ApoE基因多态性（精选4篇）
ApoE基因多态性 篇1
据统计,随着社会人口老龄化程度的日趋严重,目前全世界有约1200万阿尔茨海默病(AD)患者,美国有近400万,预计2050年患者将达4500万。由于本病的高致残率,近年来围绕AD病的诊断与治疗研究日趋激烈。同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)是一种含巯基氨基酸,是蛋氨酸代谢中间产物。大量研究表明,高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia,Hhcy)在动脉粥样硬化和血栓栓塞性疾病的发病机制中起着重要作用,被认为是独立的危险因素之一[1]。人载脂蛋白E(ApoE)是含299个氨基酸残基的分泌性糖蛋白,其基因位于第19号染色体上,约3.7 kb,含4个外显子和3个内含子。ApoE基因呈现多态性, 其3个等位基因ε2、ε3、ε4组合产生6种基因型ε2/2、ε3/3、ε4/4、ε2/3、ε2/4、ε3/4,其中 ε4被认为是与AD发病相关的重要的生物学危险因素。本文采用循环酶法及聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性法(PCR-RFCP)检测患者血浆Hcy水平与ApoE基因多态性,旨在为AD的早期诊断及预防提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 研究对象
选择符合中国精神障碍诊断与分类标准第三版(CCMD-3)诊断标准的本院老年痴呆症门诊患者,其中AD组145例,男54例,女91例,年龄52～91岁,平均(75.4±8.1)岁。入组患者无肝、肾、贫血、肿瘤等疾病。经脑CT确认脑萎缩。另选正常健康体检者130例作正常对照组,男52例,女78例,年龄48～73岁,平均(60.2±7.3)岁。无肝、肾、贫血、肿瘤等疾病。
1.2 材料和方法
1.2.1 Hcy检测:
采集肝素抗凝全血3 ml,采血后立即3000 r/min,离心20 min,取上层血浆置-40 ℃冰箱保存,1周内完成检测。所有被检者均禁食12 h,晨起后空腹抽血。Hcy循环酶法检测原理:基于小分子捕获SMT的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶。Hcy被转化为游离型后,通过与共价底物反应,循环放大,同时产生腺苷。腺苷立即水解成氨和次黄嘌呤,氨在谷氨酸脱氢酶的作用下。使NADH转化为NAD,样本中的Hcy浓度与NADH转化速率成正比。
1.2.2 ApoE基因多态性分析:
标本采用EDTA·K2抗凝全血2 ml,采血后立即1500 r/min,离心10 min,弃上层血浆,红细胞层置-80 ℃以备作DNA提取。取抗凝全血200 μl,按UNIQ-10柱式临床样品基因组抽提试剂盒说明书提取基因组DNA,并经紫外分光光度计比色定量及纯度鉴定。根据基因库序列号AF261279设计一对引物,序列如下:上游引物5’AACAACTGACCCCGGTGGCG 3’,下游引物 5’ATGGCGCTGAGGCCGCGCTC 3’。 PCR反应总体系为25 μl,其中包含1×PCR缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl,pH 8.5、50 mmol/L KCl,1.5 mmol/L MgCl2),200 μmol/L dNTP 、上游引物、下游引物各100 nmol/L、DNA 200 ng,Taq DNA聚合酶1 U,用蒸馏水补至25 μl。