两端带有相应双酶切位点的GbCO基因片段, 测序结果表明正确引入了BamHⅠ和HindⅢ酶切位点。
对植物表达质粒pCAMBIA 1304和克隆扩增得到的带有BamHⅠ和HindⅢ双酶切位点的目的基因片段双酶切。酶切电泳结果如图2, 图2 (a) 显示植物表达质粒pCAMBIA 1304经过酶切后, 由原来的环形或超螺旋结构变成了单一的线性结构, 酶切完全;由图2 (b) 可见GbCO基因酶切后基因条带大小与酶切前的一致, 说明基因未被酶切弥散, 可以进行载体构建连接反应。
将分别酶切后的载体和片段进行连接反应, 转化TOP10感受态细胞, 在含有卡那霉素 (50mg/L) 的LB培养基上筛选转化菌落, 挑取单菌落进行菌落PCR鉴定。PCR产物电泳可见大小约1 200bp的特异条带 (图3, a) , 与预期大小一致, 初步说明pCAMBIA 1304-GbCO植物表达载体构建成功。对PCR为阳性的单菌落进行摇菌培养后提取质粒, 用BamHⅠ和HindⅢ双酶切再次鉴定, 电泳可见两条大小约1.2kb和3.0kb的目的条带 (图3, b) , 证明pCAMBIA 1304-GbCO植物表达载体构建准确。构建的表达载体送往上海生工测序, 结果表明克隆的重组质粒是研究所需的植物表达载体pCAMBIA 1304-GbCO。
(a) 为pCAMBIA 1304载体双酶切图 (ck为双酶切前的载体, 1、2、3为双酶切后的载体) 。 (b) 为GbCO基因正义和反义ORF片段的双酶切图 (M为DNA marker DL2000, 1、2为酶切后, 3、4为酶切前;1、3为正义链, 2、4为反义链) 。
a为菌落PCR结果电泳, b为pCAMBIA 1304-GbCO质粒酶切。
2.3 GbCO基因植物表达载体转化农杆菌
pCAMBIA 1304-GbCO重组质粒转化农杆菌LBA4404感受态细胞, 涂布YEP平板上培养长菌后, 挑取单菌落进行PCR鉴定。选择GbCOS-FP和GbCOA-FP为单菌落检测的上游引物, 通用引物M13 pM4:GTTTT CCCAG TCACG AC为下游引物。得到约1 200bp的特异条带 (图4) , 证明pCAMBIA 1304-GbCO重组质粒已经被成功转入农杆菌LBA4404感受态细胞中, 命名pCAMBIA 1304-GbCO/LBA4404菌落, 可以作为转基因等后续研究之用。
其中, M为DL2000分子量标记;+1为正义链阳性菌落;+2为正义链阴性对照;-1～-3为反义链阴性对照;-4为反义链阳性菌落。
3 讨论
近年来, 关于光周期的研究已有大量报道[10]。光合周期变化是一种诱导植物开花的环境因子之一。在拟南芥光合周期途径中, 现已证明FT、CO和SOC1等基因的表达均受到光合周期节律的调节[11,12,13]。Koornneef M等人通过光周期失活的拟南芥突变体首先筛选得到CO基因[14], 进而对其结构研究证明, CO基因编码一个转录因子调控植物对光合周期的响应, CO是植物光周期途径中的关键基因。