基因多态论文（精选12篇）
基因多态论文 篇1
猪应激综合征(PSS)的发生是由氟烷基因的隐性突变引起的,与猪应激综合征密切相关[1];氟烷基因对繁殖力和肉质有负效应,而对瘦肉率具有正效应[2]。现已证明,应激综合征是由一对氟烷基因(Hal N,Haln)控制,Hal N基因对Haln基因表现为不完全显性。研究发现,骨骼肌兰尼定受体(RYR1)经胰蛋白酶消化后,电泳后有3种带型,分别为显性纯合子Hal N Hal N、杂合子Hal N Haln和隐性纯合子Haln Haln。Hal N Hal N表现为氟烷阴性(抗应激猪),Haln Haln表现为氟烷阳性(应激敏感猪)。Fujii等确定了基因的单碱基突变引发了氨基酸的改变,从而导致受体蛋白结构与功能的改变[3]。因此,氟烷基因(RYR1)被作为影响猪肉质性状的候选基因之一。
荷包猪是是东北民猪的一个小型类群,是我国宝贵的地方良种资源,已列入《国家畜禽品种资源保护名录》,具有优秀的繁殖性能和优良的肉用品质。但由于荷包猪体型较小,生长速度缓慢,目前荷包猪只有很小的保种群体。大白猪、长白猪与杜洛克猪具有高生长速度、高瘦肉率和低脂肪的特点,是生产三元商品猪的主要种猪类型。
本试验通过对辽宁大白猪、长白猪、杜洛克及荷包猪种猪群体RYR1基因的多态性进行研究,为种猪候选基因标记辅助选择奠定基础,同时为荷包猪的保种提供分子遗传学的依据。
1 材料与方法
1.1 试验动物
荷包猪83头由辽宁省家畜家禽遗传资源保存利用中心提供,其他品种299头来自辽宁各地猪场,每个个体采集耳组织样1 g左右。采集后的样品迅速浸泡在75%酒精溶液中,冷冻保存。
1.2 试验方法
1.2.1 DNA的提取
采用传统的苯酚-氯仿抽提法提取基因组DNA,TE Buffer溶解后,-20℃保存。
1.2.2 引物设计与合成
参考文献报道的序列设计引物上游5′TCC AGT TTG CCA CAG GTC CTA CCA′,下游5′ATT CAC CGG AGT GGA GTC TCT GAG 3′。
1.2.3 PCR产物扩增
PCR反应总体系为20μL,PCR反应组分如下:其中10×buffer 2μL,dNTP(2.5 mmol/L)1μL,引物(20 pmol/μL)各1μL,MgCl2(2.5 mmol/L)1μL,Taq DNA聚合酶(10 U/μL)0.2μL,DNA模板50 ng,加双蒸水至20μL。PCR反应条件:95℃预变性4 min,94℃变性45 s,58℃退火30 s,72℃延伸1 min,共30个循环,最后72℃延伸10 min,降温至4℃保存。PCR产物用1%琼脂糖电泳检测。
1.2.4 PCR-RFLP分析及电泳检测
按HhaI内切酶说明书要求,酶切659 bp的扩增产物,PCR产物10μL,内切酶HhaI(10 U/μL)0.5μL,加超纯水至20μL,37℃恒温3 h,产物用2%琼脂糖凝胶电泳分析。
1.3 基因型及基因型频率
基因频率是指同一基因座上两个等位基因或多个复等位基分别在群体内该基因座上的基因总数中所占的比率。各基因的频之和等于1。
其中,Pi:第i个等位基因的频率;i:纯合复等位基因;j1,j2,……jn:与i共显的第1到第n个等位基因;N:群体总数。
基因型频率是指决定该性状的基因座上的两个等位基因或多复位基因所组成的各种基因型的个体分别在群体中所占的比率各基因型频率之和等于1。基因型频率=基因型个体数/测定群体总数。
用x2值检验基因型的观察值和期望值之间是否符合Hardy-Weinberg平衡。公式:x2=∑(观察值-期望值)2/期望值。纯合子基因型的预期值=(基因频率)2×样本数;杂合子基因型的预期值=2×等位基因1频率×等位基因2频率×样本数。
2 结果与分析
2.1 PCR扩增片段结果猪RYR1基因PCR扩增产物片段长度659 bp,电泳结果如图1所示。
注:M为100 bp DNA mar ker;1～5为659 bp RYR1基因扩增产物
2.2 猪RYR1基因PCR-RFLP分析
HhaI内切酶酶切消化RYR1基因未发生突变时,内切酶HhaI可将PCR扩增的659 bp的特异片段酶切成493 bp和166 bp两条带,基因型为NN(Hal N Hal N);当RYR1基因都发生突变(C-T)时,HhaI限制内切酶识别位点消失,659 bp扩增的片段不能被酶切消化,电泳后只有一条带,基因型为nn(Haln Haln);当一个RYR1等位基因发生突变,而另一个正常,用HhaI酶切可以观察到659 bp﹑493 bp和166 bp一共3条带,基因型为Nn(Hal NHaln),见图2。
注:M为100 bp DNA mar ker;1,2,3为NN型;4为Nn型。
2.3 基因型及基因频率的分布及Hardy-Wein-berg平衡性检验
适合性检验表明,在HhaI酶切位点上,外来群体与荷包猪的基因频率和基因型频率均达到了Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。结果见表1。
注:*表示P>0.05(x20.050(1)=3.84)
3 讨论
本试验对不同猪群的氟烷基因频率进行检测,结果显示在长白、大白和杜洛克猪中均检测出杂合子Hal N Haln,频率分别为2.46%、5.21%和9.88%,所有猪群中未能检测到纯合子Haln Haln。检测结果表明外来猪种均有氟烷敏感基因,但基因突变率低于国内外报道的数据[4,5],这可能跟近年来国外一些育种公司纷纷推出的无氟烷基因种猪有关,同时也可能和这些品种在辽宁地区引种时间较长,经多代繁育后与国外同一品种在遗传基础上有一定差距。鉴于氟烷基因的负面影响,应该从种猪群体中淘汰,下一步应该扩大检测群体,将氟烷基因从辽宁种猪中予以剔除。检测发现荷包猪基因型均为Hal N Hal N,即全部为氟烷阴性纯合子,这是否与荷包猪具有良好的抗应激性能有关,还待进一步研究。
本研究对荷包猪保种群体RYR1基因遗传特点进行了研究,填补了东北荷包猪RYR1基因多态性的研究空白,也为今后荷包猪的杂交利用及选育提供了分子生物学理论依据。研究结果还可为RYR1基因作为分子标记在今后育种计划的应用提供理论依据。
参考文献
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基因多态论文 篇2
脱碘酶基因多态性与疾病关系的研究进展
微量元素硒(Se)是一种人体必需的微量元素,在人体组织中主要是以硒半胱氨酸(Se-Cys)和硒蛋氨酸(Se-Met)的形式存在,构成了硒蛋白或含硒酶,是许多具有重要生物功能的硒酶的活性中心,与机体的免疫应答及抗氧化作用等生理功能密切相关.哺乳动物体内硒蛋白主要有谷胱甘肽过氧化物酶、脱碘酶家族(脱碘酶1、脱碘酶2和脱碘酶3)、SEPP、硒蛋白W、硒蛋白N和硫氧还蛋白等.脱碘酶是甲状腺激素代谢中最重要的转化酶,对维持机体甲状腺激素水平起着决定作用,很多的研究结果还表明,脱碘酶的基因多态性与许多疾病的发生有关,可能是相关疾病的`易感基因.本文就脱碘酶基因多态性与疾病的关系研究做一综述,以期为相关疾病治疗与预防提供新的思路.