扩增循环参数:94 ℃ 预变性5 min,然后按94 ℃ 40 s、58 ℃ 40 s、72 ℃ 90 s共35循环,最后72 ℃ 延长至5 min。PCR 结束后取 10 μl PCR 产物行 20 g/L 琼脂糖凝胶电泳(含 0.5 μg/ml 溴化乙啶),5 V/cm 电泳 40 min,在紫外灯下观察 PCR 扩增效率。5 μl PCR产物用10 U的Hha I限制性内切酶在37 ℃酶切3 h。取5 μl 酶切产物与1 μl 6×上样缓冲液混合,行8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,100 V 电泳1～2 h,经0.1% AgNO3 染色后观察拍照。
1.2.3 试剂:
Hcy试剂为北京九强公司循环酶法试剂盒,严格按说明书操作。Taq DNA聚合酶购自Promega公司。UNIQ-10柱式临床样品基因组抽提试剂盒购自上海生工公司。Hha I限制性内切酶、DL2000 DNA Marker购自大连宝生物公司。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。
1.2.4 仪器:
日立7080生化分析仪。美国Bio-Rad公司PTC-200型PCR扩增仪; 上海天能科技公司的凝胶成像系统、垂直电泳槽和电泳仪。
1.3 统计方法
等位基因频率=(纯合子例数×2+杂合子例数)/(2×总例数)。组间分析采用χ2检验。各组间指标采用单因素方差分析。全部统计数据均用SAS 6.12统计软件进行。
2 结果
2.1 AD组与正常对照组Hcy检测结果比较
AD组血浆Hcy检测结果(18.42±8.4)μmol/L较正常对照(8.6±6.1)μmol/L差异有显著性(P<0.01)。男性AD患者与女性AD患者Hcy结果比较差异无统计学意义(P>0.05)。
2.2 PCR-RFLP结果
ApoE是一种具有多态性的蛋白质,有3种常见的异构体,即E2、E3、E4。由于Hha I内切酶只能识别编码精氨酸的核苷酸顺序GCGC,导致酶切片段不同。PCR检测结果见图1。
2.3 AD组与正常对照组ApoE
等位基因频率分布 利用基因频率计数方法统计AD患者和正常人ApoE 3种等位基因频率分布。与正常对照比较,AD患者ε4基因频率增高(χ2=6.21,P<0.05),ε2和ε3频率与正常对照组比较差异无显著性,见表1,2。
注:与正常对照组比较,*P<0.05
2.4 ApoE ε4基因频数与血浆Hcy水平比较
由于ApoE ε4等位基因频率在AD患者中明显增高,因此本次研究将含不同剂量ε4等位基因AD患者的血浆Hcy水平作一比较分析。统计结果显示,含2个ε4等位基因患者血浆Hcy水平较不含ε4等位基因及含1个ε4等位基因显著增高,差异有显著性,P<0.01。含1个ε4等位基因与不含ε4等位基因血浆Hcy水平比较差异无统计学意义。见表3。
注:与不含ε4基因及含1个ε4基因比较,**P<0.01;与正常对照组比较,△△P<0.01
3 讨论
