分子遗传（共10篇）
分子遗传 篇1
一、知识网络
二、疑难点拨
(一) 探究遗传物质是DNA的两个经典实验
1. 肺炎双球菌转化实验
(1) 格里菲思的体内转化实验:格里菲思做了四组实验, 分别是:给四组小鼠分别注射R型活细菌、S型活细菌、加热后杀死的S型细菌、R型活细菌与加热后杀死的S型细菌的混合液。实验结果分别是:小鼠不死亡、小鼠死亡、小鼠不死亡、小鼠死亡并从小鼠体内分离出S型活细菌。实验结论是:加热杀死的S型细菌中含有促成R型细菌转化为S型细菌的“转化因子”。
(2) 艾弗里的体外转化实验:实验是将S型细菌的不同成分进行分离, 然后在培养R型细菌的培养基中分别加入S型细菌的各种成分, 观察培养基上是否出现S型细菌。实验结论是:DNA是促成R型细菌转化为S型细菌的“转化因子”, 从而证明了DNA是遗传物质。
点拨: (1) 体内转化实验和体外转化实验都遵循了实验设计的对照性原则和单一变量原则, 体外转化实验是在体内转化实验的基础上进行的, 进一步确定了“转化因子”的化学本质是DNA。 (2) 通过加热杀死的S型细菌体内的DNA最终并没有被破坏。在加热的过程中, DNA分子中碱基对之间的氢键被破坏, 从而导致DNA双螺旋结构解体, 双链分开 (这一现象称为DNA分子的变性) , 但当温度缓慢降低以后, 变性的DNA又可以恢复为原来的双螺旋结构 (称为DNA分子的复性) 。这就是为什么S型细菌经过加热杀死后还能使R型细菌转化为S型细菌的原因。 (3) R型细菌转化为S型细菌这一变化属于生物变异的范畴, 变异的来源是基因重组。
2. T2噬菌体侵染细菌的实验
(1) 病毒的特性和T2噬菌体的结构:病毒是专门寄生在相应的活细胞中的非细胞生物, 在活细胞外病毒不具有生命特征, 在寄主细胞内病毒利用寄主细胞提供的原料 (核苷酸和氨基酸) 、场所、能量、酶等复制自身的遗传物质和控制自身蛋白质的合成, 并将复制的遗传物质和合成的蛋白质组装成子代病毒, 从而实现病毒的增殖。T2噬菌体是一种细菌病毒, 专门寄生在细菌体内, 它是一种DNA病毒, 由蛋白质外壳和内部的DNA组成。
(2) T2噬菌体侵染细菌实验的过程和结论:两组T2噬菌体分别被35S和32P标记, 然后用被标记的噬菌体分别侵染未被标记的细菌, 最后经过搅拌、离心, 分别检测上清液和沉淀物中的放射性。实验结论:DNA是遗传物质。
点拨: (1) 对T2噬菌体进行标记的方法:先对大肠杆菌进行标记, 再用噬菌体侵染被标记的大肠杆菌———用含有35S的培养基培养大肠杆菌→T2噬菌体侵染大肠杆菌 (即让T2噬菌体与被标记的大肠杆菌混合培养) →子代T2噬菌体的蛋白质外壳含有35S;用含有32P的培养基培养大肠杆菌→T2噬菌体侵染大肠杆菌→子代T2噬菌体的DNA含有32 P。 (2) 不能用C、H、O、N作为标记元素, 这是因为C、H、O、N是DNA和蛋白质共有的元素, 被标记后无法确定进入细菌的是何种物质。
3. 转化实验和侵染实验的比较
(1) 实验设计思路相同:都是设法将DNA与其他物质分开, 单独地、直接地研究它们各自的作用。
(2) 实验设计原则相同:都遵循对照性原则和单一变量原则。
(3) 实验结论: (1) 肺炎双球菌转化实验:DNA是遗传物质, 蛋白质不是遗传物质; (2) 噬菌体侵染细菌实验:DNA是遗传物质, 但没有证明蛋白质不是遗传物质, 这是因为蛋白质没有进入细菌体内; (3) 两实验都不能证明DNA是主要的遗传物质。
(二) 对“DNA是主要的遗传物质”的理解
1. 生物遗传物质的种类
(1) 以DNA作为遗传物质的生物:所有的细胞生物 (包括真核生物和原核生物) 的遗传物质都是DNA, 部分病毒 (如T2噬菌体等) 的遗传物质也是DNA。
(2) 以RNA作为遗传物质的生物:含有RNA的病毒 (如SARS病毒、烟草花叶病毒、HIV等) 的遗传物质是RNA。
2. 对“DNA是主要的遗传物质”的理解
由上面的分析可知, 绝大多数生物的遗传物质是DNA, 只有极少数生物的遗传物质是RNA, 这就是“DNA是主要的遗传物质”的含义。
误区:对“DNA是主要的遗传物质”理解的几种常见错误——— (1) 认为“一种生物的遗传物质主要是DNA, RNA是次要的遗传物质”。实际上, DNA和RNA不可能同时成为一种生物的遗传物质, 一种生物的遗传物质只可能是DNA或RNA; (2) 认为含有DNA和RNA的生物的遗传物质是DNA和RNA。实际上, 含有DNA和RNA的生物的遗传物质只有DNA, RNA不是遗传物质; (3) 认为细胞核中的遗传物质是DNA, 细胞质中的遗传物质是RNA。实际上, 细胞中的遗传物质都是DNA。
(三) DNA分子的结构
1. 组成DNA分子的基本单位
脱氧核苷酸是组成DNA分子的基本单位, 它由一分子脱氧核糖、一分子磷酸和一分子碱基通过共价键连接形成 (结构如右图) 。 (1) (2) (3) 分别表示磷酸、脱氧核糖和碱基 (A、T、G、C) 。由于碱基有4种, 因此, 组成DNA基本单位的脱氧核苷酸也有4种。
2. 脱氧核苷酸连接形成DNA
脱氧核苷酸通过两种连接方式形成DNA, 即在一条单链上通过磷酸二酯键连接, 在两条单链间通过氢键连接。磷酸二酯键是一种共价键, 它是在两个相邻的脱氧核苷酸中的其中一个脱氧核苷酸上的脱氧核糖与另一个脱氧核苷酸上的磷酸之间形成的, 由于这种联系特点, 使DNA分子的基本骨架成为“…—磷酸—脱氧核糖—磷酸—脱氧核糖—…”的结构。氢键将两条单链连接起来, 它是在两条单链间对应的碱基之间 (A与T、G与C) 所形成的化学键, 这一特性决定了DNA分子两条单链上的碱基具有互补配对的对应关系。DNA分子两条单链间碱基互补配对的关系就是碱基互补配对原则。这一原则是进行与DNA分子结构有关计算的基础。
点拨: (1) DNA的分子结构可用“点 (脱氧核苷酸) →线 (脱氧核苷酸链) →面 (两条链连接成的平面) →体 (规则的双螺旋结构) ”的系列物理模型来帮助理解; (2) 氢键只在DNA分子的两条单链间形成, 在A与T间有2个氢键, G与C间有3个氢键, 因此, 含有G-C碱基对较多的DNA分子结构比较稳定; (3) 磷酸二酯键可被限制酶破坏, 可在DNA连接酶或DNA聚合酶作用下形成;氢键可被解旋酶或高温破坏。
(四) DNA的复制
1. 复制时间
有丝分裂的间期和减数第一次分裂前的间期。在DNA复制时, 有可能出现差错, 从而导致基因突变。
2. 复制的场所
有DNA的地方或结构 (如真核细胞的细胞核、原核细胞的拟核、线粒体、叶绿体、质粒) 就有DNA复制, 但病毒 (含有DNA的) 的DNA并不是在病毒体内复制, 而是在宿主细胞内。
3. 复制的特点
上图显示, 上一代DNA分子的两条链均在所形成的子代DNA分子中保留下来, 体现了半保留复制的特点。此外, DNA在复制时是边解旋边复制的。
4. 与DNA复制有关的计算:
(1) DNA双链分子中, 若某种碱基 (或脱氧核苷酸) 有x个, 复制n次, 则需要作为原料的该碱基 (或含有该碱基的脱氧核苷酸) 的数目为: (2n-1) x个。如果求第n次复制需要该碱基 (或含有该碱基的脱氧核苷酸) 的数目, 则有如下关系:第n次复制需要的原料数量=复制n次需要的原料数量-复制 (n-1) 次需要的原料数量= (2n-1) x- (2n-1-1) x=2n-1x个。
(2) 一个DNA分子复制n次, 形成2n个子代DNA, 其中含有亲代DNA分子单链的DNA只有2个。
(五) 基因指导蛋白质的合成
1. 转录和翻译中的碱基互补配对
(1) 转录过程中的碱基互补配对:发生在DNA分子的一条单链和RNA分子之间, 图解如下:
点拨:DNA上的碱基T与RNA上的碱基A配对, 而DNA上的碱基A与RNA上的碱基U配对。
(2) 翻译过程中的碱基互补配对:发生在mRNA和tRNA之间, 是mRNA上的密码子与tRNA上的反密码子之间的配对, 图解如下:
点拨:DNA、mRNA和tRNA之间通过碱基互补配对建立联系, 即DNA—mRNA—tRNA。只要知道三者中任一物质上的三个相邻碱基序列, 即可求出另外二者对应的碱基序列。
2. mRNA上的密码子
(1) 密码子的种类和功能。
mRNA上的密码子共有64种, 除了3种密码子 (称为终止密码子, 在翻译时, 终止密码子为肽链的合成提供终止信号) 不决定任何氨基酸外, 其他61种密码子都分别决定一定种类的氨基酸。
(2) 密码子的特性。
(1) 通用性:密码子和氨基酸的对应关系在几乎所有的生物中都是通用的, 也就是说一种密码子所决定的氨基酸种类在各种生物体内几乎都是相同的。这一特性说明了地球上不同种类的生物均有共同的起源。
(2) 简并性:61种密码子只决定20种氨基酸, 这说明决定一种氨基酸的密码子往往并不只有一种, 这一特性称为密码子的简并性。在密码子表中, 除了极少数种类的密码子只决定一种氨基酸外, 其他密码子都决定2种或2种以上的氨基酸。
点拨:如果一种氨基酸只由一种密码子决定, 这样能够决定氨基酸的密码子就只有20种, 余下的44种密码子都将作为终止密码子。当基因的结构改变时, 引起肽链合成不正常终止的机会就会大大增多。但是由于密码子简并性的存在, 当基因结构改变时, mRNA上对应的密码子所决定的氨基酸种类常常不会发生变化, 这样所合成的蛋白质结构也不会改变。可见, 密码子的简并性对于维持生物性状的稳定性具有重要的意义。
3. 有关计算
转录是以DNA分子的一条链为模板合成mRNA的过程, 因此, DNA分子 (或基因) 所含有的碱基数量大约是mRNA的2倍;翻译是以mRNA为模板合成蛋白质的过程, mRNA上的密码子 (由3个相邻的碱基组成) 决定蛋白质分子中的氨基酸, 因此, mRNA的碱基数量大约是蛋白质中氨基酸数量的3倍。由此可见, 在转录和翻译过程中, DNA分子 (或基因) 中的碱基数量、mRNA中的碱基数量、蛋白质中的氨基酸数量三者的比例关系约为6∶3∶1, 常利用这一比例进行相关计算。
(六) 基因对性状的控制
1. 基因控制性状的方式
(1) 基因对性状的间接控制:基因通过控制酶的合成来控制代谢过程, 进而控制生物的性状。
(2) 基因对性状的直接控制:基因通过控制蛋白质的结构直接控制生物的性状。
2. 基因与性状的关系
基因与性状的关系有以下几种情况: (1) 一种基因决定一种性状, 一种性状由一种基因决定, 即基因与性状之间是一一对应的关系, 或“一因一效”; (2) 一种基因决定或影响多种性状, 即“一因多效”; (3) 一种性状受多种基因控制或影响, 即“多因一效”。
三、典例剖析
例1.下列关于艾弗里的肺炎双球菌转化实验的叙述中错误的是 ()
A.需对S型细菌中的物质进行提取、分离和鉴定
B.配制培养基的成分应适合肺炎双球菌的生长和繁殖
C.转化的有效性与R型细菌的DNA纯度有密切关系
D.实验证明了DNA是遗传物质而蛋白质不是
解析:艾弗里的肺炎双球菌转化实验是在格里菲思实验的基础上进行的。格里菲思确定了S型肺炎双球菌中存在转化因子, 但没有确定转化因子究竟是何种物质, 艾弗里实验的目的是进一步确定转化因子的种类。他设计的思路是提取、分离和鉴定S型细菌的各种物质, 分别单独观察各种物质的作用。配制培养基的成分应适合肺炎双球菌的生长和繁殖, 不至于影响转化实验的进行。肺炎双球菌转化是S型菌的DNA进入R型菌体内, 因此, 转化的有效性与S型细菌的DNA有关, 并且S型细菌的DNA纯度越高, 转化越有效。该实验证明了DNA是遗传物质, 蛋白质不是遗传物质。
答案:C
例2.赫尔希和蔡斯在做“噬菌体侵染细菌”实验时, 应用了放射性同位素标记技术。下列相关说法不正确的是 ()
A.利用放射性同位素标记技术的目的是追踪T2噬菌体DNA和蛋白质分子的去向
B.用35S标记蛋白质是由于T2噬菌体化学组成中S只存在于蛋白质中
C.用含32 P的肉汤培养基培养T2噬菌体获得DNA被标记的T2噬菌体
D.检测离心后试管中上清液和沉淀物的放射性差异可推测侵入细菌中的物质
解析:在实验中对两组噬菌体分别进行不同的放射性同位素标记, 对一组噬菌体用35S标记其蛋白质, 对另一组噬菌体用32P标记其DNA, 然后分别用这两组噬菌体侵染未被标记的细菌, 再经过搅拌、离心, 分别检测上清液和沉淀物中的放射性, 并比较上清液和沉淀物中放射性的差异, 就可以确定T2噬菌体DNA和蛋白质分子的去向。S元素只有蛋白质中才有, DNA中没有, 但DNA中有P元素, 蛋白质中没有P元素, 因此, 应分别用35 S和32 P标记噬菌体的蛋白质和DNA。噬菌体为病毒, 不能直接在培养基上培养, 对噬菌体进行放射性同位素标记应先用含32P的培养基培养大肠杆菌, 再用该大肠杆菌培养噬菌体。
答案:C
例3.下列有关生物遗传物质的叙述, 不正确的是 ()
A.只含有RNA的生物, 遗传物质是RNA
B.只含有DNA的生物, 遗传物质是DNA
C.既有DNA又有RNA的生物, 遗传物质是DNA和RNA
D.既有DNA又有RNA的生物, 遗传物质是DNA不是RNA
解析:绝大多数生物的遗传物质是DNA, 少数生物的遗传物质是RNA。只含有RNA的生物 (如HIV、SARS病毒) , 其遗传物质是RNA。只含有DNA的生物 (指含有DNA的病毒) , 其遗传物质是DNA。既有DNA又有RNA的生物, 其遗传物质是DNA, 而不是RNA。
答案:C
例4.下列有关计算中, 错误的是 ()
A.用32P标记的噬菌体在大肠杆菌内增殖3代, 具有放射性的噬菌体占总数为1/4
B.某DNA片段有300个碱基对, 其中一条链上A+T比例为35%, 则第三次复制该DNA片段时, 需要780个胞嘧啶脱氧核苷酸
C.若某蛋白质分子中含有120个氨基酸, 则控制合成该蛋白质的基因中至少有720个碱基
