遗传多态性（共9篇）
遗传多态性 篇1
研究运用聚合酶链反应-单链构象多态性分析 (PCR-SSCP) 的方法研究草原红牛 (GH) 基因的遗传多态性, 为寻找可用于标记辅助选择的分子标记和中国优质特色肉牛——草原红牛的早期分子育种奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
草原红牛68头, 来自吉林省农业科学院, 利用颈静脉采血, ACD抗凝, -20 ℃保存, 备用。TaqDNA聚合酶、dNTPs、蛋白酶K等试剂, 购自北京鼎国生物技术有限责任公司;pMD-18载体试剂盒、PCR产物回收试剂盒和质粒提取试剂盒, 购自宝生物工程 (大连) 有限公司。
1.2 方法
1.2.1 DNA的提取和检测
利用常规的苯酚/氯仿抽提方法提取基因组DNA, 用TE溶液将DNA样品稀释, -20 ℃保存, 备用。用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法双重检测DNA的纯度和浓度, 然后稀释成30 ng/μL, 备用。
1.2.2 引物的设计
试验所用GH引物是参照参考文献[1], 并根据已发表的牛GH基因 (accession number M57764) 的碱基序列设计的, 6对引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列、PCR产物大小、位置见表1。
1.2.3 PCR扩增
反应物体系共25.0 μL, 其中包括灭菌去离子水18.6 μL, 30.0 ng/μL 的DNA模板1.0 μL, 10×Buffer 2.5 μL, 2.5 mmol/L的dNTP1.0 μL, 10 pmol/L的上下游引物各0.7 μL, 3 U/μL rTaq聚合酶0.5 μL。
PCR反应循环参数:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s, 55～65 ℃复性40 s, 72 ℃延伸30～40 s, 35个循环;最后72 ℃延伸10 min。
1.2.4 PCR-SSCP分析
2 μL PCR产物加10 μL变性上样缓冲液, 98 ℃变性10 min后, 立即冰浴10 min, 然后上样置于预冷的聚丙烯酰胺凝胶上。 试验根据扩增片段的大小, 将30%的聚丙烯酰胺凝胶 (29∶1) 配成8%～12%的聚丙烯酰胺凝胶, 以160 V电压于1×TBE电泳14～18 h。电泳结束以后, 首先在70%乙醇中固定10～15 min, 用去离子水洗2次, 每次2～3 min;银染30 min (100 mL染色液中含NH3·H2O 1 mL, 0.36% NaOH 21 mL, 20% AgNO3 1.8 mL) , 再用去离子水洗3～4次, 每次2～3 min, 加入显色液 (200 mL显色液中含1%柠檬酸钠1 mL, 甲醛100 μL) , 待电泳条带清晰后换上去离子水停显。
1.2.5 目的片段的克隆、测序
进行PCR-SSCP分析后, 将不同纯合子基因型个体的PCR扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶中电泳分离、纯化回收, 回收后的DNA与pMD-18载体连接, 并转化到大肠杆菌DH5α菌株中, 蓝白斑筛选后经PCR扩增鉴定阳性克隆, 提取质粒DNA进行序列测定。
2 结果与分析
2.1 GH 基因内含子3 PCR扩增结果和PCR-SSCP分析结果
对GH基因的内含子3进行扩增, 产物经2%的琼脂糖凝胶检测, 获得了与目的片段大小一致的产物 (345 bp) , 带型清晰且无杂带, 稳定性和特异性好 (见图1) , 可进行SSCP分析。PCR产物经SSCP分析结果表现出3种基因型 (见图2) 。对P1RF的两种纯合基因型AA、BB克隆测序, 并用DNASTAR比对分析, 结果见图3。结果表明, 在1 435 bp处有一个T→C的突变 (与 GenBank accession M57764相比而得) , 导致等位基因A变为等位基因B;在1 692处有C→T的突变 (与Yao J等[1]1996年的研究结果相同) , 但并未导致新的等位基因出现。
1～9.PCR产物;M.DL2 000 Marker。
1～9.PCR产物;M.DL2 000分子质量标准。
2.2 GH基因内含子4 PCR-SSCP分析结果 (见图4)
由图4可见, 在8%的聚丙烯酰胺凝胶 (PAGE) 电泳条件下对PCR产物进行PCR-SSCP分析, 在不同个体中检测到了3种基因型 (CC、CD、DD) 。 对P2RF的两种纯合基因型CC、DD克隆测序, 发现该位点在1 918处有C→A的突变 (与 GenBank accession M57764相比而得) , 导致等位基因C变为等位基因D, 序列比拼结果见图5。
2.3 GH基因外显子5 RCR-SSCP分析结果 (见图6、图7、图8)
1～9.PCR产物;M.DL2 000 Marker。
利用30%的聚丙烯酰胺配制成浓度为12%凝胶, 160 V电压电泳18 h, 结果表明, 该位点由1对等位基因控制 (E、F) 。对PCR产物中的纯合子基因型克隆测序, 由序列比较结果 (见图7) 可以看出:于GH基因外显子5的2 291 bp处发生了1处碱基A→C突变[1]。
2.4 GH基因3′UTR P5RF扩增片段PCR-SSCP分析结果
在8%的聚丙烯酰胺凝胶 (PAGE) 、160 V电泳扩增结果见图9条件下进行PCR-SSCP分析, 结果表明, 在不同个体中检测到了3种基因型, 见图10。根据PCR-SSCP结果, 将GG和HH两种纯合基因型进行克隆测序, DNASTAR比对分析, 发现在GH基因3′UTR 位点2 639处有C→G突变, 导致等位基因由G变为H, 导致HaeⅢ增加一个酶切位点;在2 735 bp处有T→C (与 GenBank accession M57764相比而得) 突变, 但是并未导致新的等位基因出现。结果见图11。
1～8.PCR产物;M.DL2 000 Marker。
2.5 GH基因5′UTR P6RF引物PCR-SSCP分析结果
对GH基因的5′UTR片段进行PCR扩增 (结果见图12) , 经2%的琼脂糖凝胶检测, 获得与目的片段大小一致的464 bp PCR产物, 带型清晰且无杂带。PCR产物经SSCP分析结果表现出3种基因型 (见图13) 。将P5RF位点的纯合基因型II、JJ个体的PCR产物进行克隆测序, 与DNASTAR比对, 结果见图14。由结果分析可见, 该片段在431处有一个A到G的突变, 导致等位基因由I变为J。
1～9.PCR产物;M.DL2 000 Marker。
2.6 GH基因5′UTR PCR-SSCP分析结果
利用P6RF引物对5′UTR PCR扩增 (结果见图15) 后, 其产物进行PCR-SSCP电泳分析, 结果如图16所示。
1～9.PCR产物;M.DL2 000 Marker。
3 讨论
生长激素是调节动物生长发育和三大物质代谢过程的一个重要内分泌因子[2]。bGH基因定位于19号染色体上, 由5个外显子和4个内含子组成, 长约2 856 bp。国内外研究报道证实, GH基因遗传多态性与牛的生长发育、屠宰和胴体性状、泌乳和肉质性状有不同程度的相关性。
试验以PCR-SSCP的方法, 首次研究了基因全长在草原红牛群体中的的遗传多态性, 结果发现在GH基因的第3内含子、第4内含子、第5外显子的3′端和5′端存在丰富的等位基因突变。这与Yao J等[1]1996年的研究结果相同, 但在草原红牛群体中, 并未导致新的等位基因出现。第4内含子在1 918 bp处有C→A的突变, 而Yao J等[1]的报道则是在2 017 bp处碱基 T→C突变, 高雪等[3]报道, 在1 947 bp处有T→G突变, 该位点的突变需要进一步探讨。本试验中GH基因外显子5 2 291 bp处有A→C突变, 与Yao J等[1]报道的一致。
研究对草原红牛GH基因的全基因组序列进行了多态性分析, 发现了大量的突变位点, 这些碱基的突变是否影响了GH的生物活性有待进一步研究, 同时这些突变位点与肉用和屠宰性状的相关关系也有待进一步研究。这些位点是否可以作为遗传标记用于草原红牛屠宰和肉用性状的早期选种选育, 如何建立相应的基因诊断方法, 将是下一步研究的重点, 研究结果将会为草原红牛的胴体和肉质性状早期选育打下分子生物学基础。
参考文献
[1]YAO J, SAMUEL E, DAVID Z, et al.Sequence variation in the bo-vine growth hormone gene characterized by SSCP analysis and theirassociation with milk production traits in Holsteins[J].Genetics, 1996, 144:1809-1816.