Hcy 1931年由Vincent首次从膀胱结石中分离得到。1969年McCully第一次指出Hhcy的患者血管病变是由高水平Hcy引起的。近年来,Hhcy作为一种独立危险因素已在多种疾病的诊断与治疗中得到肯定[1]。Hcy是一种含硫氨基酸,不参与蛋白质合成,是蛋氨酸、半胱氨酸和谷胱甘肽的前体。血浆Hcy有氧化型和还原型2种形式,还原型Hcy中游离的巯基或硫醇基具有高度活性,容易氧化,形成二硫化物。血浆中还原型Hcy只占约1%,绝大部分为氧化型Hcy,以二硫化物形式或是与蛋白质共价结合的形式存在。目前已知Hcy体内主要有2种代谢途径:(1)以维生素B12依赖性的蛋氨酸合成酶(MS)重甲基化为蛋氨酸,此过程需要亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)催化叶酸生成N5-甲基四氢叶酸作甲基供体。(2)经维生素B6依赖性的胱硫醚β合酶(CBS)转硫化生成半胱氨酸和腺苷。
研究认为血浆Hcy水平介导了AD患者脑血管损害后表现为神经系统高级功能丧失的病理过程。Hhcy产生的超氧化物可以损伤血管内皮细胞,改变凝血因子功能,增加血栓形成,促使小动脉血管栓塞,促进血管平滑肌细胞增殖,参与粥样硬化形成,增加血小板黏附性,促使血小板聚集。同时,Hhcy还能影响核酸、蛋白质、胆碱等甲基化反应,干扰细胞的发育、分化。本次试验显示,AD组Hcy水平与对照组比较差异显著(P<0.01)。同时,脑影像学研究证实,Hhcy与海马容积呈负相关,海马容积减小是AD早期的影像学标志,海马容积进行性减小是AD病情发展重要的动态指标。
ApoE是含299个氨基酸残基的分泌性糖蛋白,其基因位于第19号染色体上,约3.7 kb,含4个外显子和3个内含子。ApoE基因呈现多态性,其3个等位基因ε2、ε3、ε4分别编码ApoE 3种主要异构体E2、E3和E4。这3种异构体多肽链第112位和第158位氨基酸残基不同,E2均为半胱氨酸(Cys),E4均为精氨酸(Arg),E3第112位为Cys,第158位为Arg。ApoE 3个等位基因组合产生6种基因型ε2/2、ε3/3、ε4/4、ε2/3、ε2/4、ε3/4,对应存在6种遗传表型E2/2、E3/3、E4/4、E2/3、E2/4、E3/4。正常人群中的ApoE基因型分布以ε3/3最多,ε2/2或ε4/4最少。ApoE是血浆脂蛋白重要组分之一,主要在肝脏合成,中枢神经系统中主要由星形胶质细胞合成和分泌,在体内脂质代谢和神经系统发育及损伤修复过程中均起着重要作用。近年来研究发现人ApoE基因位点的遗传存在不平衡现象,AD患者中ApoE ε4等位基因频率明显增高。与本次研究结论一致(χ2=6.21,P<0.05)[5]。
由于ApoE ε4是导致AD的重要生物学危险因子之一,本次试验将ApoE ε4基因剂量与血浆Hcy水平作一比较分析。研究显示,基因型ε 4/4的AD患者,其血浆Hcy水平较其他不含及含1个ε4基因的AD患者显著增高,差异有统计学意义,P<0.01,提示遗传可能是导致Hhcy的又一重要原因。
目前认为Hhcy的发病有遗传和营养2种因素,几种相关的遗传性酶缺陷或活性降低导致了Hcy水平升高,这些酶有甲基四氢叶酸还原酶、胱硫醚合成酶等。营养因素指代谢辅助因子,如叶酸、维生素B12和B6缺乏,这些因子缺乏可导致Hhcy的发生,规律地补充B族维生素以及饮食中富含叶酸、维生素B12等可使患者血Hcy水平下降,但能否影响AD的病理过程,缓解临床症状,还有待进一步地研究。
参考文献
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ApoE基因多态性 篇2
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集2010年8月至2012年10月阿尔茨海默病(AD)患者80例,为AD组,男性患者34例,女性患者46例,平均年龄(72.16±5.64)岁;选取同期的正常对照者80例,男38例,女42例,两组在性别、年龄和病情方面没有显着差异,因此对TF促凝活性(TF-Procoagulant Activity,TF-PCA)或称组织因子活性(TF Activity)的测定成为判断血栓前状态的重要途径。