作 者：宋瑞霞 熊咏民 SONG Rui-xia XIONG Yong-min 作者单位：西安交通大学医学院地方病研究所,环境与相关基因教育部重点实验室,陕西西安,710061刊 名：国外医学(医学地理分册)英文刊名：FOREIGN MEDICAL SCIENCES(SECTION OF MEDGEOGRAPHY)年，卷(期)：30(4)分类号：Q51 Q581 R188关键词：硒蛋白 脱碘酶 基因多态性 甲状腺激素 易感基因
基因多态论文 篇3
关键词：黑羽番鸭；生长激素基因；体质量；屠宰性能
中图分类号： S834.2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）09-0030-04
收稿日期：2013-12-04
基金项目：中国农业科学院家养动物种质资源平台建设项目；江苏省农业三新工程项目[编号：SXGC（2013）361]。
作者简介：王丽华（1972—），女，辽宁营口人，硕士，副教授，主要从事家禽生产与科研工作。E-mail：jstzwlh2008@163.com。目前，水禽生长方面的功能基因研究主要是围绕下丘脑-垂体-生长轴调节过程中的基因。生长激素（growth hormone，GH）是动物垂体前叶合成、分泌的一种单链蛋白类激素，具有种属特异性，在刺激生长、促进代谢、强化其他内分泌激素方面具有重要作用，还对动物生殖功能产生影响[1]。通过对动物（包括人和畜禽）GH基因的深入研究，目前已明晰其基本结构。通常，畜禽GH分子量为21～22 ku，由186～191个氨基酸组成。动物GH基因一级结构主要有如下特点：包括人类在内的灵长类动物中，GH基因拷贝数较多；GH基因主要由5～6个外显子和4～5个内含子所组成，且GH基因的外显子数量和大小存在种间特异性；GH基因的cDNA长度一般为650～1 200 bp。在1988年，Chen等首次克隆获得了820个碱基对的鸭GH基因cDNA序列，编码216个氨基酸，含有1个27个残基的信号肽，该序列与鸡高度同源[2]。2004年GenBank上才有了鸭GH基因全序列的报道，该序列包含了 5 219个碱基对，同样编码216个氨基酸，包含了5个外显子和4个内含子。虽然有了鸭GH基因全序列，但是在各个鸭品种GH基因多态性方面开展的研究工作较少，鉴于此，本试验拟采用PCR-SSCP方法检测黑羽番鸭GH基因序列中潜在的SNPs，并分析不同基因型间体质量、屠宰性能之间的差异，为GH基因功能研究提供参考资料。
1材料与方法
1.1试验对象
试验所用黑羽番鸭由江苏农牧科技职业学院提供，选择健康黑羽番鸭135只进行饲养，其中公鸭70羽，母鸭65羽。在初生（0周龄）及2、4、6、8、10、13周龄时测定禁食6 h后的体质量；10周龄时，从翅静脉采血2 mL，采用肝素钠抗凝，用于提取DNA。13周龄时，对所有黑羽番鸭进行屠宰测定，测定指标为宰前活质量、屠体质量、半净膛质量、全净膛质量、腿肌质量、胸肌质量、肝质量、心质量、腺肌胃质量、腹脂质量等，用公式计算出相应指标占有的比例。
1.2引物设计
根据GenBank中公布的水禽GH基因序列，设计了多对引物用于检测黑羽番鸭群体中存在的SNPs。引物由生物公司进行合成。试验所用引物序列及信息见表1。表1试验所用引物序列及信息引物名称引物序列（5′→3′）产物长度1.3DNA提取和检测
采用酚/氯仿法抽提黑羽番鸭基因组DNA，并溶于TE中。用核酸浓度测定仪测定其浓度和纯度，然后稀释成100 ng/μL备用。
1.4PCR扩增
PCR反应物组成：10×PCR buffer（不含Mg2+） 2.5 μL、10 mmol/L dNTPs 2 μL、25 mmol/L MgCl2 1.5 μL、10 pmol/L上下游引物各1 μL、5 U/μL Taq酶0.2 μL、100 ng/μL DNA模板1 μL，加ddH2O至25 μL。
PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，54～56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。
1.5PCR产物检测及分型
PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶中电泳，结束后用凝胶成像系统检测扩增结果。条带单一清楚、長度大小符合的产物才能用12%非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离。点样前样品需要进行处理形成单链，经过5 V/cm的电压电泳过夜后，用银染显色，然后进行基因型分析。
1.6测序
挑选纯合基因型的PCR产物进行切胶回收，连接到PMD18-T载体上转化到大肠杆菌DH5α上，经过大量繁殖后，通过鉴定后提取质粒送公司进行测序分析。
1.7统计分析
测序所得序列通过DNAMAN软件进行比对获得不同基因型之间具体的序列差异。采用SPSS 13.0软件中单因素方差法分析不同基因型之间体质量和屠宰性能的差异。
2结果与分析
2.1SSCP检测结果
以黑羽番鸭基因组DNA为模板与所设计的6对引物分别进行PCR扩增，扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶检测，扩增片段与预期大小一致且特异性好，方可用于SSCP分析。
在SSCP结果分析中发现，只有引物GH16扩增的片段可以检测到多态，聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染结果见图1。由图1可知，在黑羽番鸭群体中共检测到3种基因型，纯合子定义为AA、BB，杂合子定义为AB。
nlc202309042148
2.2不同纯合基因型的克隆和测序
取AA、BB基因型多个PCR产物进行回收、克隆、测序。AA和BB基因型之间序列比较发现，存在4个单核苷酸变异，均位于第1内含子，分别为第1 251位点A-C突变、第 1 322 位点A-G突变、第1 378位点T-C突变、第1 440位点G-A突变（图2）。
2.3不同基因型（基因）频率在黑羽番鸭群体中的分布
在引物GH16检测到的不同基因型在黑羽番鸭群体中分布情况见表2。由表2可知，杂合子AB型基因型频率最高，为0.614 8；AA型次之，为0.229 6；BB型最低，为0.155 6。A等位基因频率比B等位基因频率高0.074 0。
表2引物GH16不同基因型及等位基因在黑羽番鸭群体中的分布
素材样本量
（羽）基因型频率等位基因频率AAABBBAB黑羽番鸭1350.229 6 0.614 8 0.155 6 0.537 0 0.463 0
2.4遺传特性分析
根据GH基因突变位点等位基因频率可推算出黑羽番鸭群体平均纯合度为0.502 7，杂合度为0.497 3，多态性信息含量为0.373 6（表3）。
2.5生产性能与多态位点的关联性分析
2.5.1GH16多态位点对体质量性能的影响由表4可知，BB型公鸭体质量在所有时间点均处于最高值，初生时BB型公鸭体质量显著性高于AA型；在4、6、8周龄时3种基因型间体质量无显著差异；在2、10、13周龄时，BB型体质量显著性高于AA、AB型，AA与AB型之间无显著差异。除0周龄外，其他各周龄母鸭均以BB型体质量处于最高值；母鸭各周龄不同基因型之间均无显著性差异。表4引物GH16不同基因型间体质量比较
2.5.2GH16多态位点对屠宰性能的影响由表5可知，BB型公鸭活质量、屠体质量、半净膛质量、全净膛质量均显著高于AA型、AB型；胸肌质量、腿肌质量、肝质量在3种基因型间无显著差异；BB型腹脂质量、心质量显著高于AB型，AA型与BB型、AB型无显著差异；BB型腺肌胃质量显著高于AA型，AB型与AA型、BB型无显著差异。
10个屠宰质量指标在母鸭3种基因型之间均无显著差异。表5引物GH16不同基因型间屠宰性能质量比较
3讨论
目前已经开展了大量畜禽关于GH基因多态方面的研究，结果表明其存在大量的多态位点，以猪GH基因多态性研究成效最为显著。在猪GH基因5′端、编码阅读框和3′端序列中总计26个SNPs，18个在内含子上，6个在外显子2中，1个在外显子3中，1个在外显子4中，某些SNPs对猪生产性能有显著性影响[3-7]。牛GH基因多态性研究主要是分析其对产奶量、乳脂率、乳蛋白的影响程度[8-10]。在禽类上，鸡GH基因在禽类上研究较早[11-15]，鸭研究处于相对落后阶段，尚有许多工作需要开展。许盛海等在鸭中检测到了11个点突变，分别为5′调控区序列2个，外显子4序列中1个，内含子2序列中7个，内含子3序列中1个[16-17]。邹剑敏等在GH基因外显子上第3 01位点发现了C-T突变，分析了这个突变点对血浆中低密度脂蛋白（LDL-C）含量具有显著影响[18]。吉文林等在我国6 个地方鸭品种中检测到了GH基因1个C-T突变，位于外显子4中，分析了该突变在不同鸭群中的分布情况[19]；伍革民等应用PCR-SSCP技术分析了5个品种鸭GH基因潜在的点突变，检测序列覆盖了5′和3′调控区及部分外显子和内含子，共发现了5个多态位点[20]；李慧芳等发现GH基因第4外显子C3701T 的突变对高邮鸭最长连产天数和双黄率有显著相关[21]。
本试验设计了6对引物，其中引物GH16出现了多态位点，在第1内含子上发现了4个SNP，分别为G945A、T1039G、A1251C和A1322G，形成了3个基因型，分别为AA型、AB型、BB型。2个等位基因的频率较为接近，黑羽番鸭的纯合度为0.502 7，多态信息含量为0.373 6，说明黑羽番鸭该位点上群体呈现中等多态。在杂合度越大、PIC越高的群体中遗传变异的程度就越大，在选育过程中可进行选择的潜力越大；以此类推，在杂合度越小、PIC越低的群体中遗传变异的程度就越小，对群体进行选择的潜力就越小。黑羽番鸭处于中等水平，说明对GH基因该位点还有选择空间。公鸭13周龄BB型的体质量（同宰前活质量）、屠体质量、半净膛质量、全净膛质量显著高于AA型和AB型，3种基因型的胸肌质量与腿肌质量差异不显著；在内脏器官组织中，BB型腹脂质量、心质量显著高于AB型；AA型、AB型、BB型 3种基因型间屠宰指标百分比无显著差异；母鸭所有指标在3种基因型间均无显著差异。畜禽的生产性能是由内在遗传因素和外在环境因素共同作用的结果，不同性别的鸭在其内在因素的影响下，可导致同一基因在性别之间所起作用效果存在差异，导致最终所起作用不同。
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KIR基因多态性与丙型肝炎 篇4
1.1 一般资料
