基因纳米复合物（精选7篇）
基因纳米复合物 篇1
聚合物纳米体系在药物传递与基因载体方面有着重要的科研价值与广阔的应用前景, 这方面的研究已经成为当今生物医学材料最活跃的领域之一。纳米控释系统所具有的特有的性质, 使它能够在药物与基因输送等其他方面具有很多方面的优越性, 比如它可以帮助释放药物, 从而延长药物作用的时间;它可在保证药物完好作用的前提下, 减少给药的剂量, 从而减轻或者避免毒副发生;它可以帮助保护核苷酸, 防止其被核酸酶降解;它还可以达到靶向输送的目的;可以帮助提高药物的稳定性, 有利于药物的存储;可以起到定位作用等。纳米控释系统是一种非常有前途的控释系统, 现对其研究越来越深入, 其用途也越来越广泛。
1 资料与方法
1.1 一般资料
用于治疗的聚合物纳米体系主要包括理性设计的聚合物药物、聚合物-蛋白质偶连体、聚合物-药物偶连体、连接药物的聚合物胶束以及聚合物-基因复合物等类型, 以聚合物为基础的治疗药物的粒径大多在几纳米与几百纳米之间。
1.2 方法
纳米控释系统是一种有前途的控释系统, 我们对它的研究越来越深入和透彻, 当然控释系统的医学用途也越来越广泛。近年来纳米控释使得我们在肿瘤组织和肿瘤细胞两个水平有了显著的提高。除此之外, 研究者们对近年来纳米控释系统在肿瘤治疗等方面的应用研究有了进一步的发展与提高。只要传统的纳米粒子进入人体的血液之中, 马上就会受到某些固定的单核吞噬细胞系统各器官中的巨噬细胞的迅速的调理反应, 这个速度是超级快的, 还没等到我们反应过来, 该调节作用已经完毕, 这样的结果就是大部分的传统的纳米粒子将巨噬细胞扫荡一空。当研究者们运用传统纳米粒子的这一特性进行运载抗肿瘤药物进行治疗这一工作时, 单核的吞噬细胞系统的以上特性将毋庸置疑地可以帮助使得抗肿瘤药物对位于单核吞噬细胞系统的肿瘤化疗效果明显得到提高。众所周知的是纳米粒子并不会迅速地被毛细血管壁所吸收然后进入血液循环之中, 而是渗透进入到注射部位周围的细胞间隙, 并渐渐地被毛细淋巴管吸收然后进入淋巴系统中。
然而为了更好地了解聚合物纳米体系在药物和基因载体中的应用, 我们还需要探讨两亲多糖纳米胶束作为药物的缓释载体的制备和释药研究, 医用纳米控释系统在治疗肿瘤方面的应用, 基因治疗在医学上的贡献等等。
探讨两亲多糖纳米胶束在药物缓释方面的应用, 使用动态光散射仪来观察两亲多糖纳米胶束的有效粒径的微小变化, 并且利用体外药物释放实验来考察研究它对不同水溶性药物的缓释作用效果。多糖材料具有可生物降解和生物相容性好等庞大的无可比拟的优势, 可有效避免或者降低纳米载体潜在的毒性的有效作用, 在相关实验中我们把源自天然的可生物降解的葡聚糖作为最优原料。纳米微粒在传递与控制释放系统的载体内降解较为缓慢或难以降解, 这一观点已经受到了人们的关注且在医学上做出了很大的贡献。纳米材料的这种特种材料的生物安全性是近年来备受关注的研究领域, 我们必须清楚地认识到良好的生物相容性是纳米材料运用于医药领域之中的首要条件。通过相关的试验来达到初步了解载药纳米胶束对不同水溶性药物的缓释规律的目的。使用溴化钾压片法进行制样的工作, 采用红外光谱法分别测定多个批样, 使用紫外分光光度计来完成测定胶束的透析液在EZQ 45波长处的吸光度并且还需要根据G, +DE溶液的标准曲线计算透析液中G, +DE的含量。求得它的胶束的药物在药物总量中所占的比重。
基因治疗正成为当今医学研究领域的热门课题, 随着当今多种纳米材料的涌现和近几年纳米生物技术的发展, 以纳米颗粒为基础的非病毒基因载体受到研究者的普遍推崇。基因治疗的成功除了需要特异的有效的目的基因外, 还不可缺少高效、安全和靶向的基因导入载体。
2 结果
理想的有效药物缓释制剂不仅可以减少给药次数, 而且还可保证给药间期平稳的血药浓度, 药物载体的研究有待于继续深一步的开展。因为纳米粒子被局部注射之后具有对淋巴系统的靶向特异性, 所以它可以作为针对淋巴系统原发肿瘤或转移瘤的一种化疗手段。我们不得不承认纳米控释系统在肿瘤的治疗方面将会被发扬光大, 它的生物相容性对人体无毒副作用。近几年来研究者们已开始将其与抗生素、抗肿瘤药物等结合制成药物缓释载体, 从而实现基因治疗的主动靶向性。
3 讨论
值得我们注意的是, 对生物相容性及其潜在的毒副作用的研究较少, 要达到最终的临床应用, 还需在这方面加强研究。以磁性纳米颗粒作为其靶向性和转染效率, 积极开发各种新型载体, 基因载体在基因治疗 (特别是肿瘤治疗) 中的应用是摆在我们面前亟待解决的问题。深入研究纳米载体转运机制, 提高纳米颗粒的磁性导航, 使基因转移至靶向部位, 达到定向基因治疗的目的。纳米控释系统作为一种新型的药物与基因的载体, 有着缓释、靶向、提高生物利用度等一系列的特点, 仅仅还只对一些肿瘤的动物模型有着极其好的疗效。但想要运用于人们的医疗事业中还需一些深入的研究, 这种现状是因为目前大多数的有关方面的研究还处在体外和动物体内的实验阶段, 要想成为临床常用剂型还需大量人体实验。纳米聚合物还有助于增大药物的药代动力学, 有着可以直接应用于药物治疗的潜力, 它将是未来新药的设计方向与发展趋势。
摘要：目的:探讨聚合物纳米体系在药物和基因载体中的应用。方法:含有共价结合药物的纳米聚合物在结构上更接近于一个化学体, 可以借助聚合物以共价键连接, 有利于实现定位、定时的释放, 因而在药物释放前不会对人体产生伤害。结果:对病人的损伤达到较小;多功能聚合物还可以隐蔽生物活性物质比如蛋白质多肽等, 使其具有EPR效应, 使其可以进入到带有疾病部位的血管或者是炎症组织处且不影响到正常的组织。结论:药物在带有疾病处释放, 能够减少副作用的发生。
关键词：聚合物,药物释放,癌症治疗,基因治疗
基因纳米复合物 篇2
关键词：纳米粒,基因治疗,RNA干扰
基因治疗是一种将外源基因导入目的细胞并有效表达,从而达到治病目的的治疗方法[1]。基因治疗中,高效安全的基因转染载体是一个重要研究课题。理想的基因转运系统,应具有较高的基因转染效率、良好的靶向性和生物相容性、较高的稳定性及生物可降解性。目前,基因治疗常用的载体系统主要包括两大类:病毒类载体(viral vector)和非病毒类载体(non-viral vector)[2]。病毒类载体虽具有较高的转染效率,但是在临床上暴露出的免疫原性和致瘤性等安全性问题,阻碍着它的进一步发展[3,4,5]。因而目前对基因治疗载体转运系统的研究重点从病毒载体系统转移到了非病毒载体系统。
壳聚糖纳米粒作为一种新型的基因递送系统,以其具备无毒性、生物可降解性和良好的生物相容性[6]、药物缓释和药物靶向传递[7],以及其本身带正电荷易与DNA、RNA结合等特性成为良好的基因载体[8]。但是,由于壳聚糖分子间氢键的存在,使它不溶于一般的有机溶剂和水。为了改进其溶解性,抑制其作为载体时被单核吞噬细胞(MPS)系统的识别,可通过接枝的方法将亲水的聚乙二醇链段引入壳聚糖链段中。
1 材料与方法
1.1 试剂及仪器
1.1.1 主要实验试剂
三聚磷酸钠(成都科龙化工试剂厂),壳聚糖(Aldrich公司),单甲氧基聚乙二醇5000(美国Sigma公司),l l'-羰基二咪唑(浙江临海市凯乐化工厂),甲醇、氢氧化钠、氯化钠等其他试剂均为一般国产分析纯。
1.1.2 主要实验仪器
纳米激光粒度分析仪(上海爱建纳米科技发展有限公司);pH计(Bechman公司);高速冷冻离心机(德国Sigma公司);电热恒温水浴箱(江苏省金坛市大地自动化仪器厂);台式恒温振荡器(江苏省金坛市大地自动化仪器厂);透射电子显微镜(日本Jeol公司);79-1磁力加热搅拌器(江苏省富华仪器有限公司);超净工作台。
1.2 实验方法
1.2.1 活化单甲氧基聚乙二醇
5000(MPEG-CDM)的合成称取适量单甲氧基聚乙二醇(MPEG)和l l'-羰基二咪唑(CDM)(MPEG∶CDM摩尔比为1∶6)于圆底烧瓶中,加入二氧六环-二甲亚砜(v/v 2∶1),37℃磁力搅拌24 h后,冷至室温,于冰水浴中、搅拌下滴加无水乙醚沉淀产物(白色沉淀),布氏漏斗抽滤,冷二氧六环-二甲亚砜-无水乙醚(2∶1∶3)适量洗涤沉淀,再用冷无水乙醚洗涤3次,真空干燥后备用。