[2]贺淹才.生长激素和生长激素受体的分子生物学[J].生命化学, 2002, 22 (1) :29-32.
[3]高雪.牛生长发育性状候选基因的分子研究标记[D].杨凌:西北农林科技大学, 2004.
遗传多态性 篇2
安徽地区汉族人群15个STR基因座遗传多态性
应用荧光标记引物复合扩增技术,对安徽地区263名汉族无关个体的`D3S1358、TH01、D21S11、D18S51、Penta E、D5S818、D13S317、D7S820、D16D539、CSF1PO、Penta D、vWA、D8S1179、TPOX、FGA等15个STR基因座的多态性调查,现报道如下.
作 者：郑卫红 王留柳 宫荣彬 陈真宁 作者单位：安徽省公安厅刑警总队,安徽,合肥,230061刊 名：中国法医学杂志 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF FORENSIC MEDICINE年，卷(期)：200621(3)分类号：Q2关键词：法医物证学 STR 复合扩增 遗传多态性
遗传多态性 篇3
1 氧化亚铁硫杆菌的生理特性
氧化亚铁硫杆菌 (Thiobacillus ferrooxidans) :是生物湿法冶金过程主要的浸矿菌种。这种菌系短杆菌, 很小, 0.3～0.5×1.0-2.0um, 圆钝末端, 以单个、双个或几个成短链状存在。是一种化能自养菌, 专性好氧, 嗜酸性, 广泛生活在金属硫化矿和煤矿的酸性矿坑水中。最适生长温度25℃～30℃。生长在pH 1.4～6.0之间, 最适p H 2.0～2.5。T.f以氧化亚铁、元素硫以及还原态的硫化合物等来获得生命过程所需的能量, 以空气中的二氧化碳为碳源, 以氨或铵盐为氮源。有鞭毛, 能快速游动, 革兰氏染色阴性。在9K固体培养基上呈红棕色菌落, 近杆形[5]。
2 氧化亚铁硫杆菌的氧化机理
自20世纪60年代以来, 因为它们具有特殊的生物学功能, 吸引了许多学者对T.f和T.t的生理特性进行了研究。许多研究表明, T.t利用单质硫的能力比T.f强, 但T.t不能利用硫酸亚铁。Wong和Henry对氧化硫酸亚铁的机理进行了详细的研究, 指出能将亚铁氧化成三价铁, 三价铁会与硫酸根离子发生反应产生铁矾沉淀, 同时产生硫酸而引起pH的下降:
Templellvl和Leathen等人研究发现氧化亚铁硫杆菌能将矿物中的硫化矿物氧化为硫酸和硫酸盐。Bryne等对T.f氧化硫化矿物的机制进行了详细的研究。并提出了一些常见矿物的主要反应机理, 如黄铁矿和黄铜矿:
3 微生物分子生态学研究的一般方法和原理
微生物分子生态学是分子生态学的重要组成部分, 是分子生物学、微生物生态学、微生物生理学与遗传学相互结合而产生的一门边缘学科。从目前的发展状况来看, 当前的主要研究领域有:采用分子生物学技术研究不同自然环境中微生物的种类组成和群落结构以及它们的数量动态;环境因子对微生物基因表达的影响:自然条件下微生物之间遗传物质的转移:微生物与高等生物相互作用的分子机制, 包括共生关系的建立、病原微生物的致病机制等。因此, 微生物分子生态学是利用现代分子生物学的基础理论与技术, 在分子水平上, 研究微生物与其生态环境间相互关系的一门新兴学科。
3.1 一般研究方法
(1) 平板涂布分离。
(2) 显微镜观察:普通光镜、相差显微镜、透射电镜、扫描电镜。
(3) MPN法, 即最大或然值计数法, 是平板涂布分离法的一种, 但由于广泛应用, 被单独作为微生物研究的一种技术。
(4) 活菌计数法, 常见的用哑咙橙染色, 活菌死菌颜色不一样。
3.2 分子研究方法
(1) 纯种分离, G+C测定、16SrDNA, ISR测序、比对。
(2) 变性梯度凝胶电泳 (D GGE) , 通用引物PCR扩增同样长度的基因, 常为16S的一段 (300bp～400bp) , 割胶纯化、克隆测序, 比对变性梯度凝胶电泳 ( (DGGE) 技术以土壤微生物群体的基因组DNA为研究对象, 通过比较不同土壤中各种微生物的16SrRNA基因信息来了解微生物的多样性。
(3) FISH荧光原位杂交, 设计不同荧光染料标记的特异探针, 检测不同分类界元水平的细菌, 可在细胞水平或者核酸水平与目标菌种杂交, 在表面荧光显微镜或者CLSM (共聚焦激光扫描显微镜) 下监测。
(4) TRFLP, 末端限制性长度多态性。
(5) ARDREA.RISA。
(6) 流式细胞仪计数。
(7) Real-time实时荧光定量PCR监测技术。
(8) 克隆转化法:通用引物扩增从水样、土样中提取得总DNA, 获得全长的16S rDNA序列, 随机克隆入载体, 转化到大肠杆菌, 挑取阳性菌落, 用不同的限制酶酶切检测不同的克隆, 测序、比对。
(9) DNA芯片技术, 主要用来研究微生物的功能基因组学。
4 本论文的立论依据
AMD的pH通常很低, 严重的地方可达pH2.0, 富含SO42-离子和Fe3+离子, 易浸出废矿石中的有毒元素, 如铅、砷、铬、铜等以及氰化物, 对矿业生产、生态环境造成严重危害, 所以就AMD的研究越来越重要。我国自1959年以来, 对微生物处理污水的技术的研究已取得了一定的成果, 但重点放在污水菌种的保藏的研究方面, 而且就整体情况而言与国外相比要差的远, 在污水处理微生物生物学方面的研究相对于前者明显滞后。不仅设备、工艺落后, 更主要的是对微生物本身没有作进一步的研究, 缺乏对菌种生物学性状较为全面的认识, 譬如菌种的生理、生化性状以及分类地位的了解, 缺乏对菌种分子水平上的认识及其在污水处理过程中菌种所参与的机理等的研究, 因而也就不能很好的指导生产实践。从目前发表的一些较为零碎的文献及几本专著看出, 在酸性污水中细菌的研究方面, 生物领域的科技工作非常薄弱, 主要是一些污水治理方面的专业人员在从事相关研究。
