单核苷酸多态性检测技术在法医学中的应用进展（共6篇）
单核苷酸多态性检测技术在法医学中的应用进展 篇1
人工神经网络在单核苷酸多态性(SNP)检测中的应用
人类单核苷酸多态性(SNPs)国际研究计划和中华民族单核苷酸多态性项目已经进行了两年多时间,由于研究工作耗资巨大,使得这两个项目都进展缓慢.目前人类单核苷酸多态性(SNPs)研究主要都是依靠生物实验来确定,借助计算机和数学算法来预报人类单核苷酸多态性(SNPs)是生物信息学领域的`一个难题.在大量文献分析的基础上,试用人工神经网络算法来预报人类单核苷酸多态性(SNPs),通过构建适当的数学模型,预报人类单核苷酸多态性(SNPs)的准确率达到了73%,在生物实验中参考数学模型预报结果,可以节省大量研究资源.
作 者：董和泉 邓文华 郭景康 Dong Hequan Deng Wenhua Guo Jingkang 作者单位：上海大学生物信息研究中心,上海,44刊 名：计算机与应用化学 ISTIC PKU英文刊名：COMPUTERS AND APPLIED CHEMISTRY年，卷(期)：23(10)分类号：Q811.4 TP183关键词：单核苷酸多态性 人工神经网络 预报
单核苷酸多态性检测技术在法医学中的应用进展 篇2
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2011年9月—2012年12月在我院接受口腔检查的100例患者, 经病理检查后, 证实5例为口腔黏膜癌, 5例为口腔鳞状细胞癌 (OSCC) [2]。年龄35~75岁, 平均55岁。诊断指标为世界卫生组织针对口腔肿瘤与口腔黏膜癌变危害的诊断标准。其中5例OSCC患者是原发癌症的病变损伤, 并未经过相应的放射性化疗。
1.2 方法
首先, 在采集标本的过程中, 利用0.9%氯化钠溶液冲洗病变组织, 并及时将其放置在-75℃~-72℃的冰库中冷冻保存;其次, 采取SNP6.0Array基因芯片依照各类型检测单核苷酸的多态性 (SNP) 位点与拷贝数的变异情况[3];第三, 备制DNA。选取MN试剂盒, 精心取出癌症病变的组织DNA, 并采用一定比例的琼脂糖凝胶实施电泳和检验以取出模板DNA。调节电压幅度为6V/cm, 电泳时间为25~31min, 并在紫外灯的照射下密切观察电泳条带的变化情况, 留置备用。第四, 具体的检测手段。选取局限性的内切酶 (Nsp I) 消化事先已经取出的DNA模板, 其次在5bp酶切的末尾连接上一小段类型相同的双链DNA, 以此用作接头。并添置专门用来辨别该接头的牵引物品。再者, 针对已和接头连接上的DNA片段, 利用PCR扩增其两侧, 同时根据新设计的PCR条件, 将DNA片段首先扩增至210~1100bp左右的长度。最后, 把PCR产物进行重新混合及定量, 待经过电泳检测后, 在检测片段的末尾添置及利用单色光检测标记物, 及时做好标记物的上样, 清洗、扫描、和芯片进行杂交、数据处理与分析等工作。第五, 处理基因芯片的检查及测量数据。利用先进的聚焦扫描仪器全面扫描杂交完成之后的芯片, 存档备用。此外, 开展多种基因的分型、数据导出与整理等工作。第六, 认真观察检测的结果, 并对此做出判断。
1.3 计算方法
选取SNP6.0Array基因芯片依照各类型检测单核苷酸的多态性 (SNP) 位点907, 670, 同时检测拷贝数变异的947, 001个位点, 最后详细分析。
2 结果
(1) 根据口腔白斑与OSCC的电泳检测结果显示, 癌症DNA的纯度与含量均满足要求, 可将取得的DNA用来检测下一次的基因芯片。 (2) SNP6.0Array对基因芯片上全部位点的检测率为99.2%, 其中重复性≥99.5%, 一致性≥99.2%, 超出SNP基因芯片的控制指标, 检验效果确切。 (3) 口腔黏膜白斑与OSCC分子中均存有复杂繁琐的遗传基因改变, 具体包含:DNA序列的拷贝数减少或增多且关系到全部的染色体。其中口腔黏膜白斑中多数CN增多的基因改变主要位于染色体7p、3q、11q等;而多数CN减少的基因转变则主要位于染色体7q、3p、17p及18q上。在OSCC中多数CN增多的基因改变通常位于染色体7p、3q、5p、11q、15q等, 而多数CN减少的则位于染色体7p、3q、11q、17p与18q上。这些均是通过其他的检测技术发现的位点。
3 讨论
对癌变发生前的病理机制进行研究, 预估癌变的发生时间是避免或者减少肿瘤发生的重要前提。癌症的发生原因繁多且复杂, 不仅受到遗传基因的影响, 而且还包含机体诱导因素的作用。拷贝数的变异与SNP是当前研究肿瘤基因的热门话题, 经过大量的研究结果显示, 拷贝数的变异与SNP在调节及控制肿瘤基因过程中起关键作用[4]。由于该种基因的转变首先来自于表层形式的转变, 给予拷贝数变异与SNP检测, 有利于在早期及时发现癌症, 且预防和治疗危险人群。近年来, 肿瘤组织经过大量的实验研究后发现, 拷贝数变异与SNP的转变能清楚展示肿瘤分子的横向改变情况。配合科学先进的PCR微卫星检测技术, 能更加快速简便的检测出细小病变中不正常的细胞, 对尽早诊断OLK患者与癌变监测具有重大意义。通过分析头颈部、鼻咽以及子宫内膜等位置的不良病变与OLK患者发生癌变前染色体的转变情况, 结果发现人体基因的缺少或损失和肿瘤癌变的变化过程存在密切联系。因此, 针对上述情况, 可重点研究癌变染色体3, 8, 9, 17。