1.2.2 壳聚糖-
聚乙二醇接枝共聚物(CS-PEG)的合成壳聚糖(CS)与MPEG-CDM按摩尔比1∶1投料于圆底烧瓶中加入CS,用0.7%盐酸溶液溶解后,再加入MPEG-CDM,37℃磁力搅拌;18 h后,冷至室温,滴加0.5 M氢氧化钠至pH 7～8(呈白色凝胶状),于冰水浴中、搅拌下滴加等量丙酮和2倍量无水乙醚,G4玻砂漏斗抽滤,冷水-丙酮(v/v 1∶10)适量洗涤沉淀,80℃干燥后备用。
1.2.3 空白壳聚糖-聚乙二醇纳米粒的粒径及ζ电位测定
形态测定:取少量纳米粒混悬液滴至铺有碳膜的铜网上,静止2 min,用滤纸吸干混悬液,再滴加2%(w/v)磷钨酸负染2 min,于透射电子显微镜下观察纳米粒形态,并选取几个有代表性的视野进行拍照。
粒径及Zeta电位测定:取纳米粒混悬液适量,加双蒸水稀释后用纳米激光粒度分析仪测定粒径、分散度及ζ电位。
1.2.4 Survivin si R NA的构建
根据Genebank提供的基因序列,编号为NM_001168,2 655 bp,利用从Genbank中寻找Survinvin基因的m RNA序列,参照si RNA设计原则,利用si RNA设计工具"siRNA Sequence Selector"设计针对Survivin的si RNA序列,再利用BLAST分析所设计序列的特异性。由上海吉凯生物公司体外合成靶向survivin si RNA。
1.2.5 壳聚糖-聚乙二醇纳米粒与survivin si R NA质粒结合物的制备
取纯化、干燥、灭菌的CS-PEG纳米粒10 mg,用0.3 mol/L氯化钠溶解,使其浓度为10 mg/m L,再稀释成10μg/m L。将提取纯化的重组质粒稀释至20μg/m L。在无菌条件下,以设计比例加入CS-PEG纳米粒,使DNA与纳米粒的比例(w/w)为4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶5、1∶10、1∶20,将一定浓度的CS-PEG溶液(pH 5.0)和500μL一定浓度的基因溶液(含一定浓度三聚磷酸钠,STPP)分别置于55℃水浴恒温20 min,精密吸取CS-PEG溶液500μL在漩涡混合条件下逐滴加入到质粒基因溶液中,混合30 min,即得载基因纳米粒混悬液。
1.2.6 纳米粒的包封率测定
精密量取λDNA标准品贮备液适量,用双蒸水稀释成一定浓度的对照品溶液,另取基因纳米复合物与不含DNA的纳米颗粒胶体溶液在40 000 r/min、4℃条件下超速冷冻离心后,精密吸取等量上清液分别作为供试品溶液与阴性对照液,以上溶液混匀后加入石英比色杯,用紫外分光光度计检测在260 nm处的吸光度,根据标准曲线,即可算出供试品溶液中游离的DNA含量,并按下式计算包封率:包封率(%)=(W总-W游)/W总×100%(W总:供试品总的DNA量;W游:上清液中游离的DNA量)
1.2.7 DNA保护性试验
为了验证基因纳米复合物对DNA的保护作用,选用核酸酶Ⅰ(DNaseⅠ)作为酶源进行抗核酸酶试验。吸取按不同比例配制的各样品或质粒DNA(pDNA)溶液20μL(相当于pDNA 1μg),分别加入130 U/m L DNase I 4μL,37℃反应15 min,0℃冰浴中放置30 min,中止反应,用含有0.5μg/m L溴化乙啶的8%琼脂糖凝胶进行电泳分析(100 V,30 min),同时与pDNA进行对照,观察纳米粒对DNA的保护效果。
1.2.8 基因-纳米复合物转染效率评价
取HT-29细胞传代接种于6孔板内,调整细胞浓度,使每孔细胞数为1×105个,常规条件下培养24 h,在显微镜下观察,细胞融合达到约90%时开始转染。转染前均换为不含血清的RPMI-1640培养基,细胞分为基因-纳米复合物组、和裸基因组,每组设3个复孔,转染时每组DNA含量相等,转染16小时后再换用RPMI-1640完全培养基。分别于转染24、48、72、96和120 h后,把培养板直接放在倒置荧光显微镜下观察,激发波长为490 nm,在400倍的视野中,每孔随机计数10个视野,分别计数荧光下和白光下的细胞数量,发出荧光的细胞占全部细胞的比例即为该批细胞的平均转染效率。
2 结果
2.1 壳聚糖-聚乙二醇纳米粒的的形态、粒径及ζ电位
由图1可见制备出的壳聚糖-聚乙二醇纳米颗粒近似球形、形态规则。其粒径为(61.1±12.6)nm,粒度分布均匀,粒径大都集中于53～68 nm之间,ζ电位为(36±6.2)m V。
2.2 质粒的提纯鉴定
经酶切和凝胶电泳法鉴定,转化成功了pGenesil-1质粒,并成功提取了pGenesil-1质粒;紫外分光光度计检测DNA浓度为2.1μg/μl,纯度为1.87。
2.3 包封率测定
随着CS-PEG浓度的加大,基因纳米复合物的粒径也逐渐增大,ζ电位也逐渐增大,而药物的包封率减少(即未被结合的DNA增加);载药量总的趋势是随DNA浓度的加大而增加。考虑到纳米粒的粒径是影响基因转运的重要因素,在一定范围内,粒径越大,其转染效率越低,再参考包封率和基因保护实验结果,基因/纳米为1∶5的条件制备的基因纳米复合物更适合进行基因转染。
2.4 载基因纳米颗粒对基因的保护作用评价
经琼脂糖凝胶电泳、照相结果显示裸基因完全被消化,孔内外看不到透亮条带,载基因纳米溶液中的游离DNA由于被酶消化孔外也看不到透亮带,但孔内的基因纳米复合物则不被消化,结合的基因越多,亮度越强,说明纳米粒对基因有很好的保护作用。
2.5 基因-纳米复合物转染效率评价
由流式细胞仪测得壳聚糖-聚乙二醇纳米粒介导的survivin RNAi基因纳米复合物在体外HT-29细胞上的细胞转染率为80.75%(n=3)。从转染效率比较来看,最大转染效率出现在转染后72h;在96 h、120 h仍有较高的转染效率,可能原因是纳米粒中由于含有聚乙二醇,能起到对基因的缓慢释放,同时也进一步证明纳米粒对基因有很好的保护作用;裸基因的转染效果明显低于基因纳米复合物,且持续时间很短,在72 h后看不到带荧光细胞,也充分说明了纳米载体的载基因功能和缓释功能。
3 讨论
近年来研究证明[9,10,11],利用RNA干扰技术沉默Survivin基因促进肿瘤细胞凋亡,能够使多种人类恶性肿瘤细胞的凋亡率显著增高、增殖速度明显减低。但是由于核酸酶的作用使Survivin si RNA会迅速在细胞中代谢掉,导致RNA干扰的作用十分短暂和有限。
壳聚糖纳米粒作为一种新型的基因递送系统,具备无毒性、生物可降解性和良好的生物相容性、药物缓释和药物靶向传递等性质。实验证明,在盐溶液或乙酸溶液中壳聚糖易与DNA结合,并且可以有效地防止DNA降解[12,13]。但由于壳聚糖分子间氢键的存在,使它不溶于一般的有机溶剂和水,而通过接枝的方法将亲水的聚乙二醇链段引入壳聚糖链段则能改进其溶解性,抑制其作为载体时被MPS系统的识别。
基因纳米复合物 篇3
关键词：银纳米粒子,复合纳米材料,电纺丝,制备
聚合物与贵金属粒子结合来制备贵金属粒子/有机复合纳米材料, 可大大提高结构高分子材料参与电子转移和输运的能力, 拓宽其可能应用的范围, 因而具有巨大的应用潜力。近年来, 以纳米银粒子填充聚合物合成功能性复合材料已经取得很大进展, 已经报道的聚合物有聚乙烯醇、聚吡咯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等。纳米复合材料由于分散相与基体相之间的界面面积特别大, 如分散相粒径为15～20nm 时, 其界面面积高达160～640 m2/g , 当分散相和基体的性质充分结合起来时, 将对基体的物理和化学性质产生特殊的作用。银/聚合物复合材料同时具有了纳米银和聚合物的优良特性, 并赋予材料一些特异或新的功能, 从而使其在光子学、电子学、生物医学和信息材料学等诸多领域具有广阔的应用前景[1,2,3,4,5] 。因此其制备与应用已经成为目前纳米材料研究领域关注的热点课题。