D.用15 N标记的细胞 (含8条染色体) 在含14 N的培养基中培养, 第二次分裂中期和后期含15 N的染色体数分别是8和16
解析:DNA复制3次, 形成8个子代DNA分子, 其中含32 P的噬菌体占2/8=1/4。一条链上A+T比例为35%, 则在该链上含有的A+T=300×35%=105个, 由于在两条链间碱基A与碱基T相互配对, 因此, 另一条链上的A+T数量也有105个, 则在该DNA片段中含有的A+T总数为210个, 这样可以得出G+C=600-210=390个, G=C=195个, 第3次复制需C=195×23-1=780个。基因中碱基数至少是蛋白质中氨基酸数的6倍, 蛋白质分子中含有120个氨基酸, 则控制合成该蛋白质的基因中至少有120×6=720个碱基。含15 N的为亲代DNA分子的链, 细胞第一次分裂后, 所有染色体 (DNA) 都含有15 N, 而细胞第二次分裂时, 只有一半的DNA分子含有15 N, 即细胞第二次分裂中期含15 N的染色体8条, 第二次分裂后期染色单体分开后, 含15 N的染色体仍然为8条。
答案:D
例5.下列有关遗传物质基础的叙述中, 正确的是 ()
A. (A+C) / (T+G) 的碱基比例体现了DNA分子的特异性
B.tRNA识别并转运氨基酸是通过碱基互补配对实现的
C.要用32P标记噬菌体, 可直接用含相应磷酸盐的培养基培养
D.基因通过控制血红蛋白的结构直接控制红细胞形态
解析:DNA分子碱基的特定排列顺序, 构成了DNA分子的特异性, 从碱基对比例的角度看, 决定DNA分子特异性的是A+T/G+C, 而不是 (A+C) / (T+G) (在DNA分子中, A=T, C=G, 则A+C=T+G, 这就是说不同的DNA分子都具有A+C=T+G的关系) 。氨基酸上没有碱基, 不能与tRNA进行碱基配对。噬菌体是病毒, 寄生在活细菌中, 标记噬菌体, 先要用含32 P的培养基培养大肠杆菌, 再用该大肠杆菌培养噬菌体。
答案:D
例6.如图甲、乙表示真核生物遗传信息传递过程中的某两个阶段的示意图, 图丙为图乙中部分片段的放大示意图。对此分析合理的是 ()
A.图甲所示过程主要发生于细胞核内, 图乙所示过程主要发生于细胞质内
B.图中催化图甲、乙所示两过程的酶1、酶2和酶3是相同的
C.图丙中a链为模板链, b链为转录出的子链
D.图丙中含有两种单糖、五种碱基、五种核苷酸
解析:图甲所示为DNA的复制过程, 图乙所示为转录过程, DNA的复制和转录都主要发生在真核细胞的细胞核内。图甲中酶1和酶2相同, 都为DNA聚合酶, 图乙中酶3为RNA聚合酶。由于转录是以DNA为模板合成RNA的过程, 图丙的a链中含有碱基T, b链中含有碱基U, 故a链为DNA模板链, 而b链为转录产生的RNA链。图丙中含有2种单糖 (核糖和脱氧核糖) 、5种碱基 (A、T、G、C、U) 、8种核苷酸 (4种脱氧核甘酸和4种核糖核苷酸) 。
答案:C
例7.如图是某DNA双链的片段和由它控制合成的一段多肽链 (甲硫氨酸的密码子是AUG) , 下列说法中错误的是 ()
A.该DNA片段含有2个游离的磷酸基团、4个游离的碱基
B.转录的模板是乙链, 其碱基序列可代表遗传信息
C.转录形成的mRNA片段中至少有18个核糖核苷酸、6个密码子
D.若箭头所指的碱基对被替换, 则其编码的氨基酸序列可能不会改变
解析:该DNA分子中含有2个游离的磷酸基团 (在DNA单链的末端, 每一条单链上各有一个, 方向相反) , 但碱基是互补配对的, 以氢键相连, 所以不能说碱基是游离的。甲硫氨酸的密码子AUG与转录的模板链上的碱基TAC互补配对, 甲链和乙链中含有TAC碱基序列片段的是乙链, 因此, 乙链是转录的模板, 其碱基序列代表遗传信息。乙链上有18个碱基, 因此, 由它作为模板转录形成的mRNA上至少有18个核糖核苷酸。mRNA上三个相邻的碱基构成一个密码子, 因此, 该mRNA上至少有6个密码子。因为一种氨基酸可以对应一种或几种密码子, 故密码子改变, 其编码的氨基酸序列可能不变。
答案:A
四、跟踪训练
1.艾弗里的肺炎双球菌转化实验和赫尔希、蔡斯的噬菌体侵染细菌实验, 都能证明DNA是遗传物质, 对这两个实验的研究方法可能有: (1) 设法把DNA与蛋白质分开, 研究各自的效应; (2) 放射性同位素标记法。下列有关叙述正确的是 ()
A.两者都运用了 (1) 和 (2)
B.前者运用了 (1) , 后者运用了 (2)
C.前者只运用了 (2) , 后者运用了 (1) 和 (2) D.前者只运用了 (1) , 后者运用了 (1) 和 (2)
2.下列有关“噬菌体侵染细菌实验”的叙述, 正确的是 ()
A.分别用含有放射性同位素35S和放射性同位素32P的培养基培养噬菌体
B.用32P标记的噬菌体的侵染实验中, 上清液存在少量放射性可能是保温时间太长
C.32 P、35 S标记的噬菌体侵染实验分别说明DNA是遗传物质、蛋白质不是遗传物质
D.用噬菌体侵染3 H标记的细菌, 离心后检测到放射性主要分布在上清液中
3.下列关于生物体内遗传物质的说法, 正确的是 ()
A.细菌的遗传物质主要是DNA
B.病毒的遗传物质是DNA和RNA
C.有细胞结构的生物其遗传物质是DNA
D.细胞质中的遗传物质是DNA或RNA
4.下列关于DNA结构与功能的说法, 不正确的是 ()
A.DNA分子中G与C这一碱基对含量越高, 其结构稳定性相对越大
B.碱基排列顺序的千变万化, 构成了DNA分子的多样性
C.生物体所有DNA分子的转录和翻译是同时同地进行的
D.亲子代DNA分子结构相对稳定的重要原因之一是碱基互补配对原则保证了DNA复制的准确进行
5.下列有关DNA复制过程的叙述中, 正确的顺序是 ()
(1) 互补碱基对之间氢键断裂 (2) 互补碱基对之间氢键形成 (3) DNA分子在解旋酶的作用下解旋 (4) 以解旋后的母链为模板进行碱基互补配对 (5) 子链与母链盘旋成双螺旋结构
A. (1) (3) (4) (2) (5) B. (3) (1) (5) (4) (2)
C. (1) (4) (2) (5) (3) D. (3) (1) (4) (2) (5)
6.下列有关基因控制蛋白质合成的叙述, 正确的是 ()
A.一个密码子只决定一种氨基酸, 一种氨基酸只由一种tRNA转运
B.该过程需要有三个高能磷酸键的ATP提供能量
C.该过程一定遵循碱基互补配对原则, 即A一定与T配对, G一定与C配对
D.DNA转录和翻译的原料分别是核糖核苷酸和氨基酸
7.下面是几种抗菌药物的抗菌机理以及中心法则的图解。已知: (1) 青霉素能抑制细菌细胞壁的合成; (2) 环丙沙星能抑制细菌DNA解旋酶的活性; (3) 红霉素能与核糖体结合以阻止其发挥作用; (4) 利福平能抑制RNA聚合酶的活性。以下有关说法错误的是 ()
A.环丙沙星会抑制a过程, 利福平将会抑制b过程
B.除青霉素外, 其他抗菌药物均具有抑制遗传信息传递和表达的作用
C.过程d涉及的氨基酸最多20种、tRNA最多有64种
D.e过程需要逆转录酶
8.下图为人体内基因对性状的控制过程, 下列选项中叙述错误的是 ()
A.图中 (1) (2) 过程的场所分别是细胞核、核糖体
B.镰刀型细胞贫血症致病的直接原因是血红蛋白分子结构的改变
C.人体衰老引起白发的主要原因是图中的酪氨酸酶活性下降
D.该图反映了基因对性状的控制是通过控制蛋白质的结构直接控制生物体的性状
9.据研究, 并非任意两株R型菌与S型菌之间的接触都可发生转化。凡能发生转化的R型菌必须处于感受态。所谓感受态是指受体菌最易接受外源DNA片段, 并能实现转化的一种生理状态。处于感受态细菌的细胞内发生一系列的变化:首先分泌感受态因子, 该因子与细胞表面受体相互作用, 诱导产生一些感受态特异蛋白, 其中包括膜相关DNA结合蛋白、细胞壁自溶素和几种核酸酶。其转化过程图示如下:
请回答下列问题。
(1) 步骤是____将S型菌加热杀死。
(2) S型菌的DNA双链片段与A细胞膜表面相关DNA结合蛋白结合, 其中一条链在____酶的作用下水解, 另一条链与感受态特异蛋白结合进入R型菌细胞内。
(3) 完成步骤 (4) 需要___酶和___酶, 实现了____。
(4) C细胞经DNA复制和细胞分裂后, 产生大量的____型菌导致小鼠患败血症死亡。这说明____得到了表达。
(5) 肺炎双球菌的转化实验说明了, 通过DNA可以实现细菌间____的转移。
(6) 科学家在不同物种之间的相关实验, 说明生物界基因表达的基本机制是相同的, 一种生物的基因表达系统能够识别另一种生物所携带的遗传信息, 并可在适当条件下加以表达。性状的表达需经过___和____过程。
10.图1、图2 (图2中甘、丙等表示甘氨酸、丙氨酸等) 表示人体细胞中蛋白质合成的相关过程, 据图回答:
(1) 在蛋白质合成过程中, 图1、图2分别表示___和___过程。
(2) 图1中 (2) 和 (3) 在组成上的区别是____。如果 (2) 发生改变, 生物的性状____改变, 原因是____。
(3) 图2中c表示____, 色氨酸的密码子是____, 若图中多肽a是由60个氨基酸脱水缩合而成, 则 (1) 中至少含有____个碱基对。
参考答案
1.D 2.B 3.C 4.C 5.D 6.D 7.C8.D
9. (1) (1) (2) 核酸 (3) 限制DNA连接基因重组 (4) S重组的S型菌的基因 (或DNA) (或重组的控制荚膜合成的基因) (5) 性状 (6) 转录
翻译
10. (1) 转录翻译 (2) (2) 含有脱氧核糖, (3) 含有核糖不一定密码子的简并性 (3) tRNAUGG 180
分子遗传 篇2
如何从分子角度上为学生阐述生命的奥秘，提高“分子生物学”教学的趣味性，是我们需要重点关注的问题。分子生物学是建立在实验基础上的学科，任何一个假说与理论，都是源自于实验的，每一个实验的背后，往往都有一个动人的故事。为了提高“分子生物学”教学的趣味性，可以利用科学史来导入课堂教学内容，为学生讲解知识背后的故事。这种课程导入方式降低了课堂内容的难度，让学生可以轻松学习教学内容，让学生对后续的学习内容产生源源不断的兴趣，这对于学生创新能力的培养非常有益。
3.2优化传统的教材理论教学内容
为了降低“分子生物学”的难度，我们从几个方面对教学内容进行了优化，将大纲分为几个内容：①绪论部分：让学生对分子生物学的建立、发展趋势有全面的认识;②基础知识：介绍基础知识，让学生掌握基因的概念、DNA复制、蛋白质合成、RNA转录等基因表达过程;③研究方法：包括体外操作技术、蛋白质操作方式、体内与体外重组技术;④分子生物学的应用：采用实例的方式介绍生物分子生物学知识的应用，以教材为出出发点，激发学生的学习热情，夯实基础知识。并将分子生物学融入生活案例中。
3.3应用多元化的教学模式
传统填鸭式的教学模式会导致学生对“分子生物学”的学习产生逆反心理，为了提高教学质量，需要根据各部分教学内容的特点采用案例式、启发式、讨论时教学法，创新教学方法。对于对遗传学新知识点有重要铺垫作用的其他课程的基础性知识，可采取布置学生课前或课中自学、再集中小结的方法帮助学生巩固复习之，还要注意从遗传学的角度阐明同一知识点，突出遗传学的学科特色。如，在讲解关于人类基因组测序应用、亲子鉴定的知识时，即可采用案例教学法，引起生活中常见的实例，引导学生来提出自己的见解。除此之外，我院还会定期举行分子生物学研究会、生物学研究进展讲座等，帮助学生拓展学习视野，更新知识体系。此外，还可以推行计算机辅助教学CAI，将各类教学资源整合起来，通过动画、音频、视频、图形、文本、仿真软件的方式来直观的呈现相关内容，扩展学生的学习时间与空间，逐步解决课程教学难点。并构建了“精品课程网站”，其中的内容包括教学录像、教学计划、教学大纲、在线辅导、毕业设计等内容，并结合课程内容及时来更新，让学生从传统的“要我学”转化为“我要学”，拓展学生的学习渠道。
3.4构建完善的实验课程体系
实验是“分子生物学”的重点内容，在传统实验教学中，多为验证性实验与基础性实验，实验内容的创新性不足，为此，需要将实验资源与科研力量整合起来，提高实验的创新性、启发性、实践性、系统性与完整性，根据专业要求划分实验模块，包括基础性实验、综合性实验、设计性实验与创新性实验。其中，基础性实验与综合性实验是常规实验内容，在大一阶段开展，让学生掌握基本的分子生物学知识;设计性实验是实验教学的重点，需要让学生以小组为单位应用相关理论来确定实验方法、选择实验设备，合作完成实验项目;创新性实验是依托科研项目开展的实验项目，由学生按照主题来设置实验方案，重点锻炼学生的创新能力与科研能力。
3.5采用灵活的考核模式
传统考核模式单一，以理论成绩作为主要考核依据，忽视了学生学习能力、创新能力以及中间环节的考察。为此，需要采用灵活的考核模式，从“过程后考核”转化为过程中考核，内容包括“考勤与纪律”、“小组论文”、“课堂讨论”、“期末闭卷考试”、“开卷随堂测试”几个方面。这种全新的考核模式提高了学生的参与积极性，既能够帮助教师掌握学生的学习状态。
4结语
分子生物学是在揭示DNA双螺旋结构基础上快速发展起来的一门新兴实验性学科。随着DNA和RNA聚合酶的发现、遗传密码子的揭示、乳糖操纵子的发现、PCR技术的开发和应用、组学研究的深入以及合成生物学的诞生，使分子生物学得到了长足的发展。遗传学与多门课程教学内容的重复是客观存在的，随着生物科学专业课程设置专业化程度的提高，这种局面将变得愈来愈突出。因此，调整遗传学教学内容势在必行。但无论进行怎样的调整，都必须遵循遗传学的发展历史、保持基础遗传学完整的知识结构体系。
参考文献：
[1]邢雪琨,武红艳.医学遗传与优生课堂教学模式探讨[J].卫生职业教育,,(21).