除此之外, 对于上述癌症基因转变的实验研究, 我国开始分析及研究口腔癌症与其癌变的步伐相对较慢[5], 有关此类的报道更为少见。通过借鉴中外大量的临床文献, 本组研究采用SNP 6.0Array基因芯片加以检测并分析口腔白斑发生癌变前与OSCC的遗传变异。研究结果发现OSCC中的染色体出现明显变化, 而且口腔白斑发生癌变前拷贝数与SNP也有所变化, 只是相对鳞状细胞癌而言, CNV拷贝数与SNP发生的可能性较小。另外, 检测结果表明CNV拷贝数与SNP的转变已在口腔癌变的早期出现, 并且随着口腔癌变的逐步深入, CNV拷贝数与SNP改变的频率就越高。因此, CNV拷贝数与SNP的转变是检测及发现口腔白斑癌变的重要标准。基因转变针对形态学的转变而言相对较早, 并且具有尽早诊断和检测验证癌症的优点, 是一种较为先进有效的监测方法, 可广泛用于临床诊断方面。
摘要：目的 探讨单核苷酸的多态性芯片在口腔白斑癌病监测中的应用效果。方法 选取2011年9月—2012年12月在我院接受口腔检查的100例患者, 经病理检查后, 证实5例为口腔黏膜癌, 5例为口腔鳞状的细胞癌。采取SNP6.0Array基因芯片依照各类型检测单核苷酸的多态性 (SNP) 位点907, 670个, 同时检测拷贝数变异的947, 001个位点, 最后详细分析及检验癌症的DNA序列。结果 口腔黏膜白斑与鳞状细胞癌分子中均存有复杂繁琐的遗传基因改变, 并且多数出现在染色体3、7、9、8、11、13、15、17与18上。结论 基因转变针对形态学的转变而言相对较早, 并且具有尽早诊断和检测口腔癌症的优点, 可广泛用于临床诊断方面。
关键词：多态性, 单核苷酸,口腔肿瘤,基因
参考文献
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单核苷酸多态性检测技术在法医学中的应用进展 篇3
【关键词】 UGT1A1，基因多态性，CPT-11，结直肠癌，个体化，化疗
【中图分类号】R722.12 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2014）08-0188-01
伊立替康（CPT-11）常用于晚期结直肠癌的化疗，可显著改善患者的生存期，但应用受到其可能发生的严重毒性的限制（主要为迟发性腹泻和中性粒细胞减少），严重可导致死亡。因此，急需探寻能够预测化疗毒性的指标用于指导临床。近年来大量临床观察显示，UGT1A1基因多态性（SNP）与CPT-11的毒副作用密切相关，成为研究热点。
1、 CPT-11的体内代谢
CPT-11（Irinotecan，CPT-11）是喜树碱人工合成物，经静脉注射后，在体内经羧酸酯酶（ CE）转化为细胞毒性更强的活性代谢产物7-乙基- 10-羟基喜树碱（ SN-38）。SN-38经尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1（UGT1A1）灭活为葡萄糖醛酸产物SN-38G后，经胆汁排泄进入肠道，在肠道细菌β-葡萄糖醛酸酶作用下转换为SN-38，引发肠黏膜损伤及迟发性腹泻；而肠道内的UGT1A1酶又可再度催化SN-38為SN-38G进行解毒[1]。
CPT-11的毒性与其主要的药物代谢酶 UGT1A1有关，而其酶活性的高低又受UGT1A1基因多态性的影响。因此CPT-11化疗的安全性不仅与患者的年龄、肝功能情况、是否接受放射治疗、CPT-11的剂量及方案有关，更重要的是取决于患者个体的 UGT1A1 基因型。
2、UGT1A1基因位点及其多态性（SNP）
人类的UGT1A1基因是UGTs基因家族中的一员，位于2 号染色体的2q37，以插入、缺失、单核苷酸多态性等形式表现出了序列间很大的个体差异。文献报道的UGT1A1基因位点的改变多达50余种，UGT1A1 的基因多态性主要来自于启动子区 TATA 盒的变异，变异范围包5～8个TA 重复片断，目前研究最多的突变主要集中在UGT1A1基因启动子区TATA序列及第1外显子区突变。UGT1A1基因启动子区存在大量TA 碱基重复序列，最常见的为6个TA 重复序列，即（ TA6 /TA6 或* 1 /* 1）；UGT1A1* 28 为7 个 TA 重复序列，包括纯合突变型（ TA7 /TA7 或* 28 /* 28） 和杂合突变型（ TA6 /TA7 或* 1 /* 28）。UGT1A1* 6 的多态性表现为211G>A，形成3种基因型： G/G A/G 和 A/A， 且UGT1A1* 6 的多态性目前仅在亚洲人群中发现[2]。