静电纺丝法是通过高压静电来制备连续的聚合物纳米纤维的重要方法。它是将高分子、纳米微粒/聚合物溶液或熔融体在几千至几万伏的高压静电场作用下产生正电荷, 带电荷的高分子或纳米微粒/聚合物溶液或熔体首先在喷射孔处形成Taylor圆锥形液滴, 在高压电场所产生的拉伸力克服了液滴的表面张力后, 该带电液滴形成喷射流, 由于电场的作用以及自生电荷的相互排斥而发生劈裂, 该喷射流进一步被拉伸, 然后由于溶剂挥发或熔体冷却而固化, 最后以无纺布状的形式形成纤维状纳米材料[6,7,8]。
1 银纳米粒子/聚合物复合纳米纤维的制备
在电纺丝方法的研究初期, 人们将注意力主要集中在单组分高分子纤维的制备方法和电纺丝理论的研究方面。自本世纪初, 这一领域的研究开始转移到有机/无机纳米复合材料的制备, 特别是一维有机/无机纳米复合材料的研究。近年来, 运用电纺丝技术将贵金属纳米粒子引入聚合物纳米纤维矩阵中已倍受人们关注, 其中最早被研究的是将银纳米粒子添加到聚合物纳米纤维当中, 可以获得具有相应功能的银纳米粒子/聚合物复合纳米纤维。
运用电纺丝技术制备银纳米粒子/聚合物复合纳米纤维在当前纳米材料研究中占有极其重要的地位。丙烯腈上的腈基 (CN) 贡献出它们外层轨道的孤对电子和银的空轨道形成配位键, 银离子可以和丙烯腈上的 CN 键络合, 使得聚丙烯腈 (PAN) 成为银的理想载体。在2003年, Yang等在首次获得表面光滑、尺寸均匀、直径较细的PAN纳米纤维后, 这为原位合成银纳米粒子提供了非常好的条件, 最后在还原剂作用下, 采用液相原位化学还原法先制备银纳米粒子, 银离子被还原为单质银, 并迅速被PAN 包裹起来, 形成了相应的溶胶。又将 (PAN) 保护的银溶胶利用静电纺丝技术制备了银/PAN复合纤维, 并且发现银纳米粒子的晶体结构在高压电场下能保持稳定, 从而为进行该类研究打下了很好的基础[9]。PAN纤维及银/PAN纤维的电镜照片见图1。
2006年, Yang等在聚乙烯吡咯烷酮 (PVP) 溶液中, 采用液相原位化学还原法, 乙醇直接还原银离子得到银纳米粒子;在PVP上的O原子有孤对电子与银粒子的外层电子空轨道形成配合键, 生成的银粒子就被高分子包覆起来, 阻止了粒子之间紧密接触而生成沉淀。并用以上溶液为原料来制备银/PVP复合纳米纤维, 并且对其拉曼光谱性质进行了研究[10]。
抗菌材料中的核心成分是抗菌剂。抗菌剂根据其基质材料的不同, 可以分为天然抗菌剂、有机抗菌剂和无机抗菌剂三种。无机抗菌剂是通过将无机材料固有的稳定性和抗菌成分的抗菌高效性及广谱性相结合, 比有机抗菌剂有更为显著的优点, 在抗菌陶瓷、抗菌搪瓷、抗菌塑料、抗菌纤维制品及抗菌涂料等方面都有广泛的应用。银系无机抗菌剂以其优越的抗菌性能得到了广泛的关注。为提高抗菌剂的活性和使用分散性能, 以纳米粉体为载体的抗菌剂成为研究热点。Youk的研究小组研究含有银纳米粒子的聚合物纳米纤维及其抗菌性能的研究方面成果显著。最初, 他们对如何控制稳定的纳米银粒子的尺寸和晶型, 改善其形貌, 避免纳米银粒子制备后的团聚现象, 在聚合物基质内制备出尺寸均一、形状可控的纳米银粒子做了较为细致的研究。他们制备了含有银纳米粒子的PAN纳米纤维、PVP纳米纤维及PVP/聚乙烯醇 (PVA) 复合纤维, 对这类含有银纳米粒子的聚合物纳米纤维制备条件进行了初步探索[11,12]。Son等采用电纺硝酸银/纤维素复合溶液, 得到含有银盐的纤维素纤维, 通过紫外灯照射还原阴离子, 得到了银纳米粒子/CA复合纳米纤维;复合纤维对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和绿脓杆菌具有较好的抗菌性能[13,14]。
Youk等报道了银/PVA复合纤维的制备过程, 并对其生物抗菌性能进行了研究, 表明复合纤维对金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌具有较好的抗菌性能[15,16]。最近, 他们在非水溶性聚合物纳米纤维内掺杂了银纳米粒子制得了银/PCL-PU复合纤维, 这种非水溶性的抗菌纤维必将有良好的应用前景[17]。
2 结 语
无机纳米基因载体的研究进展 篇4
随着医药和纳米技术的发展,人类基因组研究已经从结构遗传学进入了功能遗传学研究,使基因治疗癌症成为可能。基因治疗是将外源目的基因通过载体或其它途径导入体内并在靶组织和靶细胞中显示出相应生物学效应而达到治疗疾病的一种方法。基因治疗的关键是获得高效、安全的基因转运载体。基因载体主要分为病毒型载体和非病毒型载体两种。目前,有近80%的一期临床实验仍采用病毒型载体[1]。病毒载体最大的优点是转染率高,一般可达90%以上,但其制备复杂,且存在一些关键的安全性问题,如内在毒性、短期或长期潜在的危险性(如对宿主的免疫原性及导致插入基因融合而激活癌基因[2]),而且其免疫原性和致瘤性迄今仍未彻底解决,这些缺点使病毒型载体的临床应用受到很大限制。非病毒型载体具有无免疫原性和致瘤性、无毒或极低毒性、运载量限制小、制备简易、易与DNA结合、不受DNA片段大小的限制、通过靶向修饰可以转运DNA到靶细胞等优点,很大程度上弥补了病毒型载体的缺陷,使基因治疗应用于临床成为可能。
目前已报道的非病毒型载体有裸DNA、脂质体、高分子多聚物、纳米载体等,其中裸DNA的操作复杂、转染率低以及存在对细胞的潜在损伤等限制应用的诸多因素。近年来有关脂质体的应用报道很多,但脂质体也存在稳定性差、难以保存、基因不能稳定长效表达、转染时需去除血清、阳离子脂质体的细胞毒性等问题。随着纳米生物技术的发展,应用纳米载体作药物及基因载体成为研究热点[3]。
1 无机纳米载体特性
无机纳米载体一般是指粒径为纳米量级(1~100nm)的无机微粒。随着载体粒径的减小,其比表面积增大,表面能也迅速增加,产生大量悬键和不饱和键,从而出现许多化学活性点。这些活性点易与有机物或基因发生相互作用,从而达到负载作用。而且,无机纳米载体易稳定分散、制备和贮存方便、装载量大,能穿过组织间隙并被细胞吸收,可通过人体最小的毛细血管和血脑屏障,且无免疫原性和致瘤性,低毒或无毒,这些特性使其在药物和基因输送方面具有许多优越性。
2 无机纳米载体负载与转染基因机制
无机纳米载体负载基因的方式主要是通过物理、化学等相互作用吸附或接枝上DNA或基因而成载体-DNA复合物。Parker A L等[4]研究发现,纳米载体-DNA复合物呈某些规则的形状,DNA的一级结构保持不变,二、三级结构发生了变化。而且不同形貌的纳米载体负载基因的形式不同,对于球状微粒,DNA或基因负载在其表面(如氧化铁,量子点等);对于多孔微粒,DNA或基因负载在其孔内;对于层状微粒,DNA或基因负载在其层内。负载有DNA或基因的无机纳米粒子穿过细胞膜,再到细胞核,将DNA或基因转运到生物体细胞中进行表达,目的基因的表达标志转染的成功。其具体转染过程如下:首先,负载有DNA或基因的载体进入细胞内并被释放,在该过程中,如果DNA不能及时从内涵体中逸出,就会被溶酶体酶降解(溶酶体中的pH值低于5)。此外,当DNA等被释放到细胞质中后,同样会有一些特定的酶(核酶等)降解DNA。其中载体-DNA复合物的入胞机制仍然不明确,主要存在内吞入胞、非内吞路径及直接穿入细胞膜等可能途径,但大多数学者更倾向于内吞入胞的机制[5]。其次,DNA等导入细胞核并表达。一般来说,分子都是通过核孔复合物进入细胞核。核孔复合物是一个插入到双层核膜中的蛋白质大分子,允许约9nm的溶质自由通过。生物大分子或纳米粒子要通过核孔则需要信号介导的转运分子:这些分子或纳米粒子必须携带核定位序列才能与转入子a结合,形成的复合物再触发结合转入子b,在GTP酶——Ran的协助下通过核孔复合物进入细胞核。尽管对核定位进行了大量研究,但仍无法确定DNA进入细胞核的途径。例如,人们对于DNA是单独进入细胞核还是与纳米粒子整合后一起进入细胞核仍无定论。尽管如此,人们主要倾向于两种主要理论:一种是纳米粒子在内涵体或细胞质中被溶解,然后释放DNA转运进核;另一种是携带DNA的纳米粒子直接到达细胞核表面,然后DNA转运进核。
