分子育种遗传（共7篇）
分子育种遗传 篇1
分子标记是20世纪80年代初发展起来的遗传标记, 它是DNA水平的标记能够对发育时期的生物个体、组织器官、甚至细胞进行检测, 不受环境基因表达与否等因素的限制, 同时具有数量丰富、多态性强及操作简便的特点, 分子标记为遗传育种提供了方便快速的途径, 目前已有RFLP, RMAPD, SSR, RAPD, AFLP, IS-SR, STS, SCAR等分子标记。目前主要应用于基因定位, 构建分子图谱, 种质资源分类与遗传多样性研究以及辅助育种。本研究着重探讨几点对分子标记技术有影响的实验条件。
1 RAPD: (Random Amplified Polymorphism DNA, 随机引物扩增多态性)
是由美国杜邦公司的Williums和加利福尼亚生物研究所的Welsh领导的两个小组于1990年同时提出的一种快速、简单、多态性高的一项DNA分子标记技术。RAPD是基于PCR的分子标记方法。基本步骤包括:提取植物个体的总DNA;以人工合成的10~15个核苷酸序列为引物, 在Taq聚合酶的催化下, 通过PCR技术扩增DNA片段;利用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳分析扩增产物的多态性。所有能够影响PCR的因素都会影响RAPD:
1.1 模板DNA对RAPD结果的影响
经本实验室对RAPD条件的摸索实验数据表明:利用CTAB法提取的样品基因组DNA即可满足模板纯度上的要求, 但在25μl反应体系中, 模板的量应为15~25μg, 模板量过高会导致不显多态或假阴性, 模板量过低同样会出现假阴性。
1.2 Mg2+浓度对RAPD结果的影响
Mg2+是taq酶的辅助因子, Mg2+浓度的增加会使RAPD产生的非特异性带增加, Mg+浓度过低会降低Taq酶的活性, 经摸索在种质资源多样性分析中, RAPD体系中Mg2+浓度为2.0m M时效果时最好。
1.3 d NTP浓度对RAPD结果的影响
d NTP包括四种脱氧核糖核苷三磷酸 (d ATP、d TTP、d GTP、d CTP) 利用100m M的四种脱氧核糖核苷三磷酸的母液各取等量混合配成10m M的d NTP混合液, 在种质资源多样性分析中, RAPD体系中加入10m M的d NTP混合液0.5μl最好, d NTP的量过多会导致错误碱基的掺入率过多, 太低则不能满足DNA合成的需要。
1.4 Taq聚合酶对RAPD结果的影响
Taq聚合酶是一种从嗜热菌中分离得到的耐热的taq聚合酶, 目前本实验室不能自己分离, 只能从Ta Ka Ra、promega、invitrogen等公司购买, 每个公司都有不同价格不同特性的taq聚合酶, 在植物种质资源和遗传多样性分析中, 综合实验效果和实验成本选用Ta Ka Ra公司的r Taq聚合酶可满足要求, 25μl反应体系加0.5μl。
1.5 引物浓度对RAPD结果的影响
RAPD用的扩增引物是美国opern公司设计的10~15bp长的短引物, 他们并不能和各物种的模板DNA严谨配对, 在RAPD扩增反应中只加入一个随机引物, 靠这个随机引物在模板中的两条链上有互补的位置是扩增出产物, 在扩增体系中, 引物的量过少会使RAPD多态性降低, 引物量过多会导致扩增出现弥散。经摸索25μl扩增体系中采用15~30ng的引物量产生多态性效果最佳。
1.6 扩增反应过程中的温度与时间对RAPD结果的影响
对RAPD反应来说有其特定的变性、退火、延伸的温度和时间。常规PCR反应得变性温度为90~95℃, 变性时间一般为30~60s, 变性温度过低, 时间过短会导致taq聚合酶活力下降, RAPD结果不佳。另外由于RAPD扩增反应一般要采用40个以上的循环, 酶活性降低导致RAPD结果不佳的问题较为明显, 在分析植物遗传多样性的过程中, 发现采用94℃预变性4min, 94℃变性15s, 一方面DNA的解链情况满足实验需要, 另一方面节省了完成全部循环的时间, 克服了由于长时间的高温给taq酶带来的负面影响。RAPD退火温度和时间也与普通PCR反应不同。由于所采用的是10~15bp的随机引物与模板DNA严谨配对的可能性较小, 所以退火温度为35℃~40℃之间, 退火时间为30s~60s。72℃, 1min延伸即可满足分析要求。RAPD具有快速、安全、简便、灵敏的特点。RAPD技术目前已经被广泛应用于植物类群的划分、遗传多样性分析及遗传作图和基因定位中。
2 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism, 扩增片段长度多态性)