3、UGT1A1* 28 及UGT1A1*6与CPT-11导致化疗相关性腹泻及中性粒细胞减少发生的关系
Zhang等[3]研究发现UGT1A1*28基因突变可以增加患者发生2 ～ 4级迟发型腹泻的风险，野生型、杂合突变型和纯合突变的发生率逐渐升高（15.0%、34.8%、50.0%，P=0.000）。张君孝等[4]研究结果提示在中国汉族人群中，UGT1A1*6基因突变型（G/A和A/A）的频率为高于UGT1A1*28基因突变型（ TA6 /7 和TA7 /7） 的频率，UGT1A1*6基因多态性也可使UGT1A1的葡萄糖醛酸化的能力下降7 0 % ， UGT1A 1*6突变与伊立替康的毒副作用风险增加显著相关， 与UGT1A1*28基因型患者的不良反应风险相近。这提示在临床工作中联合检测UGT1A1*28和*6基因多态性更有助于预测伊立替康不良反应。
4、UGT1A1与药物剂量的关系
国内学者胡哲益等对国内外已发表文献进行 ME-TA 分析，以进一步明确不同剂量伊立替康导致腹泻与 UGT1A1* 28 基因多态性之间关系。该研究共纳入 20 个临床试验共1 760名患者，通过系统的分析得出结论： 基因型为 UGT1A1 *28 /* 28 及 UGT1A1* 1 /* 28 的患者较基因型 UGT1A1* 1 /* 1接受中等剂量及高等剂量伊立替康治疗后，腹泻发生概率明显增高，而在低剂量组则无明显差别[5]。
总结
综上所述，UGT1A1 SNP与伊立替康药物毒性存在密切联系，伊立替康的不良反应主要取决于患者个体的UGT1A1 基因型，治疗前检测患者基因型有助于预测不良反应，指导临床用药，规避相关风险，提高伊立替康临床使用的疗效和安全性，对实现肿瘤个体化治疗有重要意义。
参考文献
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单核苷酸多态性检测技术在法医学中的应用进展 篇4
【关键词】计算机 基础技术教学 医学院校
一、计算机对医学工作的影响
计算机信息系统在医学领域中，能有效的提高工作人员的工作效率，能有效的提高数据的准确性，加快数据的统计，并且能形成有效分析数据处理的结果，具体主要表现在以下几个方面：
（一）对数据的速度产生影响
运用计算机能有效的提高处理数据的速度，在计算机信息系统的数据处理中，能有效的分析在此环节下的数据异常，而且能提高数据的准确性。
（二）对医学设备和精度的影响
在计算机系统下进行医学数据分析工作，大部分数据的分析可由计算机系统来完成，医生进行审查时，完全可以根据需要进行顺查、逆查或采用抽样的方法进行审查。但在计算机信息系统环境下，也并非全部由计算机系统按一定的程序指令完成，必要的取样等操作还是需要人员来完成。制定详细的操作规范，并对软件设计跟开发之初就提出更为严格的要求，这样才能有效的利用计算机信息系统，并便于系统在核算中留下新的线索，根据线索来进行相关的分析，更好的运用到医学领域和医学教学中。
（三）对医学教学方法的影响
计算机信息系统的特点决定了在医学院校中教学技术应当相应改变，利用计算机基础技术的教学，让更多的学生能够接触和运用计算机技术，将收集到的各项数据进行分析和处理。而且运用计算机技术，能够提高学生的学习动力和兴趣。
二、利用计算机信息系统进行医学教学计划的制定和工作
（一）充分了解计算机信息系统
医生在使用计算机系统下进行工作，首先要充分的了解计算机信息系统。医生在用计算机系统进行数据处理的时候，应该充分了解计算机信息系统的特点，程序设计的原理，组织结构，计算机信息系统的复杂性，在计算机信息系统中，应该建立对应的组织系统，包括软件的设计，人员的配置，网络系统的设置等等，同时做好数据的处理和储存、输送，大大提高审计的工作效率。
（二）利用计算机系统确定教学的计划内容
利用计算机系统确定医学教学的计划内容，对计算机收集的结果资料进行认真分析研究，以此来确定教学内容以及教学重点，并制定详细的教学计划。这些内容包括：1.电子数据处理系统的范围、目的、重点和起讫时间；2.计算机信息系统的概况；3.教学课程的具体安排跟各项目的详细要求；4.工作原理、过程、以及工作进度跟计划分工的安排；5.运行过程中应该注意的各种事项跟要求。
（三）运用计算机内的相关系统开展教学工作
了解了计算机系统的结构和软件的运用后，运用计算机内的相关软件进行数据的分析，提出相关的数据进行对比，通过制定的审计计划，一步步的根据相应的计划开展数据工作，相关数据的处理均可通过计算机系统进行有效的处理。
三、教学内容
在医学院校的教学中，利用计算机基础教学技术，能有效的让学生掌握医学数据分析和医疗设备的使用。
（一）计算机在医学数据分析中的应用
在医学科学研究中，各项数据的分析和统计是离不开计算机的，计算机对数据处理的准确性直接关系到了科研成果的质量。在现代科技技术的飞速发展下，让生物医学的研究更具有复杂性，在整个研究过程中需要的处理的数据更加多元化，并对计算机的处理能力提出了更高的要求，因此，对处理数据快、计算准确、性能更高的计算机需求更大。是否能够正确使用统计软件来处理数据也成为一个医生的需要基本掌握的知识。