1.2 方法
ApoE基因检测:但人血中TF的含量极少,当组织中的TF因某种原因进入血中时,可激活外源凝血系统,并启动内源凝血系统。
2 结果
2.1 两组ApoE基因型频率分布
在ApoE的基因型中,原理将待测标本及一系列浓度的TF标准液加入到已包被有TF抗体的反应板中,AD患者ApoE基因型频率分布与正常对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。
注:与对照组相比,P<0.05
2.2 两组LRP基因频率分布
见表2所示。两组LRP的基因型频率和等位基因频率差异无统计学意义(P>0.05)。显著差异无统计意义。
3 讨论
家族性AD与ApoE定位的第19q13号染色体连锁。从30个迟发性AD家族任选的83名AD病人中,ApoEε4等位基因频率明显高于91名年龄匹配对照者[2]。存在于一个迅速血小板活化的白细胞表面受体糖蛋白位点-1(PS-GL-1)转移到白细胞表面后引起的白细胞血小板聚集引起的TF上调细胞内的信号传递,白细胞酶和细胞微粒TF-PCA增强,并且在相同的时间,P-选择也被激活的单核细胞表面的Mac-1(CD11b/CD18的),活化clotting factor Xa因子(FXa)和(或)纤维蛋白原结合到加速凝血反应[3]。ApoE基因多态性分布的种族差异与其相应的AD发病率高低相吻合:不精密度批内变异系数(CV)0.43%～2.12%,批间CV1.07%～3.73%,总的不精密度CV1.81%～4.90%。8、12、16周β-HCG的参考范围比厂家给的范围要小(P<0.01,P<0.005,P<0.001)。此测试ECLIA检测β-HCG,结果表明低8、12、16周建康怀孕HCG-β的范围比制造商的罗氏范围。说明ApoEε4与AD之间的关系为AD遗传学上的共性。ApoEe4频率的升高对AD相对特异:已发现在中枢神经退行性病路易体病患者ε4频率增高,提示它与AD在发生机制上存在某种联系;对血管性痴呆患者的ε4频率各家报道不一,可能与ε4也是动脉粥样硬化的易感因素,且AD和血管性痴呆常合并发生有关[4]。然而,它的β-HCG 8、12、16周参考范围是不适合的人,参考范围是否是适合待进一步研究,并确认其他胎龄和其他测试项目的人,还有待进一步研究。LRP(LDL受体相关蛋白)是一种多配体型受体,除肝脂酶、LPL、α2-巨球蛋白等是其配体外。
此外,组织因子启动凝血过程未显示,以及慢性肾功能衰竭、肿瘤血管新生和转移。有些恶性淋巴瘤晚期出现的弥漫性血管内凝血(DIC)与肿瘤细胞高表达某些细胞因子,刺激血细胞和周围组织高表达组织因子有关[5]。此外,CM和VLDL的残骸大量增加。本组资料显示,AD患者ApoE基因频率分布与正常对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。两组LRP的基因型频率和等位基因频率差异无统计学意义(P>0.05)。因此,AD患者精神行为障碍与ApoE基因频率多态性存在一定联系,ApoEε4是AD的风险基因,LRP基因多态性和AD的关系有待进一步研究探讨。
参考文献
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ApoE基因多态性 篇3
1 材料与方法