目前, 我国对浸矿细菌的资源开发工作做的远远不够, 根据国内外文献报道, 用于处理酸性污水的细菌有氧化硫硫杆菌 (A.Thiooxidans) 和氧化亚铁硫杆菌 ( (Acidithiobacillus ferrooxidans) ;钩端螺菌 (Leptospirillum) 、中等嗜高温菌, 如文献报道的硫化杆菌属 (Sulfobacillus) , 如热氧化硫化杆菌 (Sulfobacillus thermosuidooxidan) 以及一些未确定分类位置的细菌、嗜酸嗜高温古细菌等。就细菌遗传多样性、系统学研究工作来说, 目前国内发表的文献主要集中在放线菌、根瘤菌、嗜盐碱的古菌方面, 对硫杆菌其他浸矿细菌的多样性及系统发育工作而言, 国内尚见较为系统的报道。因此, 对硫杆菌及其它浸矿细菌的多样性研究就很有必要。
(1) 硫杆菌 (Thiobacillus) 及其它嗜酸菌分子系统学研究目标及意义。
在地球表面广泛分布有元素硫及其金属化合物而形成的许多特殊环境, 如硫铁矿、地表及海底的含硫热泉等。近年来, 由于各国微生物学家对极端环境条件中的微生物资源的研究开发成为一个热点, 使得硫铁矿、含硫热泉等酸性条件中的微生物多样性的研究取得了较快的进展, 发现了许多生理生化性状特殊的细菌, 其中有些归属于硫杆菌, 有些目前还未确定其系统位置。分子生物学技术在含硫的酸性环境微生物系统学、生态学研究中的广泛应用, 不仅发现了许多常规技术不能发现的新细菌, 也对这些细菌的分类及系统学地位的确定提供了有力的手段, 同时对一些已知细菌的分类及系统位置进行了修订, 使得传统意义上的硫杆菌分类更趋合理, 尽量可以建立一个亚利士多德所谓的接近于自然的分类体系。对氧化亚铁硫杆菌系统学地位的确定不仅具有重要的理论意义, 对指导细菌浸矿等生产实践中优良菌株的选择也具有直接的应用价值。我国地域广阔, 各种含硫的矿产资源及自然生态环境非常多样化, 蕴含着非常丰富的代谢硫的细菌资源, 而倍受国外微生物学家的关注, 因此加大这些细菌资源的开发和研究力度, 将为这些细菌的生产应用实践奠定理论基础。本课题研究的目标之一就是大量开发我国不同酸矿环境中的微生物资源, 尤其是一些硫氧化细菌及其这些细菌的分子系统学的研究。
(2) 不同环境中嗜酸菌的遗传多样性研究及其意义。
由于Acidithiobacillusferrooxidans, A.thiooxidans, A.caldus, Leptospirillumferroo xidans这几种细菌能够氧化亚铁、还原性的金属硫化矿, 目前被广泛应用于微生物湿法冶金、煤和天然气脱硫、酸性矿区的生态恢复治理、污水处理等技术, 使得这些细菌成为微生物学家研究的热点之一。但是由于硫矿的化学组成不同与含硫酸性环境在地球上的生态分布与多样性极其复杂, 使得这类细菌同一种不同菌株的生理生化性状表现出显著的不同, 形成了表型差异明显不同的菌株, 同时造成这些细菌不同菌株的遗传组成差异显著, 即所谓的遗传多样性, 利用分子生物学技术研究这些细菌的遗传差异, 不仅有助于筛选、鉴定出性状明显不同、在浸矿实践中针对不同化学组成的矿体表现高效的菌株, 反过来也可以从物种进化上阐明不同环境造成的选择压对细菌进化的作用以及细菌对环境的适应性, 进一步对表型差异悬殊、介于相似种之间的菌株的系统学地位重新进行研究修订, 并且有助于阐明自然界广泛分布的许多代谢硫、铁有关的细菌的起源及进化关系。目前, 虽然微生物冶金基础研究被列为国家973重点基础发展计划, 但我国在浸矿细菌的生物学基础研究方面所作的工作几为空白, 对这些细菌的多样性有待进一步研究挖掘。从世界各地大量采集分离纯化菌株, 进一步阐明这些细菌的分子系统学及进化关系, 从遗传多样性的角度选择优良菌株, 为应用于生产实践提供理论基础。
由于我国生态环境多样性非常丰富, 存在各种各样的富含金属及硫化合物的生态环境, 因此有可能分离到生理及遗传差异明显的不同菌种, 存在非常丰富的种以上水平和种下水平的多样性。但到目前为止, 国内对嗜酸细菌物种多样性和遗传多样性的研究几乎为空白, 基于此这两个细菌多样性的研究是本课题的主要目标之一。
5 前景展望
在研究的基础上, 进行微生物优势群落的生理生化分析和限制多态性分析, 可继续进行矿区酸性污水微生物类群多样性的研究, 进而研究矿区酸性污水微生物类群的结构和分布的特异性, 进而确定这些菌株分类学和系统发育学地位。由于条件有限, 本研究许多方法、步骤还有待改进和完善 (比如在提取污泥中细菌的方法上我们有待改进) , 在未分离和测序的种群中还蕴藏着丰富的微生物资源, 需要进行进一步的研究。随着工业污水微生物资源研究理论的发展和研究技术的完善, 人们必定从工业污水微生物中获得瞩目成果, 更好地为人们的生产生活服务。
参考文献
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[3]林建群, 颜望明, 林建强, 等.硫杆菌的分子遗传学研究[J].微生物学杂志, 2000, 3, 20 (1) .
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遗传多态性 篇4
D1S1676在山西汉族人群中的遗传多态性
目的.:对基因座D1S1676的基因多态性和法医学意义进行研究.方法:山西汉族人群中随机筛选110例无关个体,提取静脉血,用GDB中的引物进行PCR扩增,银染显色.对其筛选的等位基因测序,构建等位基因分型标准物;按照ISFG原则命名各等位基因.结果:本研究首次选择了常染色体基因座D1S1676,该基因座为4核苷酸简单重复STR,重复单位为[GAAG]n.在110例山西汉族无关个体血样中共检出了6个等位基因.其个人识别能力(DP)和非父排除率(PE)为0.920和0.630,其基因型分布符合Hardy-Weiberg平衡(P>0.05).结论:基因座D1S1676具有较高的遗传多态性,在法医学及人类遗传学方面具有较高应用价值.