（二）计算机在医疗设备中的应用
计算机早已成为医疗设备的最为普遍的工具，从最早的CT到现代的各种先进医疗设备，都与计算机操作紧密联系在一起，各种检查，化学实验、测试等都离不开计算机。同时，医学院的本科生可以利用计算机进行各种模拟实验，进行医学信息检索等，极大的提高了学习的效率。
四、教学方法
首先，应加强实验教学，计算机教学的方法不应该和其他学科一样，因为它是一门操作性强的学科，而且在讲课的过程中，应该理论与实践相结合，教师多利用现代多媒体技术，充分调动学生的主动性和积极性，让学生能够迫切的对实践操作感兴趣，学生能够通过上机操作来掌握课堂知识，而且可以布置一定的作业，必须上机来完成。其次，要探索教学方法的改革，课堂教学的时候，应该结合实际进行演示，让学生能够更好的掌握知识，充实课堂的信息量。再次，高等医学院校在进行计算机教学的时候，应该注重对学生应用能力的培养，不仅注重专业基础知识的教学，更应该结合学科的特点，开设医学数据处理与分析的教学，紧密结合专业课程，可见，在医学高等院校的计算机教学中，对教学方法和教学内容提出了更高的要求，对学生利用计算机解决实际工作能力的要求更高。
五、总结
充分发挥计算机系统内软件的作用，从了解计算机信息系统的组织构造，到了解计算机信息系统环境，到最后利用计算机系统进行医学教学工作的计划和施行。相信在以后的社会发展中，计算机也会等到进一步的发展，利用计算机基础技术教学进行医学教学将会变得更加实用和方便。
参考文献：
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单核苷酸多态性检测技术在法医学中的应用进展 篇5
（四川省泸州医学院附属医院四川泸州646000)【摘要】超声造影技术是近年来发展起来的一种评价微循环血流灌注的新方法，它具有对乳腺肿块具有诊断和鉴别诊断的价值。本文就超声造影成像技术的特点以及该技术应用于乳腺癌的诊断进展作一综述。【关键词】 超声造影；乳腺癌【中国分类号】R737.9【文献标识码】A【文章编号】1004-5511（2012）04-0440-01 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，仅次于肺癌引起的女性肿瘤引起相关死亡的第二大病因［1］。据统计，2006年美国有21.292万名妇女被诊断为乳腺癌，因乳腺癌死亡的人数达到了1.497万人［1］。自1990年以来，乳腺癌的死亡率呈下降的趋势，一方面是因为乳腺癌辅助治疗的进步；另外一方面是因为乳腺癌的筛查技术的提高和普及，使得早起乳腺癌的检出率增加。随着医学的迅速发展，新的超声诊断技术如三维、造影、介人等在临床上的应用价值被逐渐肯定。本文就近年发展起来的超声造影技术在乳腺癌中的诊断和鉴别诊断中的应用作一综述。1 超声造影成像原理超声造影是经外周静脉注射超声造影剂，增加病变组织与周围正常组织之间的对比从而可显示病变组织造成的异常灌注情况［2］。目前常用的超声造影剂SonoVue被称为“真正的血池造影剂”，它采用六氟化硫作为微气泡，稳定性强，能够在低机械指数超声波的作用下产生谐振，同时利用低声能发射声波与脉冲反向谐频技术相结合能延长微气泡的寿命，突出微气泡的谐频回声成分，从而使肿瘤新生血管效地显示出来。因此，超声造影技术的优势是明显提高了微小血管的显示率，可显示直径< 100μm的血管［3］。2 超声造影在乳腺癌中的应用目前普遍认为肿瘤细胞通过分泌血管内皮生长因子（VEGF）等刺激新生血管的形成，而肿瘤血管的生成是肿瘤生长、转移和复发的的基础［4］。肿瘤的恶性程度越高，血管生成活性越高，新生血管越多，是乳腺癌超声造影的病理解剖基础。乳腺癌早期，新生血管的形成早于肿瘤形态学上的变化，而随着肿瘤的进展，肿瘤细胞往往破坏乳腺正常的微管系统，产生新生血管，后者走行纡曲，内径粗细不一，外形不规则，因此，超声造影剂通过时速度较快、进入剂量多，形成明显增强，而分布不均，并形成局部团块状增强。但是，良性的乳腺肿物如乳腺纤维瘤或者乳腺增生则表现为正常的血管增生，并且保存正常的静脉系统，超声造影剂能顺利平缓进出良性肿瘤的血管，不会出现淤滞现象，造影剂能均匀分布［5］。乳腺良恶性肿物的不同的血管和血流动力学，可通过超声造影前后血流信号增强程度，血管数目的多少，形态走行， 即时间-強度曲线形态学特征或应用造影分析软件计算始增强时间、达峰时间、峰值持续时间、消退时间，以及增强方式等定量参数来鉴别。国内学者研究表明，与良性肿瘤相比，恶性肿瘤时间-强度曲线上升支的斜率更大，达峰时间更短，峰值更高，下降缓慢，曲线下面积也较大［6, 7］。国内张翠明等对48例乳腺肿块行超声造影检查，良性组时间一强度曲线形态为慢上慢下型，恶性组时间一强度曲线形态则表现为两种：快上单相慢下和快上多相慢下［8］。