AFLP是1993年由荷兰科学家Zabeau和Vos发展起来的一种基于PCR和RFLP技术的分子标记技术, 它兼有RFLP技术的可靠性, 也具有PCR技术的高效性。现在已被广泛用于遗传图谱构建、遗传多样性研究、基因定位及品质鉴定等方面。AFLP的原理是通过限制性内切酶对样品基因组DNA进行酶切, 产生分子量大小不等的限制性片段, 这些限制片段都带有粘性末端。将人工合成短的双链接头连接在这些DNA片段的两端, 形成带接头的特异片段 (这些接头一端具有同样的内切酶识别粘性末端) 。用专用引物对这些特异片段进行扩增, 专用引物有三部分组成:核心碱基序列 (core sequence CORE) , 该序列与人工接头互补;特异性内切酶识别序列 (enzyme specific sequence, ENZ) ;引物3'-端选择碱基 (selective extension, EXT) ;引物3'-端加了1~3个选择性碱基, 选择性碱基延伸到酶切片段, 这些选择性碱基使得引物选择性地识别具有特异配对顺序的内切酶酶切片段并与之结合, 实现特异性扩增。在扩增程序中, AFLP的扩增与常规PCR反应不同的是退火温度, AFLP的PCR开始与高温复性 (65℃) , 比常规PCR反应的复性温度高10℃左右, 已获得最佳的选择性, 以后循环的复性温度逐步降低, 一直降到复性效果的最好温度56℃, 然后在这个复性温度下完成PCR循环。
结语
分子标记的问世和发展为定向的对作物进行遗传操作和改良提供了可能, 成为分子生物学和植物遗传学研究中的有力手段。分子标记的实验进程快速高效, 结果稳定可靠, 各种分子标记之间互相结合互补不足, 一方面可以提高检测结果的准确性和可靠性, 另一方面也可以构建饱和的遗传图谱, 与分群分析法BSA (bulked segregant analysis, 简称BSA) 结合, 可以找到与目的基因紧密连锁的分子标记, 定位克隆某些重要基因。在过去几年里, 利用定位克隆方法已克隆了许多基因。分子标记也是数量性状基因 (QTL) 研究的有效工具便于在育种中对有关的QTL的遗传动态进行跟踪, 从而大大增强人们对数量性状的遗传操纵能力, 提高育种中对数量性状优良基因型选择的准确性和预见性。分子标记在在物种的起源和进化、遗传多样性、遗传疾病的诊断、基因表达等遗传和育种有关的研究领域中有着广阔的应用前景。
分子育种遗传 篇2
1 分子标记分类
分子标记发展至今已有几十种, 主要有以分子杂交为主的分子标记, 如限制性片段长度多态性 (RFLP) 、可变数目串联重复 (VNTR) 、原位杂交等。以PCR技术为基础的分子标记, 如随机扩增多态性 (RAPD) 、酶切扩增多态性序列 (CAPS) 、扩增片段长度多态性 (AFLP) 、DNA扩增指纹分析 (DAF) 选择性扩增DNA片段 (SADF) 、特定序列扩增区段 (SCAR) 等。以重复序列为基础的分子标记, 如简单序列重复 (SSR) 、简单序列重复区间 (ISSR) 等。此外还出现了许多基于高通量检测技术的分子标记技术, 如表达序列标签 (EST) 、单核苷酸序列多态性 (SNP) 、多样性芯片技术 (DArT) 、限制性内切酶位点标签 (RAD) 等[1]。在家蚕研究中应用较多的分子标记技术主要有RAPD、RFLP、AFLP、SSR等, 已广泛应用于遗传图谱构建、种质资源鉴定、基因定位及连锁分析、遗传多样性和亲缘关系分析、生物进化和系统发育等方面。
2 家蚕遗传育种研究中分子标记技术的应用
2.1 家蚕的分类、进化及遗传多样性分析
家蚕在长期驯养过程中, 由于地理隔离产生了不同的地理系统, 而地理系统内的品种又各具经济和生态特征。研究家蚕不同地理品种分类、进化、遗传变异和亲缘关系是种质资源鉴定、评价、保存和利用的依据, 也是育种中亲本选择和杂种优势预测的重要基础。分子标记反映DNA水平上的差异, 这些差异相比表型差异更为丰富, 而且基于此的家蚕分类、进化和遗传多样性分析不受环境因素影响, 结合传统分析结果更为准确可靠。
夏庆友等[2]利用RAPD标记对不同系统、化性和眠性共6类59个家蚕品种及野蚕之间的遗传差异进行研究, 结果表明中国一化性四眠种最早从野蚕中分化出来, 中国一化性三眠种和中国一化性四眠种进化上有显著差异。鲁成等[3]以AFLP分子标记技术对33个代表性的不同地理家蚕品种及来自不同地区的10个野桑蚕和5个柞蚕品种进行了DNA多态性分析和分子系统学研究。结果从分子水平上证明家蚕起源于野桑蚕, 中国家蚕二化种在进化上介于一化种和热带多化种之间。李竞等[4]以家蚕C108和C100为材料, 用25个SSR标记对中国5个地区的野桑蚕和2个家蚕品种进行多态性分析, 共产生58个等位基因, 平均每个位点多于2个等位基因。Li等[5]用19个ISSR引物对42个品种的家蚕进行扩增, 其中的12条引物能扩增出清晰条带, 重复性较好, 共扩增出108条带, 其中85个有多态性, 聚类分析将这些品种分为7个亚群结果表明IS-SR标记能够很好用于家蚕遗传多样性分析。