作 者：车莎 张更谦 郭大玮 刘艳琼 CHE Sha ZHANG Gengqian GUO Dawei LIU Yanqiong 作者单位：山西医科大学,山西,太原,030001刊 名：山西职工医学院学报英文刊名：JOURNAL OF SHANXI MEDICAL COLLEGE FOR CONTINUING EDUCATION年，卷(期)：19(2)分类号：Q987关键词：短串联重复序列 聚合酶链反应 D1S1676 遗传多态性
遗传多态性 篇5
微卫星( microsatellite) 一般是包括2 ~ 6个碱基、 重复10 ~ 20次的DNA区域构成短的串联重复序列( short tandem repeat,STR) ,又称为简单序列重复( simple sequence repeat,SSR)［4］。微卫星DNA在基因组上随机分布,从真核生物的基因组来看,微卫星DNA覆盖了整个基因组,每隔10 ~ 50 kb就存在1个微卫星位点［5］。几乎在哺乳动物的每个基因中均至少包含1个微卫星位点［6］。微卫星DNA的结构通常有3种,即复合型、连续型和间断型。这3种类型也被称为复合型、完全和不完全微卫星［7］。微卫星倍受推崇的原因就是其具有分布广、数量多、呈共显性遗传方式、多态性丰富、多态信息含量( PIC) 高以及检测快速、方便等优点［8］,是一种新型的分子遗传标记,是目前种群遗传分析领域中最有效的分子标记［9］。
基因多态性是指在一个生物群体中,同时和经常存在2种或2种以上不连续的变异型或等位基因( allele) 或基因型( genotype) ,称为基因多态性,也称遗传多态性( genetic polymorphism) 。从根本上讲,基因水平上的变异导致多态性的产生,一般发生在没有重要调节功能的区域和基因序列中,不编码蛋白的区域［10］。对于个体而言,基因多态性按孟德尔规律世代相传,并且碱基顺序终生不变。生物群体的基因多态性通常分为三大类,即DNA片段长度多态性、单核苷酸多态性、重复序列多态性［11］。
试验对延边地区的圈养黑熊进行遗传多态性检测,选择Gen Bank上登录的6个黑熊微卫星基因座, 分析这些圈养黑熊中的遗传变异标记位点,为圈养黑熊种质特性研究积累分子生物学数据基础。
1材料
试验分别从延边白头山熊场选取113头、延边熊场选取37头、汪清县野生动物养殖场选取26头成年黑熊,雌雄比例约为1∶1,进行圈养黑熊遗传多样性分析。
2方法
2. 1基因组的提取
试验黑熊血液采集于吉林省延边地区圈养黑熊, 对已麻醉的黑熊用乙二胺四乙酸二钠( EDTA - Na2) 采血管抽取全血3 m L,参照《分子克隆实验指南》［12］中哺乳动物全血DNA的提取方法,选用酚- 氯仿抽提法,操作过程中尽量除尽酚- 氯仿、乙醇等试剂。 为避免物理性因素导致DNA降解,保证DNA模板的质量,需要用1% 琼脂糖凝胶电泳检测提取的产物, 最后置于- 20 ℃冰箱中冷冻保存。
2. 2微卫星DNA多态性的检测
试验选用Gen Bank上发表的亚洲黑熊6个微卫星标记序列,使用Primer Premier 5. 0和DNAStar软件在重复序列两端的侧翼序列区设计PCR引物。
2. 2. 1引物的设计与合成引物由上海英潍捷基贸易有限公司合成,见表1。新合成的引物为带有荧光标记的固体粉末,荧光引物稀释后需避光保存。
2. 2. 2PCR扩增PCR反应体系( 25 μL) : 10 × Buffer 2 μL,2. 5 mmol / L d NTPs 2 μL,F - primer 1 μL,R - primer 1 μL,模版2 μL,Taq聚合酶0. 25 μL,Mg2 +1. 5 μL,加去离子水补足至25 μL。
PCR反应条件: 95 ℃ 预变性5 min; 94 ℃ 变性30 s,退火时间均为30 s( 各引物退火温度参照表1) , 72 ℃ 延伸30 s,共35个循环; 72 ℃ 再延伸10 min; 4 ℃ 保存。
2. 3数据的统计分析
采用Microsallite Tookit计算等位基因数、有效等位基因数等相关数据,采用POPGEN32计算PIC。
3结果与分析
3. 1基因组DNA的提取与结果
采用博迈德血液提取试剂盒提取采集到的175份延边圈养黑熊血液DNA,取5 μL基因组DNA溶液,用1% 琼脂糖凝胶电泳检测,见图1。
3. 2 PCR扩增结果
PCR产物经1% 琼脂糖凝胶电泳检测,ABB1位点扩增结果,见图2。
3. 3扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
经过PCR反应条件的筛选,并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳验证具有多态性的15个微卫星位点进行样本的大量PCR扩增,部分结果见图3。
3. 4微卫星座位的多态性分析
3. 4. 1等位基因和基因频率分别统计3个熊场及总体圈养黑熊的6个位点的等位基因数、有效等位基因数以及各等位基因的基因频率,结果见表2、表3。 各微卫星位点有4. 000 ~ 8. 000个等位基因数,其平均等位基因数为6. 500个,平均有效等位基因数为4. 148 5个,6个微卫星标记共有39个等位基因。
注: - 表示未检测。
3. 4. 2微卫星位点的多态性试验中ABB1、ABB3、 ABB4、ABB5、ABB6、ABB7均为多态性位点。研究对所有具有多态性位点的圈养黑熊的PIC进行统计分析,结果见表4。
注: PIC > 0. 5为高度多态性位点; 0. 25 < PIC < 0. 5为中度多态性位点; PIC < 0. 25为低度多态性位点。
由表4可知,延边3个圈养黑熊中各位点的PIC值在0. 453 4 ~ 0. 742 2之间,平均值为0. 571 7,其中位点ABB1、ABB3、ABB7的PIC值处于0. 25 ~ 0. 5之间,属于中度多态性位点,其余位点均高于0. 5,属于高度多态性位点,说明所选标记具有丰富的多态性, 在分子水平上能够切实反映圈养黑熊物种的遗传关系。延边3个黑熊养殖群体的平均PIC均高于0. 5, 说明该群体可提供的遗传信息较高。养殖群体应注意种公畜的保有量,并加大饲养管理,最大可能地避免近亲繁殖,使群体的遗传多样性得以保持,从而保证较高的PIC。
4讨论
微卫星作为具有共显性的高度多态的分子标记, 已经基本取代了其他标记在生态学研究中的地位,目前在种群遗传分析领域中几乎是最有效的分子标记。 大多数濒临灭绝的哺乳类物种中均进行了以微卫星为分子标记的种群遗传学研究,因此研究选用微卫星作为研究评价圈养黑熊的遗传多样性［13］。PIC是衡量片段多态性的一个重要指标。D. Botstein等［14］研究表明,PIC指标能衡量基因变异程度高低,当PIC > 0. 5时,为高度多态性位点; 0. 25 < PIC < 0. 5时,为中度多态性位点; PIC < 0. 25时,为低度多态性位点。 李利等［15］利用5个微卫星基因座对四川地方品种进行遗传多样性研究,结果表明,在地方山羊群体中所选微卫星遗传多样性丰富。试验样品均采自延边地区,但该人工繁殖群体在不同微卫星位点上的PIC差距很大。
反映某个位点在进化过程中所积累的遗传变异的一个因素就是等位基因的数量,等位基因数量越多说明进化史上这个位点突变越活跃,导致物种对生活环境适应的潜能越大。根据微卫星选择标准来看,要想较好地评估遗传多样性,每个微卫星标记至少应有4个等位基因［16］。从试验结果來看,6个微卫星位点的等位基因数量为4. 000 ~ 8. 000个,平均每个微卫星位点有6. 500个,说明黑熊养殖群体的遗传多样性还比较丰富。