54例CHC患者均来自我院2005年4月至2006年8月住院病人, 诊断符合中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会2000年西安联合修订的病毒性肝炎防治方案。
1.2 方法
入院后常规进行血常规、血生化、肝功能、H C V R N A定性检测以及抗HCV系列等病毒学指标、肝胆脾B超检查, 并排除其他肝炎病毒感染、酒精性肝病、自身免疫性肝病以及原发性胆汁性肝蚀化者;我院以保健门诊进行健康查体的随机个体324例作为正常对照。所有个体均采用标准盐析法从5m LEDTA抗凝外周血中抽提DNA备用, 采用序列特异性引物聚合酶链反应 (PCR/SSP) 法, 对每个DNA样本进行15种KIR基因同步扩增。扩增后产物经由1.5%琼脂糖凝胶电泳后, 在Alphaimager TM2000图像分析仪下扫描成像, 对每一样本进行基因分型, 比较两组间每一KIR基因位点的基因频率有无统计学差异。
2 结果
2.1 在CHC病人组与正常随机对照组中均可检测到所有15种KIR基因。
2.2 个体间基因频率比较发现
CHC病例组KIR2DL5基因 (pf=74.07%) 、KIR2DS3基因 (pf=33.33%) 的阳性率较随机对照组 (pf别为53.4%, 19.44%) 升高, 且具有显著性意义 (PKIR2DL5=0.005 PKIR2DS3=0.030) ;进一步比较分析发现, KIR3DS1和KIR2DS2的基因频率也较对照组有不同程度升高, 但统计学分析示差异无显著性意义;其它KIR基因位点基因频率未发现统计学差异。
3 结论
K I R基因多态性与C H C的易感性有关。活化性基因型尤其KIR2DS3以及抑制性基因KIR2DL5基因频率的异常在CHC易感性中发挥重要作用。
4 讨论
己经证实NK细胞在许多种病毒及病原微生物的入侵中发挥重要的免疫防御作用[1], 但是其在HCV感染中的作用仍有待于进一步深入探讨。肝脏富含NK细胞, NK细胞的抗病毒活性、免疫调节活性以及NK细胞与其它淋巴细胞之间的相互作用无不彰显出其在HCV感染中的重要性。这将改变以前所认为的只有CD4+T细胞, CD8+T细胞和/或肝侵润性T淋巴细胞介导肝细胞损伤的观点。
杀伤细胞免疫球蛋白样受体 (killer cell immnoglobulin-like receptor, KIR) 是属于免疫球蛋白样超家族的一系列分子, 表达在NK细胞和部分T细胞的表面。编码KIR的基因位于人类染色体19ql3.42。KIR家族的基因呈现多态性, 表现在两个方面:其一, KIR的基因数目在不同的NK细胞克隆, 不同的个体有差异, 不同的个体可表现为不同的单元型。其二, KIR的多态性还表现在同一KIR基因座位有多种不同的等位基因, 其中大多数为非同义突变。到2002年第13届国际HLA专题讨论会为止, 可分成14种KIR成员, 以及2个假基因X和Z, 根据胞外Ig样结构域的数目分为HIR2D和KIR3D, 后面加上L或S表示胞内段的长短。总的来说, 胞内段长的 (L) 属抑制性受体, 胞质区具有免疫受体酪氨酸抑制基序 (immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif, ITIM) , 其模式为V/I/Lx Yxx L/V保守序列;胞内段短的 (S) 属激活性受体, 胞质区具有免疫受体酪氨酸活化基序 (immunoreceptor tyrosinebased activatory motif, ITAM) , 其模式为YX (2) LX (6~8) YX (2) L保守序列, 这两种基序均可被PTK磷酸化, 并由此启动信号转导分子的活化并产生级联反应。KIR可与靶细胞表面的MHC I类分子结合, 传导激活或抑制信号, 从而调节NK细胞和T细胞的活性, 在肿瘤免疫、抗感染免疫及清除老化变异细胞等方面发挥调节作用[2]。
本研究中, 我们共分析了15种KIR基因。其中2DS3 (P=0.005) 、2DL5 (P=0.030) 在病例组中的频率都显著高于对照组。提示KIR基因可能与H C V感染的易感性有关, 并可能影响了感染后的转归。2DS3与2DL5同属于单元型B, KIR2DL5具有独特的D0-D2Ig样胞外段结构域和较长的胞内段结构特征[3], 在其胞浆区含有两个酪氨酸抑制基序 (ITIM) , 可通过募集SHP-2传导抑制性信号抑制NK细胞活性[4], 导致NK细胞不能识别信号, 诱导免疫耐受, 可能是增加HCV感染易感性的重要因素。
KIE2DS3是具有短胞内段的活化性受体, 由于其与含有免疫酪氨酸激活基序 (ITAM) 的分子DAP12偶联而传导激活性信号。活化性KIR的多样性, 如果是机能上的表达, 有可能偶然地增加免疫细胞的激活, 这种不正确的活化尤其发生在当抑制性KIR受体与它们的HLA配体不能有效结合的时候。我们的研究发现在C H C病人中KIR2DS3基因频率较正常对照显著升高, 其过度表达有可能导致NK细胞毒作用增强而对肝细胞造成迁延不愈的破坏。
NK细胞受体对HCV感染的影响可能涉及多个激活性和抑制性受体与肝细胞表达的多种HLA分子的相互作用, 由于KIR与HLA配体识别及相互作用的复杂性, 导致CHC的具体机制可能不同, 研究具有不同遗传背景及不同临床表型的病例, 可能有新的发现。总之, 无论是激活性还是抑制性KIR数目增多都有可能打破NK细胞和/或T细胞受体平衡, 便NK细胞和/或T细胞功能异常而导致机体发生不利的免疫反应, 明确KIR基因是否为HCV感染的易感基因及其各基因型在CHC记病程中的作用机制尚有待于进一步研究。KIR基因多态性分析有可能为我们研究CHC的发病机制带来新的思路。
参考文献
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基因多态论文 篇5
猪PGC1基因PCR-RFLP多态性研究
通过PCR-RFLP方法,检测外来品种大约克猪和江苏省地方品种梅山猪、二花脸猪、姜曲海猪以及培育品种苏钟猪共144头,结果表明,PGC1基因序列经AluⅠ酶切后存在AA、AT和TT 3种基因型,其中大约克猪中AA基因型占优势,A等位基因频率为0.7;江苏省地方品种猪中,TT基因型占绝对优势,T等位基因频率平均为0.99,梅山猪和二花脸猪均为TT型.PGC1基因的PCR-RFLP基因型分布χ2检验结果表明,大约克猪与苏钟猪、梅山猪、二花脸猪、姜曲海猪差异极显著;苏钟猪与梅山猪、二花脸猪、姜曲海猪差异极显著;梅山猪、二花脸猪、姜曲海猪三者之间无显著性差异.
作 者：李碧侠 王学敏 任守文 葛云山 作者单位：江苏省农业科学院畜牧研究所,江苏,南京,210014刊 名：江苏农业科学 ISTIC PKU英文刊名：JIANGSU AGRICULTURAL SCIENCES年，卷(期)：“”(6)分类号：S8关键词：猪 PGC1基因 PCR-RFLP 多态性
基因多态论文 篇6
【关键词】 痛风；单核苷酸多态性；rs2231142；三引物法；早期诊断
痛风是一种单钠尿酸盐沉积所致的晶体相关性关节病，与嘌呤代谢紊乱及（或）尿酸排泄减少所致高尿酸血症直接相关，属于代谢性风湿病范畴，流行病数据表明，近年来我国人民由于生活水平提高和生活习惯改变，痛风发病率急剧升高，并呈现低龄化趋势[1]。研究表明，遗传因素是痛风发病的一个重要因素，三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2基因（ATP-binding cassette，subfamily G（WHITE），member 2；ABCG2）是一种ATP结合转运蛋白，广泛分布在具有分泌和排泄功能的组织，其功能异常可导致尿酸排泄能力下降[2]。目前认为ABCG2基因上单核苷酸多态性在这一过程中起了重要作用，其中（single nucleotide polymorphism，SNP，rs2231142，）C421A（rs2231142）位点与痛风发病相关性最大，能够解释10 %～29 %的痛风发病[3]。ABCG2基因单核苷酸多态性在闽南地区人群中研究还未见报道，本文采用改进的单引物等位基因特异性扩增方法，不经过基因提取，直接对154例痛风患者和160例健康志愿者的外周血样品进行扩增检测，并分析rs2231142位点基因型与痛风发病相关性，为痛风的预防控制和治疗提供参考。
1 实验样本
所有的基因组样本均来自福建省泉州市正骨医院痛风患者及健康志愿者，年龄17～78岁，平均（64±14）岁。痛风组154例，为2010年7月至2011年12月福建省泉州市正骨医院门诊和住院的痛风患者，均符合1977年美国风湿病协会制定的痛风性关节炎诊断标准。对照组160例，为2010年7月至2011年12月福建省泉州市正骨医院日常体检等健康志愿者，排除痛风、高尿酸血症、高脂血症、高血压、冠状动脉硬化性心脏病、糖尿病、恶性肿瘤等疾病。
2 试验方法
2.1 引物设计 本文主要检测人群ABCG2基因rs2231142位点基因型，SNP位点附近的相关基因序列从NCBI获得，引物设计使用Primer 5.0软件，Tm值计算采用网上软件工具OligoAnalyzer 3.0[4]；为增加检测的特异性，引物3′端倒数第3个碱基引入了错配碱基，见表1。
2.2 血液样本与基因组的获得与保存 用EDTA（或柠檬酸钠）抗凝管抽取实验对象的外周静脉血5 ml（在知情同意的前提下，获取患者和志愿者的血液样本）置4 ℃保存备用。取200 μl外周血样本，用全血DNA提取试剂盒（Beijing Sunbiotech Co.td）按说明书提取基因DNA，TE缓冲液溶解，并将其浓度调整为50 ng·μl-1，置4 ℃保存备用。
2.3 三引物SNP基因型特异性扩增 扩增体积25 ?l，包括1.5 mmol·L-1的MgCl2、0.25 mmol·L-1的dNTPs、1.0 U Taq DNA聚合酶（大连TaKaRa公司生产），0.4 ?mol·L-1的P142FW，0.4 ?mol·L-1的P142RN（每个样品需要两管PCR进行反应，内引物分别为P142RN1和P142RN2）， 2.5 ml10×PCR buffer（50 mmol KCl、15 mmol Tris?HCl、pH 8.0，TaKaRa公司，大连），1 ?l基因组模板。将上述各试剂加入200 ml规格的PCR管中，按下述程序进行PCR操作，95 ℃ 5min；95 ℃ 30 s，57.3 ℃ 35 s，72 ℃35 s，35个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保持。