[2]廖亚平,梁玉华,蔡绍京.医学遗传学教学改革初探[J].井冈山医专学报,,(2).
[3]温扬敏,丘丹缨.社会化行为生态学在高职医学遗传与优生学课程建设中的应用[J].亚太传统医药,,(11).
分子遗传 篇3
关键词：河川沙塘鳢；相关序列扩增多态性；遗传多样性；多样性指数
中图分类号： S917文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）10-0037-03
收稿日期：2014-01-20
基金资助：国家星火计划（编号：2013GA690166）；江苏省科技支撑计划（农业）项目（编号：BE2013441）；“江苏省六大人才高峰”高层次人才项目（编号：NY-032）；江苏省农业科技自主创新资金[编号：CX（11）1037]；南京师范大学科技成果转化基金（编号：2013-02）；江苏省扬州市农业科技攻关计划（编号：2012074）；。
作者简介：侯新远 （1988—），女，山西阳泉人，硕士研究生，从事鱼类种质资源与遗传育种研究。E-mail：houxinyuan1988@126.com。
通信作者：尹绍武，博士，教授，博士生导师，主要从事鱼类种质资源与遗传育种研究。E-mail：yinshaowu@163.com。河川沙塘鳢（Odontobutis potamophila）属鲈形目（Perciformes）虾虎鱼亚目（Gobioidei）沙塘鳢科（Odontobutidae）沙塘鳢属（Odontobutis），广泛分布在我国长江中下游（湖北荆州至上海江段 ）及其沿江各支流、钱塘江水系、闽江水系，为我国小型淡水底栖肉食性鱼类[1-2]。河川沙塘鳢营养价值高，深受人们喜爱，是一种很有开发前景的小型经济鱼类。在2012年世界自然保护联盟（IUCN）红色名录中，河川沙塘鳢被评级为信息缺乏物种。近年来，由于过度捕捞、环境破坏及人类其他活动，导致其自然资源受到极大的破坏，从而对其种群遗传结构产生一定影响。国内外关于河川沙塘鳢的报道多集中在其人工繁殖、生物学特性、病害防治等方面[3-13]，关于其种质资源利用和资源保护等方面的报道较少，仅有Hou等采用线粒体DNA（D-loop）序列对河川沙塘鳢的群体进行遗传多样性研究[14]，李妍等采用ISSR分子标记对江苏常熟河川沙塘鳢个体大小不一的2个群体遗传差异性进行研究[15]。相关序列扩增多态性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）是一种新型的旨在扩增开放阅读框（ORFs）的分子标记技术[16]，该分子标记具有简单、高效、稳定、重复性高、产率高和多态性较丰富等特点，目前广泛应用于植物种质鉴定、基因定位、遗传多样性分析和图谱构建[17-20]。目前在水产研究中已用于罗氏沼虾[21]、海南沼虾[22]、草鱼[23]、暗纹东方鲀[24]、团头鲂[25]、彩鲤[26]、乌苏里拟鲿[27]、文蛤[28]的遗传多样性研究。本研究采用SRAP分子标记对3个群体的河川沙塘鳢遗传多样性进行分析，以期了解河川沙塘鳢种质资源现状及其种群间的遗传分化情况，为河川沙塘鳢种质资源保护和开发利用提供参考资料。
1材料与方法
1.1试验材料
试验所用样品分别采自安徽省当涂县运粮河流域（简称DT，31°25′37″N，118°42′59″E）、浙江省余姚市姚江流域（简称YY，30°0′16.49″N，121°3′6.33″31°25′37″E）、江苏省太湖靠近东西山侧水域（简称DXS，30°59′58.16″N，120°27′21.02″E），每个种群采集8尾，将尾鳍保存于无水乙醇中（-20 ℃）备用。
1.2基因组DNA提取
采用常规苯酚-氯仿抽提法[29]从鳍条组织中提取基因组DNA。用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，放入 -20 ℃ 冰箱储存备用。
1.3SRAP-PCR 反应
根据已发表的SRAP通用引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成正、反向引物各14个（表1），将它们随机配对构成196对不同引物组合，用于PCR扩增，筛选出带型清晰、稳定、多态性较好的引物组合用于进一步试验。25 μL SRAP-PCR反应体系为：10×buffer 2.5 μL（含 Mg2+），2 mmol/L dNTPs 2.5 μL，10 mmol/L正/反向引物各 0.5 μL，5 U/μL Taq DNA 酶0.2 μL，基因组 DNA 1 μL，不足部分用灭菌双蒸水补齐。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性 1 min，35 ℃ 退火1 min，72 ℃延伸2 min，5个循环；94 ℃ 变性 1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35个循环；72 ℃延伸7 min。
表1用于河川沙塘鳢遗传多样性分析的SRAP引物序列
引物
1.4数据分析
根据SRAP扩增电泳图谱，将每条带视为1个位点，对每个样品SRAP扩增带的有无进行统计，有带记为1，无带记0，将电泳图谱转换成数字矩阵。采用POPGENE 1.32计算群体的Shannons信息指数（I）、Neis基因多样性（H），统计不同引物组合对不同群体的多态位点百分率（P），计算Neis无偏遗传距离（D）和遗传相似度（S），并根据遗传距离构建3个群体的UPGMA聚类图。
2结果与分析
2.1SRAP引物的筛选及扩增图谱
利用河川沙塘鳢3个群体的DNA对196对SRAP引物组合进行筛选，其中11个引物组合（F2R3、F2R8、F2R12、F3R3、 F3R5、F3R10、 F4R4、F6R9、F9R11、F11R12、F12R8）得到稳定、可重复、多态性好的扩增图谱（图1、图2、表2）。
表2河川沙塘鳢不同SRAP引物组合的多态性位点数
引物组合位点总数
（个）引物组合位点总数
（个）F2R311F4R46F2R86F6R95F2R126 F9R115F3R37F11R126F3R54F12R88F3R107
记录扩增出的在100～750 bp之间的条带数（即位点数），发现每对引物组合扩增的位点数为 4～11 个。扩增位点最多的引物组合是 F2R3，扩增位点数为 11个；扩增位点最少的引物组合是F3R5，扩增位点数为 4个。
2.2群体遗传多样性分析
表2中11对引物组合在 24尾河川沙塘鳢个体中共扩增出71个位点，由表3对各群体遗传参数的比较发现：YY群体和DXS群体多态位点占比最大，为24.14%；DT群体最小，为6.90%。此外还可看出，Neis 基因多样性（H）由大到小依次为DXS群体（0.093 9）、YY群体（0.078 4）、DT群体（0.033 0）；Shannons 多样性指数（I）由大到小依次为DXS群体（0136 8）、YY群体（0.120 6）、DT群体（0.046 3）。整体结果可以看出，DXS群体、YY群体的多态位点占比、Neis 基因多样性和 Shannons 多样性指数均稍高于DT群体。
2.3群体遗传距离和遗传相似度
依据Nei的方法由各位点等位基因频率计算河川沙塘鳢3个群体间的Neis无偏遗传距离（D）、遗传相似度（S），结果
表3河川沙塘鳢3个群体SRAP扩增位点的多态性和遗传多样性参数
群体多态位点
占比（%）Neis基因
多样性（H）Shannons
信息指数（I）DT6.900.033 00.046 3YY24.140.078 40.120 6DXS24.140.093 90.136 8
见表4。可以看出，DT群体与YY群体间的遗传距离最大（0286 7），遗传相似度最小（0.750 7）；DXS 群体与YY群体的遗传距离最小（0.036 3），遗传相似度最大（0.964 4）。UPGMA 聚类图显示，YY群体和DXS群体聚为1支，DT群体单独聚为1支（图3）。
表4河川沙塘鳢群体间的Neis无偏遗传距离D
（对角线下方）和遗传相似度S（对角线上方）
群体DTYYDXSDT0.750 70.765 7YY0.286 70.964 4DXS0.267 00.036 3
3讨论与结论
遗传多样性作为生物多样性的重要组成部分，是物种多样性、生态系统多样性和景观多样性的基础，也是生命进化和适应的基础；种内遗传多样性越丰富，物种对环境变化的适应能力也越大。通常认为多态位点比率、Neis 基因多样指数和 Shannons 信息指数是衡量群体遗传多样性的常用指标。本研究中3个河川沙塘鳢群体的多态位点占比在6.90%～2414%间，Neis 基因多样指数为0.033 0～0.093 9，Shannons信息指数在0.046 3～0.136 8间。与其他水产动物的SRAP数据比较发现，3个群体的多态位点占比低于程长洪等研究的暗纹东方鲀群体（54.98%～58.87%）[24]，冉玮等研究的3个地理群体团头鲂（29.07%～58.14%）[25]，贾永义等研究的翘嘴红鲌群体（50.00%）、团头鲂群体（4632%）[30]，张志伟等研究的江苏南通文蛤（57.81%）[28]；周劲松等研究的罗氏沼虾（55.6%～64.1%）[21]；张慧研究的大麻哈鱼（7375%）[31]，可见河川沙塘鳢的遗传多样性目前仍处于比较低的水平，与Hou等用D-loop基因序列研究不同群体的河川沙塘鳢遗传多样性结果[14]一致。这可能与第四纪冰川有关，冰期使得很多淡水鱼都遭受了灾难性毁灭，河川沙塘鳢也难逃厄运，受到严重的破坏，只有少数幸存下来。除了历史原因，近年来环境恶化、生态栖息地被破坏、水利修建、人类过度滥捕等因素也导致河川沙塘鳢数量锐减。
遗传相似度和遗传距离从一定程度上衡定了种群间遗传差异程度[32]。本研究对各群体进行遗传结构分析结果表明，DT群体与YY群体间的遗传距离最大（0.286 7），遗传相似度最小（0.750 7），DXS 群体与YY群体的遗传距离最小（0036 3），遗传相似度最大（0.964 4），亲缘关系最近，同时UPGMA聚类图显示YY群体和DXS群体聚为1支，DT群体聚为单独的1支，与mtDNA控制区序列分析得出的DXS 群体与YY群体的遗传距离最小的结果一致[14]。从地理位置上看，DXS群体的地理位置与YY群体的地理位置较近，客观上增加了2个群体的遗传相似度。
本研究结果显示，河川沙塘鳢的遗传多样性低，为了恢复河川沙塘鳢渔业资源，在加强对其保护、保护其产卵场和改善水域环境条件的同时，应该严格设立禁捕期、限制捕捞器械规格，同时加强人们对渔业资源保护的意识，在明确遗传结构的基础上，加强河川沙塘鳢人工养殖的研究和推广，从而减轻人类对野生资源的捕捞压力，缓解市场需求。同时应选择等位基因数多、杂合度较高、亲缘关系接近天然个体的群体进行人工放流，从而恢复野生河川沙塘鳢资源。
参考文献：
[1]伍汉霖，钟俊生. 中国动物志 硬骨鱼纲 鲈形目（五） 虾虎鱼亚目[M]. 北京：科学出版社，2008.