1.1 试验材料
主要试剂有DMEM (Gibco) , 胰蛋白酶 (Biotopped) , SYBRRPremix Ex TaqTMII试剂盒。
1.2 试验方法
1.2.1 崂山奶山羊胎儿成纤维细胞的分离和体外培养。从怀孕40日龄的奶山羊取出胚胎, 将胎儿进行实验室原代及传代培养。
1.2.2 总RNA的提取及质量检测。采用Trizol法提取崂山奶山羊第2、8、16、32、40、50代胎儿成纤维细胞总RNA。
1.2.3 总RNA的反转录。用反转录试剂盒分别将不同代数的总RNA反转录成c DNA。
1.2.4 引物设计及PCR反应。参照Gen Bank中公布的奶山羊SOD1基因序列 (NM_001285550) 和APOE基因序列 (XM_005701775) , 用Primer3 (v.0.4.0) 在线软件设计特异性引物。
使用特异性SOD1上下游引物和APOE上下游引物分别对2~50代的崂山奶山羊胎儿成纤维细胞进行PCR扩增反应。
1.2.5 荧光定量PCR。实时荧光定量PCR检测SOD1和APOE基因的表达量。
2 结果与分析
2.1 细胞培养
根据2种细胞对胰蛋白酶的耐受性不同, 通过差速消化和差速贴壁法可获得纯化的成纤维细胞[1], 传至F2代时即可获得纯成纤维单层细胞。
2.2 总RNA提取、浓度测定结果
提取的总RNA通过琼脂糖凝胶电泳后呈现3条带, 分别为28 s、18 s、5 s;且28 s比18 s的亮度大2倍, A260/A280在1.79~1.92, RNA含量在375~789 ng/μL。
2.3 RT-PCR扩增结果
通过RT-PCR扩增, 分别获得长度为207、172 bp的特异性片段, 产物经琼脂糖凝胶电泳检测。SOD1和APOE基因在第2代崂山奶山羊胎儿成纤维细胞中的含量最高, 随着细胞传代次数的增加, SOD1和APOE基因表达量有逐渐下降的趋势, 第50代二者表达量最低。
2.4 实时荧光定量检测结果
通过△Ct法来表明SOD1和APOE基因在奶山羊胎儿成纤维细胞中表达[2]。SOD1和APOE基因在第2代崂山奶山羊胎儿成纤维细胞的表达量最高, 随着细胞传代次数的增加, 二者表达量均逐渐下降, 其中第50代表达量最低, 与RT-PCR结果相一致。
3 结论与讨论
试验以崂山奶山羊SOD1和APOE作为候选基因, 以胎儿成纤维细胞为素材, 通过荧光定量PCR检测SOD1和APOE基因在不同代数崂山奶山羊胎儿成纤维细胞中的表达情况。结果表明:SOD1和APOE基因在崂山奶山羊不同代数胎儿成纤维细胞的表达不同。SOD1和APOE基因在第2代崂山奶山羊胎儿成纤维细胞中含量最高, 随着传代次数的增多表达量逐渐降低, 其中第50代最低。分析可能是在第2代细胞新陈代谢快, 产生ROS、脂质类物质等相对较多, 需更多的SOD1和APOE将其清除或运输走。随着传代次数的增多, 虽然细胞仍保持一定的分裂能力, 但新陈代谢变得缓慢, 细胞的各种功能开始退化, 出现衰老现象[3,4]。因此, SOD1和APOE基因在不同代数崂山奶山羊胎儿成纤维细胞中含量的变化可用作断定细胞是否衰老死亡的一个非常重要的指证。试验研究了崂山奶山羊SOD1和APOE基因在不同代数胎儿成纤维细胞中的表达, 其结果具有重要意义, 可以为将来研究人类衰老疾病而建立细胞模型提供参考[5,6]。
参考文献
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ApoE基因多态性 篇4
1 材料和方法
1.1 实验动物分组和处理