2.4 全血PCR扩增 扩增体积25 ?l，包括0.25 mmol·L-1的dNTPs、1.0 U Taq DNA 聚合酶（TaKaRa公司，大连），0.4 ?mol·L-1的P142FW，PN1的浓度为0.4 ?mol·L-1的P142RN（每个样品需要两管PCR进行反应，内引物分别为P142RN1和P142RN2），2.5 ml10×PCR buffer（全血扩增缓冲液，HpH buffer[5]），0.7 ?l外周血样品。将上述各试剂加入200 ml规格的PCR管中，按下述程序进行PCR反应：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，57.3 ℃ 30 s，72 ℃ 35 s，35个循环；然后 72 ℃ 10 min；4 ℃ 下进行保持。
2.5 电泳检测 对所有PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析：取7 ?l PCR产物，混合1.5 ?l 的6×loading buffer，2 %琼脂糖电泳，电泳缓冲液为1×TAE，电压100 v，电泳时间10 min；琼脂糖凝胶采用GoldView核酸染料染色（5 μl·100ml-1），凝胶成像仪观察结果并拍照，记录并分析相关基因型。
2.6 相关生化指标检测 采用全自动生化分析仪对所选人群的与痛风发病相关的血尿酸、尿尿酸、血沉、C–反应蛋白、血甘油三酯、血胆固醇、尿素氮、肌酐等进行检测，同时还测量血糖、收缩压、舒张压、肾结石等指标，根据肾结石大小和分布将其量化，其中未见明显异常为1，单侧肾脏出现结石为2，双侧结石为3。
2.7 统计分析 将痛风患者和健康志愿者按年龄分为3组，对获得的实验数据进行整理，SNP的hardy–weinnerg平衡采用在线工具进行计算，采用SPSS17.0 数据分析软件对获得的数据进行分析和处理（P<0.05为显著性差异），各等位基因的相对危险度（odd ratio，OR）值通过非条件Logistic回归法计算OR的比值比和95 %的可信区间[6]，并经年龄、甘油三酯等因素校正。根据以上结果分析泉州地区人群痛风相关的rs2231142位点基因性型的与闽南地区人群痛风发病的相关性。
3 结 果
3.1 引物设计与全血扩增 有关rs2231142位点的扩增引物如下表，为了增强三引物法扩增特异性，等位基因特异性内引物（rs142PRN1，rs142PRN2）倒数第3位引入了错配碱基。本研究采用华东医学技术研究所研制的全血扩增缓冲液（HpH buffer）[5]，结合本课题发展的三引物扩增法，随机选用不同基因型的样品（痛风患者），按上述试验方法进行扩增，检测结果如图1所示，外周血样本与经提取基因组样本扩增结果一致，扩增效率相近，证明直接对外周血进行三引物法PCR进而检测其SNP基因型是可行的。从图1还可以看出，样品A基因型为（A/C），样品B为（AA）型。说明泳道1～2提取基因组样品A扩增电泳结果；泳道3～4EDTA抗凝剂处理外周血样品A直接扩增电泳结果；泳道5～6柠檬酸钠抗凝剂处理外周血样品A直接扩增电泳结果；泳道7～8EDTA抗凝剂处理外周血样品B直接扩增电泳结果。
图1 不同方式处理的样品三引物法检测ABCG2基因SNP位点（rs2231142）结果图
3.2 SNP位点（rs2231142）基因型分布与痛风发病相关分析 依据笔者建立的三引物等位基因特异性扩增法，对154例痛风患者和160例健康志愿者进行SNP分型检测，对所测得数据进行Hardy-Weinberg平衡分析，结果显示，对照组P=0.063567；痛风组P=0.706304，均符合Hardy-Weinberg平衡分析。为了进一步分析ABCG2基因SNP位点（rs2231142）基因型与闽南地区人群痛风发病的相关性，我们对所检测到的rs2231142位点不同基因型做了基本统计分析和OR值计算，其中OR校正因子为年龄、尿尿酸、C-反应蛋白、甘油三脂、尿素氮、收缩压、舒张压、肾结石等因素。
结果如表2所示，rs2231142位点AA基因型，在痛风组中分布频率为18.18 %，对照组中为8.12 %；A/C杂合型基因型在痛风组中携带频率为50.65 %，对照组为30.63 %；CC基因型，在痛风患者中携带频率为31.16 %，对照组为62.51 %，各基因型携带频率在痛风患者和健康人群之间有显著性差异（P<0.01）。rs2231142位点等位基因A在痛风患者中携带频率也远高于正常人群（分别为43.52 %和23.44 %， P≤0.01）。经过分析，rs2231142位点AA基因型携带者痛风发病风险提高了4.397倍，A等位携带者发病风险与正常C等位基因携带者相比提高了2.516倍。这些均揭示了rs2231142与泉州地区人群原发性痛风具有相关性。
为了验证rs2231142位点与其他痛风相关的生化指标是否有关联性，将rs2231142基因型与相关生化指标进行了单因素方差分析，结果如表3所示，rs2231142多态性与血尿酸、C-反应蛋白、甘油三酯、收缩压、舒张压、肾结石等生理生化指标具有相关性，具体机理则需要开展进一步实验及相关研究。
4 讨 论
rs2231142，又称Q141K或C421A，是一个在ABCG2基因第5外显子的SNP，Owen等[2]实验证实ABCG2作为一种转运蛋白及尿酸分泌蛋白定位于细胞膜，广泛分布在具有分泌和排泄功能的组织，在14783名受试者中进行ABCG2单核苷酸基因多态性分析，发现rs2231142多态性的存在与血清尿酸浓度密切相关。C421A引起ABCG2蛋白141位谷氨酰胺转变为赖氨酸（Q141K），使尿酸的转运速率下降53 %[7]，从而导致血尿酸水平升高，影响痛风的发生，约有10 %的白人痛风病案与C421A缺失突变相关。在采用基因组关联法对7699例（Framingham）和4148例（Rotterdam cohort）以及4000例非裔美国人研究后，得出其odds ratio为1.74，其中AA型更被认为是导致痛风的原因，而杂合型AC也增加了1.7倍患病风险[8]。Kazumasa等[3] 在3925名年龄在40～90岁的日本人中，分析了rs2231142多态性与血清尿酸浓度及高尿酸血症和痛风的关系，证明两者具有密切相关性并可解释29 %的痛风发病原因。Wang Binbin、李发贵等 [9，10]通过对不同地区汉族人群ABCG2基因的rs2231142位点基因型携带规律的研究，发现中国汉族男性人群中rs2231142位点AA基因型的携带者痛风发病率远高于CC基因型携带者，表明rs2231142位点多态性与中国汉族男性原发性痛风的发病密切相关。因此可以说rs2231142多态性位点是一个重要的痛风发病遗传标志，但其在闽南地区人群中还未做充分研究。
本研究以314例闽南人群样本为研究对象进行分析，发现ABCG2基因上的rs2231142位点，痛风患者携带高风险基因型（A/C、CC型）的比率为68.83 %，正常人群中为仅为38.75 %；而且rs2231142位点各基因型在正常人和痛风患者携带频率均有显著性差异（P<0.01）。根据本研究对发病风险分析结果，AA基因型携带者痛风发病风险提高了4.397倍，A等位携带者发病风险与正常C等位基因携带者相比提高了2.516倍。因此将rs2231142作为对闽南地区人群进行痛风筛查的一个遗传标记对于痛风早期诊断和发现有很大参考意义。另外，我们还发现ABCG2 基因的rs2231142位点多态性还影响到收缩压、舒张压以及血尿酸、C-反应蛋白、甘油三酯、肾结石等指标，这与实际临床痛风患者临床表征相符，痛风患者常合并糖、脂等物质代谢紊乱，肾结石和高血压也出现的较多，但其中遗传及分子机制还需要进一步研究。
本研究采用了一种简便、准确和低成本的三引物法检测痛风相关基因的SNP的方法，仅用一条外引物和两条序列一样的内引物（仅3′端第一个碱基为等位基因特异性碱基），虽然需要两管PCR反应，但这种方法对大部分样品，特别是对于模板量变化不定的全血PCR扩增而言，重复性好，操作简便，易于实现，经改进和完善后适于在普通医疗机构临床使用。
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阿司匹林抵抗与基因多态性 篇7
关键词：阿司匹林抵抗,基因多态性,抗血小板聚集
阿司匹林作为一种有效的抗血小板聚集药,可抑制血小板活化、聚集,防止血栓形成,在心脑血管病的一、二级防治中,起着至关重要的作用。然而,临床发现部分长期服用阿司匹林的患者,心脑血管事件的发生率并未降低,即可能在一定程度上存在阿司匹林抵抗(Aspirin resistance,AR)现象。目前,AR的发生机制尚不明确,但新近研究发现,基因多态性与AR的发生有重要的关系。现对近年来AR与基因多态性的相关性研究结果作一综述。
1 AR定义及分型
Bhatt等[1]将AR分为实验室型和临床型。实验室型指虽长期服用常规剂量的阿司匹林(75~325 mg),但实验室检测发现血小板聚集能力未被抑制;临床型指口服阿司匹林,仍发生缺血性心脑血管事件;Gum等[2]则将10μmol/L ADP诱导的血小板聚集率超过70%,或0.5 mg/m L花生四烯酸(arachidonic,AA)诱导的血小板聚集率超过20%作为AR的实验室诊断标准。
Weber等[3]应用体内(口服阿司匹林100 mg/d至少5 d)和体外试验(体外血浆中加入100μmol/L阿司匹林),通过联合检测血栓素B2(thromboxane B2,TXB2)浓度与胶原诱导血小板聚集率,将AR分为三型:(1)药代动力学型(Ⅰ型):在体内试验中,TXB2的合成和胶原诱导血小板聚集均未被抑制;而在体外试验中,TXB2的合成和胶原诱导血小板聚集可被抑制,推测其原因可能与个体间的药代动力学差异有关。(2)药效学型(Ⅱ型):在体内试验及体外实验中,TXB2的合成和血小板聚集均未受抑制,可能机制与血小板COX的基因多态性有关。(3)假性抵抗型(Ⅲ型):在体内试验及体外实验中,阿司匹林仅可抑制TXB2合成,但不能抑制胶原诱导的血小板聚集。
2 AR的作用机制
AR的作用机制尚未明确,可能与药物剂量不足、肠道吸收能力的差别、非甾体抗炎药的使用、血小板活化路径及基因多态性等多种因素有关。目前,关于血小板活化路径及基因多态性研究结果表明,AR主要与环氧合酶(cycloxygenase,COX)、纤维蛋白原受体、ADP受体和胶原受体、血管性假血友病因子(von wilebrand factor,v WF)受体等的基因多态性相关。
2.1 COX基因多态性