[2]Iwata A，Jeon S R，Mizuno N，et al. A revision of the eleotrid goby genus Odontobutis in Japan，Korea and China[J]. Japanese Journal of Ichthyology，1985，31（4）：373-388，128.
[3]顾建华，孟艳玲，吕军开，等. 河川沙塘鳢卵母细胞发育过程中卵黄脂磷蛋白的变化[J]. 水产科学，2007，26（1）：43-47.
[4]徐忠源，王新荣，骆小年，等. 不同开口饵料对鸭绿沙塘鳢仔鱼生长性能的影响[J]. 水产学杂志，2010，23（1）：28-31.
[5]赵军，盛劲东. 河川沙塘鳢的人工繁殖与集约化苗种培育技术[J]. 水产养殖，2011，32（6）：17-18.
[6]苏志烽，王建民，丁彩霞，等. 蟹池套养沙塘鳢新技术[J]. 中国水产，2009（5）：38-39.
[7]翁敏婵，郭莎园，胡先成. 河川沙塘鳢早期发育过程中耗氧率及NH3-N排泄率的变化[J]. 重庆师范大学学报：自然科学版，2010，27（5）：14-18.
[8]罗颖，胡先成，翁敏婵.河川沙塘鳢孵化腺的超微结构[J]. 重庆师范大学学报：自然科学版，2009，26（4）：20-24.
[9]胡先成. 河川沙塘鳢仔、稚、幼鱼的发育阶段及生长的研究[J]. 重庆师范学院学报：自然科学版，1996，13（2）：10-15.
[10]孙帼英，郭学彦. 太湖河川沙塘鳢的生物学研究[J]. 水产学报，1996，20（3）：193-202.
[11]张根玉，施永海，张海明，等. 河川沙塘鳢养殖技术① 河川沙塘鳢的生物学特性及市场前景[J]. 水产科技情报，2012，40（3）：123-127，131.
[12]周志明，曹铮，沈锦玉，等. 河川沙塘鳢致病真菌的特性及分子生物学鉴定[J]. 淡水渔业，2011，41（2）：69-72.
[13]熊良伟，孙继真，叶建生. 几种药物对沙塘鳢水霉病的室内防治实验[J]. 渔业致富指南，2009（16）：58-60.
[14]Hou X Y，Zhu F，Yin S W，et al. Genetic diversity of Odontobutis potamophila from different geographic populations inferred from mtDNA control region[J/OL]. Mitochondrial DNA，（2013-07-10）[2013-12-01]. doi：10.3109/19401736.2013.803084 .
[15]李妍，荣楠，徐建荣，等. 河川沙塘鳢的ISSR分析[J]. 安徽农业科学，2010（2）：606-608.
[16]Li G，Quiros C F. Sequence-related amplified polymorphism （SRAP），a new marker system based on a simple PCR reaction：its application to mapping and gene tagging in Brassica[J]. Theoretical and Applied Genetics，2001，103（2/3）：455-461.
[17]Han X Y，Wang L S，Liu Z A，et al. Characterization of sequence-related amplified polymorphism markers analysis of tree peony bud sports[J]. Scientia Horticulturae，2008，115（3）：261-267.
[18]Budak H，Shearman R C，Parmaksiz I，et al. Molecular characterization of buffalograss germplasm using sequence-related amplified polymorphism markers[J]. Theoretical and Applied Genetics，2004，108（2）：328-334.
[19]Ferriol M，Picó B，Nuez F. Genetic diversity of a germplasm collection of Cucurbita pepo using SRAP and AFLP markers[J]. Theoretical and Applied Genetics，2003，107（2）：271-282.
[20]Lin Z X，Zhang X L，Nie Y C，et al. Construction of a genetic linkage map for cotton based on SRAP[J]. Chinese Science Bulletin，2003，48（19）：2064-2068.
[21]周劲松，曹哲明，杨国梁，等. 罗氏沼虾缅甸引进种和浙江本地种及其杂交种的生长性能与SRAP分析[J]. 中国水产科学，2006，13（4）：667-673.
[22]傅洪拓，乔慧，姚建华，等. 基于SRAP分子标记的海南沼虾种群遗传多样性[J]. 生物多样性，2010，18（2）：145-149.
[23]丁炜东，曹丽萍，曹哲明.草鱼种质相关SRAP及SCAR的分子标记[J]. 动物学报，2008，54（3）：475-481.
[24]程长洪，张敏莹，刘凯，等. 利用SRAP标记研究四个暗纹东方鲀群体的遗传多样性[J]. 水生生物学报，2012，36（5）：858-865.
[25]冉玮，张桂蓉，王卫民，等. 利用SRAP标记分析3个团头鲂群体的遗传多样性[J]. 华中农业大学学报，2010，29（5）：601-606.
[26]Hu Z H，Lv Y P，Wang C H，et al. Analysis on ‘Whole Red’ of patterns Oujiang colour carp （Cyprinus carpio var. Color） by SRAP and SCAR markers[J]. Aquaculture Research，2012，43（4）：588-594.
[27]徐汗福. 乌苏里拟鲿（Pseudobagrus ussuriensis）不同群体间的遗传多样性比较研究[D]. 苏州：苏州大学，2011.
[28]张志伟，陈爱华，姚国兴，等. 我国沿海不同地理原种文蛤的 SRAP 分析[J]. 海洋与湖沼，2010，41（3）：429-434.
[29]Sambrook J，Fritsch E F，Maniatis T. Molecular cloning：a laboratory manual[M]. 2nd ed. New York：Cold Springharbor Laboratory Press，1989.
[30]贾永义，顾志敏，叶金云，等. 翘嘴红鲌（♀）×团头鲂（♂）杂种F1的SRAP标记分析[J]. 上海海洋大学学报，2011，20（2）：198-203.
[31]张慧. 大麻哈鱼SRAP体系建立及其遗传多样性研究[D]. 哈尔滨：东北林业大学，2011.
油橄榄分子遗传研究进展 篇4
1 油橄榄在我国引种栽培现状和发展前景
油橄榄为木犀科 (Oleaceae) 常绿乔木, 主要分布在地中海地区。我国古代已有引种记载, 称之为“齐墩果”。20世纪50、60年代, 我国开始大规模地从欧洲引种栽培, 其后大致经历了试验、推广、提高、沉寂、兴起几个阶段, 尤其是20世纪90年代, 我国油橄榄产业基本上处于放任状态[1,2]。进入21世纪后, 随着生活水平的提高, 消费者对橄榄油健康价值进一步的认识, 我国对橄榄油需求剧增, 进口逐年增加。我国油橄榄种植产业逐步恢复, 近几年油橄榄产业在四川、甘肃、陕西、云南等地发展迅速, 油橄榄已列入西部大开发“十二五”规划和四川、甘肃等多个省的“十二五”林业发展规划。“十二五”期间, 我国油橄榄的种植面积和产量将会进一步增加, 对适合于我国栽培的优质油橄榄品种的需求也越来越大。
2 我国引种栽培油橄榄的研究进展
我国对油橄榄的科学研究随着油橄榄的引种逐步展开, 21世纪以前的研究主要集中在引种后的栽培管理方面, 如繁殖技术, 包括扦插、嫁接、种子萌发、组织培养技术等[3,4], 林间管理技术包括施肥、灌溉、病虫害和冻害防治等, 并对引种的油橄榄的生态生物学特征进行了系统总结, 对其生态适应性进行了综合评价[5]。徐纬英教授对我国20世纪30多年的引种栽培经验进行了总结, 撰写了《中国油橄榄》[6]一书。
进入21世纪后, 我国学者除了对油橄榄的栽培管理技术继续进行研究外, 又展开了油橄榄的适应区划、产业发展模式等方面的研究。适应区划研究主要依据“相似论”的观点, 将我国各地区的气候条件从气温、热量、水分和光照等因子来对比地中海地区的气候条件, 然后运用模糊数学和地理信息系统等方法对我国的油橄榄适生区进行划分[7,8]。油橄榄在我国的产业发展模式方面也取得了较大进展, 根据我国的实际情况, 建立了“公司+科研+基地+农户”的经营模式, 推动了我国油橄榄产业的发展[1]。此外, 我国的一些学者也展开了油橄榄引种后在形态[9]、生理生态特征[10]、产油量和脂肪酸成分组成[11]等方面的差异研究, 但在油橄榄引种的分子遗传背景方面的研究较少。主要有:马万里和Collins G运用RAPD 技术对澳大利亚油橄榄品种进行了鉴定研究[12];邱源、韩华柏等采用RAPD 技术对四川省开江县油橄榄品种园的23个引种品种进行了RAPD分析, 获得了4个品种的特异位点, 为种质鉴定奠定了基础[13]。进一步开展油橄榄引种遗传背景方面的研究将会对我国油橄榄引种品种的管理、优良品种的本土化选育、分子遗传育种等方面奠定一定的基础。
3 国外油橄榄分子遗传的研究进展
国外对油橄榄的研究主要集中在地中海沿岸的油橄榄主产地国家, 尤其是西班牙、意大利、希腊等国家的油橄榄栽培历史悠久, 拥有丰富的种质资源。利用现代分子遗传技术对大量的种质资源进行鉴定成为油橄榄研究的重要内容。尤其是20世纪90年代分子标记技术成熟之后, 各种分子标记技术被用于不同地域、不同品种间的油橄榄遗传背景差异分析, 进行品种鉴定、遗传多样性分析和基因定位研究[14]。如Besnard等利用RFLP技术对油橄榄的叶绿体DNA多态性的分析[15];Bronzizni等采用RAPD和RFLP技术对地中海科西嘉岛和撒丁岛的野生油橄榄基因组DNA 和线粒体DNA的研究[16];Rao等利用AFLP技术对意大利南部油橄榄栽培品种的分析[17];Shu-biao等利用RAPD、微卫星和SCAR技术对油橄榄进行的遗传图谱绘制[18]等。基于核酸测序技术的SNP技术和基于微阵列芯片杂交技术的DArT技术等新的分子标记技术也被用于油橄榄的遗传多样性分析[19,20,21]。这些分子标记技术体系的建立和应用为进一步开展油橄榄的分子遗传背景方面的研究奠定了基础。
油橄榄营养价值高的一个重要方面就是橄榄油中不饱和脂肪酸含量较高, 对油橄榄研究的另一个重要方面就是对其脂肪酸合成和脱饱和的过程研究。目前已对油橄榄脂肪酸合成和脱饱和过程基本清楚 (图1) , 并对该过程中多个关键酶的基因进行了克隆和基因功能分析[14]。植物脂肪酸的生物合成发生在质体中, 这一过程主要由两个关键酶控制, 一个是乙酰辅酶A羧化酶, 另一个是脂肪酸合成酶。这两种酶的结构和功能较复杂, 目前关于这两种酶的研究主要集中在拟南芥等模式植物中[22]。在油橄榄中虽然已有部分相关的基因 (如ear) 被克隆, 但是在基因功能等方面的研究还相对较少[14]。脂肪酸脱饱和过程在油橄榄中的研究相对较深入, 该过程的几个关键酶基因如△9、fad6、fad7、fad2、fad3等基因已经被克隆, 在油橄榄果实发育过程中的表达情况也进行了分析, 这些基因都具有一定的发育阶段表达特异性[14,23,24]。此外, 其他一些与油橄榄脂肪酸代谢相关的基因也已被克隆分析[25,26,27]。
4 产油量和油脂成分含量差异研究进展
分子遗传 篇5
生物多样性包括遗传多样性、物种多样性、生态系统多样性和景观多样性。 在生物多样性这四个层次中， 遗传多样性是核心内容和生物进化的基础。 遗传多样性是指同一物种内不同种群间或同一种群内不同个体间的遗传变异的总和[1], 在 种群间或种群内主要表现为分子、细胞和个体三个水平上的遗传变异[2]. 通 常来说 , 遗传变异程度的高低是反映遗传多样性大小的最直接表达形式。 在自然界中， 种群是生物进化的基本单位， 种群遗传结构的差异也反映着遗传多样性的程度， 所以遗传变异的大小和种群遗传结构的差异同时决定着一个物种的进化潜力和对不良环境的抵抗能力[3].
遗传多样性的研究有着重要的价值， 可以为物种的进化提供理论支持， 加深人们对生物起源的认识， 同时为保护现有资源提供背景资料[4]. 对 于寄生线虫来说， 每年由寄生线虫引起的疾病， 给家畜的健康和畜牧业的发展带来严重的危害， 这使得人们的研究不断深入， 从最初对寄生线虫的形态学、系统分类学和生态学特征等方面的描述， 逐渐发展到遗传特性、分子进化以及基因功能等方面的研究[ 5].