5结论
遗传多态性 篇6
1 材料与方法
1.1 材料
试验采用典型群随机抽样法, 采集了60份岷县黑裘皮羊 (公羊10头、母羊50头) 的新鲜血样, EDTA抗凝。采样羊只均来自中心产区, 采样个体具有该品种的明显特征。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA的提取
基因组DNA提取参考《分子克隆实验指南》 (第3版) 用蛋白酶K和苯酚从哺乳动物细胞中分离高分子质量DNA的方法, 稍加改进。
1.2.2 微卫星标记的选择
采用FAO推荐微卫星引物, 共15对 (见表1) , 可由GenBank查得, 由宝生物工程 (大连) 有限公司合成。
1.2.3 PCR反应条件
PCR反应体系为20 μL。PCR扩增程序:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s, 50～60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 共35个循环;72 ℃延伸10 min;4 ℃保存, 备用。
用10%的非变性PAGE凝胶进行电泳, 然后用银染法进行定影、显色。
1.3 统计分析
使用Excel Microsatellite Toolkit计算等位基因频率、等位基因大小范围。多态信息含量 (PIC) 、杂合度 (He) 和有效等位基因数 (Ne) 用Dispan软件计算。
2 结果与分析
2.1 基因组DNA的检测
采用常规的酚-氯仿抽提法提取基因组DNA, 用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测, 结果见图1。由图1可知, 基因组DNA是1条较为整齐的条带, 亮度较好, 说明提取的DNA纯度较高, 浓度较大, 符合分子生物学试验要求。
2.2 PCR产物的检测
2.2.1 PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测
对选取的15个微卫星座位进行PCR产物扩增, 用2%琼脂糖凝胶电泳检测;结果见图2。从图2中几乎看不出等位基因之间的差别, 这是由于碱基数相差较小, 琼脂糖凝胶电泳无法分辨。特异PCR产物在琼脂糖检测时只会看到1条带, 根据DNA Marker 来判断所扩增产物是否在该微卫星位点的特异性条带区域之内。
2.2.2 PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
根据等位基因扩增片段的大小判断个体的基因型, 分离出1条带的为纯合子, 2条带的为杂合子, 无条带为无效等位基因。15个微卫星座位中73.33%的微卫星座位等位基因数为10～13个。图3和图4为微卫星标记BM6526和BM757在岷县黑裘皮羊中扩增产物的部分聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果。通过对电泳结果分析表明, 所选15个微卫星座位的多态性是比较丰富的。
1～11.酚-氯仿抽提法提取的基因组DNA。
1～6.PCR产物;7.DNA Marker;8.PCR产物。
1～9, 11～21.BM6526位点引物的PCR产物;10.DNA Marker。
1～2, 4～15.BM757位点引物的PCR产物;3.DNA Marker。
2.2.3 微卫星位点等位基因频率
15个微卫星位点的等位基因在岷县黑裘皮羊中的分布及频率见表2。由表2可知:岷县黑裘皮羊在15个微卫星座位上共检测到160个等位基因, 每个座位平均10.67个等位基因, 其中OarFCB128和BM6506位点的等位基因数最多, 为15个, 片段大小分别为101～147, 184～234 bp, 等位基因频率分别为0.048 4～0.161 3、0.032 3～0.177 4;OarAE129位点的等位基因数最少, 为6个, 片段大小分别为145～175 bp, 等位基因频率分别为0.032 3～0.354 8。
2.2.4 微卫星位点的多态信息含量、有效等位基因数及群体杂合度
结果见表3。由表3可知:15个微卫星位点在岷县黑裘皮羊中的平均多态信息含量、平均有效等位基因数及群体平均杂合度分别为0.861 5, 9.248, 0.882 6;OarFCB128位点的多态信息含量、有效等位基因数及群体杂合度最高, 分别为0.910 8, 13.310, 0.924 9;BM8125位点最低, 3个指标分别为0.778 8, 5.379, 0.814 1。说明OarFCB128位点变异最大, BM8125位点变异最小。
3 讨论
岷县黑裘皮羊又称岷县黑紫羔羊, 以生产黑色二毛裘皮著称。首先, 它是资源评价的基础, 因其可以确定品种范围, 判定品种属性;其次, 它可以估计某些基因资源在特定品种或群体中潜在分布的可能性, 以便制订保持或发展品种特性的计划[4] 。对一个品种从外型到基因遗传结构的分析, 有利于对其进行综合评价, 为遗传资源的保护提供可靠的依据[5] 。
研究中所选择的微卫星位点要求尽可能地分布在各个染色体上, 位点的选择还考虑等位基因数的多少, 这样就有可能提供更多的遗传信息。每个位点的等位基因至少在4个以上才能较好地进行遗传分析, 一般选择等位基因数在5～19个为宜, 等位基因数太少, 不能提供足够的信息量, 为以后的分析带来不便。而多态信息含量大于0.7的微卫星为最好的遗传标记, 这是由于此时双亲在该位点通常是杂合的, 在其后代中可以观察到等位基因分离。另外, 扩增产物的片段大小应在100～300 bp之间, 片段太大, 不容易获得扩增产物;太小, 不利于结果的统计分析[6]。研究参考联合国粮农组织 (FAO) 和国际动物遗传学会 (ISAG) 推荐的引物, 选取了其中15个微卫星引物, 试验结果表明15个微卫星位点多态性较好, 可以用于岷县黑裘皮羊的遗传多样性评价。
注:每个微卫星位点的第一行数据为基因的大小, 单位为bp;第二行为基因频率, 单位为%。
等位基因数、有效等位基因数、杂合度和多态信息含量等参数是描述群体内遗传变异的重要指标。等位基因频率是衡量动物群体遗传结构的主要指标之一, 是估计和比较遗传变异的第一步。
多态信息含量是衡量片段多态性的指标。Botstein D等[7]首先提出了用多态信息含量衡量基因变异程度:当PIC>0.5时, 该位点为高度多态性位点;当0.25
基因杂合度又称基因多样度, 反映各群体在多个位点上的遗传变异, 被认为是度量群体遗传变异的一个最适参数。就相同的分子标记而言, 群体平均杂合度的高低反映了群体的遗传一致性程度, 群体杂合度越低, 表明该群体的遗传一致性越高, 而群体的遗传变异越少, 群体遗传多样性越低。研究表明, 岷县黑裘皮羊的平均杂合度为0.882 6, 大于0.5, 说明岷县黑裘皮羊具有较高的群体杂合度, 群体内的遗传变异较大, 群体近交程度弱, 具有丰富的遗传多样性。
参考文献
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遗传多态性 篇7