COX包括COX-1和COX-2两种亚型。人体COX-1基因位于染色体9q32~9q33.3上,长约22 kb,包含11个外显子,共编码576个氨基酸。研究表明,COX-1基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)可引起碱基替换及启动子连接部位的变化,显著影响内含子或外显子的功能,改变COX-1蛋白的构象,使阿司匹林对COX-1的敏感性不均一,从而影响阿司匹林的抗血小板聚集作用。Maree等[4]观察144例口服阿司匹林(75~300 mg)治疗的爱尔兰心血管病患者2周,采用Taq Man SNP基因分型检测技术对COX-1基因5个SNPs(rs10306114、rs1236913、rs3842788、rs5788和rs5789)进行基因分型,结果显示单体型A-C-G-C-C与AA诱导的AR密切相关(P=0.004)。Lepantalo等[5]对101例芬兰动脉血栓疾病患者COX-1基因4个SNPs(rs10306114、rs1236913、rs5788和rs5789)进行检测,经多因素Logistic回归分析发现,60%伴有AR的患者携带rs10306114 G等位基因,而敏感患者携带G等位基因仅17%;进一步研究发现,rs10306114 GG基因型与AR密切相关(GG vs AA,16%vs 2.5%,OR=10.0,95%CI:1.2~87.0,P=0.017)。李晓利等[6]运用聚合酶链反应-限制性片段长度多态法(PCR-RFLP)对431例服用阿司匹林的冠心病患者COX-1基因6个SNPs(rs1888943、rs1330344、rs3842787、rs5787、rs5789、rs5794)进行分析,结果提示rs1330344等位基因G可显著增加AR的发生风险(OR=1.77,95%CI:1.07~2.92,P=0.02),同时构建单体型,结果提示单体型C-G-C-G-C-C可作为AR的一个基因标志(48%vs 0.39%,P<0.05)。然而,亦有部分学者发现部分COX-1基因SNPs与AR无相关性。Clappers等[7]和Pettinella等[8]研究发现,rs3842787 C>T与AR无关。
人体COX-2基因定位于染色体的1q25.2~q25.3区,长度约8.3 kb,包含10个外显子和9个内含子,共编码604个氨基酸。COX-2几乎在所有组织中有表达,血管内皮细胞中的COX-2可以将AA转化成前列腺素H2,H2转运到血小板内,可增加TXA2生成,诱导血小板聚集。小剂量阿司匹林不能完全抑制COX-2诱导TXA2的生成,尤其在炎症或感染状态下COX-2常常表达上调,是AR发生的原因之一。杨蓉等[9]等采用PCR产物直接测序分析法,对181例服用阿司匹林的心脑血管病患者的COX-2基因rs20417进行基因型检测,结果发现,rs20417在AS组、AR组间分布差异有统计学意义(P=0.039),提示rs20417与AR密切相关,其发生机制可能由于该位点位于COX-2的启动子区,C等位基因通过增加COX-2的表达,使非COX-1途径的TXA2的产生增加,激活血小板,从而减弱了阿司匹林的作用效果,表现为AR。Xu等[10]对360例阿司匹林治疗患者COX-2基因rs20417进行基因型检测,结果发现,AR组rs20417 CC基因型显著高于AS组(P<0.05),提示rs20417 C等位基因与AR密切相关。然而,亦有相反的结论。李艾宁等[11]应用PCR-RFLP检测技术对264例冠心病患者COX-2基因rs20417进行检测,结果显示AR组/阿司匹林半抵抗(Aspirin semi-resistance,ASR)组GC和CC基因型频率虽高于AS组,但差异无统计学意义(P=0.16);C等位基因频率虽亦高于AS组,差异亦无统计学意义(P=0.097),提示rs20417与AR无明显相关性。
2.2 纤维蛋白原受体———血小板糖蛋白(GP)ⅡbⅢa)的基因多态性
血小板GPⅡbⅢa受体是血小板激活的最后共同通道,在血小板聚集中发挥着重要作用。血小板GPⅡb和GPⅢa有很高的多态性,常见的是GPⅢa的第2外显子1565位氨基酸突变(rs5918),包括Pl A1和Pl A2两种等位基因,其中Pl A1编码leu,Pl A2编码pro。丁建平等[12]对160例冠心病患者的GPⅢa rs5918基因多态性进行检测,其中野生型T/T(63.1%)101例,杂合子T/C(26.3%)42例,纯合子C/C(10.6%)17例。结果显示,携带等位基因C的患者服用阿司匹林后的闭塞时间较携带等位基因T的患者延长(P<0.05),野生型T/T的患者出现高血小板聚集活性的几率显著增加(P=0.006),提示GPⅢa受体rs5918的基因多态性与AR密切相关。有学者对服用阿司匹林的28例伴高血压的IS患者及140例患高血压的非IS患者进行基因分型,结果发现Pl A2等位基因在脑卒中患者中出现频率更高(脑卒中:46.4%,非卒中:22.6%,
62中国医药导报CHINA MEDICAL HERALD
P=0.01),用多因素回归分析,Pl A2等位基因增加了发生缺血性卒中的危险性(B=0.986,95%CI:1.23~6.85,P<0.03)[13]。Goodman等[14]研究发现GPⅢA的Pl A1/A2的基因多态性与AR相关(OR=2.36,95%CI:1.24~4.49,P=0.09)。但Pamukcu等[15]对204例行冠脉支架术患者的研究发现,GPⅢa与AR无关(P>0.05)。
2.3 ADP受体的基因多态性
ADP受体(P2Y1和P2Y12)是血小板聚集的重要介质,血小板表面G蛋白可通过与其受体P2Y1和P2Y12偶联,调节血小板的激活和聚集,P2Y1和P2Y12中任何一个受体的表达高低都会影响血小板的聚集率。ADP受体P2Y1基因位于染色体3q25上,长度约为4 kb,碱基的相应变化能够改变ADP的信号功能,降低对阿司匹林的反应性,导致血栓前状态的产生。Lordkipanidze等[16]采用PCR-RFLP法,对192例口服阿司匹林的冠心病患者进行基因型检测,结果发现,rs701265 GG基因型与AA和AG基因型比较,对AA诱导的血小板聚集率影响更大(AA∶AG为9.0%∶2.0%,P=0.047),GG基因型增加了AR的危险性,使AA诱导的血小板聚集率≥20%的危险性增加8.5倍(OR=8.53,P=0.022),发生不良的心脑血管事件的危险性增加7倍(OR=6.92,P=0.018)。Jefferson等[17]研究发现,P2Y1 rs1065776 T等位基因是AR的高危因素(OR=2.72,95%CI=1.12~6.50,P<0.05)。
P2Y12全长47 kb,包含3个外显子、2个内含子。有研究证实P2Y12受体的血小板聚集与阿司匹林抗血小板聚集的复合拮抗作用可显著减少血栓事件的发生。Fontana等[18]在健康研究对象中发现P2Y12受体有5种多态性,其中,有4种处于连锁不平衡状态,结果产生2种单体型H1(86%)和H2(14%),携带有1个H2等位基因的杂合子(H1/H2)的平均血小板聚集率为67.9%,携带有2个H2等位基因的纯合子(H2/H2)的血小板聚集率则高达82.5%,远远高于H1/H1纯合子的34.7%,提示P2Y12多态性可能与AR相关。而德国学者Anneke等[19]对140例冠心病患者进行研究,结果发现,P2Y12多态性与AR无相关性(P=0.56)。
2.4 胶原受体的基因多态性
血小板表面主要有GPⅠa/Ⅱa、GPⅥ、GPⅣ三种胶原受体。GPⅠa/Ⅱa位于连接血小板与胶原纤维(Ⅰ、Ⅱ型)或非胶原纤维(Ⅲ、Ⅳ型)的二价阳离子键之间。GPIa基因位于第5号染色体上,它的SNP常常会改变血小板膜胶原受体的密度,使血小板的聚集、血栓形成发生改变,影响阿司匹林的疗效。Santoso等[20]研究发现携带rs1126643T等位基因,血小板表面的GPⅠa/Ⅱa的密度增加4倍,血小板活性显著增加,血小板聚集加强。苏冠华等[21]对200例服用阿司匹林进行心脑血管病预防的中国汉族高危人群进行分析,结果显示AR和ASR组T等位基因频率均显著高于AS组(χ2=12.848,P<0.005);AR组与ASR组的TC和TT基因型频率也均高于AS组(P<0.05)。Logistic回归分析提示,血小板膜蛋白rs1126643 T等位基因与AR的发生显著相关(OR3.76,95%CI:2.87~9.58,P<0.05)。李春晓等[22]对150例口服阿司匹林治疗动脉粥样硬化患者的基因多态性进行分析,结果提示,AR组与ASR组的rs1126643 T等位基因频率显著高于AS组(56.3%、44.8%vs 30.9%,均P<0.005)。GPⅥ受体主要参与血小板与胶原的初期黏附,促进血小板活化,引起血小板聚集和促凝活性表达,导致血栓形成,是血小板表面非常重要的胶原受体。Lepantalo等[5]发现接受选择性经皮冠状动脉介入治疗的患者中,38%的AR患者携带有GPⅥ受体的rs1613662 T等位基因,而在AS患者中,只有13%携带此等位基因(OR=5.6,95%CI:1.4~22.2,P=0.008),表明rs1613662 T等位基因与AR相关。
2.5 v WF受体的基因多态性
v WF受体GPⅠb-Ⅸ-Ⅴ是血小板在高黏状态下的一个重要介质,具有多态性,其中血小板GPⅠbα受体是其最大的亚基。Fujiwara等[23]对健康志愿者关于血小板聚集的SNPs进行研究,结果表明,rs6065 T等位基因与AR有关(P=0.009 2)。Cervera等[24]对5年内再发脑梗死的82例患者进行研究,评估GPⅠbα基因多态性与AR的相关性,结果提示,GPⅠbα基因多态性与脑卒中患者发生AR相关(OR=9.6,95%CI:1.5~61.0,P<0.05)。
3 小结与展望
以上综述了近年来关于基因多态性与AR的研究结果。由于对AR尚无国际公认的定义,且多数研究样本量较小,研究结果间还存在很多矛盾,迄今为止遗传对AR的作用并不确切,故仍需继续开展大规模和不同种族人群中的前瞻性研究来证实基因多态性与AR的相关性。
基因多态论文 篇8
1 材料与方法
1.1 材料
草原红牛68头, 来自吉林省农业科学院, 利用颈静脉采血, ACD抗凝, -20 ℃保存, 备用。TaqDNA聚合酶、dNTPs、蛋白酶K等试剂, 购自北京鼎国生物技术有限责任公司;pMD-18载体试剂盒、PCR产物回收试剂盒和质粒提取试剂盒, 购自宝生物工程 (大连) 有限公司。
1.2 方法
1.2.1 DNA的提取和检测