肖炜等探讨分析了36个乳腺肿块的超声造影表现及时间-强度曲线，得出的结果是典型恶性肿块有其特异性增强模式，时间-强度曲线形态与周围正常组织相差较大，而良性肿块的时间-强度曲线形态与周围正常组织相似［9］。外，有研究显示实时超声造影增强模式对诊断恶性肿瘤的敏感性为90.38%，特异性为87.50%，准确性为88.88%［10］。因此，国外的研究者认为通过比较病灶与周围组织的时间一强度曲线参数的差值可能更有助于乳腺良恶性病变的鉴别诊断［11］。3 超声造影前景研究发现淋巴结造影后总血管数和外周血管数明显增多，并且造影持续增强时间均较良性淋巴结明显延长，增强强度大于良性淋巴结，而使得超声造影可望成为今后检测乳腺癌前哨淋巴结的常用方法［12］。另外，超声造影还可能成为评价乳腺癌新辅助化疗的良好工具。总之，超声造影以其独特的优势，它将在乳腺癌临床诊治过程中占据凸出的位置。参考文献［1］Jemal A, Siegel R, Ward E, et al. Cancer statistics, 2006. CA Cancer J Clin 2006;56:106-30.［2］Balleyguier C, Opolon P, Mathieu MC, et al. New potential and applications of contrast-enhanced ultrasound of the breast: Own investigations and review of the literature. Eur J Radiol 2009;69:14-23.［3］朱庆莉. 超声造影在乳腺肿瘤诊断中的应用. 中国医学影像技术 2003;19:1404-6.［4］李晓清. 肿瘤血管生成的研究与进展. 福建医药杂志 2006;2:115-7.［5］Forsberg F, Dicker AP, Thakur ML, et al. Comparing contrast-enhanced ultrasound to immunohistochemical markers of angiogenesis in a human melanoma xenograft model: preliminary results. Ultrasound Med Biol 2002;28:445-51.［6］关少卿. 超声造影时间强度曲线分析在乳腺良恶性肿瘤鉴别诊断中的应用. 岭南现代临床外科 2006;6:181-2.［7］张渊. 超声造影时间强度曲线分析在乳腺肿瘤诊断中的应用. 上海医学影像 2008;17.［7］张翠明. 超声造影在乳腺肿瘤诊断中的应用研究. 中国药物与临床 2009;9:320-1.［8］肖祎炜. 超声造影结合时间-强度曲线在乳腺肿块鉴别诊断中的应用. 影像诊断与介入放射学 2007;16:211-4.［10］张渊. 超声造影诊断乳腺肿瘤的价值. 中国超声医学杂志 2011;27:413-5.［11］Kook SH, Kwag HJ. Value of contrast-enhanced power Doppler sonography using a microbubble echo-enhancing agent in evaluation of small breast lesions. J Clin Ultrasound 2003;31:227-38.［12］Yang WT, Metreweli C, Lam PK, et al. Benign and malignant breast masses and axillary nodes: evaluation with echo-enhanced color power Doppler US. Radiology 2001;220:795-802.
单核苷酸多态性检测技术在法医学中的应用进展 篇6
关键词：超声波；酶解制备；作用机制；耦合技术；应用前景
中图分类号： TS201.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0013-04
收稿日期：2013-09-05
基金项目：国家自然科学基金（编号：31371723、31201449）。
作者简介：滕超（1981—），男，博士，副教授，研究方向为食品生物技术。E-mail：tengchao@th.btbu.edu.cn。
通信作者：李秀婷，博士，副教授，研究方向为食品微生物与酶工程。E-mail：lixt@th.btbu.edu.cn。超声波是指频率高于20 kHz的声波，它具有波动与能量的双重属性，属于机械波的一种。超声学至今已有超过100年的研究历史，而自20世纪80年代以来相关领域的研究发展迅猛，超声波除理论研究外在应用研究领域也取得了较大发展。目前，超声波技术已经广泛应用于食品加工、化工、医疗、生物工程等领域[1-3]。超声波与酶解反应的耦合技术在生工产品制备中的应用研究虽然起步较晚，但由于其独特的优势及应用潜力，近些年逐渐受到人们的重视。超声波技术在酶解制备中的应用主要是通过超声波能量作用于反应体系改变各个组成部分的作用方式，提高产物的合成效率来实现的。但由于酶解体系很复杂，其确切的作用机制尚需大量研究进行验证，本文就超声波对酶解产物制备的影响、超声波辅助酶解制备中关键影响因素等进行论述，对超声波辅助酶解制备的应用进展及现存问题进行介绍和分析。