载体DNA复合物被哺乳动物的细胞摄取的过程中大致要克服5个主要障碍[6]:pDNA的酶稳定性、载体DNA的入胞、DNA从内含体的释放、DNA在胞核的定位、目的基因的表达。多种研究报道表明,影响纳米载体转染效率的因素有:不同载体的类型、载体的组成、粒径大小、表面电荷、热力学性质、转染细胞类型、N/P比值、体外物理环境的干预(热、电、磁、超声等)等。
3 无机纳米载体
近几年来无机纳米基因载体已经成为研究负载药物与基因载体的热点。已经报道了多种载体,主要有二氧化硅、磷酸钙、碳纳米管、氧化铁、量子点和层状双氢氧化合物等。
与有机纳米载体相比,无机纳米粒子具有许多显著的优点:纳米粒子能包裹、浓缩、保护核苷酸,使其免遭核酸酶的降解;具有生物亲和性,易在表面偶联特异性的靶向分子;能使核苷酸缓慢释放,提高转染效率和转染产物的生物利用度;代谢产物少,副作用小,无免疫排斥反应等。
3.1 二氧化硅
二氧化硅纳米颗粒具有分散单一性和悬浮稳定性。超纯的二氧化硅纳米颗粒表面经阳离子氨基修饰后,不仅可以保护质粒DNA免于酶解,而且可转导细胞并表达相关蛋白质,与未加修饰的二氧化硅纳米颗粒相比,修饰后的二氧化硅纳米颗粒可以克服输送DNA过程中的诸多限制[7],如经亲水、疏水性修饰后形成的核-壳类胶束可以装载亲水或疏水药物或染料;修饰成分的基团可行再修饰以增加其靶向性;在离心、蒸发等操作中及有机溶液中不易被破坏;可经Si-C键的破坏而降解。Chen等[8]制备了粒径为10~100nm的硅纳米颗粒并用其转导HT1080细胞,结果显示其转导效率为70%,并且可以有效保护DNA不被降解,同时未见细胞毒性作用;另外通过研究SNAP在体内的分布表明SNAP可以通过血脑屏障、血前列腺屏障、血睾丸屏障。Li等[9]利用PLL对硅纳米粒进行化学修饰合成了PMS-NP。PMS-NP是一种可以经口服途径介导的基因治疗的新型载体,在胃小肠的黏液细胞中可观察到病毒基因的表达。Jiaofeng Peng等[10]制得有负载反义寡核苷酸(Antisense oligonucleotides)的氨基化二氧化硅纳米颗粒(Amino silica nanoparticles),其平均粒径为25nm,能保护反义寡核苷酸不被核酸酶分解,体外实验还表明,氨基化二氧化硅纳米颗粒可提高反义寡核苷酸的转染率,阻止癌细胞的分化与增殖,并具有很好的生物相容性和无毒性。上述研究结果表明硅纳米颗粒是基因治疗及药物输送等领域的一个很有潜力的载体。
Mobil首先合成了具有高表面积、高孔容量和可控孔径(2~30nm)的多孔二氧化硅颗粒(Mesoporous silica particle),此研究一经报道就引起了大量研究人员的注意,并将其作为催化剂、吸咐剂和主体材料等加以应用。近年来,随着方法与技术的进步,更多的多孔二氧化硅纳米颗粒被合成出来,经修饰后植入高分子、蛋白质、DNA等而用作基因载体。Fei Qin等[11]采用溶胶-凝胶法合成出高分散性、粒径为50~250nm的多孔二氧化硅纳米颗粒(Mesoporous silica nanospheres),经阳离子多聚物修饰后,通过静电作用吸附DNA分子,使DNA分子装入多孔二氧化硅的孔中,成功地实现了多孔二氧化硅负载DNA在细胞间的转运。另外,对于孔径较小的二氧化硅纳米颗粒,可用溶胀剂使其孔径胀大,从而实现植入DNA分子等。Mamoru Mizutani等[12]用溶胀掺入法制备出一种单分散多孔二氧化硅球,由于溶胀剂的掺入,多孔二氧化硅中的孔径由2.5nm变为5.0nm;溶胀后的二氧化硅再与Fe(NO3)3·9H2O和H2PtCl6·6H2O反应制得含有Fe与Pt的二氧化硅。该颗粒具有磁性和中间多孔结构,可植入量子点、酶、药物和DNA分子。Brian G.Trewyn等[13]合成了球形与管状的多孔二氧化硅纳米材料,通过转染癌细胞与非癌细胞的实验表明,其被细胞内吞作用吸收的效率不仅与其形态(聚集程度、粒径等)有关,还与细胞类型有关。多孔二氧化硅具有很好的生物相容性和高吸附量,是一种理想的基因载体,但现在还处在制备颗粒与负载分子阶段,对其吸附量、释放效果和机理还未有研究。
3.2 磷酸钙
微米尺寸及纳米尺寸的磷酸钙粒子已被成功制备并用于载体系统及DNA疫苗的佐剂,以DNA双螺旋形成离子混合物,后者易通过细胞膜并被内含体介导通过离子通道入胞。磷酸钙进行体外转导已作为实验室研究的常规应用,但因磷酸钙易集聚的特点限制了其体内转导的应用。Bisht等[14]首次报道了应用磷酸钙纳米粒介导pGFP转染Hela细胞,结果发现其转导效率高于商品化转导剂PolyFect,表明磷酸钙纳米粒可以作为基因治疗中一种有效的非病毒型载体,但临床应用还存在一定的转染技术问题。Hamid等[15]用胰岛素分解软骨细胞,再将细胞分散在磷酸钙/核酸沉淀中,又将软骨细胞粘附在一起放置24h,从而使软骨细胞的转染率达到了80%。此方法还可应用于其他细胞基因治疗。Claudio等[16]优化吸附有DNA的磷酸钙纳米颗粒转染成骨细胞的实验,得出了影响其转染细胞的两个关键性因素,即Ca2+与Cl-的浓度与纳米颗粒的粒径。Ruchi Singh等[17]通过反相微乳液法合成了包裹pDNA的磷酸钙颗粒,通过凝胶电泳实验表明,包裹pDNA的磷酸钙没有被降解,且HEK-239细胞和肝细胞的体外转染与体内管内转运实验都表明,磷酸钙颗粒具有延长基因表达的重要作用,而且文章还指出,在临床应用上,包裹少量pDNA的磷酸钙具有更高的转染效率。Thomas等[18]成功地合成了包裹有机染料Cy3和药物神经酰胺的磷酸钙颗粒,其粒径为20~30nm。通过对有机染料Cy3发出荧光的检测,可反映出包裹药物的转染效率和纳米颗粒的在体内的吸收机制,并在体外将神经酰胺成功导入人体血管的平滑肌细胞,表明磷酸钙纳米颗粒可有效地用作染料与药物的运载,实现生物成像与潜在的干预治疗。另外,羟基磷灰石(Hydroxyapatite,HA)作为一种稳定的磷酸钙盐,由美国牙科医生Brown和Chow于1987年首先发现,是临床上最常用的骨修复材料,其粒径减小到纳米尺度时,可作为基因治疗或药物缓释系统的载体。Liu等[19]使用不同浓度的HA溶液静脉注入白兔体内观察其毒性反应及对兔血液中电解质、酶的影响,结果显示纳米羟基磷灰石没有累积毒性,对电解质浓度影响较小。另外经小鼠静脉注射HA纳米粒后发现在脑、肝、脾、肺、肾、胃、肠、前列腺、睾丸等器官均有纳米颗粒分布[20]。朱晒红等[21]通过电沉积-水热合成法制备了40nm左右的HA混悬液,用其与增强型绿色荧光蛋白基因结合体外转导SGC7901细胞,结果发现HA有良好的生物相容性,72h后转导效率为脂质体转导效率的80%,转染效率约为50%左右,充分证明了HA作为基因载体的可行性。孙虹等[22]采用HA纳米颗粒经体内、体外试验,成功地将神经营养素3和绿色荧光蛋白基因转导入内耳细胞并产生广泛表达,对Hela细胞的体外转导率约为15%。与硅纳米颗粒等相比,以上研究均证实HA与生物膜的良好相容性且可以与DNA结合并转运其通过细胞膜实现表达,但转染效率有待提高。HA纳米颗粒的最大优势在于其具有更好的生物相容性、强大的核酸吸附能力以及可以根据需要制备成相应口径、尺寸、三维结构等要求的载体材料。进一步探讨其转导机理、毒理及制备工艺以提高其转导率是促使HA纳米粒应用于基因治疗的关键之一。
3.3 碳纳米管
碳纳米管(Carbon nanotube,CNT)具有典型的层状中空结构特征,其管身部分由六边形碳环微结构单元组成,端帽是由含五边形的碳环组成的多边形结构。CNT按照结构与维数可分为单壁碳纳米管(Single-walled carbon nanotube,SWNT)和多壁碳纳米管(Multi-walled carbon nanotube,MWNT)。CNT具有许多优良的性质,如高导电性、高导热性、高强度和高韧性,已经被用在场致发射材料、储能材料、分子电子学和原子力电子显微镜等方面[23,24]。