寄生线虫种群遗传学的研究可以在种群间或种群内进行， 遗传多样性依赖于碱基的突变率、种群的有效大小和种群的迁移率等[6]. 遗传多样性的研究对了解寄生线虫的流行方式、抗药性等位基因的扩散以及疾病的防控有着重要的意义。
攻击行为的分子遗传学病因研究 篇6
1 五羟色胺 (5-hydroxytryptamin, 5-HT)
在攻击行为的神经生物学机制中, 5-HT是一种最具特异性的神经递质。国内外大量证据表明, 5-HT异常与冲动攻击行为、自杀和各种行为异常有关。
1.1 5-HT受体多态性
在动物实验中, 耗竭5-HT后的大鼠会出现咬死小鼠的攻击行为;而提高5-HT能传递的药物, 如选择性5-HT 1A 或5-HT 1B受体激动剂似乎能特异性地降低大鼠的攻击行为。法国Saudou等[2]设计不同类型的5-HT转基因鼠发现, 缺乏5-HT 1B受体的实验鼠攻击性增强。一项5-HT 2C和色胺酸羟化酶受体的多态性与反复自我伤害关系的研究发现, 有冲动人格特质与男性5-HT 2C和色胺酸羟化酶表型部分相关, 与反复自我伤害无关[3]。
1.2 5-羟色胺转运体基因启动子区多态性
近年来研究显示, 五羟色胺转运体基因启动子区 (the serotonin transporter gene-linked polymorphic region, 5-HTTLPR) 的一个插入/缺失多态性 (5-HTTLPR) 与多种精神疾病的攻击行为有关联[4]。
五羟色胺转运体基因位于17q11.2上, 对调节5-羟色胺的代谢有重要作用, 而在其启动子区转录起始点的-1415 nt到-888 nt的区段存在2种分别为14或16个重复单位的等位基因, 即为5-HTTLPR。前者称为短等位基因, 即S型;后者称为长等位基因, 即L型。其中S具有低转录活性, 能使5-HT重吸收率降低, 因而和数种精神障碍及人格特质有关。
国内外研究显示, 5-HTTLRP等位基因可能与疾病暴力有关, 但结论不一致。如Sukonick等[5]用病例对照研究方法研究伴攻击行为和不伴攻击行为的Alzheimer病患者的5-HTTLPR的多态性, 结果显示, 5-HTTLRP长等位基因和长纯合子基因型的Alzheimer病患者易于发生攻击行为。而Kim等[6]的研究发现, 携带S等位基因的有攻击性的精神分裂症患者更具易愤怒的相关特征。另一项研究发现, 有自我攻击行为个体的S/S与L/L基因型的OR值达到3.63, 提示自我攻击行为与5-HTYLPR多态性的关联[7], 然而Kotler等[8]研究30例伴有凶杀的精神分裂症患者与415例正常对照组及非暴力精神分裂症比较, 未发现与5-HTTLPR有关。
国内左素娥等[9]研究96例无攻击行为的非精神疾病组、89例有攻击行为的非精神疾病组、87例无攻击行为的精神疾病组和70例有攻击行为的精神疾病组, 发现有攻击行为、或有攻击行为的精神疾病人群的S型基因分布频率较低, 但差异无统计学意义。郭建雄等[10]的研究也未见5-HTTLPR多态性与精神分裂症患者的攻击行为存在关联, 进一步性别分层讨论结果也显示与5-HTTLPR多态性攻击行为没有关联。
基于目前研究结果的不一致性, 5-HTTLPRPR与攻击行为的联系以及联系是直接的还是间接的尚无定论。再者, 现有研究的样本例数不大, 也没有重复性的研究加以探讨, 因此, 完善的大样本相关研究需要进一步开展。
1.3 色氨酸羟化酶基因多态性
色胺酸羟化酶 (tryptophan hydroxylase, TPH) 与苯丙氨酸羟化酶 (phenylalanine hydroxylase, PAH) 、酪氨酸羟化酶 (tyrosine hydroxylase, TH) 一样是芳香族氨基酸羟化酶大家族的一员。TPH在5-HT合成过程中起着重要作用, 它催化L-色氨酸转化为5-羟色氨酸, 是5-HT生物合成开始、也是5-HT合成过程中的限速酶。因此TPH活性是5-TH合成的前提, 在描述神经细胞特征方面比5-TH本身的含量更有价值。
自20世纪90年代初, 有多项研究均提示, TPH基因内含子7中A218C多态性与脑脊液中5羟吲哚乙酸 (5-hydroxyindoleacetic acid, 5-HIAA) 水平有关, 并与自杀未遂史、自杀次数及自杀企图有关[3,11,12,13,14]。一项Meta分析也发现, TPH的7号内含子A218多态性与自杀行为有关。但也有一些研究显示, 精神疾病患者的TPH基因A218C多态性与患者的自我攻击行为——自杀无关联[15]。Hong等[16]研究了TPH基因内含子7 A218C多态性与精神分裂症之间的关系, 结果提示精神分裂症与该基因多态性的基因型关联, 但是未发现其与精神分裂症攻击行为的关联。国内有关研究也未见TPH基因A218C多态位点基因型或等位基因频率与精神分裂症患者的攻击行为相关联。
2 儿茶酚胺氧位甲基转移酶 (catechol-O-methytransferase, COMT) 多态性
COMT有可溶型 (S-COMT) 和膜结合型 (MB-COMT) 2种异构体, 在S-COMT的第108个密码子和MB-COMT的第158个密码子处, 一个单核苷酸的替代 (G→A) 产生一个缬氨酸 (Val) 到一个甲硫氨酸 (Met) 的替代, 导致不同的酶活性和热不稳定性, 表现为低活性Met/Met (A/A) 、中等活性Val/Met (G/A) 和高活性Val/Val (G/G) 3种。多项研究显示, COMT不同活性等位基因的分布存在地域和种族差异。
多项研究均认为, COMT低活性等位基因 (COMT-A) 分别与精神分裂症、分裂情感样障碍的暴力行为有关, 高活性等位基因 (COMT-G) 有保护效应[17,18,19,20,21]。而另一些研究认为是高活性的COMT等位基因 (COMT-G) 与暴力攻击行为相关, 为危险因素[22,23]。
姜红燕[24]研究88例精神分裂症患者的攻击行为与其COMT基因型及基因型频率的分布情况, 结果未发现攻击行为与非攻击行为患者各基因型及基因型频率的分布有差异;但性别分层分析显示, 低活性等位基因158Met与男性精神分裂症的攻击行为显著相关, 可能是男性精神分裂症患者攻击行为的易感基因。然而, 刘文英等[25]的研究结果显示, 伴发暴力行为精神分裂症和未伴发暴力行为精神分裂症组之间的COMT基因频率分布无显著性差异。不同COMT基因型强迫症的言语攻击行为分、对物品的攻击行为分、对自身躯体的攻击行为分、对他人的攻击行为分和攻击行为总分差异无统计学意义, 因而推测有无伴发暴力行为精神分裂症与COMT基因多态性无关联。黄雄等[26]的研究也得出了一致的结论。
3 单胺氧化酶A (MAOA) 基因多态性
MAOA是去甲肾上腺素、5-羟色胺和多巴胺的降解酶, 参与这三者的代谢, 而这些神经递质与暴力攻击行为也有关联。MAOA的编码基因位于X染色体的短臂上 (Xp11.23-p11.4) , 现已发现MAOA基因多态性与攻击行为有关[16]。
国外研究发现, MAOA转基因幼鼠成年后, 其行为较之正常鼠具有明显的攻击性。与MAOA转基因小鼠类似, 人类中也有相似的情况, Brunner[27]研究一个具有异常的攻击性大家族发现, 患者MAO底物升高, 而产物生成减少, 因而推断该家系异常行为可能是MAOA功能缺陷所致。进一步遗传连锁分析发现, 在MAOA结构基因的第八外显子的936号核苷酸位置出现C突变为T, 终止密码子替换原有的谷氨酰胺密码子, 引起MAOA的结构改变, 导致其生理功能异常。因此, MAOA缺陷和这个家庭的冲动攻击行为相关联[27]。Caspi等[28]对一组男性儿童样本的纵向研究发现, 有儿童期虐待史并且有MAOA低活性基因型的男人更具有反社会行为。Meyer-Lindenberg等[29]使用磁共振成像比较功能性MAOA基因多态性对有攻击行为精神分裂症患者和健康受试者脑结构和功能的影响, 结果发现MAOA启动子区可变数目重复序列多态性的基因型对暴力和攻击行为的影响在男性中更显著。然而也有研究显示, 未发现MAOA启动子区可变数目重复序列多态性与攻击行为有关联[30]。
郭建雄等[16]研究显示, MAOA基因可能与攻击行为有关。MAOA基因T1460C多态位点的等位基因分布在有和无攻击行为的精神分裂症患者间差异有统计学意义, 尤其是男性有C等位基因的患者是有T等位基因者发生攻击行为风险的2.18倍, 而女性患者中未见同样的阳性结果。提示MAOA基因可能与攻击行为有关, 而且MAOA基因对不同性别的攻击行为影响可能不同, 但是亦不排除本研究女性样本偏少的影响。
4 离子型谷氨酸受体-6 (ionotropic glutamate receptor 6, GluR6) 基因多态性
离子型谷氨酸受体-6 (GluR6或GRIK2) 是红藻氨酸盐受体家族的一员, 基因定位于与精神分裂症易患连锁的染色体区域6q21。汪作为等[31]研究20例有攻击行为的精神分裂症患者和20例无攻击行为的精神分裂症患者的GluR6基因多态性rs6922753和rs2227283, 首次发现了汉族人群GluR6基因多态性可能与攻击行为发生有关, 携带rs2227283A等位基因者发生率增加, 提示谷氨酸系统功能紊乱亦可能参与了攻击行为发生的病理机制。
5 细胞核受体2E1 (nuclear receptor subfamily 2, group E, member 1; Nr2e1) 基因
Nr2e1的研究对这一观点提出了挑战。Nr2el是一种核受体基因, 其位置在鼠第10号染色体上, 在人6号染色体6q21。该核受体作为配体激活转录因子, 调节靶基因的表达, 影响脑的结构和神经发育。
Young等[32]的研究表明, Nr2e1基因敲出小鼠的视神经和视网膜发育异常、大脑皮质及边缘区畸形, 出现认知缺陷, 并且表现出高于正常小鼠的攻击性, 于是将此类小鼠称为“凶猛”小鼠;“凶猛”雌性小鼠嗅脑和边缘脑减小, 与正常小鼠相比缺乏母性本能。进一步检测表明, 雌鼠血清睾酮水平并无异常增高, 生育率与正常小鼠没有差别, 因此推测其攻击性变化很可能是由其异常的脑结构直接引起的。Abrahams等[33]为探究人类Nr2e1是否与小鼠Nr2e1基因具有相同的作用, 用人类Nr2e1基因序列填补“凶猛”小鼠缺失基因, 结果发现, 转基因小鼠的脑结构异常和眼畸形得到改善, 更重要的是其攻击行为与正常小鼠差异无统计学意义, 从而证实Nr2e1基因敲出小鼠行为异常的机制同样适用于人类的暴力攻击行为, 即Nr2e1基因与人类攻击行为有关。Kumar等[34]通过病例对照研究发现, Nr2e1基因变异导致人类精神疾病和行为异常的易感性增加, 是Ⅰ、Ⅱ型双相情感障碍、精神分裂症和冲动性攻击的危险因素, 同时证实该基因在正常成人大脑内的表达集中在前脑, 包括大脑皮质部、枕极、额叶、颞叶和豆状壳核。
分子遗传 篇7
1 RAPD: (Random Amplified Polymorphism DNA, 随机引物扩增多态性)
是由美国杜邦公司的Williums和加利福尼亚生物研究所的Welsh领导的两个小组于1990年同时提出的一种快速、简单、多态性高的一项DNA分子标记技术。RAPD是基于PCR的分子标记方法。基本步骤包括:提取植物个体的总DNA;以人工合成的10~15个核苷酸序列为引物, 在Taq聚合酶的催化下, 通过PCR技术扩增DNA片段;利用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳分析扩增产物的多态性。所有能够影响PCR的因素都会影响RAPD:
1.1 模板DNA对RAPD结果的影响
经本实验室对RAPD条件的摸索实验数据表明:利用CTAB法提取的样品基因组DNA即可满足模板纯度上的要求, 但在25μl反应体系中, 模板的量应为15~25μg, 模板量过高会导致不显多态或假阴性, 模板量过低同样会出现假阴性。
1.2 Mg2+浓度对RAPD结果的影响
Mg2+是taq酶的辅助因子, Mg2+浓度的增加会使RAPD产生的非特异性带增加, Mg+浓度过低会降低Taq酶的活性, 经摸索在种质资源多样性分析中, RAPD体系中Mg2+浓度为2.0m M时效果时最好。
1.3 d NTP浓度对RAPD结果的影响
d NTP包括四种脱氧核糖核苷三磷酸 (d ATP、d TTP、d GTP、d CTP) 利用100m M的四种脱氧核糖核苷三磷酸的母液各取等量混合配成10m M的d NTP混合液, 在种质资源多样性分析中, RAPD体系中加入10m M的d NTP混合液0.5μl最好, d NTP的量过多会导致错误碱基的掺入率过多, 太低则不能满足DNA合成的需要。
1.4 Taq聚合酶对RAPD结果的影响
Taq聚合酶是一种从嗜热菌中分离得到的耐热的taq聚合酶, 目前本实验室不能自己分离, 只能从Ta Ka Ra、promega、invitrogen等公司购买, 每个公司都有不同价格不同特性的taq聚合酶, 在植物种质资源和遗传多样性分析中, 综合实验效果和实验成本选用Ta Ka Ra公司的r Taq聚合酶可满足要求, 25μl反应体系加0.5μl。
1.5 引物浓度对RAPD结果的影响
RAPD用的扩增引物是美国opern公司设计的10~15bp长的短引物, 他们并不能和各物种的模板DNA严谨配对, 在RAPD扩增反应中只加入一个随机引物, 靠这个随机引物在模板中的两条链上有互补的位置是扩增出产物, 在扩增体系中, 引物的量过少会使RAPD多态性降低, 引物量过多会导致扩增出现弥散。经摸索25μl扩增体系中采用15~30ng的引物量产生多态性效果最佳。
1.6 扩增反应过程中的温度与时间对RAPD结果的影响