1超声波对生化反应的一般作用机制
超声波由于频率相对较高而赋予其自身巨大能量。一般认为，高频能量使得被其辐射的分子急速运动，并伴有显著的声压作用，分子结构也因此受到一定程度的破坏，从而直接或间接改变反应速率。超声波在传播过程中与介质相互作用引起各种超声效应。超声效应一般有热效应、机械传质作用、空化效应等3种，而超声波的频率、强度等参数会直接影响上述3种作用的强弱[4]。其中，热效应一般会引起介质整体或边界外局部温升，而空化形成激波时则会导致波前处的局部产生加热现象等。超声波的热效应虽然不是超声波对生化反应过程作用的主要方式，但现已确定为重要影响因素之一。其次，超声波作为一种机械振动能量的传播形式，可以使介质质点进入振动状态，从而增强液态介质的质点运动，加速质量传递作用，进而在液体中形成有效的流动与搅动，导致介质结构的破坏，液体中的颗粒被粉碎，达到普通低频机械搅动所达不到的效果[4]。空化作用是当超声波在介质中传播时强度超过了某一空气阀值所产生的空化现象，主要表现为液体中微小空气泡核在超声波作用下被激活，出现泡核的振荡、生长、收缩、崩溃等一系列动力学过程。通常认为以上超声波所具有的效应对生物质提取尤其是酶催化反应具有重要的影响。
超声波在食品加工中的应用主要通过上述几种机制将声能转化为机械能实现。其中，空化效应通常被认为在催化过程中起主要作用。根据不同的特性，空化作用又可以分为瞬态空化和稳态空化2种。一般较高强度的超声会产生瞬态空化作用，空化泡崩溃的瞬间，释放出高温高压，导致大量自由基的形成，并伴有強大的冲击波或射流；高能量的自由基直接攻击酶分子发生化学变化，影响酶的活性中心，使酶活性减弱甚至失活；而酶分子在强大的冲击波或射流的作用下，分子结构被破坏甚至被剪切成小碎片而表现出活性减弱甚至失活的现象。稳态空化作用形成的空化泡则可使其周围的酶或细胞颗粒受微声流作用下的切应力作用，这种类型的空化作用同样对超声波在生物催化反应中的应用具有重要意义。
2超声波对酶解反应的影响
酶是一类具有生物催化活性的特殊蛋白质，具有催化效率高、高度专一性、易调节控制等优点，其应用范围十分广泛。酶催化在食品工业中的应用可以提高产率，降低能耗，甚至可以促进新产品、新技术、新工艺的兴起和发展。根据已有研究可知，众多种类物理场对酶活性均会产生不同程度的影响，例如，磁场、微波、电场、超声场等均可以不同程度地改变特定酶的性质。酶解反应速度通常主要取决于传质效率和酶分子构象等2个因素；而超声场则会通过加热、机械传质和空化等作用机制不同程度地影响这2个因素，进而改变酶催化反应进程。当前研究已经初步证实，超声波可以促进底物分子之间的相互作用，强化反应物进入及生成物离开酶活性中心的过程，提高酶的活性；另外，还可以改变细胞膜的透性，加强物质传输，因而被广泛用于酶解产物的制备过程中。
2.1超声波对酶解底物的预处理
超声波对底物的作用效果主要是通过提升底物的传质速率来实现的。在较低强度的超声作用下，超声还可以通过降低溶液的黏度和表面张力来增加底物的传质效果。另外，超声产生的机械传质作用和加热作用也可以增加底物分子（包括酶分子）的能量使其运动性加强，增加两者间的接触概率。在此基础上，合适的超声场还可以加强介质与酶之间的传质扩散过程，超声振动产生气泡的界面不仅有利于介质中的底物分子进入酶活性中心，同时也可以帮助酶解产物进入介质提高酶促反应速度。已有相关试验证实，较低强度超声产生的空化泡可使附近的酶分子受到微流产生的切力作用，可能会对疏通酶内外扩散的传质通道有利。此外，超声还可以使反应生成的水再分配，避免新生成的水在酶分子表面形成较厚的水化层而影响底物分子和产物分子的传质。
何荣海等在利用超声波辅助酶法生产紫菜降压肽的研究中，采用20 kHz、800 W的超声场对底物紫菜蛋白进行60 min的预处理，然后再用蛋白酶水解。结果显示，经超声波处理的紫菜蛋白与未处理的样品相比，相同条件下底物蛋白水解度增加110%，同时水解产物活性也有所提高（IC50降低295%）[5]。Imai等在超声辅助纤维素酶水解试验中也得到了类似结果，首先使用超声波对底物（纤维素）进行预处理而后酶解，使得酶解速度显著提高，说明可能是超声在改善传质效果的同时改变了底物分子的部分空间构象，增强了底物与酶分子的结合度，加快了酶解进程[6]。但对于不同反应体系及超声条件也可能会产生不同的作用效果，例如，林洮等在利用超声辅助胰蛋白酶水解米渣蛋白试验中发现，当使用超声波对底物蛋白溶液进行预处理后，酶解反应速率迅速降低；当超声预处理时间大于30 min时，酶解反而会被完全抑制。这可能是因为通过超声波预处理使得底物蛋白空间结构发生改变，减少了底物与水解酶的结合位点，进而降低了反应速度[7]。