12个月龄载脂蛋白E(Apo E)基因敲除小鼠和低密度脂蛋白受体(LDLR)基因敲除小鼠各16只与其遗传背景相同的正常C57BL/6J小鼠8只。各类小鼠雌雄各半,均购自美国Jackson实验室。每种基因敲除小鼠随机分成两组,分别为普通饲料组和高脂饲料(含胆固醇为0.15%)组。C57BL/6J正常小鼠仅用普通饲料饲养。各组小鼠食物均经自由摄取,连续饲养4个月。各组小鼠均在深度麻醉下用0.01M PBS作活体灌注,分离获得主动脉组织,将主动脉组织投入新鲜配制的4%多聚甲醛固定液中在4℃冰箱过夜,次日置换缓冲液后,动脉组织分为两半,一半作冰冻切片用于油红O染色,另一半组织经石蜡包埋切片(5μm厚)作Masson染色和免疫组织化学分析。
1.2 组织切片Ma s s on染色和油红O染色及AS斑块面积差异分析
取石蜡切片经过二甲苯和酒精脱蜡处理后按常规作Masson染色,每只鼠动脉组织取3片非连续切片组织,用于病理学评估。小鼠AS斑块病理学特征组织学评估方法均依据美国心脏学会(American Heart Association,AHA)修订的动脉粥样硬化的病理分类标准。取7μm厚冰冻切片(每鼠动脉组织取3片不连续切片组织)按常规作油红O(Oil Red)染色,低倍镜下观察组织中呈现红色的脂肪沉积分布范围,借助KS300程序进行图像数字作半定量分析。
1.3 免疫组织化学检测AS斑块内金属蛋白酶的表达水平
取脱蜡切片投入PBS缓冲液,经抗原修复液(Vector,H-3300)80℃存放20 min,缓冲液清洗2次,再入0.3%H2O2溶液内室温20 min,以消除内源性过氧化物酶。然后,切片孵育在2%小牛血清溶液中1h,以减少非特异性反应。在继后的免疫组织化学中,设计了3个方面的检测:(1)观察炎症反应:抗巨噬细胞Mac-3抗体采用美国BD Pharmingen公司(550292)生产的抗Mac-3单克隆抗体(1∶100)检测组织切片中巨噬细胞。(2)观察平滑肌细胞,采用由美国R&D System公司(MAB1420)生产的抗α-Actin单克隆抗体(1∶2 000)检测组织中肌动蛋白。(3)动脉粥样硬化斑块内基质金属蛋白酶表达水平检测,两种一抗采用美国abcam公司(ab37150,ab38898)生产的抗MMP2多克隆抗体和抗MMP-9多克隆抗体(均为1∶500)。实验中所用一抗均经1%小牛血清与0.15%Triton X100(Sigma)缓冲液配制。切片在一抗溶液培育中,经4℃培育过夜,次日缓冲液洗涤3次后,加相应二抗(1∶400)溶液,室温孵育1h,加生物素与卵白素结合(ABC)试剂盒配置的混合液中培育1h。底物呈色反应剂采用DAB试剂盒。所有二抗、ABC和DAB试剂盒购自美国vector公司。呈色反应后,切片经逐级脱水并用加拿大中性树胶封片。在Axiovert-200镜下观察结果,并用Axiocam高分辨率数码像机经Axiovsion 3.1软件拍照。对每个组织切片均通过拍照收集全组织切面图像。结果分析,采用KS300程序软件作图像数字采集及半定量分析(以着色面积占组织切片总面积的比例确定为标志物免疫组化的阳性数值)。每组小鼠取其均数进行ANOVA统计学分析比较。
为阐明炎症与基质金属蛋白酶在AS斑块形成间的关系,本试验采用了荧光双标抗体免疫组织化学法来观察MMP阳性细胞存在于平滑肌细胞和巨噬细胞中比例。其方法,取Ch-Apo E-组小鼠动脉管壁组织切片作AS斑块组织同一切片分别作两种荧光标记的不同抗体,采用带图像叠加软件的多色荧光显微系统获取图像,并以着色面积占组织切片总面积的比例来确定标志物免疫组织化学的阳性数值。