对RAPD反应来说有其特定的变性、退火、延伸的温度和时间。常规PCR反应得变性温度为90~95℃, 变性时间一般为30~60s, 变性温度过低, 时间过短会导致taq聚合酶活力下降, RAPD结果不佳。另外由于RAPD扩增反应一般要采用40个以上的循环, 酶活性降低导致RAPD结果不佳的问题较为明显, 在分析植物遗传多样性的过程中, 发现采用94℃预变性4min, 94℃变性15s, 一方面DNA的解链情况满足实验需要, 另一方面节省了完成全部循环的时间, 克服了由于长时间的高温给taq酶带来的负面影响。RAPD退火温度和时间也与普通PCR反应不同。由于所采用的是10~15bp的随机引物与模板DNA严谨配对的可能性较小, 所以退火温度为35℃~40℃之间, 退火时间为30s~60s。72℃, 1min延伸即可满足分析要求。RAPD具有快速、安全、简便、灵敏的特点。RAPD技术目前已经被广泛应用于植物类群的划分、遗传多样性分析及遗传作图和基因定位中。
2 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism, 扩增片段长度多态性)
AFLP是1993年由荷兰科学家Zabeau和Vos发展起来的一种基于PCR和RFLP技术的分子标记技术, 它兼有RFLP技术的可靠性, 也具有PCR技术的高效性。现在已被广泛用于遗传图谱构建、遗传多样性研究、基因定位及品质鉴定等方面。AFLP的原理是通过限制性内切酶对样品基因组DNA进行酶切, 产生分子量大小不等的限制性片段, 这些限制片段都带有粘性末端。将人工合成短的双链接头连接在这些DNA片段的两端, 形成带接头的特异片段 (这些接头一端具有同样的内切酶识别粘性末端) 。用专用引物对这些特异片段进行扩增, 专用引物有三部分组成:核心碱基序列 (core sequence CORE) , 该序列与人工接头互补;特异性内切酶识别序列 (enzyme specific sequence, ENZ) ;引物3'-端选择碱基 (selective extension, EXT) ;引物3'-端加了1~3个选择性碱基, 选择性碱基延伸到酶切片段, 这些选择性碱基使得引物选择性地识别具有特异配对顺序的内切酶酶切片段并与之结合, 实现特异性扩增。在扩增程序中, AFLP的扩增与常规PCR反应不同的是退火温度, AFLP的PCR开始与高温复性 (65℃) , 比常规PCR反应的复性温度高10℃左右, 已获得最佳的选择性, 以后循环的复性温度逐步降低, 一直降到复性效果的最好温度56℃, 然后在这个复性温度下完成PCR循环。
结语
分子遗传 篇8
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样本采集及来源
选择中国云南和内蒙地区大麻为材料,分别采取两地区10株样本,并各取用大麻的叶片15mg,用于提取基因组DNA。
1.1.2 主要试剂与仪器
聚丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺(美国Sigma公司);引物由Invitrogen 生物公司(英潍捷基上海贸易有限公司)合成;Taq DNA 聚合酶购自北京TIANGEN生物公司;PCR仪(Biometra 公司,德国);高速低温离心机(德国Hettich公司)。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA的提取与纯化
将大麻样品干叶置于预冷的研钵中,加入3mg聚乙烯吡咯烷酮和少量石英砂磨成细粉末后转移到1.5 mL离心管中,再结合酚氯仿法和改进的CTAB法提取大麻基因组DNA[7]。
1.2.2 ISSR引物筛选
随机抽取云南内蒙两个地区部分样本进行预备试验,优化实验条件,并采取多次重复试验方法,最终确立大麻PCR扩增的最佳反应体系。从设计的10个ISSR引物中筛选出能获得稳定清晰条带的4个引物 (表1)。
1.2.3 ISSR的PCR反应体系及热循环参数
PCR反应体系:1×buffer,0.8ng/μL～2.0ng/μL基因组DNA,400μmol/L引物,Taq DNA聚合酶1.5U,0.1mmol/L dNTP,加消毒水至反应总体积为25μL。热循环参数为94℃预变性4 min,94℃变性45s,51℃～53℃退火45s,72℃延伸45s,扩增36个循环,72℃终延伸10 min,4℃保存[8]。
1.2.4 ISSR分子标记的分析
应用质量分数为6%的中性聚丙烯酰胺凝胶电泳PCR产物,硝酸银染色法染色后,根据图谱中扩增产物片段大小的不同对大麻遗传多样性进行初步分析。
1.2.5 数据处理与统计分析
将所有样品电泳后图谱中显现的条带,用gel-pro analyzer软件[9]进行定量分析,根据不同分子量在容许范围内列出不同行统计分析。
2 结果与分析
2.1 ISSR技术检测云南内蒙地区间大麻遗传多态性结果与分析
从设计的10个ISSR引物中,筛选出4个条带清晰稳定,多态性较高的引物,分别对云南内蒙地区供试的20份大麻样本进行ISSR-PCR扩增,部分扩增结果见图1和图2。ISSR对云南内蒙地区的大麻共扩增出51条带,条带的分子量范围在200bp以上,其中多态性条带40条,多态性条带百分比为78.43%。不同引物能扩增出4～12清晰条带,平均每个引物扩增片段条带数为12.75条。从分子水平上揭示了大麻在云南内蒙不同地区间有较高的遗传多样性,为鉴别不同产地来源的大麻提供科学依据。
2.2 ISSR技术检测云南内蒙地区内大麻遗传多态性结果与分析
地区内大麻的遗传多样性分析结果(表2),4个ISSR引物对云南地区内大麻共扩增出43条带,33条为多态性条带,多态性百分比为76.74%。同样的,4个ISSR引物对内蒙地区内大麻共扩增出33条带,21条为多态性条带,多态性百分比为63.64%。其中引物UBC873和UBC848扩增内蒙大麻条带的分子量范围在300bp以上,而扩增云南大麻条带的分子量范围在200bp以上。说明了同一地区内不同居群大麻的遗传多态性也相当高,这可能为鉴定、鉴别犯罪现场遗留大麻检材的居群奠定基础,为毒品犯罪案件的侦破提供更多相关信息。
注:泳道1～7代表内蒙地区大麻样品;泳道8～14代表云南地区大麻样品;M:DNA Marker。
Lanes 1-7 represent hemp cultivars from Inner Mongolia autonomous regions and 8-14 represent hemp cultivars from Yunnan province;M:DNA Marker.
注:泳道1～6代表内蒙地区大麻样品;泳道7～12代表云南地区大麻样品;M:DNA Marker。
Lanes 1-6 represent hemp cultivars from Inner Mongolia autonomous regions;7-12 represent hemp cultivars from Yunnan province;M:DNA Marker.
3 讨论
大麻是联合国禁毒公约所列的三大毒品之一,能有效鉴别、鉴定大麻种属及产地来源,对禁毒工作可能产生实际意义。国内外报道了很多检测大麻类毒品的方法,但随着贩毒分子大量采用新型的作案手段,传统植物学及理化检验方法已难以满足现代禁毒工作的要求。张爱芝等[10]研究报道利用超高效液相色谱-串联质谱法和气相色谱法对大麻中含有的四氢大麻酚、大麻酚和大麻二酚进行定性定量测定,但是这种方法耗用大麻检材量较大。近年来法庭科学研究方向有向DNA检测技术发展的趋势,这也是禁毒工作的一项崭新课题[11]。
Sakamoto K等[12]人报道采用随机扩增多态性DNA分子标记检测大麻遗传多态性,路帆等[13]曾利用扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)技术对鉴别罂粟、虞美人和大麻植物种属间差异做了初步研究。DNA分子标记是一种研究植物品种鉴定及种质资源遗传多样性的有效技术[14],克服了传统的形态学和理化法的局限性,耗用微量检材,获得的信息量更多,操作简单快速。目前,用于检测大麻遗传多样性的分子标记主要是AFLP和RAPD分子标记,要实现鉴别不同产地,不同种属大麻类毒品,还应开发更多检测大麻遗传多样性的DNA分子标记。ISSR分子标记是一种快速、可靠、能提供有关基因组丰富信息的DNA指纹技术。ISSR分子标记技术已经应用于多种植物种质资源遗传多样性的研究,为植物分子标记辅助育种和遗传改良提供依据,本研究采用ISSR分子标记检测和初步分析大麻的遗传多样性。
ISSR引物并不像简单重复序列(simple sequence repeats,SSR)引物那样需测序获得两侧的单拷贝序列,这样在一定程度上降低了实验成本。与RFLP和RAPD分子标记相比,ISSR分子标记可以检测到更多遗传信息,有时能获得几倍于RAPD分子标记信息量。本研究从分子水平上揭示了大麻在云南内蒙不同地区间有较高的遗传多样性,而且同一地区内不同居群大麻的遗传多态性也相当高。这可能为鉴定、鉴别犯罪现场遗留大麻检材的居群及不同产地来源奠定基础,为毒品犯罪案件的侦破提供更多相关信息。
分子遗传 篇9
1 AFLP技术的基本原理及特点
1.1 AFLP技术的基本原理
AFLP技术是1992年由荷兰科学家Zabean和Vos发展起来的一种新的检测DNA多态性的方法, 并于1993年获得欧洲专利局专利, 专利权属keyg ene公司。AFLP是RFLP和PCR相结合的一种标记技术, 其基本原理是基于对植物基因组DNA限制性酶切片断进行的选择性扩增[7,10]。具体是植物基因组DNA经限制性内切酶双酶切后, 形成酶切位点不同、分子量大小不等的随机限制性片段。酶切后的DNA片段两端被连上通用的双链人工接头 (Adapter) , 形成一个带接头的特异片段作为PC R扩增反应的模板, 即DNA模板。根据接头序列和相邻的限制性位点序列设计引物对限制性片段进行扩增, 专用引物由人工接头互补的核心碱基序列、限制性内切酶识别序列和引物3’端的选择碱基三部分组成。经变性、退火和延伸周期性的循环只有那些与引物的选择性碱基严格配对的DNA片段才能被扩增出来, 长度不同的扩增产物即多态性片段通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将特异的限制性片段分离。[10~12]
1.2 AFLP技术的特点
1.2.1 AFLP结合了RFLP和RAPD的优点
AFLP结合了RFLP的稳定性和PCR技术的简便高效性, 同时又能克服RFLP带型少、信息量小以及RAPD技术不稳定的缺点, 其优点主要表现在: (1) AFLP标记理论上可以无限多, 并可覆盖整个基因组, 不需要预知DNA序列信息, 呈典型的孟德尔方式遗传。 (2) 多态性丰富。AFLP技术能高效地检测出DNA的多态性, 几乎每对AFLP引物都可以扩增出具有多态性的片段, 典型的AFLP实验一次检测可获得50~100个清晰的扩增带。王斌等通过对5460S和5460F这一对水稻等位突变系的AFL P分析, 比较了AFLP与RAPD及RFLP检测多态性的相对效率。结果表明, 这3种分子标记的DN A多态性检出效率依次为AFLP>RAPD>RFLP[13]。 (3) DNA用量少, 仅需0.15μg, 也不需要预知D NA序列信息, 灵敏度高。 (4) 重复性好, 假阳性低, 分辨率高。AFLP优化了PCR反应条件, 可准确反映基因不同时间表达量的变化。加上接头用统一的引物扩增PCR重复性可高达95%以上。严格控制退火温度, 只有在模板浓度极低时才会发生错配, 降低了错配比率。选扩引物碱基数目的变化增强了扩增的特异性。一般用2个如果增加到3个就足以去除非特异扩增, 保证低丰度片段高扩增, 降低了假阳性。 (5) 选择上为中性, 引物在不同物种间通用性强, 可用于没有任何分子生物学研究基础的物种。不需要经过Southern杂交, 操作简单, 易于标准化和自动化。[14~17]
1.2.2 AFLP的缺点
虽然AFLP技术操作要求严格, 但还存在一些不足: (1) 技术难度较高、成本比较昂贵。 (2) 放射性同位素标记会对操作人员造成伤害, 因此需要特殊的防护措施。 (3) 扩增时也存在一定的假阳性和假阴性现象以及凝胶背景杂乱等, 需作重复实验进行验证[18]。 (4) 很难鉴别等位基因, 如对杂合子进行分析, 需要准确了解其等位基因的状况时, 就不能用此方法[19]。 (5) 由于产生的带多, 对其分析及结果的解释就较困难, 要依赖于先进的计算机程序才能完成[20]。
2 AFLP技术在杨树遗传育种中的应用
2.1 遗传多样性和亲缘关系分析