近几年来,CNT又被应用于生物医学领域,Alberto Bianco等[25]报道了新型被修饰载体CNT可用于作氨基酸与多肽、抗原、药物与基因等的载体。Yanrong Wu等[26]成功地合成了一种负载有单链DNA探针的SWNT(DNA探针也进一步被高分子所修饰),它在细胞中有很好的生物稳定性。与没有修饰的相比,这种被DNA探针修饰的SWNT具有更高的自我运载能力与生物稳定性,因此,还可利用DNA探针来监测细胞内处于分子或离子水平的状态。Mingwu Shen等[27]将强酸处理的MWNT用聚乙烯亚胺(PEI)修饰,用乙酸酐和丁二酸酐与MWNT表面上PEI的胺基反应,分别得到表面不带电和带负电的MWNT;在体外将其导入FRO细胞(一种甲状腺癌细胞系)和KB细胞(表皮癌细胞系)都表明其生物相容性与其表面电荷有关,表面呈中性与带负电的MWNT在质量浓度达到100μg/mL时是无毒性的,而表面带正电的MWNT在质量浓度达到10μg/mL时就具有了毒性。Bifeng Pan等[28]用树状聚酰胺(PAMAM)修饰MWNT(dMWNT),再接上反义寡核苷酸(asODN),导入人体乳腺癌细胞系MCF-7细胞与MDA-MB-435细胞,肝癌细胞系HepG2细胞,与表面修饰有胺基的MWNT相比,第五代PAMAM修饰的MWNT-asODN具有最大的转染率,表明dMWNT有助于解决现在反义治疗中的难题,在基因和药物运载方面有很好的发展前景。由上所述,所有用作基因载体的CNT都经过了功能化与修饰,原因是未修饰的CNT不能溶于体液而具有毒性,而修饰后的CNT则具有良好的生物相容性并且无毒。所以,通过进一步研究CNT的功能化与修饰,可使CNT成为一种新型的具有潜力的非病毒型载体。
3.4 氧化铁
氧化铁包括三氧化二铁(γ-Fe2O3)和四氧化三铁(Fe3O4),由于具有磁性,在外加磁场的作用下可实现靶向性。为了增大其生物相容性,在Fe3O4表面修饰壳聚糖[29]、多聚赖氨酸[30]等可以改善其性能。应用外加磁场靶向导入是一种有效的体内外转导方法,不仅提高了转导效率,而且载体用量减少,明显减轻了毒性反应,降低了费用,转导时间也大大缩短,这种新型纳米载体有极大的应用前景。
氧化铁纳米载体经表面化学修饰后,可用于核磁共振成像、组织修复、免疫测定、细胞分离、药物运载和温热治疗等。为了更好地应用磁性纳米颗粒作为基因载体,必须解决好两个问题,一是负载物释放快速的问题,二是负载物被分解的问题。Mahmoudi等[31]为了解决这两个问题,合成了一种交错包覆聚乙二醇与富马酸氯酯共聚物(Poly(ethylene glycol)-co-fumarate,PGEF)的氧化铁纳米颗粒,与没有交错包覆的相比,这种颗粒能减慢药物,释放达21%,其生物相容性也大大超过其他聚合物修饰的颗粒。Kazumasa Kamei等[32]将腺病毒(Adenovirus,Ad)嫁接在金/氧化铁磁性纳米颗粒(Gold/iron-oxide MAgnetic nanoparticles,G/IO-MNP)上形成Ad-G/IO-MNP的运载系统,并将该系统转染小老鼠黑色素瘤细胞(B16BL6);与单独植入Ad相比,Ad-GoldMAN系统在磁场的作用下,其基因表达效率是前者的1000倍。Alke Petri-Fink等[33]分别用聚乙烯醇(PVA)、乙烯醇/聚乙烯醇(VA/PVA)、聚乙烯亚胺(PEI)来修饰超顺磁性氧化铁纳米颗粒(Superparamagnetic iron oxide nanoparticles,SPI-ONP)。这些系统在水与磷酸盐缓冲液中都是稳定胶体溶液,与同样浓度的VA/PVA相比,A/PVA-SPIONs具有更低的毒性;而与PEI和PEI-SPIONP相比,负载有DNA的PEI-SPIONs系统在转染实验中表现出无毒性。Kristi L Hultman等[34]报道了一种目标免疫超顺磁性氧化铁颗粒(Immunotargeted superparamagnetic iron oxide nanoparticles,ITSIONP)。ITSIONP能应用于磁共振诊断与作为潜在治疗肾脏疾病的基因载体;ITSIONP是以单分散的氧化铁作为核心,再用磷脂修饰其表面,使其具有靶向细胞表达来抗原的功能。Kievit等[35]报道了一种修饰有壳聚糠(Chitosan,CP)和PEI的SPIONP(CP-PEI-SPIONP),其是具有高效基因运载与高转染率的基因载体,由转染小鼠C6神经胶质瘤细胞(C6 rat glioma cells)实验显示,PEI-SPIONP具有的最高转染率为90%,但细胞生存率仅为10%,而CP-PEI-SPIONs也达到了50%,且细胞的生存率近100%。虽然CP-SPIONP转染率不到10%,但细胞生存率达到了100%,说明PEI-SPIONP有一定毒性,修饰上CP的CP-PEI-SPIONP就没有毒性了。Xiangyang Shi等[36]报道了用树状聚胺酯(PAMAM)3代修饰SPIONP,再在PAMAM上接上叶酸分子(FA),在体外将其导入KB细胞,尽管带负电荷的颗粒与表面带负电荷的细胞存在斥力,但FA-PAMAM-SPIONP还是可以被KB细胞吸收。上述研究表明,修饰后的氧化铁颗粒有良好的生物相容性、低毒、转染效率高和靶向性强。此种载体的独特性是可在外加磁场的作用下达到靶向释控作用,这是其他载体无法比拟的。
3.5 量子点
量子点(Quantum dots,QDs)是一种粒径为几个纳米的微小粒子,由Ⅱ-Ⅵ或Ⅲ-Ⅴ半导体组成,如CdSe、ZnSe、GaAs、InAs等。20世纪70年代末QDs就引起了物理学家、电子工程学家和化学家的注意,但直到20世纪90年代后期,随着QDs制备技术的不断提高,QDs才在生物、医学研究中展现出极大的应用前景。Timothy等[37]总结QDs在生物医学领域主要有如下7方面的应用:荧光能量共振转移、基因工程、荧光标记细胞蛋白、检测病原体与毒素、动物体内成像、体内载体和肿瘤生物学研究等。
Ⅱ-Ⅵ和Ⅲ-Ⅴ半导体QDs(如CdSe、CdTe)存在其固有的毒性,而且Bharali DJ等[38]指出由于Ⅲ-Ⅴ半导体QDs以共价键结合,比Ⅱ-Ⅵ半导体QDs以离子键结合具有更低的毒性。QDs具有毒性的原因可能有两个:表面阳离子的存在(如Cd2+)和光自由基的形成。近3~4年来的研究表明,表面修饰能降低QDs的毒性,甚至报道还有完全无毒性,使得QDs也可用作基因载体。Akiyoshi Hoshino等[39]用ZnS涂层CdSe的QDs作为基因载体,其表面经过多重修饰后,再接上优化绿色荧光蛋白(eGFP)的核定位序列,并导入哺乳动物细胞,成功地实现了表达,转染率为8%左右。Lifeng Qi等[40]将Amphipol与QDs结合,产生了一种新的基因运载系统,其效果在无血清与完全细胞培养基中优于脂质体,且比聚乙烯亚胺(PEI)在基因沉默实验中具有更低的毒性。由于QDs固有发射荧光和优良光学属性,使得此运载系统广泛应用于SiRNA运载与体内体外成像。Cornelia Walther等[41]发现QDs表面经过修饰处理后,与多肽形成运载系统,在生物细胞中能稳定存在且没有毒性;并指出该系统能很好地运载RNA进入细胞。Li hua等[42]合成了CdS量子点,并用PEI修饰,在PEI/QDs数目比为200时,其粒径为24nm,Zeta电位为+15mV,并且表现出最大的转染效率(是PEI/QDs的数目比(20)的17倍),但少量降低了线粒体约30%的活性。现阶段对QDs的研究表明其转染率低,且具有一定毒性,但其固有发射荧光的优良光学属性,使QDs作为基因载体有很大的发展前景。
3.6 层状双氢氧化合物