2.2超声波对酶的预处理
酶活性的强弱主要取决于酶分子构象的合理程度。超声作用于酶分子时释放的能量可导致酶分子的构象发生一定程度的改变，从而影响到催化活性的变化。较低强度的超声处理会使酶分子能量增加以及介质发生温升，从而引起酶分子构象的微小变化，使酶分子的超微结构更具柔性、更合理，进而表现出较高的催化活性。如果超声强度进一步加强，酶分子结构则有可能进一步改变以趋向不合理的构象，导致酶分子本身的催化活性受到阻碍，表现为酶失活。
Wang等用圆二色谱（CD）对纤维素酶二级结构的变化进行分析，以α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲的含量来阐明二级结构与酶活性之间的联系[8]。如表1所示，超声引起一定数量的α-螺旋形变和无规则卷曲含量的增加，进而造成蛋白质的构象发生变化。这些变化使纤维素酶更具柔软性和灵活性，使底物更容易进入纤维素酶的活性中心，这也有利于纤维素酶活性的改善。但是过量的超声处理后，随着α-螺旋含量的增加和无规卷曲含量的减少，纤维素酶活性减弱，这表明酶活性中心可能被较紧凑的结构所包围，从而阻碍底物与酶反应。
Wang等在研究低强度超声波对纤维素酶预处理的影响中，用色氨酸荧光光谱（最大荧光发射波长为348 nm）对酶构象的变化进行了研究[8]。相关研究表明，酶分子的荧光强度随着超声功率、超声频率、超声时间的增加而逐渐减弱。这表明酶分子的构象随着超声波的预处理而逐渐改变，其原因可能是超声预处理诱导蛋白质分子展开，破坏了蛋白质分子的疏水相互作用，造成更多蛋白质分子的疏水基团暴露到外部[9-10]。
超声波产生的能量可以在一定程度上改变生物大分子（如蛋白质）结构，因此当适宜的超声波作用于酶时，可改变酶分子的空间构象使其折叠更趋合理（更易于与底物结合形成中间产物），从而提高酶催化效率[11]。另外也有观点认为，超声波主要通过对酶活性部位的结合位点施加影响，使失去活性的酶重新具有活性或有活性的酶失活进而改变酶解反应表1用超声波处理后纤维素酶的二级结构的含量
处理方法α-螺旋含量
（%）β-折叠含量
（%）β-转角含量
（%）无规卷曲含量
（%）酶活性
（U/mL）正常对照组26.226.621.924.850.42±1.7518 kHz、5 W超声处理5 min23.925.023.730.452.21±1.3824 kHz、15 W超声处理10 min23.425.023.732.159.58±1.4426 kHz、20 W超声处理10 min24.824.622.826.954.77±1.7129 kHz、50 W超声处理30 min27.626.423.522.231.62±4.23
进程[12]。在作用方式方面，超声波对酶的影响主要取决于超声频率、反应介质含水量以及介质的疏水性等。在低强度及适宜的频率下，通过超声波的空穴作用、磁致伸缩作用和机械振荡作用表现出对生化反应的促进功能或是对酶催化的协同加速作用。
2.3超声作用于酶解体系
如果在酶解反應发生时对整个体系施加超声，首先超声波热效应可以提高反应体系温度，在一定程度上能促进反应的进行。另外，当超声波振动时通过能量的传递引起媒质质点以极高的速度和加速度进入振动状态，也可以在一定程度上增加酶与底物的接触机会，进而改变酶解反应的进程。
林洮等发现，当用超声对底物蛋白和水解酶的混合液直接处理时，试验组底物的分解率比对照组高；但随着时间的延长，试验组底物最终分解率并没有提高。此结果可能是温升及蛋白质构象发生变化等因素导致的综合效果[7]。丁青芝等以双低菜籽饼粕蛋白为原料，分别考察了超声预处理蛋白酶、超声预处理蛋白原料和酶解过程前期施加超声等3种超声处理方式对该蛋白酶解制备ACEI活性肽的影响。结果显示，以上3种超声辅助方式都可以明显促进菜籽饼粕蛋白的酶解效率，而其中超声预处理蛋白原料效果最明显。可能是因为超声波对反应底物的均质作用起到了主要作用，通过超声对底物的预处理增加了酶与底物的接触面积，从而促进了酶解反应的进行[13]。
3影响超声波耦合酶解效果的主要因素
超声波与酶解反应的耦合作用机理较复杂，超声处理的强度及其他反应条件的差异均会对包括催化酶构象、底物均质、反应体系的温升等方面产生复合影响；另外，酶种类的差异、反应体系的不同均会对超声条件的选择产生直接影响[6]。因此，要达到促进酶解效果的目的，必须根据具体情况对超声条件进行系统考察。
3.1超声温度对酶解反应的影响
通常大多数酶的活性在最适温度范围内最强，酶促反应速度最大。而超声波作为一种能量形式具有加热作用和空化作用，因此对酶反应可产生促进和抑制的双重作用。当温度较低时，与空化作用相比，加热作用占主导地位，超声场下的反应体系吸收超声波能量，从而加速了酶促水解反应，表现为促进作用。随着温度的升高，空化作用逐步显现，一方面，当温度超过特定值时，由于酶本身发生热变性导致反应速率降低[14]；另一方面，由于空化作用在液体介质中微泡的形成和破裂并伴随能量的释放，在此过程中会产生瞬时局部高温、高压，同时可能伴有自由基（如水分子电离产生的 H·和OH·自由基）的形成，这些自由基可进入酶活性中心破坏酶分子的构象，进而降低反应速率，表现为抑制作用。