开展遗传多样性研究有利于正确制定植物资源收集保存策略。AFLP标记表现为共显性, 能够鉴定出纯合基因型与杂合基因型, 提供完整的遗传信息, 从DNA水平研究检测群体之间甚至个体之间的差异, 进行比较分析, 为植物遗传多样性的检测提供了新的技术手段。确定物种的亲缘关系往往是争议较大的问题, AFLP被认为是进行遗传变异评价的理想标记[21]。1998年Arens Coops[22]用AFL P来分析荷兰莱茵河分支的岸边残存的欧洲黑杨的遗传结构, 共分析143株树, 其中包括三角杨和一些欧美杨 (P.euramericana) , 6对AFLP引物产生319条多态带。结果表明, 欧洲黑杨的变异比较明显, 并且观察了黑杨和已经被证实的杂交杨欧美杨的变异方式, 两个种的杂交是多态的, 很难从种本身来分析, 说明杂交后代不易判断, 尤其是杂交又回交。同年Winfield[23,24]用AFIP分析了英国Up per Severn地区146个黑杨样本, 使用2对引物共获得147条带, 并且聚类分析揭示很低的遗传多样性水平。1999年Michael[25]等对西班牙的一个胡杨 (P.euphratica) 群体的257个样品进行AFLP分析, 在个体间未检测到任何遗传变异, 证明该群体为无性系起源。2006年詹亚光等[26]以成年欧美杂种山杨 (P.tremula×P.tremuloides) 优良无性系为材料, 通过组织培养方法获得体细胞无性系。AFLP分析由激素诱导的再生植株中谱带发生了变化, 表明体细胞无性系发生分子水平变异。2007年宋红竹[27]等将AFLP分析用于杨属五大派遗传分化研究, 建立了杨树五大派AFLP标记分析系统, 利用AFLP分析谱带的588条多态性条带, 进行遗传相似系数计算和聚类分析, 结果表明, 白杨派、胡杨派、大叶杨派聚在不同的组内, 说明它们的亲缘关系较远, 这符合传统的表型形态的分类结果, 而青杨派、黑杨派和黑杨派内的杂交种以及派间杂种聚在了一组, 说明青杨派和黑杨派的亲缘关系较近, 这与李宽钰等 (1996) 的RAPD分析结果一致。从形态性状上看, 银榆杨是银白杨×白榆的科间杂种.杨成超[28]等为了进一步从分子水平上弄清银榆杨与其亲本银白杨及白榆的亲缘关系, 采用AFLP技术, 用20对引物对银榆杨、银白杨、白榆等l0个样本进行了亲子关系分析。结果表明银榆杨中白榆的基因在4个白榆样本中的存在具有普遍性。但相对于辽宁产地的白榆而言, 北京的白榆与银榆杨杂种的亲缘关系较远。李善文等利用13对A FLP引物对杨属4个派19个种及杂种的47个无性系进行分析, 共检测到858个标记, 其中多态性标记为771个, 多态性位点的百分率为89.9%, 每对引物产生的多态性位点的百分率在80.7%~98.1%之间, 表明杨属种间及无性系间在DNA水平上存在广泛变异。根据AFLP标记结果计算杨属派间、派内种间、种内无性系间分子遗传距离, 对它们的亲缘关系进行定量描述。聚类分析结果表明, 派间聚类与经典形态分类完全一致, 派内种间及种内无性系间聚类与形态分类基本相同。
2.2 遗传图谱的构建
构建遗传图谱又称分子作图, 是把分子标记定位在某一物种的染色体上或连锁群上而构建分子图谱的过程。它是植物基因组研究中的重要环节, 可为植物性状基因的定位、克隆基因、分析数量性状基因等打下基础[9]。1996年尹佟明等[29]利用中国特有的白杨派树种, 响叶杨 (P.adenopoda Maxi m) X银白杨 (P.adlba L.) F1群体, 对双亲分别进行了作图研究, 采用AFLP和RAPD标记作图, 用于银白杨作图的符合孟德尔分离的位点共有122个, 响叶杨中有24个标记构成了38个连锁群 (对) , 银白杨中有80个标记构成了23个连锁群 (对) ;响叶杨连锁标记覆盖的基因组总长度约为214 cm, 银白杨连锁标记覆盖的基因组总长度约为707.5 cm。1998年尹佟明等人[30]又利用AFLP标记使用两个引物组合对南京林业大学杨树种质资源收集圃的42个美洲黑杨无性系进行了AFLP指纹图谱的构建, 发现每个无性系的扩增谱带数都在50条以上, 扩增片段大小在0.3~1.5 kb之间。2001年Cervera等[31]使用AFLP、SSR及STS标记各构建了美洲黑杨×欧洲黑杨的连锁图谱。随机性检验表明, AFLP标记在基因组中是随机分布的。2003年张蕴哲等[32]利用毛新杨×毛白杨的杂交群体构建了毛新杨与毛白杨的AFLP遗传连锁图谱。在双亲整合的图谱中, 239个标记共形成22个连锁群, 总图距4 418 cm, 标记间的平均图距是18.5 cm。此外还得到15个属于双亲共有的只有2~3个标记的小连锁群, 13个父本独有的连锁群和21个母本独有的连锁群。同年, 张德强等[33]以毛白杨及其杂种毛新杨和银白杨与腺杨的杂种银腺杨为材料, 制备了3个规模较大的作为构建毛白杨遗传连锁图的遗传作图群体。并利用AFLP技术对随机抽取的120株子代个体进行了基因型检测, l0对AFLP引物组合在作图亲本间共检测到197个多态性位点, 其中有158个位点在P<0.01水平上符合1︰1孟德尔期望分离比, 占多态性位点总数的80.2%。2004年黄秦军等[34]利用美洲黑杨×青杨F2作为作图群体, 利用AFLP和SSR标记技术构建分子连锁图谱。连锁图共有19个较大的连锁群, 16个二联体 (Doub lets) , 7个三联体 (Triplets) 和5个较小的连锁群。19个较大的连锁群上包括356个AFLP标记和12个SSR标记, 总图距为3 382.4 cm, 标记间的平均间距为9.69 cm。估计基因组长度为2 607~3319 cm, 平均为3 042 cm, 同时采用Lander和Bishop的方法计算期望基因组覆盖度, 平均值分别为96.7%和98.4%。
2.3 基因定位和克隆
高密度遗传图谱的建立为数量性状和质量性状基因定位的研究奠定了基础, 当只有通过标记与质量性状的相关分析才能将质量性状的基因定位到相关的染色体区段上。AFLP技术将强有力的多态性检出能力与多态性扩增产物的高效克隆方法相结合, 为寻找与目的基因紧密连锁的分子标记并进行相关基因的克隆提供了有力的工具[16]。1996年M.T.Cervera[35]等以美洲黑杨×黑杨的F1代的叶片为材料, 利用AFLP技术144个引物筛选了大小为70~800核苷酸的11 500个多态性片段, 得到3个与抗杨树叶锈病基因紧密连锁的AFLP标记。同年比利时正在构建美洲黑杨 (P.del toides S) 和欧洲黑杨 (P.nigra.GHO Y) 为材料的高密度的AFLP标记连锁图谱, 以此材料应用分离群体分析法 (BSA) , 他们已获得3个与抗青杨锈病 (M.L aricispopulina) 紧密连锁的分子标记[36]。1997年Ceruera[37]用AFLP构建了杨树的基因图谱。构建的Populus trichocarpa, P.nigra和deltoi des的基因图每个包括了差不多300个标记, 这些基因图被用于剖析数量性的抗Xanhomonsa Popul i基因, 也用于检验抗Melaopsora L arici-populi na的单基因。2001年Stirling等[38]应用AFLP标记, 通过图位克隆法克隆了抗杂交杨叶锈病的基因。
2.4 种质资源和品种的鉴定
由于同一植物品种遗传背景相同, 任一植株的分子标记都可代表所属品种的特征, 即分子标记具品种特异性。以往用同工酶技术很难将这种亲缘关系很近的品种区分开, 而RFLP技术工作量大, 不适合大量样品的分析, AFLP则克服了这些缺点, 显示了其独特功效。Arens和Coops应用AFLP技术将形态上很难区分的天然杨树杂种区分开[39]。Fo ssati 2004年[40]分析了欧洲山杨自然群体到银白杨的基因渐渗水平问题, 研究中有效地运用了AFLP和SSR标记, 通过分析一系列银白杨、银灰杨和欧洲山杨个体来鉴别杂交, 结果在两树种和它们的杂交种之间得出很明确的区别。2005年[41]利用AFL P和SSR标记评估了杨树商业品种的质量, 以保证杨树品种的特异性 (Distinct ness) 、一致性 (Un iformity) 和稳定性 (Stability) 。2006年胡晓丽[42]等利用AFLP标记技术对12个三倍体毛白杨和二倍体毛白杨无性系进行了分析鉴定。利用3个引物组合的8条多态性条带构建了12个供试材料的指纹图谱, 可以作为三倍体毛白杨无性系鉴别以及品种保护的依据。高建明等[4]采用AFIP技术对来自青杨组和黑杨组的21个重要杨树品种 (无性系) 的鉴定与遗传相关性进行了研究。结果显示, 筛选的4对AFIP引物总共产生了181条多态性带, 尤其是每对引物对每个品种都产生了独特的指纹图谱;聚类分析和多维尺度分析将试验材料大体上分为五类, 结果不仅显示了组间不同品种的差异, 而且大体上区分了我国原生品种和外来品种[43]。
3展望
我国的原生杨树资源极为丰富, 种类居世界首位, 在杨树分子标记研究中, 指纹图谱、遗传图谱、数量性状基因定位虽取得了显著的成绩, 但尚未进入实用阶段。AFLP技术作为迄今为止最有效的分子标记之一, 由于其快速、简便、可靠等优点, 近年来被广泛应用于杨树树种鉴定和遗传相关性研究中。随着研究的不断深入, 利用高效的分子标记构建杨树高密度的遗传图谱, 并利用遗传图谱上的分子标记进行数量性状、质量性状的多位点定位, 开展分子标记辅助选择育种, 分子标记技术的理论和方法也将会在杨树及其它林木遗传育种中得到发展和完善[44]。
摘要：介绍了AFLP分子标记技术的基本原理及特点。对目前AFLP分子标记在杨树遗传育种中遗传多样性和亲缘关系分析, 遗传图谱的构建, 基因定位和克隆, 种质资源和品种鉴定等领域的广泛应用进行了综述, 展现出广阔的前景。
分子遗传 篇10
1 DNA分子标记技术概述
DNA分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的又一种较为理想的遗传标记。其本质上是指能反映生物个体或种群间基因组中存在差异的特异性DNA片段,直接检测DNA本身的序列变化,以蛋白质、核酸分子突变为基础,反映了包括DNA的编码区和非编码区、保守区和高变区、核DNA和细胞器DNA的遗传变异。10多年来,在人类基因组研究计划的推动下,分子标记的研究与应用得到了迅速发展。
DNA分子标记与其它遗传标记相比有以下优越性:①直接以DNA的形式表现,不受季节、环境等的限制,取材范围广泛,在发育的不同阶段,不同组织的DNA均可进行检验,不影响目的基因的表达,与不良性状无必然联系,使得对植株基因型的早期选择成为可能(毛健民等,2001)。②检测位点多,遍及整个基因组,多态性高。③许多分子标记表现为共显性,能够鉴别纯合基因型与杂合基因型,提供完整的遗传信息(徐崇志等,2006)。
常用的分子标记有RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR等。下面首先对这几种标记技术进行简要介绍。
1.1 限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)标记
RFLP标记是由美国学者Bostein等于1980年提出的一种最早的分子标记。其基本原理是利用限制性内切酶酶切不同生物个体的基因组DNA,得到大小不等的DNA 片段,经电泳分离,转移于支持膜上,与放射性核素或某些非放射性标记的探针进行Southern杂交,通过放射自显影或其它显色技术显示杂交结果,即获得反映个体特异性的RFLP图谱。RFLP是一种共显性标记,可区分纯合基因型和杂合基因型,结果稳定可靠,重复性好,适用于构建表达图谱、分析群体内和群体间遗传变异度及亲缘关系等(杨玉珍,2006)。但是RFLP对DNA多态性检出的灵敏性不高,需要大量的DNA,检测步骤较多,周期长、成本较高,尤其需要使用放射性同位素,影响了该技术的广泛应用。
1.2 随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD)标记
RAPD技术是由Willams和Welsh两个研究小组于1990年分别建立,以PCR技术为基础的一种遗传标记技术。其基本原理是以基因组DNA为模板,以随机排列碱基顺序的寡核苷酸序列(通常为10个碱基对)为引物,通过PCR扩增反应对所研究的基因组DNA片段进行体外扩增,扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳等分离,经溴化乙锭(EB)染色,于紫外灯下摄影来检测扩增DNA片段的多态性,扩增DNA片段的多态性反映了基因组DNA的多态性,从而根据对所产生的扩增DNA片段多态性的分析就可以进行遗传作图和品种鉴定。RAPD技术操作简便、快速,可免去RFLP中的克隆制备、同位素标记、Southern杂交等步骤;对DNA质量和数量的要求低,不需要克隆DNA探针,所用的引物的碱基序列是随机排列的,无需专门设计,也不受物种限制;检测灵敏方便,多态性强,但RAPD技术是显性标记,不能区分纯合子和杂合子,而且受反应条件影响较大,检测的重复性较差,因此在实验中要严格控制实验条件,才能得到可重复、理想的扩增效果。
1.3 扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism,AFLP)标记
AFLP是由Zabean和Ros于1992年发明的一项利用PCR技术检测DNA 多态性的技术,已获欧洲专利局的发明专利。其基本原理是将DNA用限制性内切酶酶切,然后连上一个接头(Adaptor),根据接头的核苷酸和酶切位点序列设计引物,即引物=接头+酶切位点+2～3个随机核苷酸,利用两个选择性引物进行特异性PCR扩增,扩增结果最终经过变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳显示。AFLP技术实际上是将RFLP和PCR相结合的一种技术。该技术既继承了RFLP的稳定性,又具有PCR反应快速、灵敏的特点,同时克服了RFLP和RAPD的缺点,且扩增的带纹多(50～100条),是多态性最丰富的一项技术。AFLP标记不足之处在于:得到的主要是显性(约占多态位点数的85%～96%)而非共显性标记,此外,扩增产物需要同位素检测,实验所用试剂盒为专利产品,成本较高,操作过程繁琐,实验周期较长,这都限制了该技术的使用(吕志华,2006)。
1.4 简单序列重复(Simple Sequence Repeat,SSR)标记
SSR又称微卫星DNA(micro-satellite DNA)标记,是指以几个核苷酸(一般为1～6个)为单位,多次串联重复的DNA序列。广泛分布于真核生物基因组中,大约每隔10～15kb就存在1个微卫星。SSR标记的基本原理是每个SSR的重复序列和重复单位数在不同基因型间差异很大,因而形成了每个位点上的多态性。SSR 两端有一段保守的DNA序列,可以通过设计一对与该保守序列互补的寡核苷酸引物,经PCR检测供试材料中SSR的多态性。SSR标记的优点在于:SSR在基因组中分布较均匀,信息量大,比RFLP和RAPD标记所检测的多态性频率高,重复性好且稳定可靠。对DNA质量要求不高,仅需微量即使是降解的DNA也能进行有效的分析,且为共显性标记,可以区分纯合基因型和杂合基因型。但是筛选重复序列和设计合成引物投入高、难度大,因而其开发受到限制,随着很多引物序列公开发表,这一限制因素在逐渐消除,SSR技术也因此将得以广泛的推广应用。