层状双氢氧化合物(Layer double hydroxide,LDH)是带有正电荷的纳米两维结构的化合物,含有两种不同的金属阳离子,其结构通式为[M1-2+xMx3+(OH)2]x+(An-)x/nmH2O[43]。近年来的研究表明,由于LDH具有高生物相容性、高药物负载性、低毒性和可控形貌与粒径等,是潜在的高效非病毒载体[44]。Zhi Ping Xu等[45]通过控制其水热条件(时间、温度、浓度等),制得了粒径为40~300nm的LDH纳米颗粒,可用于细胞的药物和基因运载。Le′a Desigaux等[46]合成了一种LDH/DNA的杂交化合物,其中DNA分子作为模板,引导LDH的自组装沉积,处在LDH的中间夹层,其厚度为1.96nm,可被宫颈癌代传细胞(Hela cell)吸收,通过调节酸度,可控制DNA分子的释放。Zhi Ping Xu等[44]合成了两种不同形貌的Mg2Al-LDH,一种是典型六边形状(边长为50~150nm,厚为10~20nm),另一种是典型的杆棒状(宽为30~60nm,长为100~200nm),通过转染哺乳动物细胞发现,杆棒状的LDH能转移到细胞核中,而六边形的则仍保留在细胞质中,说明不同形貌的载体其运输效率也有差别。LDH作为纳米基因载体研究较少,但其对DNA分子等的吸附、低毒性及对药物释放的控制等优良性质,必将使得LDH成为一种潜在的基因载体。
4 结语
目前,对无机纳米粒子作为基因载体的研究,多在可控合成纳米粒子、表面修饰和体外与体内试验时期,还没有达到临床应用阶段。上述二氧化硅、磷酸钙、碳纳米管、氧化铁、量子点和层状双氢氧化合物等无机纳米基因载体的共性是生物相容性好、低毒甚至无毒、易制备且成体低,但转染率较低。多孔二氧化硅具有优良吸附性,但其尚处在制备颗粒与负载分子阶段,吸附量、释放效果与机理尚未涉及;磷酸钙及羟基磷灰石具有极好的生物相容性,且常可达到过细胞膜后进行表达;经修饰过后的氧化铁具有无毒性、靶向释控性,且能在小动物体内达到一定的转染率;量子点的独特光学性质,使其有利于体内外成像,便于机理研究;碳纳米管和层状双氢氧化合物具有较高的药物和基因运载能力,但其对基因的转染率提高有待进一步研究。前期的研究表明了纳米载体用于基因治疗的可行性,尤其是通过改变纳米载体的物理、化学、生物等性质来调节其作为基因载体的转运功能,使其转导效率有了很大提高。尽管纳米载体的转导效率仍没有达到令人满意的转染效果,有必要对其毒理、转导机制及长期的安全性评估进行深一步的研究。相信随着纳米生物技术、材料医学、生物医学等学科的飞速发展,一种安全、高效、智能化的纳米载体终将出现,一旦其转导水平达到临床应用水平,必将造福于无数基因治疗患者。
摘要：介绍了无机纳米基因载体的特性及其负载与转染机理,主要综述了二氧化硅、磷酸钙、碳纳米管、氧化铁、量子点和层状双氢氧化合物等的研究进展,分析了其研究现状,并提出了进一步的研究方向及发展趋势。
基因纳米复合物 篇5
1 材料与方法
1.1 试验试剂、仪器及用品
氯化钙、磷酸氢二钠、柠檬酸钠,购自成都科龙化学试剂厂;DMEM培养基,购自Gibvo公司;质粒基因、Pc DNA3.1-GFP质粒、HEK 293细胞,均由四川大学华西医学院生物治疗国家重点实验室保存。
磁力搅拌器,购自河南郑州南北仪器设备有限公司;粒度仪,购自英国马尔文公司;荧光倒置显微镜,购自ZEISS公司。以上仪器均由四川大学华西医学院生物治疗国家重点试验室提供。
1.2 试验设计
1.2.1 磷酸钙纳米颗粒的制备
10μg质粒与150μLCa Cl2溶液混匀,静置5 min,放在磁力搅拌器上搅拌,逐滴加入150μL Na2HPO4溶液,用柠檬酸铵调节p H值至7.2。根据搅拌时间分为1,2,3,4 h组。
1.2.2 纳米颗粒粒径和稳定性检测
1)粒径检测:使用粒度仪检测制备完成的纳米颗粒粒径大小;2)稳定性检测:将制备好的纳米颗粒于4℃过夜,观察溶液变化。粒径和稳定性检测试验重复3次,观察差异。
1.2.3 电泳试验对比上清液与沉淀纳米颗粒含量
取搅拌时间1 h组100μL溶液,800 g离心5 min,分别取上清液和沉淀,进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.4电泳试验对比不同搅拌时间组纳米颗粒含量
分别取搅拌时间为1,2,3,4 h组各100μL溶液,800 g离心5 min,取各组沉淀进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.5 荧光标记法检测纳米颗粒转染细胞量
取10μg Pc DNA3.1-GFP质粒制备磷酸钙载体,在磁力搅拌器上搅拌3 h。取HEK 293细胞,在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养,待细胞长至铺满培养皿面积约70%时铺于24孔板中,每孔细胞数为2×104个。将包裹完成的纳米颗粒按照每孔2μg质粒DNA的量加入到细胞中,同时加500μL全培养基;对照组每孔加入2μg没有包裹纳米颗粒的裸露Pc DNA3.1-GFP质粒,与试验组在相同试验条件下培养;转染12 h后更换培养基;转染48 h后,用荧光倒置显微镜检测两组细胞转染效率。
2 结果与分析
2.1 纳米颗粒的粒径及稳定性
见表1。
nm
磷酸钙纳米颗粒制备完成后,用纳米粒度仪检测纳米颗粒粒径,结果所有时间组磷酸钙纳米颗粒粒径均小于600 nm,属于易被细胞内吞范畴。1 h组制备的磷酸钙纳米颗粒粒径最小,为343.1 nm;3 h组制备的磷酸钙纳米颗粒粒径最大,超过2 h组和4 h组。说明在一定时间内磷酸钙纳米颗粒粒径大小与搅拌时间呈非线性关系。置于4℃过夜,溶液仍保持均匀透明,无颗粒生成,证明该纳米颗粒稳定性好。试验重复3次,结果一致。
2.2 电泳试验对比上清液与沉淀纳米颗粒含量结果
见图1。
A.1 h组沉淀;B.1 h组上清液。
由图1可知,纳米颗粒在沉淀中大量存在,而在上清液中没有发现纳米颗粒。
2.3 电泳试验对比不同时间组纳米颗粒含量结果
见图2。
A~D.1,2,3,4 h组沉淀。
由图2可知,各组沉淀都有大量质粒基因,1 h组载体包裹质粒基因最多、包封率最高。
2.4 荧光标记法检测纳米颗粒转染细胞结果对比
见图3。
将搅拌1 h制备好的纳米颗粒转染HEK 293细胞,48 h后在荧光显微镜下检测转染效率,每组细胞镜下随机选取5个视野,统计每个视野的转染效率。由图3可以看出,磷酸钙纳米颗粒包裹的荧光质粒Pc DNA3.1-GFP转染细胞的转染率约为20%;裸露的荧光质粒转染细胞,荧光显微镜下观测到微弱荧光,转染效率约为0.4%。
A.纳米颗粒包裹Pc DNA3.1-GFP转染;B.裸露的Pc DNA3.1-GFP转染。
3 讨论
基因转染技术已成为了解基因功能和调控机制、建立疾病模型、获得基因水平的免疫,进而探索当前无法治愈的各种先天遗传性疾病或后天获得性疾病(如癌症、糖尿病、血友病等)的基因治疗方法的途径。裸DNA分子由于尺寸较大,易被核酸酶降解,又因含有阴离子磷酸基团而具有的亲水性等原因,直接转染进入细胞,稳定性和转染效率均不高[3],人们一般用载体介导基因进入靶细胞。
在基因载体中,由于病毒带有感染特定细胞的特性,因此病毒载体的转染效率最高[4]。虽然为了保证安全性,几乎所有介导基因进入靶细胞的病毒都会被删除某些致病基因,导致其具有选择复制缺陷,比如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒和单纯疱疹病毒[5];但这些病毒载体仍然具有比较强的免疫原性。复制缺陷型病毒复制产生的病毒蛋白可引起机体的免疫反应,使靶细胞受损、减少,导致目的基因表达的持续时间减少[6]。这些病毒的残留基因片段还会引起插入突变[7]。此外,病毒载体还有较低的外源基因携带量、致癌性等缺点[8]。
病毒载体具有的诸多难以修正的缺陷,迫使人们开始更多地关注非病毒载体。在非病毒载体中,磷酸钙粒子对比难以制备的金属粒子或金属复合物和仍受限于安全问题的碳纳米管,具有巨大的优势,如低成本、多功能性、应用广泛性、潜能巨大的装载基因量、可控的基因释放等。而且,磷酸钙遍布身体各处,如骨骼和牙齿,所以磷酸钙载体具有极好的生物相容性和生物可降解性,体内的磷酸钙浓度甚至可以由肾脏调控[9]。
本试验通过电泳及荧光标记法找出最优的磷酸钙纳米基因载体制备条件,为以后基因转染试验中制备磷酸钙纳米基载体的制备条件提供及另一种选择。