利用常规的苯酚/氯仿抽提方法提取基因组DNA, 用TE溶液将DNA样品稀释, -20 ℃保存, 备用。用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法双重检测DNA的纯度和浓度, 然后稀释成30 ng/μL, 备用。
1.2.2 引物的设计
试验所用GH引物是参照参考文献[1], 并根据已发表的牛GH基因 (accession number M57764) 的碱基序列设计的, 6对引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列、PCR产物大小、位置见表1。
1.2.3 PCR扩增
反应物体系共25.0 μL, 其中包括灭菌去离子水18.6 μL, 30.0 ng/μL 的DNA模板1.0 μL, 10×Buffer 2.5 μL, 2.5 mmol/L的dNTP1.0 μL, 10 pmol/L的上下游引物各0.7 μL, 3 U/μL rTaq聚合酶0.5 μL。
PCR反应循环参数:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s, 55～65 ℃复性40 s, 72 ℃延伸30～40 s, 35个循环;最后72 ℃延伸10 min。
1.2.4 PCR-SSCP分析
2 μL PCR产物加10 μL变性上样缓冲液, 98 ℃变性10 min后, 立即冰浴10 min, 然后上样置于预冷的聚丙烯酰胺凝胶上。 试验根据扩增片段的大小, 将30%的聚丙烯酰胺凝胶 (29∶1) 配成8%～12%的聚丙烯酰胺凝胶, 以160 V电压于1×TBE电泳14～18 h。电泳结束以后, 首先在70%乙醇中固定10～15 min, 用去离子水洗2次, 每次2～3 min;银染30 min (100 mL染色液中含NH3·H2O 1 mL, 0.36% NaOH 21 mL, 20% AgNO3 1.8 mL) , 再用去离子水洗3～4次, 每次2～3 min, 加入显色液 (200 mL显色液中含1%柠檬酸钠1 mL, 甲醛100 μL) , 待电泳条带清晰后换上去离子水停显。
1.2.5 目的片段的克隆、测序
进行PCR-SSCP分析后, 将不同纯合子基因型个体的PCR扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶中电泳分离、纯化回收, 回收后的DNA与pMD-18载体连接, 并转化到大肠杆菌DH5α菌株中, 蓝白斑筛选后经PCR扩增鉴定阳性克隆, 提取质粒DNA进行序列测定。
2 结果与分析
2.1 GH 基因内含子3 PCR扩增结果和PCR-SSCP分析结果
对GH基因的内含子3进行扩增, 产物经2%的琼脂糖凝胶检测, 获得了与目的片段大小一致的产物 (345 bp) , 带型清晰且无杂带, 稳定性和特异性好 (见图1) , 可进行SSCP分析。PCR产物经SSCP分析结果表现出3种基因型 (见图2) 。对P1RF的两种纯合基因型AA、BB克隆测序, 并用DNASTAR比对分析, 结果见图3。结果表明, 在1 435 bp处有一个T→C的突变 (与 GenBank accession M57764相比而得) , 导致等位基因A变为等位基因B;在1 692处有C→T的突变 (与Yao J等[1]1996年的研究结果相同) , 但并未导致新的等位基因出现。
1～9.PCR产物;M.DL2 000 Marker。
1～9.PCR产物;M.DL2 000分子质量标准。
2.2 GH基因内含子4 PCR-SSCP分析结果 (见图4)
由图4可见, 在8%的聚丙烯酰胺凝胶 (PAGE) 电泳条件下对PCR产物进行PCR-SSCP分析, 在不同个体中检测到了3种基因型 (CC、CD、DD) 。 对P2RF的两种纯合基因型CC、DD克隆测序, 发现该位点在1 918处有C→A的突变 (与 GenBank accession M57764相比而得) , 导致等位基因C变为等位基因D, 序列比拼结果见图5。
2.3 GH基因外显子5 RCR-SSCP分析结果 (见图6、图7、图8)
1～9.PCR产物;M.DL2 000 Marker。
利用30%的聚丙烯酰胺配制成浓度为12%凝胶, 160 V电压电泳18 h, 结果表明, 该位点由1对等位基因控制 (E、F) 。对PCR产物中的纯合子基因型克隆测序, 由序列比较结果 (见图7) 可以看出:于GH基因外显子5的2 291 bp处发生了1处碱基A→C突变[1]。
2.4 GH基因3′UTR P5RF扩增片段PCR-SSCP分析结果
在8%的聚丙烯酰胺凝胶 (PAGE) 、160 V电泳扩增结果见图9条件下进行PCR-SSCP分析, 结果表明, 在不同个体中检测到了3种基因型, 见图10。根据PCR-SSCP结果, 将GG和HH两种纯合基因型进行克隆测序, DNASTAR比对分析, 发现在GH基因3′UTR 位点2 639处有C→G突变, 导致等位基因由G变为H, 导致HaeⅢ增加一个酶切位点;在2 735 bp处有T→C (与 GenBank accession M57764相比而得) 突变, 但是并未导致新的等位基因出现。结果见图11。
1～8.PCR产物;M.DL2 000 Marker。
2.5 GH基因5′UTR P6RF引物PCR-SSCP分析结果
对GH基因的5′UTR片段进行PCR扩增 (结果见图12) , 经2%的琼脂糖凝胶检测, 获得与目的片段大小一致的464 bp PCR产物, 带型清晰且无杂带。PCR产物经SSCP分析结果表现出3种基因型 (见图13) 。将P5RF位点的纯合基因型II、JJ个体的PCR产物进行克隆测序, 与DNASTAR比对, 结果见图14。由结果分析可见, 该片段在431处有一个A到G的突变, 导致等位基因由I变为J。
1～9.PCR产物;M.DL2 000 Marker。
2.6 GH基因5′UTR PCR-SSCP分析结果
利用P6RF引物对5′UTR PCR扩增 (结果见图15) 后, 其产物进行PCR-SSCP电泳分析, 结果如图16所示。
1～9.PCR产物;M.DL2 000 Marker。
3 讨论
生长激素是调节动物生长发育和三大物质代谢过程的一个重要内分泌因子[2]。bGH基因定位于19号染色体上, 由5个外显子和4个内含子组成, 长约2 856 bp。国内外研究报道证实, GH基因遗传多态性与牛的生长发育、屠宰和胴体性状、泌乳和肉质性状有不同程度的相关性。
试验以PCR-SSCP的方法, 首次研究了基因全长在草原红牛群体中的的遗传多态性, 结果发现在GH基因的第3内含子、第4内含子、第5外显子的3′端和5′端存在丰富的等位基因突变。这与Yao J等[1]1996年的研究结果相同, 但在草原红牛群体中, 并未导致新的等位基因出现。第4内含子在1 918 bp处有C→A的突变, 而Yao J等[1]的报道则是在2 017 bp处碱基 T→C突变, 高雪等[3]报道, 在1 947 bp处有T→G突变, 该位点的突变需要进一步探讨。本试验中GH基因外显子5 2 291 bp处有A→C突变, 与Yao J等[1]报道的一致。
研究对草原红牛GH基因的全基因组序列进行了多态性分析, 发现了大量的突变位点, 这些碱基的突变是否影响了GH的生物活性有待进一步研究, 同时这些突变位点与肉用和屠宰性状的相关关系也有待进一步研究。这些位点是否可以作为遗传标记用于草原红牛屠宰和肉用性状的早期选种选育, 如何建立相应的基因诊断方法, 将是下一步研究的重点, 研究结果将会为草原红牛的胴体和肉质性状早期选育打下分子生物学基础。
参考文献
[1]YAO J, SAMUEL E, DAVID Z, et al.Sequence variation in the bo-vine growth hormone gene characterized by SSCP analysis and theirassociation with milk production traits in Holsteins[J].Genetics, 1996, 144:1809-1816.
[2]贺淹才.生长激素和生长激素受体的分子生物学[J].生命化学, 2002, 22 (1) :29-32.
脂联素基因多态性的研究进展 篇9
关键词：脂联素,基因多态性,代谢性疾病
脂联素 (Adiponectin) 是新近发现的具有重要功能的脂肪因子, 在机体的糖和脂肪代谢、维持机体能量代谢平衡过程中发挥重要作用。通过对其功能的不断深入研究, 发现脂联素基因多态性与胰岛素抵抗及2型糖尿病密切相关, 并可能参与拮抗动脉粥样硬化的形成。现将脂联素基因多态性的研究进展作一综述。
1 脂联素的基因结构及单核苷酸多态性 (SNPs)
1.1 脂联素的基因结构
人类脂联素 (apM1) 基因是单拷贝基因, 位于染色体3q27, 全长约17kb, 包括3个外显子和2个内含子。apM1基因的转录从接近5’端的胞嘧啶开始, 多肽编码区域是从外显子2起始处开始, 在外显子3起始处结束。人体内的脂联素由244个氨基酸组成, 分子量为30KD, 由氨基末端的分泌信号序列 (aa1-18) 、一段特异序列 (aa19-41) 、一组由22个氨基酸组成的胶原重复序列 (aa42-107) 、一段球状序列 (aa108-244) 组成。其中球状区是脂联素生物活性的关键部位, 和TNF-α的结构相似, 脂联素与胶原Ⅷ、X和补体C1q高度同源。脂联素的单聚体和三聚体是其生物活性形式或受体亲和配基, 可以特异性结合骨骼肌或肝脏细胞膜上的G蛋白藕联受体一型或二型脂联素受体, 进而调节脂肪酸氧化和糖代谢。
1.2 ap M1基因的SNPs
对apM1基因序列分析发现, 正常人apM1基因中存在相当数量的等位基因SNPs, 但是密码子变化并不改变其编码蛋白质的氨基酸序列。由于染色体3q27区域存在2型糖尿病、代谢综合征和冠心病的易感位点, 而且有较大频率的基因多态性, 因此, 对定位于染色体3q27区域的apM1基因的SNPs与疾病的关系成为近年来的研究热点。
2 脂联素基因多态性与疾病的相关性研究
2.1 脂联素基因多态性与糖尿病和胰岛素抵抗