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2014年1-12月于我院住院治疗的原发性高血压患者60例, 诊断方案参考WHO/ISH推荐标准, 男女比例38:22, 年龄52~71岁, 平均 (61.8±5.1) 岁, 病程3~17年, 平均 (6.5±2.1) 年。选取同期入院进行健康体检对象60例, 排除高血压患者, 男女比例36:24, 年龄51~78岁, 平均 (63.5±4.2) 岁。
1.2 方法
采集对象空腹外周血4 m L, 均分为两份, 一份抗凝、-20℃冻存, 行限制性片段长度多态性方法检测KDR基因型, 该研究基因型共SNP-604、SNP-1192和SNP-1719三种;另一份不予抗凝, -80℃下冻存, 应用全自动生化检测仪 (迈瑞BS-380) 检测对象FBG、TG、TC、LDL-c、HDL-c、UA、NADPH水平。
1.3 统计学方法
采用SPSS 19.0软件处理数据, 计数资料计算%, 行Ridit分析, 计量资料采用±s表示, 行多组间F检验, 基因型多态性应用Hardy-Weinberg平衡检验, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 KDR基因多态性分析
对比结果显示, 高血压患者KDR基因型多表现为SNP-604, 而健康体检对象多表现为SNP-1719, 两组间差异有统计学意义 (P<0.05) , 见表1。经Hardy-Weinberg平衡定律检验, 两组基因型均具备群体代表性 (P>0.05) 。
2.2 KDR基因多态性与高血压患者生化指标相关性
三组患者TG、HDL-c差异无统计学意义 (P>0.05) , 但FBG、TC、LDL-c、UA、NADPH均呈现SNP-604组>SNP-1192≈SNP-1719趋势, 此趋势具有统计学意义 (P<0.05) 。
3 讨论
高血压与基因遗传间的相关性已得到大量研究的证实, 张强等研究指出血管紧张素Ⅱ-1型受体基因1166位点多态性与原发性高血压发病有关, 1166C等位基因是其发病危险因素[4];金楠等指出瘦素基因也可能具备相似作用[5]。此类研究有助于提升原发性高血压的早期筛查效果, 同时提示高血压的发生与发展确有其遗传学机制。亦有研究表明高血压患者循环内皮祖细胞功能受损, 内源性血管内皮修复功能受损[6], 可根据此结论推测影响循环内皮祖细胞功能的基因, 可能同时与高血压的发生与发展有关。
基于上述结论, 该研究重点探讨了KDR基因多态性与高血压的相关性, 首先即明确证实高血压患者KDR基因的SNP-604分布频率明显高于健康人群, 且SNP-1719分布频率明显低于健康人群, 其次还分析了该基因多态性与患者外周血生化指标参数间的相关性, 指出SNP-604基因型患者, 其外周血FBG、TC、LDL-c、UA、NADPH水平均明显更高, 这提示SNP-1719基因型是原发性高血压的危险因素之一, 而其机制可能仍在于影响血管内皮。血管内皮作为血管屏障, 即起着引导血流的作用, 又作为重要的内分泌及效应器官, 分泌产生血管活性物质, 进而调节血管舒张与收缩[7]。既往研究虽已证实高血压与内皮功能障碍存在一致性[8], 但并未明确两者的发生先后及因果关系。该研究则提示高血压患者之所以存在血管内皮损伤, 可能与内皮细胞对舒张及收缩血管物质的分泌失调有关, 此失调又可能与KDR基因的多态性有关。事实上血管内皮细胞的活性与血管内皮生长因子有关, 而该因子要发挥作用, 必须与KDR等特异性膜受体结合。故KDR的基因多态性可以影响血管内皮功能, 这提示高血压合并血管功能损伤的发生, 可能与高血压疾病自身并无直接相关性, 但此结论还有待临床验证。
综上, 该研究证实KDR基因遗传多态性与高血压患者生化指标密切相关, 值得临床关注。
摘要：目的 探讨KDR基因遗传多态性与高血压生化指标间的相关性。方法 纳入原发性高血压患者与健康体检者各60例, 行对比分析。采集所有对象外周血, 检测KDR基因遗传多态性, 同时监测患者生化指标。结果 高血压患者KDR基因多表现为SNP-604, 健康患者多表现为SNP-1719, 组间差异有统计学意义 (P<0.05) ;SNP-604基因型患者FBG、TC、LDL-c、UA、NADPH水平明显高于其他类型患者 (P<0.05) 。结论 KDR基因遗传多态性可能影响高血压患者生化指标, 对其行临床检测有助于拟定更合理的血压控制方案。
关键词：基因遗传多态性,KDR基因,生化指标,高血压,相关性
参考文献
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遗传多态性 篇8
1 资料与方法
1.1 一般资料
1.1.1 研究对象:
自2012-03~2013-10由大庆市油田总医院、油田总医院集团龙南医院、大庆市第四医院及哈尔滨医科大学附属五医院四所三级甲等医院确诊的30例PCa患者。对照组的选择:随机选择大庆油田总医院社区卫生服务中心正常对照人群, 100例。
1.1.2 主要试验试剂:
基因组DNA提取试剂盒 (博尔诚 (北京) 科技有限公司) 、蛋白酶K、无水乙醇、异丙醇、Tag酶、dNTPs、PCR buffer、LCGreen plus饱和荧光染料、TEMED、EDTA、丙烯酰胺、N, N’-亚甲双丙烯酰胺、Tris-碱、硼酸、石蜡油、聚蔗糖Ficco400、溴酚蓝、二甲苯青、溴化乙锭。
1.1.3 主要实验仪器:
凝胶成像系统Gel Doc2000 (MJ Research) 、PCR仪C-2000 (Bio-Rad) 、LightscannerTM HR-I96 (Idaho) 。
1.2 试验方法
1.2.1 目标DNA的提取:
EDTA管分别取病例组和对照组者0.5mL外周血, 用全基因组DNA提取试剂盒抽提取8q24目标DNA, 将样本DNA置于4℃冰箱保存待用。
1.2.2 PCR反应:
从Genome 10K Ensemble中查取所有变异位点的侧翼序列, 使用Oligo 7.0软件完成引物设计, 送生工生物工程 (上海) 有限公司合成。rs4242384位点退火温度、退火时间、引物序列和片段长度见表1。
PCR反应条件为:95℃预变性5min后进入主循环, 95℃变性30s, 51℃退火30s, 72℃延伸60s, 总共35个循环, 完成后72℃延伸7min。之后进行HRM分析之前的变性和复性处理。
1.2.3 HRM反应:
将通过HRM-小扩增子法体系获得的PCR产物移入HRM专用96孔板内, 在Light Scanner TM-HR-I96上进行HRM分析:从50℃开始, 以0.3℃/s的斜率采集熔解曲线, 到98℃结束, 用Light Scanner Call IT软件对采集后的曲线进行分析, 判定基因型。图1。
1.3 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行统计分析, 资料用构成比描述, 差异比较采用行列表χ2检验;使用Logistic回归模型分析。
2 结果
2.1 rs4242384位点与前列腺癌风险因子关联性检验
通过关联性检验, 我们发现rs4242384位点的A等位基因与PCa发病明显关联, 可能会增加患PCa的风险, 并且AA与AC合并统计后, 发现AC+AA基因型的携带者前列腺癌风险明显升高, OR=1.36, P=0.03。AC基因为保护基因, 则AA基因为危险因素, 在病例组中表达高。见表2。
2.2 其他病理参数与rs4242384多态性之间的关系
rs4242384位点在不同PSA水平、不同Gleason评分、肿瘤不同分期等病理参数不同的样本中风险基因和纯合子的logistic回归模型