但是如果只是优化制备条件的话,磷酸钙基因载体的一些不足之处仍难以改变。许多研究人员在优化制备条件之外,还使用各种方法改造磷酸钙纳米颗粒,使其稳定性增强,粒子粒径减小,转染效率提高。Y.Liu等[10]利用改进过的硫酸鱼精蛋白修饰磷酸钙纳米颗粒,结果稳定性增强,可以抑制其粒径增长。研究发现,钙磷比在100~300之间、纳米粒径在25~50 nm之间时,纳米载体在宫颈癌细胞和小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1中转染效率最高。S.Bisht等[11]和I.Roy等[12]在反相微乳液环境中制备磷酸钙纳米粒子,得到100~120 nm粒径的颗粒。这些磷酸钙纳米颗粒的体外转染效果高于商用的阳离子脂质体。X.Yang等[13]使用磷酸钙纳米颗粒作为基因载体,诱导鼠牙髓干细胞中骨成形素蛋白2的转染,结果转染效率很高。
在接下来的后续试验中,将对磷酸钙纳米基因载体进行更加深入的研究,不仅优化条件,还要对其附加一定的修饰改造。相信随着研究的深入,它终将成为理想的基因治疗载体而获得持续发展。
摘要：为了优化磷酸钙纳米基因载体制备条件,提高磷酸钙纳米载体的转染效率,试验采用普通磷酸钙纳米基因载体制备方法,根据搅拌时间(1,2,3,4 h)分为4组,通过电泳测定上清液和沉淀中载体含量和纳米颗粒含量,最后使用荧光标记法检测磷酸钙纳米基因载体转染效率。结果表明:纳米颗粒在沉淀中大量存在,而在上清液中没有发现纳米颗粒;搅拌1 h制备的纳米颗粒粒径最小,且沉淀中拥有最多的纳米颗粒含量,使用此组载体转染细胞效率为20%。说明搅拌1 h为磷酸钙纳米基因载体的最佳制备条件。
基因纳米复合物 篇6
在前期工作中,我们构建和筛选了针对Survivin基因的shRNA重组质粒载体,制备了能够高效转染的基因载体——壳聚糖-聚乙二醇纳米颗粒,并制备出壳聚糖-聚乙二醇纳米粒介导的Survivin RNAi基因纳米复合物。初步实验结果表明本实验所制备出的CS-PEG是低细胞毒性的,纳米颗粒的大小适合用作基因递送,具有良好的基因保护功能、长循环能力和较高的载药量、包封率(另文报道)。本实验探讨了该纳米基因载体介导RNA干扰沉默Survivin基因对大肠癌细胞增殖和凋亡的影响,为寻找大肠癌基因靶向治疗提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
大肠癌HT-29细胞株购自中南大学细胞生物学教研室。Metafectene pro转染脂质体(德国Biontex公司);RPMI-1640培养基,杭州吉诺生物医疗技术有限公司;胎牛血清,天津T13D公司;胰蛋白酶,Gibco公司;Trizol试剂,美国Invitrogen公司;DNA Marker ladder 2000,大连宝生物工程公司;Western Blot检测试剂盒,美国Promega公司;碱性磷酸酶标记的羊抗兔二抗,美国Promega公司;RT-PCR试剂盒,大连宝生物工程公司;细胞凋亡检测试剂盒,武汉博士德生物工程有限公司;Survivin si RNA靶序列的设计则根据Genebank提供的基因序列,利用从Genbank中寻找Survinvin基因的m RNA序列,参照si RNA设计原则,设计针对Survivin的si RNA序列,再利用BLAST(http//www.ncbi.nih.gov/blast/Blast.cgi)分析所设计序列的特异性。以与人类基因无同源性的无关序列HK作为阴性对照。将设计的序列交上海吉凯生物公司体外合成靶向Survivin基因的si RNA(GGACCACCGCATCTCTACA)和1条阴性对照si RNA(GACTTCATAAGGCGCATGC)。
1.2 方法
1.2.1 细胞的复苏和培养
将装有人结肠癌细胞株HT-29的冻存管从液氮罐容器中取出后迅速在37℃水浴缸中摇动融化,移入无菌离心管,加入4m L含10%小牛血清的RPMI-1640培养基,37℃1000 r/min离心10 min,除去上清以除去冻存液中的二甲基亚矾(DMSO);加入含血清的培养基5 m L,混匀置入25 cm的培养瓶中,用含100 m L/L胎牛血清的RPMI-1640进行常规培养,待细胞融合度达80%,消化收集细胞。
1.2.2 RT PCR检测转染前后HT-29细胞Sur-vivin mRNA的表达
将HT-29细胞接种于培养瓶中,分为A组(转染壳聚糖-聚乙二醇纳米粒介导的Survivin shRNA的基因-纳米复合物)、B组(转染结合相同Survivin shRNA的脂质体)和C组(阴性对照shRNA)。各组细胞在不同时间用Trizol提取细胞RNA,进行RT PCR检测。
1.2.3 细胞凋亡率和细胞周期分布的检测
实验分为A组、B组和C组,每组设3个复孔,细胞培养及转染方法同前。转染后72 h,将细胞用0.25%胰酶常规消化,轻轻吹打,制成单个细胞悬液。PBS漂洗3次(离心1 000 r/min,5 min),弃上清,加入预冷的70%冰乙醇1 m L振荡混匀,-20℃内固定24 h后使用。取固定好的细胞,1 000 r/min离心5 min,去上清,PBS洗涤2遍。加入50μg/m L的RNAse,室温避光30 min,去除细胞的RNA。加入60μg/m L的碘化丙啶(PI),溶液避光染色30 min后待用。采用Beckon/Dickinson Facssort型流式细胞仪,在480 nm波长处检测,进行细胞凋亡率检测及细胞周期分析。应用相应程序软件进行资料的处理和分析;细胞增殖指数(PI)=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%。
1.2.4 MTT法检测细胞死亡率
将HT-29细胞按1×10/孔接种于96孔板,常规培养;分别于转染后第24、48和96小时弃去各孔培养基,加入MTT及无酚红RPMI-1640;继续孵育4 h后加入DMSO,振荡10min使结晶充分溶解;在酶联免疫仪上,570 nm处测定光吸收值,记录结果;按下列公式计算细胞死亡率:细胞死亡率=(1-实验组平均D值/对照组平均D值)×100%
1.3 统计学分析
采用SPSS 13.0统计软件包进行统计学处理。计数资料以均数±标准差描述,成组的计量资料采用方差分析,比较采用t检验或者最小显著差法(LSD),以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 HT-29细胞中S urvivin mRNA的表达
从图中见GAPDH的m RNA在基因转染前后的含量大致相等,说明制备的纳米载体及重组质粒均不影响GAPDH的表达,以Survivin/GAPDH比值作为Survivin m RNA的相对含量方法具有可靠性。在C对照组和B组均可见明显的Survivin目的DNA条带,B组的Survivin m RNA的表达丰度较C组有所下降,但并不明显。A组的Survivin基因m RNA水平较B、C组明显下调(附图),组间差异有统计学意义(P<0.01)。
2.2 HT-29细胞凋亡率和细胞周期分布的检测
各组细胞的凋亡率和增殖指数如表1,结果显示:A组细胞凋亡率显著高于其他各组,细胞的增殖指数明显低于其他各组;C组细胞死亡率最低,增殖指数最高。
注:1)与阳性对照组和阴性对照组比较,P<0.001;
2)与阴性对照组比较,P<0.05
2.3 CS-PEG介导RNA干扰沉默Survivin基因对HT-29细胞死亡率的影响
利用MTT法进行检测,在转染后24、48和96h,实验各组细胞死亡率如表2,用平方根反正弦转换数据进行完全随机设计方差分析,通过两两比较结果提示:转染后第24、48和96小时,A组细胞死亡率显著高于其他各组,C组细胞死亡率最低(见表2)。
3 讨论