有关脂联素基因多态性与糖尿病和胰岛素抵抗的关系国内外均见报道。台湾的Yang等[1]在对台湾南部的1438例老年人的研究中发现内含子SNP+276位点G等位基因携带者糖尿病的发病率降低;Petrone等[2]对意大利270名肥胖儿童的研究表明SNP-1, 391G>A, SNP-11, 377C>G和SNP+45T>G与超重儿童的胰岛素抵抗有关;德国的Schwarz PE等[3]在对具有高风险糖尿病的550例人群研究表明SNP-11391A和SNP-11377C增加糖尿病的危险。在中国, 脂联素基因多态性与糖尿病和胰岛素抵抗关系的研究主要集中在SNP+45和SNP+276, 且研究的结果不一致, 杜鹏飞等[4]的研究发现SNP+45与胰岛素抵抗有关, 而SNP+276与胰岛素抵抗无关;吴文君[5]、王淑芳[6]、初明峰[7]等均证实SNP+45与2型糖尿病的发病相关, 王淑芳[6]的试验中未发现SNP+276与2型糖尿病相关;康庄[8]的研究则发现SNP+45和SNP+276与2型糖尿病的相关性存在种族差异, 白族不相关, 而汉族相关。这种结果的不一致性除了种族差异、样本量大小不同、样本纳入标准不一样等因素外, 可能还存在以下几个因素: (1) 2型糖尿病是一个复杂性的疾病, 基因与环境的相互作用在其发病机制中占有主导地位, 因此有基因易感倾向的个体不一定必然发展为糖尿病, 这还与个体所处的环境有关; (2) 2型糖尿病是高度异质性疾病, 在不同的人群中可能存在不同的起主导作用的基因; (3) 有研究表明, 纳入的糖尿病人群有无家族史也会影响到实验的最终结果, 这是因为有家族史时, 遗传易感性可能涉及到更多的基因, 使得单个基因的作用显得相对较弱, 而且连锁不平衡的存在也会影响到实验的最终结果。
2.2 脂联素基因多态性与冠心病
法国的Foucan L[9]在对216名有2型糖尿病的非洲裔黑种人的研究中发现SNP+45与冠心病发病有关;Qi[10]对美国的879名糖尿病患者研究发现SNP+276TT冠心病的发病率明显降低;而Pischon[11]在美国的一项研究中, 对30~50岁的121700名健康女性随访8年, 对40~75岁的51529名健康男性随访6年, 没有发现apM1基因SNP+45、SNP+276、-11365C G、-3964A/G与冠心病相关, 而-4034CC与冠心病的发生有关。在中国, Liu[12]发现-4522C/T与冠心病的发病无关;马晓伟等[13]发现在2型糖尿病患者中, SNP+45、SNP+276与冠心病的发病相关;张献玲等[14]发现-11377C/G与冠心病及冠状动脉斑块的进展相关, 而孙开胜[15]的研究未发现SNP+45与冠心病的发病相关。出现上述情况的原因可能是因为冠心病为多因素、多基因性疾病, 遗传因素对冠心病的影响是基因-环境、基因-基因之间相互作用的结果, 单个基因的作用有限;同时, 各个研究对病例的入选标准、样本量不同, 研究对象也有种族差异。
2.3 脂联素基因多态性与动脉粥样硬化
韩国的Kim SH[16]在2008年对708例2型糖尿病患者的研究发现SNP+45的GG基因型与颈动脉斑块和动脉粥样硬化的形成有关;澳大利亚的Patel[17]通过对1306例健康人的研究发现SNP-11377G等位基因与动脉粥样硬化的形成有关;澳大利亚的Mackevics[18]在对1745名健康的高加索人的研究发现SNP+45T/G、SNP+276G/T与颈动脉内膜中层厚度 (CIMT) 无关;初明峰[7]发现SNP+45T/G与CIMT有关;蔡清颜等[19]发现脂联素基因启动子区-11377 C→G位点单核苷酸多态性与2型糖尿病患者CIMT相关, -11377CC基因型组CIMT低于CG+GG组。而这种相关的确切机制未明, 有待于进一步研究。
2.4 脂联素基因多态性与非酒精性脂肪肝 (NAFLD) 的关系
关于脂联素基因多态性与NAFLD的相关性研究较少, 意大利的Musso等[20]对70例无肥胖、无糖尿病、血脂正常的NAFLD患者和70例健康人的对照研究发现SNPs+45TT和+276GT患NAFLD的比例高于普通人群;日本的Tokushige K等[21]在对119例NAFLD患者和115例正常人的研究发现女性NAFLD中, SNP+276G/G基因型明显高于对照组;而SNP+45G/G基因型的肝纤维化的程度明显的比其他基因型严重;王忠莉等[22]则未发现SNP+45和SNP+276与NAFLD相关;黄春明等[23]亦未发现SNP+45与NAFLD相关, 出现上述不同结果的原因可能与不同种族、不同目标人群和研究方法的差异有关, 亦可能因为造成这种代谢紊乱的因素较多, 脂联素基因变异对表型的影响作用未能突出显示之故。为进一步研究脂联素基因变异与非酒精性脂肪肝的关系, 有必要考虑脂肪分布状态, 在非酒精性脂肪肝非肥胖和肥胖大样本人群中进行。
2.5 脂联素基因多态性与高血压病
有关脂联素基因多态性与高血压病的研究国外尚未见报道。在中国, Yan[24]对484例高血压合并肥胖的患者和502例正常人的研究未发现SNP+45T/G、SNP+276G/T与高血压有关;Ong KL[25]对1616例血压正常和高血压病人进行了6.4年的随访研究发现-11365C/G与高血压有关, 而-10677C/T与高血压无关。王忠莉[22]的研究证实SNP+45T/G、SNP+276G/T与高血压无关;贾玫[26]的研究则认为SNP-11377C/G多态性可能增加高血压的遗传风险。
基因多态论文 篇10
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择2015年1月1日-5月30日本院生殖中心就诊的100例男性患者, 其中50例精液液化时间异常患者 (精液液化时间均大于60 min) 为研究组, 50例精液液化时间正常男性 (精液液化时间均小于30 min) 为对照组。所有患者均具有完整的病史资料, 对研究知情, 自愿参加, 并签署知情同意书。研究组年龄25~32岁, 平均 (27.5±3.5) 岁, 不育年限1~10年, 平均 (4.4±0.8) 年;对照组26~33岁, 平均 (26.5±4.5) 岁, 不育年限1~10年, 平均 (4.3±0.9) 年。经男科检查所有患者均无输精管、睾丸及附睾的异常, 甲状腺功能、性激素四项结果均正常, 无染色体异常, 无外伤, 无家族遗传史和疾病治疗史, 排除影响精液质量的其他因素, 排除存在前列腺、膀胱等泌尿生殖系统疾病患者。两组患者年龄、病史、不育年限等比较差异均无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。
1.2 方法
1.2.1 外周血DNA提取
将研究组和对照组患者的外周血分别编号, 用亚能生物科技有限公司的DNA提取试剂盒, 按操作说明进行DNA提取, 保留100μL DNA溶液。
1.2.2 DNA扩增与测序
将所提取的100份DNA样本送华大基因武汉分公司分别对PSA基因的5个外显子进行测序。测序结果与NCBI中的PSA基因的外显子序列用Blast软件分别进行对比。精液液化正常和异常的PSA基因的外显子序列用Blast软件分别进行对比。
2 结果
2.1 两组等位基因及其频率
所有标本的测序结果与NCBI中的PSA基因的序列用Blast软件进行对比。结果显示, PSA基因的5个外显子中外显子2有突变 (由T→C) 和外显子3有突变 (由C→T) , 其他外显子无突变。外显子2突变在研究组检出1个, 对照组检出1个, 两组检出率比较差异无统计学意义 (P>0.05) 。外显子3有突变在100个标本中检出8个 (8.0%) , 其中研究组检出7个, 对照组检出1个, 两组外显子突变率比较差异无统计学意义 (P>0.05) 。对照组等位基因C频率为62.0%, 等位基因T频率为38.0%, 研究组等位基因C频率为72.0%, 等位基因T频率为28.0%, 两组比较差异无统计学意义 (P>0.05) 。
2.2 两组外显子2基因型及其频率
用Blast软件对对照组和研究组PSA基因的外显子2和外显子3序列进行对比。结果显示, 对照组的外显子2的基因型有CC、CT、TT, 基因型频率分别为0、62.0%、36.0%, 研究组的外显子2的基因型有CC、CT、TT, 基因型频率分别为0、72.0%、28.0%, 两组之间比较差异均无统计学意义 (P>0.05) 。
3 讨论
在世界上约15%的不孕不育育龄夫妇中, 其中由男性因素引起的约占50%。据WHO统计, 大约每7对夫妇中就有一对存在着各种生育障碍, 而且据报道男性精液的治疗在进几十年来也存在着明显的下降, 随之发生的不孕不育率也明显上升[8,9,10,11,12]。其中, 精液液化时间长是引起不孕不育的一个重要原因。虽然, 精液液化的机制还未被人们完全认识, 但目前已发现多种因素参与或影响精液液化[13,14,15]。前列腺和精囊的分泌物参与了精液的凝固与液化过程, 精囊产生的凝固因子引起精液凝固, 而前列腺产生的蛋白分解酶、纤溶蛋白酶等精液液化因子使精液液化。正常情况下, 两种因子协调作用, 精液排出体外很快凝固, 一般15~30 min开始液化。液化与凝固因子间的平衡被打破, 精液可表现为液化异常[16,17,18]。在个体发育过程中, 由于基因突变或染色体畸形可引起精液液化异常, 具体原因可能是各种物理和化学因素作用于DNA分子上, 从而改变蛋白质结构的变化, 因此改变生物特性[19,20]。
本研究通过以50例精液液化正常者和50例精液液化异常者外周血DNA为模板, PCR扩增PSA基因的五个外显子后进行测序, 通过软件对比分析测序结果, 寻找精液液化正常人群和精液液化异常人群PSA基因单核苷酸多态性位点 (SNP) 。结果显示, PSA基因的5个外显子中外显子2有突变 (由T→C) 和外显子3有突变 (由C→T) , 其他外显子无突变。外显子2突变在研究组检出1个, 对照组检出个, 两组检出率比较差异无统计学意义 (P>0.05) 。外显子3有突变在100个标本中检出8个, 占8.0%, 其中研究组检出7个, 对照组检出1个, 两组外显子突变率比较差异无统计学意义 (P>0.05) 。精液液化正常的外显子2的基因型有CC、CT、TT, 基因型频率分别为0、62.0%、36.0%, 精液液化异常的外显子2的基因型有CC、CT、TT, 基因型频率分别为0、72.0%、28.0%, 两两之间无明显差异 (P>0.05) 。精液的液化可能与PSA基因的这些突变无相关性, 可能是PSA基因的这些突变未能引起PSA蛋白表达的改变, 还有待进一步的研究。外显子3只有8.0%的标本检测到突变, 可能标本统计的数量太小所致。
综上所述, 在本研究中, PSA基因的5个外显子中外显子2有突变和外显子3有突变, 其他外显子无突变。对照组和研究组外显子2的基因型有CC、CT、TT, 两者之间比较无明显差异, 寻找精液液化异常与基因突变之间的关系需要更多样本及研究的投入, 本研究为以后的研究提供了一个方向。