rs4242384位点中allele A在低PSA与高PSA时都与PCa存在关联性, OR值分别为0.56 (95%CI:0.17~1.86, P=0.34) 和0.37 (95%CI:0.14~0.98, P=0.05) , Gleason评分≤7时存在关联性OR=0.47 (95%CI:0.21~1.05, P=0.07) , 由于本次试验例数较少Gleason评分>7时A的表达率为100%, 存在偶然性。在分期较低的PCa和分期较高的PCa样本中allele A同样存在关联性, OR值分别为0.43 (95%CI:0.19~0.99, P=0.05) 和0.42 (95%CI:0.04~4.21, P=0.46) 。见表3。
2.3 SNPs rs4242384的基因型分析
SNPs rs4242384分为3种基因型:AA、AC、CC。通过HRM分型系统分析, 可根据样本的熔解曲线差异, 将所有样本分为3个组。3组之间的熔解曲线差异非常明显, 见图2。
3 讨论
PCa是发生在男性生殖系统中最常见的恶性肿瘤, 严重威胁着老年男性患者的寿命和生活质量。PCa发病率有明显地区差异和种族差异, 高发于欧美地区。近年来, 中国男性PCa发病率出现了显著增长, 已位居中国男性泌尿生殖系统恶性肿瘤的第3位[1]。
从发现了前列腺癌病一直到今天, 关于PCa的方方面面都展开了大力研究。发病机制、治疗、预防等方面都投入了大量人力物力来研究[2], 尤其是发病机制方面, 更是研究的重中之重, 因为只有对疾病发病机制搞清楚了, 才能针对发病机制来预防发病, 即使发病了也可以针对发病机制来进行治疗。如抑癌基因、原癌基因、各种生长因子和肿瘤发生相关的生物调节素等方面的研究都从不同角度相人们阐述了在PCa发生过程中不同环节起到不同作用的相互作用。近些年来的基因多态性与PCa发病危险性的关系日益受到医学界的不断关注, 基因多态性分析在不同种族和地域人群中均有研究的报道。
目前为止, GWAS已经是研究肿瘤性疾公认的最有力的方法, 也就是本实验中采用的, 在SNP研究的基础上, 在疑似与发病有关的基因位点进行标记, 最后进行病例组和对照组的关联分析[3~7]。PCa应用snps进行小规模研究已经多年, 为了全面的对PCa的病因学进行研究, 未来我们还要进行更多的大规模的PCa组和对照组研究, 才能更完善PCa的病因。
由于PCa发病率相对较低, 全球平均发病率仅约百万分之一, 而大庆地区发病率也相对较低, 获取病例样本难度较大, 在1年内仅获取了30例PCa样本, 研究结果可能存在一定的片面性。本实验通过PCa患病组与正常对照组的研究, 探索SNP位点rs4242384与大庆地区人群的PCa发病风险的关联性, rs4242384随已被GWAS证实与国外前列腺癌存在关联性, 但在国内对其鲜有研究, 本实验为国内PCa病因学的研究提供了一个新的方向。我们仅仅是在中国大庆地区的人群中进行一个国外已证实与PCa密切相关联的小样本研究。我们已经知道, SNPs的研究在不同人群中是存在差异的, 在中国的不同地区, 甚至是在黑龙江省内的不同城市的人群中进行研究, 本实验的SNP位点与PCa相关联性也有可能存在差异。这些差异是不可避免的, 非实验能力所能改变的差异, 这些差异有他的临床意义, 它代表着某一种族或某种人群间的遗传变异。目前已经有大量研究发现, 8q24区域上的多个SNP与PCa的发病高度关联。而SNP位点随种族、地区不同而不同, 因此, 在众多的SNP位点中, 我们要不同地区逐个的进行研究, 才能确定人群中的SNP分布。随着有关SNP研究的不断深入, 也许在不久的将来, 我们可以把检测SNPs位点的方式简化, 在流行病学调查中得以应用, 在人群中进行筛查, 确定PCa的高危人群, 以及进行患病危险程度的评价, 可有助于建立有效的预警系统, 从而达到有效的预防疾病发生的目的, 甚至可以做到个体化预防与治疗, 真正的服务于大众。
摘要：目的:本研究旨在识别和探索前列腺癌 (prostate cancer, PCa) 的疾病易感基因, 对30例PCa病例组和100例对照组进行rs4242384SNP位点的对比, 并进行基因型分型研究, 验证该SNP位点的基因型和等位基因型在大庆地区人群中与PCa的关联性。方法:通过分析不同基因型与等位基因频率在病例与对照组间的分布情况, 分析此变异位点间的连锁不平衡关系进行分析, 并进行单体型关联分析, 探讨不同单体型与PCa易感性的关联。结果:应用SPSS17.0统计软件进行统计分析, 资料用构成比描述, 差异比较采用行列表χ2检验;使用Logistic回归模型分析rs4242384多态性与大庆地区前列腺癌遗传易感的相关研究。结果:病例组中AA基因型高于对照组, AC基因型低于对照组。结论:本论文所选用的rs4242384, 研究了它在中国东北地区黑龙江省大庆市人群中与PCa的关联性, (1) 我们的研究中仅证实rs4242384的SNP位点AA基因型在中国大庆地区人群中与PCa的发生有关联性 (OR=1) 。 (2) A等位基因 (OR=1) 和AC基因型 (OR=0.36, P=0.03, P<0.05) 和AC与CC基因型 (OR=0.37, P=0.02, P<0.05) 在中国大庆地区人群中与PCa的发生无密切关联性, 结果与文献报道趋于一致。AC基因为保护基因, 则AA基因为危险因素, 在病例组中表达高。
关键词：前列腺癌,rs4242384,关联性
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遗传多态性 篇9
1 资料与方法
1.1 文献检索
采用主题词结合自由词原则, 从建库至2013年10月全面检索Pub Med、Web of Science、Ciscom、Cinahl、Google学术、Ebsco、Cochrane图书馆、中国生物医学文献数据库 (chinese bio-medical, CBM) 、万方、中国知网及维普等电子数据库, 并手工检索相关纳入研究的参考文献。检索词主要包括:免疫相关GTP酶、免疫相关鸟苷三磷酸酶基因、immunity-related GTPase M、IRGM、克罗恩病、crohn's disease、多态性、polymorphism、易感性、susceptibility等。
1.2 筛选标准
文献必须符合以下标准才能被纳入: (1) 有关IRGM基因多态性与CD遗传易感性关联的病例对照研究; (2) 所有患者均经内镜和病理学活检证实为CD; (3) 所有纳入研究均有完整的SNP频率资料; (4) 所有纳入研究健康对照人群SNP频率均符合遗传学哈迪韦伯平衡 (hardy-weinberg equilibrium, HWE) 。不符合以上标准的文献将被剔除。
1.3 数据提取
根据统一制定的数据收集表, 由2位研究者分别独立提取数据。数据收集表项目主要包括:作者姓名、文献出版时间、语言类型、国家、种族、样本量、健康对照人群来源、标本类型、SNP检测方法、SNP频率等。
1.4 质量评价
采用NOS (newcastle-ottawa scale, NOS) 评分量表对纳入文献的质量进行评价[6]。NOS评分量表满分为9分, 包括研究对象的定义和选择、组间可比性、暴露因素的三方面的内容, 评分高于7分即高质量文献。
1.5 统计学方法