1.5 简单序列重复区间扩增多态性(Inter-Simple Sequence Repeats,ISSR)标记
ISSR 标记是由Zietkiewicz 等提出的一种标记技术,采用17～22碱基的重复锚定引物扩增重复序列之间的片段(蒋彩虹,2007),经检测后根据谱带的有无及相对位置来分析不同样品间ISSR 标记的多态性。ISSR标记是利用在植物基因组中经常出现的重复序列本身设计引物,无须预先克隆和测序,降低了开发费用,并且可以在不同物种间通用,不象SSR标记那样具有较强的种属特异性。与RAPD和RFLP相比,ISSR揭示的多态性较高,可获得几倍于RAPD的信息量,精确度可与RFLP相媲美。因而是一种非常有发展前途的DNA指纹技术。其不足之处在于:ISSR标记大多是显性标记,在解决交配系统、计算杂合度与父系分析等问题时效果不佳。
1.6 其他标记技术
除了以上介绍的5种常用分子标记技术,还有SNP标记、STS标记以及SCAR标记等。
SNP是动植物基因组中普遍存在的一种标记,是同一物种不同个体间染色体上遗传密码单个碱基的变化,被称之为第3代分子技术。基因组DNA序列的变异是物种遗传多样性的基础。较普遍的DNA序列变异是单个碱基的差异,包括单个碱基的缺失和插入,但更多的是单个碱基的置换,即单核苷酸多态性(SNP),这是等位基因间序列差异最为普遍的类型。检测SNP的最佳方法是DNA芯片技术,如果能将所有SNP全部信息载入DNA芯片,就可制造基因组扫描仪,用来扫描各个个体并分析它们在基因组成上的差异,从而将具有不同遗传组成的样品加以区分。
STS(序列标志位点)标记,引物的序列是特定的,对于任何一个能克隆测序的位点都可以设计特定的引物,进行扩增。因此RFLP标记、AFLP标记及RAPD标记又都可以通过测序转化为STS标记。
SCAR(Sequence characterized amplified region,又称特征序列扩增区)标记,是由RAPD技术派生出来的,是根据测定的RAPD克隆片段的末端序列,在RAPD引物的基础上加上14个碱基形成24个碱基的特定引物,以扩增特定区域。SCAR技术类似于STS技术。
2 DNA分子标记在沙棘遗传育种研究中的应用
2.1 遗传多样性及亲缘关系的研究
遗传多样性一般是指种内的差异水平,它反映着一个物种适应环境的能力及其被改造和利用的潜力。遗传多样性是生命系统的基本特征,高的遗传多样性是维持物种长期生存的基础。对沙棘遗传多样性进行分析,以揭示不同沙棘间的遗传关系,可为杂交育种过程中的亲本选择、子代测定以及优良树种的选育提供科学依据。
刘雨娜等(刘雨娜等,2007)以24个大果沙棘品种(Hippophae rhamnoides)为材料,利用RAPD方法进行沙棘的遗传多样性分析。从120个随机引物中筛选出多态性丰富的18 个引物用于扩增反应,在24个大果沙棘品种中检测到171个RAPD位点,其中多态性DNA 带112条,多态位点百分比为65.5%,表明大果沙棘品种具有丰富的遗传多样性,进行聚类分析可将供试的种质分为4 类。
Chengjiang Ruan等(Ruan C.J.等,2004)用RAPD分析了来自中国、俄罗斯、蒙古的14个品种的遗传关系,用9个引物对14个品种通过PCR扩增共产生了114个RAPD标记,其中多态性位点103个,百分率90.35%。各品种间遗传相似系数在0.45 ～0.80,平均值0.67。遗传距离在0.23 ～0.80,平均值0.40。利用UPGMA方法进行聚类分析,认为中国沙棘是一个非常独特的品种,甚至与来自中国的沙棘品种红果、中国优、辽阜2号遗传距离也较远,来自俄罗斯的、蒙古的7个沙棘品种品种和来自中国的辽阜1号等聚为两大类,作者依此对14个品种间亲缘关系进行了分析。因此,RAPD标记可以为品种资源的选择和管理以及沙棘杂交育种策略的确定提供科学的依据。
V.Bartish等(Bartish I.V.等,2000)用RAPD标记对沙棘(Hippophae rhamnoides)种内及种间的遗传多样性进行了研究。用9个引物进行RAPD扩增,共检测到219条多态性标记,发现了16个稳定的标记,这些标记中一部分用于分析种间的亲缘关系,另一部分可用于种的分类的标记。用聚类分析的树状图分析的结果与沙棘分类学的研究结果是一致的。在种间存在着丰富的遗传多样性。早期的研究发现,沙棘大部分的变异(59.6%)产生于亚种间,而种群内的基因可变性也是非常可观的,RAPD多态位点的百分率与林和莫奇种内多样性的估测表明许多高价值的种起源于中亚附近的一些种,其多样性与地理的相关性高。对一个种群每8个种进行分析时,没有发现遗传距离和地理的相关性。
V.Bartish等(Bartish I.V.等,1999)对10个海滨沙棘种群(Hippophae rhamnoides ssp.rhamnoides)和1个蒙古沙棘种群(Hippophae rhamnoides ssp.mongolica)进行RAPD标记变异分析,多态性标记大于89.7%,但是几乎没有稳定的,并且由于个体标记的频率差异,各种群间也因此有所差异。对156个多态性RAPD和63个多态性RAPD分析所得结果分别为0.192和0.159,后者能够达到3/N标准,对于一个远缘杂交品种而言,这个种内遗传多样性的结果是相对较低的。对海滨沙棘的分子变异分析结果为仅有15%的种间变异,这表明一个相对限制的种群间表现出的变异正如远缘杂交品种和另外几种分子变异分析研究中所应表现的那样。海滨沙棘各种群间区别较大,种内多样性较陆生沙棘少,这显示了种群分布对变异所带来的影响。通过裁减或者没有裁减3/N标准基础上RAPD位点的方法获得的各种群间的可能遗传距离,基本上是一致的。聚类分析和主坐标分析的结果表明,海滨沙棘各种群间的遗传距离很小,但却与蒙古沙棘样品种群相距甚远。海滨沙棘各种群间的遗传和地理距离没有相关性,这表明大范围的地理和生态型上的差异对RAPD分析并没有产生影响。
陈纹等(陈纹等,2007)应用12个随机引物对卧龙沙棘(H.rhamnoides L.ssp.wolongensis L i an , K. Sun et X. L . Chen)全部2居群共28个个体进行了RAPD分析。表明卧龙沙棘具有较丰富的遗传多样性,分布范围狭窄的卧龙沙棘在亚种水平的遗传多样性明显高于分布较广的中国沙棘。在居群水平上,卧龙沙棘同样具有很高的遗传多样性。
Chengjiang Ruan等(Ruan C.J.等,2005)用8对AFLP引物对15个在中国广泛种植的苏联、蒙古(H.rhamnoides ssp.mongolica)和中国沙棘(H.rhamnoides ssp.sinensis)品种进行分析,共检测到731个AFLP谱带,其中多态性谱带为645个,多态性位点的百分率为88%,各品种间遗传相似系数在0.29～0.78,平均值0.48。根据UPGMA树状图,在Jaccard系数0.47的水平上,将15个品种分为两大类。
孙燕琳等(孙燕琳等,2007)利用已报道的与沙棘同目不同科葡萄SSR引物筛选适用于沙棘(Hippophae rhamnoides)的SSR引物。结果表明,在供筛选的107对引物中,只有1对引物在沙棘中无扩增位点,有效扩增比率为99.07%;共有46对引物在中国沙棘和辽阜1号2个沙棘品种间表现明显多态性,扩增出了多态性位点,有效扩增比率为42.99%,扩增产物共表现出100个等位基因,其中差异等位基因数为70个,每对引物的等位基因数为1～4个,平均为2.174个。根据这46对引物的扩增结果,中国沙棘和辽阜1号间的遗传相似系数为0.413,遗传距离为0.587。这个结果与前人用RAPD、AFLP分子标记得出的研究结果相似。
Chunjie Tian等(Tian C.J.等,2004)用ISSR标记分析了分布在中国的15个沙棘(Hippophae rhamnoides L.)自然群落的遗传多样性,包括云南沙棘(Hippophae rhamnoides ssp.Yunnanensis)、中国沙棘(Hippophae rhamnoides ssp.sinensis)、江孜沙棘(Hippophae rhamnoides ssp.gyantsensis)3个亚种,共检测了300株。Shannon和Nei多样性指数估测各亚种群的遗传多样性结果表明,3个亚种的Nei遗传多样性指数的平均值分别为0.1944、0.2169和0.1372,差异不显著,说明亚种间遗传多样性指数的平均值之间没有差别。此外,7个云南沙棘亚种的基因分化系数(Gst)平均值为0.2790,7个中国沙棘的Gst 为0.4184,云南沙棘和中国沙棘亚种间的遗传变异分别占28%和42%,表明不同亚种的遗传结构不同。全部变异中14.5%来自亚种间,85.5%的变异来自亚种内,因此沙棘遗传变异主要存在于亚种内,但没有发现群落的遗传起源和地理距离之间有强相关性。所以建议在品种资源的收集保存中,对一个亚种内的个体保存要多于不同亚种群的保存。
Chunjie Tian等(Tian C.J.等,2004)用ISSR技术对来自中国东北和西北部的11个沙棘(Hippophae rhamnoides)自然群落进行了分析,了解其种群间及种群内遗传多样性,用了8个引物,共产生207个多态位点,在250～2500bp间,基因分化系数Gst是0.0679,种群内变异为93.21%,种群间为6.79%,表明这11个种群的分子遗传多样性主要存在于种群内,未发现遗传起源与地理距离的相关性。为进一步在种群水平上了解和保存沙棘的多样性提供了科学依据。
刘瑞香等(刘瑞香等,2007)采用ISSR标记,对中国沙棘(Hippophae rhamnoides Linn.ssp.sinensis Rousi)和俄罗斯沙棘(Hippophae rhamnoides Linn.ssp.turkest anica Rousi×Hippophae rhamnoides Linn.ssp.mongolica cv. Rousi)进行遗传多样性分析,结果显示,13 个随机引物共检测到96个位点,其中95个位点具有多态性;遗传多样性表现为俄罗斯沙棘雄株最高,其次为俄罗斯沙棘雌株,然后是中国沙棘雌株,最小的是中国沙棘雄株。从种间遗传关系来看,中国沙棘雌、雄株遗传上的亲缘关系近,俄罗斯沙棘雌、雄株的亲缘关系近,中国沙棘和外来种俄罗斯沙棘有一定的亲缘关系,但亲缘关系较远。
2.2 性别鉴定
DNA分子标记技术因其不受发育阶段、外界环境及组织特异性的影响,并能够提供多位点分析等优势,被广泛地应用于雌雄异株植物的早期性别鉴定研究中。
董莉娜等(董莉娜等,2007)应用RAPD技术筛选与棱果沙棘(Hippophae goniocarpa)性别相关的分子标记,对棱果沙棘雌雄株的基因组DNA进行混合分组分析(BSA),在194条随机引物中有50条引物能够在雌雄DNA反应池间形成多态性条带,应用这50条引物分别对棱果沙棘雌雄个体(雌雄个体各选取5个)进行RAPD分析,其中1个引物扩增得到一个约为1030bp的与雌性相关的RAPD标记。作者认为进一步利用该雌性特异位点设计出更加稳定的SCAR标记,可望用于棱果沙棘的早期性别的准确鉴别。
刘洪章等(刘洪章等,2006)共用13个引物对生长在同一生态条件下的中国沙棘、俄罗斯大果沙棘和蒙古大果沙棘品种雌雄株性别进行了RAPD 鉴定。结果表明,只用一个引物即可将三亚种沙棘中的任何一种雌雄株区分开,筛选出9个引物中的任何一个,均可将中国沙棘、俄罗斯沙棘和蒙古沙棘区分开,但不能同时区分开雌雄株。同时用2个引物,即可将3种沙棘及其雌雄株同时分开。经鉴定认为俄罗斯沙棘和蒙古沙棘在亲缘关系上较近。
Persson等(Persson H.A.等,1998)应用RAPD 技术和混合分组分析法(BSA),筛选与沙棘(Hippophae rhamnoides L.)性别相关的分子标记,对采自不同地区的沙棘杂交组合(‘Leikora’(雌性)בPollmix Ⅰ’(雄性)和‘Bhi10224’(雌性)ב2-24’(雄性))形成的F1代与亲本组成的雌雄反应池进行PCR扩增,筛选出78种引物,可以反映出雌雄反应池间的差异。
3 结论与展望
综上所述,近年来分子标记技术在沙棘遗传多样性和亲缘关系分析、品种鉴定、性别鉴定等研究中已得到很大发展。把沙棘的遗传多样性分析和性别鉴定等研究由宏观视角、形态水平推进到微观视角、分子水平,具有十分重要的积极意义。但与其他植物相比,仍然处于起步阶段。
(1)在沙棘遗传研究方面目前应用的分子标记种类较少,只有RAPD应用的较为普遍,ISSR、SSR和AFLP的虽有应用,但较少;
(2)在研究内容方面还很有限,诸如遗传图谱构建、基因定位、系谱分析、质量性状基因的分子标记、分子标记辅助选择育种等研究都较少甚至没有研究;
(3)沙棘的基因组研究与农作物相比还比较落后,且育种的周期长,许多共显性标记开发还比较困难。这些都严重影响了分子标记在沙棘遗传育种上的应用。
在今后的研究中,应加强以下几个方面的工作:
(1) 拓宽DNA分子标记在沙棘遗传育种研究上的应用种类和深度,继续推广应用RAPD技术的同时,加强ISSR、SSR和AFLP标记的应用,尝试将SNP、STS标记等技术应用于沙棘分子育种研究中;
(2)在加强常规杂交育种工作的基础上,构建高度饱和的遗传图谱;
(3)注重质量性状的研究,加强QTL作图;
(4)寻找与经济性状紧密连锁的分子标记,实现分子标记辅助选择育种;
(5)广泛注意分子标记在其它领域的应用动向,及时借鉴新的方法和技术,不断推动沙棘分子标记的发展,为沙棘新品种的定向选育、加速育种进程和提高选育效率提供新的技术手段。