摘要：目的:旨在发现23个与精液液化异常相关的前列腺特异性抗原 (PSA) 基因单核苷酸多态性 (SNP) 标记, 为临床上及早确诊先天性精液液化异常提供一种新的诊断方法, 为进一步研究精液液化不良的分子机制和治疗精液液化异常提供理论基础。方法:选择2015年1月1日-5月30日本院生殖中心就诊的100例男性患者, 按照精液液化时间分为对照组和研究组各50例, 以两组患者外周血DNA为模板, PCR扩增PSA基因的5个外显子后进行测序, 通过软件对比分析测序结果, 寻找两组PSA基因SNP位点。结果:PSA基因的5个外显子中, 外显子2、外显子3有突变, 其他外显子无突变;两组外显子2和3检出率比较差异均无统计学意义 (P>0.05) ;两组等位基因及其频率比较差异均无统计学意义 (P>0.05) ;对照组的外显子2的基因型有CC、CT、TT, 基因型频率分别为0、62.0%、36.0%, 研究组的外显子2的基因型有CC、CT、TT, 基因型频率分别为0、72.0%、28.0%, 两组之间比较差异均无统计学意义 (P>0.05) 。结论:对照组和研究组精液的液化与PSA基因的这些突变无相关性, 可能是PSA基因的这些突变未引起PSA蛋白表达的改变, 引起精液液化异常的原因还有待进一步的研究。
基因多态论文 篇11
【关键词】法医物证；STR；四川汉族
【中图分类号】Q987【文献标识码】A【文章编号】1044-5511（2011）11-0531-01
本文选择GoldeneyeTM-20A扩增试剂盒中除CODIS系统［1］外的6个STR基因座，对四川地区汉族群体的等位基因及基因型进行观察研究，获得其群体遗传多态性资料，为亲权鉴定、个体识别和数据库应用奠定基础。
1材料与方法
样本：四川地区300份汉族无关个体血样。
主要仪器、试剂及方法：采用BSD600自动打孔机取血样，TECAN工作站自动分装GoldeneyeTM-20A（北京基点公司）直扩试剂盒进行直接PCR扩增，ABI-3130XL型基因分析仪电泳检测，ABI-IDX软件分析基因型，采用Power States软件包进行数据处理，得到统计学分析结果。
2结果与讨论
D19S433等6个STR基因座在四川群体中的等位基因（A）及其频率（F）分布见表1。偶合率（PM）、个体识别能力（DP）、多态信息含量（PIC）、非父排除率（PE）、杂合度（H）、Hardy-Weinberg平衡检验结果见表2。GoldeneyeTM-20A试剂盒累積个体识别率（TDP）为1-2.8241×10-23，累积非父排除率（CPE）为0.9999999936。
Gill［2］等认为杂合度（H）大于或等于0.7、个体识别能力（DP）大于或等于0.9的STR基因座具有较高的鉴别能力，适合法医学的应用。由表2可见，在四川汉族群体中，D19S433、PentaE、PentaD、 D2S1338 、D12S391 、D6S10436这6个STR基因座均符合Gill的标准，非常适合四川汉族地区的法医学亲权鉴定、个体识别和DNA数据库应用。
参考文献
［1］Werrett DJ.The national DNA datebase ［J］. J Forensic Sci Int,1997,88(4):33-42
基因多态论文 篇12
抗粘液病毒基因(myxovirus resistant,Mx)是家禽抗病力的重要候选基因之一,其蛋白是抗病毒蛋白的一种,由I型干扰素诱导后,在宿主细胞中产生,含有GTP酶活性[4];抗病毒谱较广,可以抑制多种负链RNA病毒,还能抵抗某些DNA病毒。现有研究证明[4],禽Mx蛋白具有抗A型流感病毒、水泡性口膜炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)等病毒的生物活性。Mx基因的存在方式是显性等位基因,研究发现[5],通过克隆多个品系的鸡Mx基因并将序列比对,发现有25个核苷酸突变,其中15个导致了氨基酸的改变,预示鸡的Mx基因具有多态性。另有研究发现[6,7],在众多氨基酸改变中,当cDNA的2032位点为A,即鸡Mx蛋白的第631位氨基酸为天冬酰胺(Asn)时,该蛋白对流感病毒和VSV有抗性,而当此位点为G,即Mx蛋白的第631位氨基酸为丝氨酸(Ser)时则无抗性。
1,4-0-溶菌酶(lysozyme,LYZ)又称N-乙酰基胞壁酸水解酶,最早由Baldacci等[8]于1979年从鸡的两个基因库中用分子克隆的方法纯化获得,全长约3.9 kb。其属于碱性水解酶,是体内重要的非特异性体液免疫因子,在内部渗透压的作用下引起细菌裂解[9,10],有些溶菌酶还可发挥消化酶的作用,对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性菌和真菌具有直接或间接的溶解作用,能够起到杀菌、抗病毒、抗肿瘤细胞等多种作用,在免疫系统中起着重要作用。
本研究旨在通过对庄河大骨鸡Mx和LYZ基因的多态性进行研究,筛选出对两基因抗性的个体,为大骨鸡候选基因标记辅助选择奠定基础,同时为大骨鸡抗病优良品种选育提供分子遗传学的依据。
1 材料与方法
1.1 试验动物
选用辽宁医学院畜牧兽医学院科研团队养殖的庄河大骨鸡,随机挑选262只健康雌鸡单笼饲养于同一鸡舍,管理条件完全相同,日粮参照美国NRC营养标准。
1.2 试验仪器与试剂
蛋白酶K、琼脂糖、DL2000Marker、DL1000 Marker、DL5000 Marker、20 bp DNA Ladder、限制性内切酶RsaI、限制性内切酶HindⅢ、PCR用Mix、上下游引物等均购自大连宝生物工程有限公司;其他均为分析纯试剂。试验仪器均为国产或进口设备,如超净工作台、高速冷冻离心机、恒温水浴箱、PCR扩增仪、水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像系统、超纯水系统、-70℃超低温冰箱等。
1.3 试验方法
1.3.1 大骨鸡血液基因组DNA提取及质量检测
取大骨鸡静脉血2 mL,用裂解液、蛋白酶K和SDS进行细胞裂解,用酚、氯仿和异戊醇提取基因组DNA。将提取的大骨鸡基因组DNA在1%琼脂糖凝胶中进行电泳,检测DNA质量。
1.3.2 Mx、LYZ PCR扩增的引物设计
根据NCBI上基因序列号(LYZ基因:NC＿006127.3;Mx基因:AF289468.1),使用Primer premier 5.0软件分别设计引物。Mx基因引物序列,F:CCTTCAGCCT-GTTTTTTCTTCTTTTAGG,R:CAGAGGAATCTGATTGCTCAG-GCGTGTA,产物大小为101 bp,LYZ基因引物序列,F:GCCACATAAAGTTTGAGC,R:GTACTCCCATCGGTGT-TA,产物大小为590 bp。
1.3.3 大骨鸡Mx、LYZ基因片段PCR扩增
PCR扩增的反应组分如下:模板DNA 1μL,引物(20 pmol/μL)各1μL,mix混合液7.5μL,加超纯水至15μL。PCR反应条件为:94℃预变性5 min;94℃变性45 s,Mx基因55℃退火45 s、LYZ基因49.3℃退火45 s,72℃延伸45 s;30个循环,最后72℃延伸10 min。用1%的琼脂糖凝胶进行PCR产物电泳,紫外灯下观察并照相。
1.3.4 PCR扩增产物的酶切及电泳检测
根据Mx、LYZ基因序列,利用Primer 5.0分析可知上述扩增片段内含有内切酶RsaⅠ和内切酶HindⅢ酶切位点。限制性内切酶RsaⅠ和HindⅢ的酶切反应体系按内切酶说明书要求,PCR产物10μL,内切酶(10 U/μL)0.5μL,10×Buffer 2μL,加超纯水至20μL,37℃恒温3～4 h,产物用2%琼脂糖凝胶电泳分析。
2 结果与分析
2.1 大骨鸡血液基因组DNA质量检测
大骨鸡血液DNA琼脂糖凝胶电泳结果见图1。图1可见大分子量的DNA条带,为基因组DNA。
2.2 大骨鸡Mx、LYZ基因PCR扩增结果
采用所设计的引物,PCR扩增大骨鸡Mx、LYZ基因的部分片段,其琼脂糖凝胶电泳结果见图2和图3。由图2可见,Mx基因PCR产物大小约为101 bp,由图3可见,LYZ基因PCR产物大小约590 bp,均符合预期的扩增长度,可以用来进行RFLP分析。
2.3 PCR产物酶切结果
试验所设计的Mx基因PCR上下游引物间的具有一个RsaⅠ酶切位点,大骨鸡Mx基因PCR产物酶切后电泳结果见图4,条带大小为101、74和27 bp,酶切后出现了3种带型,说明本试验检测的262只大骨鸡Mx基因具有多态性;试验所设计的LYZ基因PCR上下游引物间的具有一个HindⅢ酶切位点,大骨鸡LYZ基因PCR产物酶切后电泳结果见图5,条带大小为414 bp和176 bp,酶切后仅出现一种带型,说明试验检测的120只大骨鸡LYZ基因不具有多态性。
3 讨论
本试验用PCR-RFLP法扩增大骨鸡的Mx、LYZ基因,Mx基因片段长为101 bp,经RsaI酶切后电泳,检测到该位点有两种等位基因A、G,三种基因型GG、GA和AA,基因型频率分别为0.744、0.259、0.027。结果显示,大骨鸡Mx基因具有多态性,并且抗性等位基因A的频率为0.141。据文献报道,吴晓伟等[11]检测的中国地方鸡种中的肉蛋兼用型的Mx基因抗性等位基因A的频率为0.297,其检测的庄河大骨鸡的抗性等位基因A的频率为0.100,检测的红色原鸡的抗性等位基因A的频率为0.984;李慧芳等[12]检测的在12个中国地方鸡种中Mx基因抗性等位基因A的频率的平均值为0.304;栾德琴等[13]检测的Mx基因在11个不同鸡种中抗性等位基因A的频率的平均值为0.502,这与本试验结果存在一定差异,但本试验中大骨鸡该抗性等位基因的频率高于吴晓伟等[11]的检测结果。
LYZ基因片段长为590 bp,经限制性内切酶HindⅢ对扩增片段进行完全酶切后仅产生GG基因型(176 bp和414 bp),LYZ基因不具有多态性。据文献报道,侯启瑞等[10,14]发现LYZ基因有4处突变位点,第111、1 411、1 426和1 492位点(其中111位点位于第一外显子,1411位点位于第1内含子,1 426位点和1 492位点位于第2外显子)。经研究发现第1 411位点,等位基因G和A的频率分别为0.561和0.439,该位点对京海黄鸡不同周龄体重有显著影响,AA、GA基因型个体4周龄体重显著高于GG基因型个体4周龄体重,暗示在选种、育种过程中亦可将鸡LYZ基因作为京海黄鸡体重和开产日龄候选基因应用于遗传标记辅助选择。因此本试验选取该位点检测,但未检出多态性与文献报道存在一定差异,可能与品种以及不同品种之间的各自生存环境有关,也可能是多态性基因型频率低,受检样本量不足以检测出多态性。为更加确切地探明该基因在大骨鸡上是否存在多态性位点,需进一步通过测序鉴定。