采用Stata 12.0软件进行数据处理, 通过计算优势比 (odds ratio, OR) 及其95%可信区间 (95%confidence intervals, 95%CI) 评价IRGM基因不同位点SNP与CD遗传易感性的关联, 用Z检验评价有无统计学意义, 用χ2检验评价健康对照人群SNP频率是否符合遗传学HWE平衡。研究间异质性采用Cochran Q检验和I2检验评价[7]。如P<0.05或I2>50%则提示存在异质性, 则用随机效应模型分析, 反之采用固定效应模型分析。通过亚组分析和Meta回归分析探讨异质性可能来源, 并用敏感性分析评价单一研究对总体结果的影响[8]。发表偏移用Begger's漏斗图和Egger's检验进行评价[9]。
2 结果
2.1 纳入研究的基线特征
最初检索到相关文献115篇, 根据其题目和摘要剔除53篇;进一步阅读全文内容并评价数据完整性后剔除51篇;11项病例对照研究[10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20]符合纳入标准进入本Meta分析。文献筛选过程及纳入研究年限分布见图1、2。文献发表时间从2008-2013年。纳入的11项病例对照研究包括5 183例CD患者和5 571例健康对照者, 主要涉及3种常见SNP (rs13361189 C>T, rs10065172 C>T和rs4958847 A>G) 。其中, 9项研究来源于欧美人群, 2项研究来源于亚洲人群。所有纳入研究均采用外周血标本进行SNP检测, 8项研究采用Taq Man法, 另外3项研究分别采用直接测序法、限制性内切酶法 (polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP) 和Mass Array法。所有纳入研究的健康对照人群SNP频率均符合遗传学HWE平衡 (均P>0.05) 。纳入文献的基线特征和质量评价见表1。
2.2 Meta分析结果
IRGM基因多态性与CD遗传易感性关联的Meta分析结果见表2。各研究间异质性明显, 故采用随机效应模型。Meta分析结果表明, IRGM基因rs13361189多态性与CD遗传易感性增加有关 (C比T:OR=1.30, 95%CI:1.05~1.61, P=0.017;CC+CT比TT:OR=1.32, 95%CI:1.06~1.64, P=0.013) , 但rs10065172和rs4958847多态性与CD遗传易感性之间无明确统计学关联 (均P>0.05) (见图3) 。种族亚组分析表明, IRGM基因多态性与欧美人群CD发生风险增加有关 (C比T:OR=1.22, 95%CI:1.07~1.40, P=0.004;CC+CT比TT:OR=1.22, 95CI:1.05~1.41, P=0.009) , 但与亚洲人群差异无统计学意义 (均P>0.05) 。SNP检测方法亚组分析证实, IRGM基因多态性与CD遗传易感性在Taq Man法 (C比T:OR=1.17, 95%CI:1.02~1.35, P=0.030;CC+CT比TT:OR=1.19, 95%CI:1.00~1.42, P=0.046) 和非Taq Man法 (C比T:OR=1.25, 95%CI:1.01~1.55, P=0.041;CC+CT比TT:OR=1.25, 95%CI:1.03~1.52, P=0.023) 检测SNP的研究中均存在统计学关联。进一步根据样本量大小不同进行亚组分析发现, 大样本研究中IRGM基因多态性与CD遗传易感性有关 (C比T:OR=1.31, 95%CI:1.06~1.62, P=0.011;CC+CT比TT:OR=1.34, 95%CI:1.06~1.69, P=0.016) , 而小样本研究无明显关联 (均P>0.05) 。单因素和多因素Meta回归分析结果证实, 种族差异可能是研究间异质性的主要来源之一 (P=0.003) (见表3) 。敏感性分析结果表明单个纳入研究均对总体研究结果无明显影响 (见图4) 。Begger's漏斗图提示图形对称无明确发表偏移 (见图5) , Egger's检验进一步证实纳入文献无发表偏移 (C比T:t=-2.60, P=0.019;CC+CT比TT:t=-1.54, P=0.141) 。
A:2000-2001年;B:2002-2003年;C:2004-2005年;D:2006-2007年;E:2008-2009年;F:2010-2011年;G:2012-2013年
3 讨论
CD多发于欧美国家, 且呈家庭聚集倾向, 故推测遗传因素在其发生、发展过程中发挥重要作用[4]。研究表明, 机体肠道屏障功能障碍和肠道微生物对自身正常组织的免疫耐受缺陷可能是CD发病的重要机制[20]。IRGM基因又称自噬体基因, 主要负责清除或降解功能受损的细胞和细胞器, 抵御细胞内病原体, 在细胞内病原体引发的机体固有免疫反应中发挥着重要作用[12]。IRGM基因编码一种三磷酸鸟苷结合蛋白, 它可以诱导细胞产生自噬, 提高机体免疫力[14]。IRGM基因的突变或失活可降低机体对细胞内病原体的自噬能力, 引起病原体的持续性刺激而导致肠道疾病的发生, 故推测IRGM基因多态性可能是导致CD发生、发展的重要原因[11,13]。
本Meta分析探讨了IRGM基因3种常见SNP (rs13361189 C>T, rs10065172 C>T和rs4958847 A>G) 与CD遗传易感性之间的关联, 共纳入11项病例对照研究, 包括5 183例克罗恩病患者和5 571例健康对照者。Meta分析结果显示, IRGM基因rs13361189多态性与CD易感性增加有关, 表明rs13361189多态性可能是导致CD发生的一个危险因素。虽然IRGM基因多态性在CD发生、发展过程中的功能机制尚未明确, 但IRGM基因作为CD发病机制中一个重要的趋化因子, 其基因突变和蛋白表达异常对个体CD易感性的作用已被广泛证实[17]。然而, IRGM基因rs10065172和rs4958847多态性与CD易感性无明确统计学关联, 提示这两种多态性可能不是克罗恩病发生的重要影响因素。由于各研究存在明显异质性, 故本研究根据种族、SNP检测方法和样本量大小进行了亚组分析。种族亚组分析结果表明, IRGM基因rs13361189多态性与欧美人群CD易感性增加有关, 但与亚洲人群无关。众所周知, 地域和种族因素是影响CD易感性个体差异的重要原因, 但造成该差异的具体分子学机制尚不完全明确, 可能与基因漂移和物种自然选择有关[21]。样本量大小亚组分析发现, 大样本研究中IRGM基因多态性与CD遗传易感性有关, 而小样本研究无明显关联, 这可能与小样本研究中其他外在因素对CD易感性影响较为明显有关。总体而言, 本次研究的结果和既往研究结果基本一致, 证实IRGM基因rs13361189多态性与CD遗传易感性有关, 它可能成为早期诊断CD的重要生物标志物。
虽然本研究是国内外第1项有关IRGM基因多态性与CD遗传易感性关联的Meta分析, 但仍存在诸多局限性。首先, 纳入文献过少可能无法全面评价IRGM基因多态性与CD易感性的关联, 并可能影响本Meta分析结果的统计效能。其次, 作为一种回顾性研究, Meta分析可能存在回顾或选择偏移, 也可能会影响本研究结果的可信度。再者, 由于无法获取纳入研究的原始数据, 导致无法评价其他指标如临床分期、年龄、性别等因素联合IRGM基因多态性对CD遗传易感性的影响。最后, 尽管每项研究均符合所有纳入标准, 但仍可能存在未考虑到的潜在因素影响分析结果。