2 结果
2.1 5组小鼠动脉管壁病理组织结构特征的差异
5组小鼠动脉管壁病理组织结构特征与其各自的差异,见图1。经冰冻组织切片作油红O染色后在低倍镜下观察发现,对照组小鼠主动脉未见红色中性脂肪沉积,而在LDLR和Apo E基因敲除的两类小鼠主动脉粥样硬化斑块中可见明显的红色中性脂肪沉积,特别在Apo E基因敲除高脂饲养组小鼠动脉组织中可见大量的大小不等的红色中性脂滴存在,亦可见在动脉壁中膜层沉积。经Masson染色后可见正常组小鼠的动脉壁呈正常结构,而高脂饮食组和普通饮食组的Apo E基因敲除小鼠和LDLR基因敲除小鼠的动脉壁可见典型的动脉粥样硬化斑块,呈现出粥样核心和外周的纤维帽,其中央的脂质核较少纤维和细胞(Ⅱ型与Ⅲ型为主)。其中尤以LDLR基因敲除小鼠的最为明显,特别在高脂饮食组Apo E基因敲除小鼠动脉壁斑块增大,纤维帽中基质纤维成分减少,纤维帽形状变薄。
2.2 小鼠动脉粥样硬化斑块内的炎性反应以及MMP 2,9的表达
免疫组织化学结果显示,在Apo E和LDLR基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块的炎性反应和MMP2,9的表达差异明显,在AS斑块的纤维帽以及肩区含有大量的充满脂肪滴的巨噬细胞和泡沫细胞。高脂饮食组小鼠平滑肌细胞减少而泡沫细胞明显增加。基质金属蛋白酶MMP2,9反应主要分布在炎性细胞和泡沫细胞内,总的高脂饮食组MMP2,9反应呈强阳性,广泛分布在AS斑块的肩区以及一些核心坏死区。
Normal为正常小鼠;LDLR为普通饲料喂养的LDLR基因敲除小鼠;Ch-LDLR为高脂饲料喂养的LDLR基因敲除小鼠;Apo E为普通饲料喂养的Apo E基因敲出小鼠;Ch-Apo E为高脂饲料喂养小鼠。从左到右为6种不同染色方法,分别对动脉管壁切片中的组织结构、胶原、巨噬细胞、平滑肌细胞、金属蛋白酶2和金属蛋白酶9作组织化学或免疫组织化学染色的结果。
2.3 项指标检测结果的半定量数据分析
从附表或图2结果可见Mac-3和MMPs表达水平与AS斑块形成面积的关系,呈现出AS斑块越大,Mac-3和MMPs表达水平越高。尤其是斑块大小与Mac-3水平更为突出,经统计学相关系数分析r=0.978,P<0.02。这一结果说明,高脂饮食则可加重两种基因敲除鼠(尤在ASpo E基因敲除鼠)AS斑块形成和炎症细胞增加和MMPs表达量。
每组数据来源于8只小鼠,每鼠动脉组织取3张非连续切片评估的结果。统计学分析表明:Mac-3和MMP2,9表达水平,Ch-LDLR,Apo E-,Ch-Apo E-3组与LDLR-组比,P<0.05;LDLR-组与Ch-LDLR-组比或Apo E-组与Ch-Apo E-组比,P<0.05。
2.4 免疫荧光双标反应结果
取Ch-Apo E-组小鼠动脉管壁组织切片作AS斑块组织同一切片中免疫荧光双标抗体检测结果(见图2)进行观察与半定量分析显示,MMP9阳性细胞在普食组Apo E-/-小鼠腹主动脉的平滑肌细胞(a-Actin)中约占30%,在巨噬细胞(Mac-3)中约占50%~70%。
3 讨论
载脂蛋白E(Apo E)基因和低密度脂蛋白受体(LDLR)基因敲除两种小鼠是美国Jackson实验室建立的动脉粥样硬化(AS)鼠模型,是用于研究AS斑块形成的机制和探讨治疗AS斑块发生与破裂的干预措施的理想模型[8~10]。因此,本研究采用相同遗传背景正常C57BL/6J小鼠作对照,以Apo E基因和LDLR基因敲除小鼠为AS模型,每种鼠设高脂饮食和普通饮食两组来观察和分析AS斑块形成的分子病理学特征。该研究设计的目的意义,不仅在于进一步阐明AS斑块形成及不稳定斑块产生的机制,而且为临床防治急性冠脉综合征及缺血性脑血管病发生具有重要参考价值。