刘振家等发现，当超声温度小于40 ℃时，酶解制备的抗氧化肽1，1-二苯基-2-苦基苯肼（DPPH）清除率随着温度的升高而逐渐升高；在40 ℃时，DPPH清除率达到最大；超过40 ℃后，DPPH清除率呈明显下降趋势[15]。李利军等在对超声波对酶法水解丝素作用的研究中发现，在其他条件相同的情况下分别在30～50 ℃下进行超声处理，结果显示，在45 ℃时产物得率最高。说明合适的反应温度有利于超声耦合酶解反应的进行[16]。
3.2超声时间对酶解反应的影响
超声时间的长短主要会影响超声空化效应的产生和持续。刘振家等以抗氧化肽粗品清除DPPH的能力为指标研究超声时间对酶解脱脂小麦胚芽制备抗氧化肽的影响，结果显示，抗氧化肽的DPPH清除率随着耦合超声时间的延长逐渐升高，至3 min时达到最大；超过3 min后，酶解产物的清除率并没有随时间的延长而明显升高[15]。另外，还有试验发现，在超声作用过程中，产物活性略有下降，这可能是由于超声过程的热效应以及剪切力抑制了酶的活性[17]。杨柳等也发现，通过水酶法提取大豆油产物制备得率随超声时间的延长而升高，超声15 min后渐趋稳定，即继续延长超声时间制备得率保持不变[18]。
3.3超声波强度对酶解反应的影响
莫英杰等在超声辅助酶法制备大蒜素的研究中考察了不同超声强度（0.1～0.4 W/cm2）对大蒜素得率的影响，结果显示，大蒜素得率随超声强度的升高而升高，当强度为 0.4 W/cm2 时，大蒜素的得率最高[19]；但武赟等在超声波辅助酶解制备多孔淀粉的研究发现，酶解过程中较高强度的超声波处理反而降低水解率[20]。可能是因为较高强度的超声波会使酶中氢键断裂，导致蛋白质的结构展开；另外，超声过程中产生的OH-具有很强的氧化作用，能与酶中的氨基酸结合反应，致使酶失活降低水解率[21]。
3.4超声频率对酶解反应的影响
李利军等在对超声波对酶法水解丝素的研究中发现，不同频率超声波对碱性蛋白酶水解再生丝素液作用不同。在其他条件相同的情况下，分别用频率为 26、48、69 kHz超声处理，结果显示，超声频率为 26 kHz时，产物回收率最高。说明低频超声有利于提升酶解反应效果[16]。莫英杰等在超声辅助酶法制备大蒜素研究中考察的超声频率区段为 28～135 kHz，大蒜素得率随超声酶解频率的增加呈现出先增后降的趋势，当超声频率为 50 kHz 时，大蒜素的得率最高。可能是因为随着超声频率的增加，酶和底物分子的碰撞频率也增大，反应速度加快；而当超声频率继续增大时，酶分子构象可能会进一步发生改变，酶活性反而降低，影响了产物的生成[19]。
3.5超声功率对酶解反应的影响
与其他超声条件类似，超声功率对酶解反应同样具有双重效应。李利军等发现，不同功率的超声波（110～290 W）对酶解丝素蛋白作用效果存在明显差异，结果显示，产物回收率在超声功率为200 W 时最大[16]。丁莉莎等也有类似发现，通过考察不同超声功率（0、200、250、300 W）对酪蛋白水解效果的影响发现，在超声功率为200 W时，产物酪蛋白磷酸肽得率最高；而在超声功率为300W时，产物得率甚至低于无超声耦合的空白对照组[22]。此外，对于不同反应相的水解反应似乎也存在类似规律。杨柳等在用水酶法提取大豆油的研究中发现，反应过程中耦合的超声场产物提取率随着功率增大相应提高，当功率达到400 W时，提取率最高，为85.54%；而当功率超过400 W后，提取率反而减小。可能是由于功率过大导致超声瞬间热效应过于明显，使得局部温度过高，导致原料中蛋白质变性，进而影响油脂溶出[18]。
4展望
当前国内外相关研究已经充分证明，超声技术在包括酶解制备等生物催化领域具有良好的应用前景。相关工作已经在理论研究及应用推广领域广泛展开，并逐渐将研究重点转移到对其核心规律或理论的发掘和论证上。但由于生物催化反应体系本身的复杂性以及对超声化学认识的限制，很多本质的机理性问题远未得到明确阐释和说明。而先前未重点考察的影响因素最近被证实同样可能会对反应效果产生显著影响，例如，对于部分酶解试验采用复频共振的方式明显优于单一频率的提取率[22-23]，占空比对超声提取率及提取物的纯度可能会存在一定影响。另外，目前超声提取设备基本都是通过介质（一般为水）将超声间接作用于样品，而为提高超声波作用效率可进一步开发能满足复频、占空比等研究需要的制备仪器等。随着对超声耦合酶解体系研究的逐步全面和深入，很多深层次的问题包括超声与各类反应体系影响关系的分析、相关反应模型的确定等核心规律问题有望逐渐得到涉及和明确，从而可以有效推进该项技术在实际生产中的应用。
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