Survivin是近年来发现的一种凋亡抑制因子,属于凋亡抑制蛋白(IAP)家族的新成员。Survivin能抑制Fas、bax及Caspase-7诱导的细胞凋亡,而在已凋亡的细胞中,Survivin m RNA的表达显著下调。癌细胞由于Survivin对凋亡的抑制,细胞得以继续分裂,使肿瘤邻近和远隔部位转移灶形成[9]。近年来研究证明Survivin不仅抑制肿瘤细胞凋亡,还与肿瘤细胞的增殖有关,肿瘤组织中过度表达Survivin会促使肿瘤细胞不断分裂增殖,加快肿瘤生长。作为IAP家族中目前发现的唯一同时参与细胞凋亡与周期调控的分子,Survivin对维持细胞快速增殖及肿瘤细胞的“正常生理功能”具有非常重要的作用。其异常表达可能与直肠癌的恶性生物学行为有关,Survivin表达阳性的直肠癌更倾向于出现转移、血管浸润等恶性行为[10]。更重要的是,Survivin具有高度选择性地表达于胚胎发育组织和大多数肿瘤组织,而在正常成熟组织中不表达[10,12]。基于以上特性,Survivin可作为肿瘤治疗的理想靶基因,阻断其表达有特异性地防治癌症的发生发展和转移的作用。因此,应用RNAi技术沉默Survivin诱导大肠癌细胞凋亡及抑制其生长增殖,是一个新的研究热点。但是RNA干扰仍存在一个关键问题,即如何使尽量多的shRNA分子到达目的细胞并持续发挥干扰作用,目前多采用脂质体直接包裹人工合成的改性si RNA或包裹携在宿主细胞中表达si RNA的前体分子(即shRNA)进行转染。但以上两种方法的缺陷在于:基因表达时间短,表达量低,无法达到满意的效果。为了解决这一问题,本研究在前期制备出了壳聚糖-聚乙二醇纳米粒作为基因载体,并由其介导针对人Survivin的shRNA,形成基因纳米复合物。初步实验结果表明本实验所制备出的CS-PEG是低细胞毒性的,纳米颗粒的大小适合用作基因递送,具有良好的基因保护功能、长循环能力和较高的载药量、包封率。
本实验证明壳聚糖-聚乙二醇纳米粒作为基因载体介导RNA干扰沉默Survivin基因能高效转染结肠癌细胞株HT-29并使其携带的外源性基因有效表达,同时,研究结果也表明:其能够长期、高效地抑制结肠癌细胞(HT-29)中Survivin蛋白的表达,诱导癌细胞凋亡并抑制其增殖。另外,壳聚糖-聚乙二醇纳米基因载体的特性,使得该纳米粒介导的Survivin RNAi基因纳米复合物,能较长时间地抑制结肠癌细胞HT-29中的Survivin基因,且能够克服RNA干扰在肿瘤的基因治疗中作用短暂和不能持久作用的不足。
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基因纳米复合物 篇7
1 实验部分
1. 1 原料
聚乙烯醇( PVA1799,醇解度99mol% ,聚合度1700 ±50) ,山西三维集团股份有限公司; 微晶纤维素,柱层析,国药集团化学试剂有限公司; 浓硫酸,98% ,分析纯,昆山东南化工材料有限公司; 二甲基亚砜( DSMO) : 分析纯,天津市富宇精细化工有限公司; 多元醇类化合物TPOH,自制; 蒸馏水,自制。
1. 2 仪器与设备
同步热重分析仪( TGA) ,SDTQ - 600,美国TA公司; 电子万能试验机,UTM6000,深圳SUNS公司; 动静态激光光散射仪,CGS -3 型,德国ALV公司; 扫描电子显微镜( SEM) ,JSM- 6510 型,日本电子公司。
1. 3 样品的制备
NCC制备: 在装有搅拌器、 冷凝管的三口烧瓶中加入100 m L质量分数的64% 稀释浓硫酸和7 g微晶纤维素,在45 ℃ 水浴条件下搅拌反应1. 5 h。反应结束后,在搅拌下将产物倒入1000 m L去离子水中,待静置分层后倾倒出上层清液,剩余部分用5% 的氢氧化钠水溶液中和,然后经5 次离心分离、水洗涤得到糊状物,然后放了45 ℃ 的真空烘箱中干燥,得到纳米纤维素,经粉碎机粉碎后得到纳米纤维素粉末。
PVA / NCC复合材料的制备: 将自制多元醇与蒸馏水配制成复合改性剂,在加入一定量的NCC超声搅拌30 min后,再加入干燥的PVA粉末,溶胀48 h后,在160 ℃ 下通过熔融加工制备PVA/NCC纳米复合材料,其中NCC的含量占PVA质量的0% 、1% 、3% 、5% ,记为0、1、3、5。
1. 4 性能测试
( 1) TGA分析: 采用同步热分析仪测试PVA/NCC纳米复合材料的热稳定性。氮气气氛,升温速度为10 ℃ /min,测试温度范围为: 40 ~ 600 ℃ 。
( 2) 激光粒度分析测试: 采用动态激光光散射仪测试了制备的NCC在分散液中的粒度大小以及粒度分布。
( 3) 力学性能测试: 将PVA/NCC纳米复合材料制成4 mm宽哑铃型样条,采用电子万能试验机测试其力学性能。拉伸速度为100 mm/min,标距为: 50 mm。
( 4) 扫描电子显微镜测试( SEM) : 采用扫描电子显微镜( SEM) 进行观测并拍摄成像,观察NCC在PVA基体中的分散。
2 结果与讨论
2. 1 NCC的粒度表征
动态激光光散射表征: 称取二份0. 3 g NCC粉末分别加入到300 g水、300 g的二甲基亚砜( DSMO) 的500 m L的三口烧瓶中,制备二种分散体系,在超声条件下搅拌1 h,得到NCC分散的悬浮液,测试光散射。测试结果如图1,从图1 中可以看出,在水和DSMO二种介质下,得到的NCC粒子平均尺寸在90 nm左右,说明通过在酸性条件下水解微晶纤维素成功的制备了纳米尺度的纤维素晶须( NCC) 。
2. 2 热稳定性分析
图2 为NCC、PVA、PVA/NCC复合材料的受热分解TG、DTG曲线。从图2 可知: NCC的热稳定性好,温度在300 ℃ 以上才发生分解。PVA的热稳定性较差,在200 ℃ 以上就有降解,最大热分解温度为255 ℃ 。NCC与PVA复合材料在温度超过200 ℃ 也发生了热分解,但最大热分解温度为270 ℃ ,比纯的PVA提高了15 ℃ 。通过DTG也可以看出,加入NCC可以明显降低PVA的热分解速度。这说明NCC在一定程度可以提高PVA的热稳定性。这是由于: PVA的分解的第一阶段为,脱醋酸和水形成双键的过程,第二阶段了双键的裂解［6］。NCC是一种高度结晶化的纤维素,纤维素与PVA一样具有多羟基结构,NCC中的羟基与PVA侧链羟基间可产生氢键作用,抑制了PVA的羟基脱水分解,进而降低了PVA的热分解速度,提高了PVA的热稳定性。
2. 3 SEM扫描电镜照片
图3 是NCC、PVA、PVA/NCC的表面SEM照片。从图3中纯NCC的SEM可明显看出,通过酸水解微晶纤维素制备的NCC的结构成针棒状,直径为纳米级,具有较大的长径比,可作为聚合物复合材料的增强晶须。PVA材料的表面SEM照片看出,纯的PVA具有光滑、均匀的表面。当添加3% 后,NCC在PVA基体中呈白色颗粒状,且白色颗粒在PVA基体中分散均匀,没有明显的团聚。当掺量达到5% 时,白色颗粒的分散密度明显增加,且有团聚的现象。说明,PVA与NCC基体的相容性较好,NCC在PVA基体中具有较好的分散性,但随着NCC含量的增加,逐渐出现团聚的趋势,所以NCC含量不能超过5% 。
2. 4 PVA / NCC复合材料力学性能
图4 为PVA/NCC纳米复合材料的力学拉伸曲线。从图4中了看出: 纯PVA材料拉伸强度为36. 9 MPa,断裂伸长率为200% ,掺入NCC可以增加PVA的力学性能,且随着NCC含量的增加,纳米复合材料的拉伸强度逐渐增大。当NCC掺量为5% 时,PVA / NCC复合材料的拉伸强度为62. 9 MPa,比纯的PVA材料的拉伸强度增加了70. 5% 。观察断裂变形发现,加入NCC使得PVA的断裂伸长率变小,说明NCC降低了PVA复合材料的韧性,提高了复合材料的刚性。这是由于,NCC是一种强度极高的纤维状材料,根据复合材料体系的纤维增强理论,当纤维状的NCC在PVA基体中能较好的分散,可提高了基本材料的力学性能,由图3 可知,当NCC含量在5% 以下时,其在PVA基体中分散性好,所以可以增加PVA基体的抗拉强度。
3 结论
通过酸水解微晶纤维素制备了NCC,NCC在一定范围内在PVA基体中具有很好的分散性,且可以提高PVA的热稳定性和抗拉强度,降低断裂伸长率,当其含量为5% 时,抗拉强度可达62. 9 MPa,比纯的PVA提高了70. 5% 。
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