AS是一种慢性病变。大量研究表明,许多机制参与其产生和发展,除脂代谢紊乱外、炎症是引发和促进该过程的主要因素[11]。目前已公认:AS是急性冠状动脉综合征及缺血性脑血管病发生的病理学基础;诱发心脑血管疾病急性发生的主要是高脂饮食因素,发病机制是AS斑块形成不稳定性和破裂所致[12];造成AS斑块不稳定性分子机制是在高脂饮食诱导下,AS斑块内炎性细胞大量浸润和MMPs大量表达[13],导致斑块脂核增大和纤维帽变薄而破裂[14]。因此,人们将稳定斑块作为治疗动脉粥样硬化的重要策略[15]。如何稳定斑块问题已有不少研究,大多是通过抑制MMPs合成、增加TIMP合成和表达、阻止MMPs活化等方面考虑,使基质降解减少,达到稳定斑块作用。
高脂脂饮食是否诱导动脉粥样硬化斑块形成与不稳定斑块产生,则与机体脂蛋白代谢紊乱有关。从本研究结果可见,高脂饮食使Apo E和LDLR基因敲除鼠动脉粥样硬化斑块增大,炎性细胞增多。纤维帽中基质纤维成分减少,纤维帽形状变薄和大量中性脂滴沉积,呈现出一种AS斑块不稳定性病理学特征,尤其在Apo E基因敲除小鼠更为严重。可见高脂饮食诱导动脉粥样硬化斑块形成不稳定性的机制主要由Apo E基因敲除后,造成的脂质代谢紊乱所引起,其次是LDLR基因缺失。Apo E是一种分子量为34 k Da富含精氨酸的糖蛋白,肝脏是合成Apo E的主要部位。Apo E主要存在于极低密度脂蛋白、中度密度脂蛋白、高密度脂蛋白、乳糜微粒(chylomicrons,CM)及其残粒中。Apo E还参与胆固醇转运、胆固醇再分布和细胞胆固醇外流。LDL通过LDL受体途径降解,LDLR基因敲除可影响LDL清除,使血中LDL水平升高,导致脂代谢障碍,表现为高脂血症、动脉粥样硬化。Apo E及其受体LDLR基因缺陷鼠,在高胆固醇饮食诱导下,血浆中高水平胆固醇不能被运至肝脏降解,使血浆胆固醇水平的急剧增加,易在动脉壁中大量沉积,故导致高胆固醇饮食组AS性病变程度比普通饮食组明显严重。
小鼠AS斑块经油红染色和Masson 3色染色作组织病理学观察与免疫荧光双抗体定位结果分析表明,斑块形成中呈现出大量炎症细胞,而在炎症细胞中的巨噬细胞过度分泌MMPs。MMP-9表达在斑块巨噬细胞内占50-70%,在斑块中平滑肌细胞内占30%。说明基质金属蛋白酶的产生和发展过程与活化的巨噬细胞相关。巨噬细胞面积和MMPs表达水平与AS斑块面积成正比,即AS斑块越大,MAC-3和MMPs表达水平越高(P<0.05)。高脂饮食加重斑块形成和MMPs表达,依据AS斑块破裂常基于纤维帽削弱过程的概念,MMPs水平增加能降解粥样斑块以外的全部细胞外基质成分,造成出现不稳定斑块,而修复作用的平滑肌细胞却因老化凋亡等原因减少,胞外基质的合成与降解不平衡导致基质急剧减少,其结果是纤维帽的基质成分减少,形状变薄,故易于破裂。明胶酶(MMP-2,9)主要降解变性胶原和基膜的主要成分Ⅳ型胶原。随着高脂饮食组小鼠AS的斑块增大,Mac-3表达量和炎性细胞增多更明显,MMP-2,9的免疫反应表达在脂质核边缘近纤维帽和肩部增强。因MMP-2,9表达过量,胶原降解,基质减少,斑块容易破裂和脱落,充分证明了高脂饮食与AS斑块的不稳定性密切相关。因此,在防治AS的过程中,作抗炎症治疗,则可降低巨噬细胞和平滑肌细胞的活化达到抑制MMP分泌增加,从而提高斑块稳定性,减少斑块破裂的发生。