2.2 遗传图谱构建和基因定位
2.2.1 遗传连锁图构建
分子遗传图借助分子标记技术研究家蚕分子水平的遗传规律, 确定标记及基因在连锁群上的线性关系。家蚕高密度遗传图谱是重要功能基因克隆和经济性状定位及家蚕育种研究应用的理论依据和基础。
Goldsmith等[6]利用两个家蚕近交系P50和C108原种、F1、BC1或F2群体绘制了家蚕第一张分子连锁图, 筛选得到60个RFLP标记, 其中13个是分布在已知的10个基因座位上的标记, 还有9个是反转录转座子, 60个标记除8个无连锁外, 其余52个标记分布在16个连锁群上。Yasukochi[7]用RAPD构建了一张含1018个遗传标记的高密度家蚕连锁图, 覆盖了家蚕27条常染色体和Z染色体, 标示了8个已知基因和5个突变基因, 28个连锁群中的7个已与经典连锁图对应, 标记间平均图距为2cM。Miao等[8]以大造和C108的BC1M回交群体用518个SSR分子标记构建了一张家蚕的遗传连锁图, 该连锁图包含28个SSR连锁群, 利用可见标记和由以前的构图基因、cDNA序列和克隆RAPD得到的CAPS将连锁群进一步分配到了相应的28个染色体上。通过整合可见突变P和29个昆虫保守基因到这个连锁图上, 形成的连锁图每个连锁群有7-40个标记, 总图距达到3 431.9cM。谭远德等[9]以782和od100为亲本构建的47个后代个体构成的回交群体构建了家蚕的第一张AFLP遗传连锁图。该连锁图含356个标记, 分配在30个连锁群上, 每个连锁群的图距为37.4到691.0cM不等, 总图距为6 512cM。同一连锁群上临近的两个标记间平均距离为18.2cM。性连锁基因od定位在第3连锁群的P1T3B40和P3T3B27两个标记之间, 表明第三连锁群对应于Z染色体。张烈等[10]以C108和大造的回交一代用AFLP进行作图, 构建了含814个标记, 36个连锁群的连锁图谱。连锁图总长13005cM, 连锁群平均长度361.25cM, 标记间平均图距15.98cM, 有两个连锁群分别与经典图谱15连锁群和W染色体连锁群相对应。Zhan等[11]利用SSR标记整合以前的数据构建了两个新的连锁图, 新连锁图覆盖了27条染色体, 包含了692个唯一的SSR位点, 使以前的图谱的密度由平均6.3cM缩小到4.8cM;在相应的低多态性位点区域有497个标记, 其中244个有多态性。利用构建的新图谱, 定位了一些单基因、QTL位点和许多核糖体蛋白基因。Yamamoto等[12]以家蚕品种p50T和C108为材料构建了SNP连锁图, 覆盖了家蚕全部的28个连锁群, 总图距为1 035cM, 后又进一步将标记数增加到1 755个, 使其密度达到平均每0.81cM一个SNP位点;通过用不同的限制性内切酶消化3个BAC文库产生的指纹克隆构建了6 221个重叠群, BLAST搜索BAC末端序列和表达序列标签作为探针的高密度BAC滤膜杂交在这些重叠群上找到724个单拷贝基因, 经RFLP分析非重组的雌性回交群体在连锁群上标示了另外964个表达序列标签。
2.2.2 基因定位
基因定位是借助紧密连锁的分子标记确定目标基因在染色体上的位置, 高密度的遗传连锁图使得基因定位更加方便。分子标记相比传统遗传标记在家蚕重要突变性状及经济性状基因定位研究中更为高效, 定位精度更高。随着分子标记技术及分析方法的日益成熟和完善, 今后在家蚕基因定位特别是QTLs定位分析中将得到更大的发展。
Dai等[13]通过SSR连锁定位结合候选基因筛查, 证实家蚕暗化型 (mln) 为乙酰转移酶基因Bm-iAANAT突变所致。Wei等[14]以家蚕正常斑纹品种P50和限性斑纹品种H9为材料, 利用SSR标记将控制家蚕斑纹的+P基因定位在离标记S0206 3.0cM处, 结合家蚕基因组精细图分析认为包括+P基因的最近的两个标记之间的物理距离为995kb, 有三个候选基因靠近+P基因, 其中最近的一个距离仅19.1kb。王修业等[15]利用BC1M群体构建了关于无鳞毛翅nlw基因的遗传连锁图, 连锁图的遗传距离为125.7cM, 与nlw基因最近的引物为STS标记cash2p, 图距为11.4cM。Ogoyi DO等[16]以易感品种C124和耐受品种902为亲本构建BF1群体用于对浓核病抗性基因nsd-2连锁分析。结果表明该基因与第17连锁群上的基因连锁, 构建的17连锁群连锁图图距为30.6cM, nsd-2被定为在24.5cM处, 鉴定了临近的3个连锁cDNA标记。谭远德等[17]将茧长和茧层量的主基因Q (1) -q (1) 及Q (w) -q (w) 分别定为在Z染色体的两个形态标记基因sch和od两侧, 其中Q (1) -q (1) 距sch74.25cM, Q (w) -q (w) 距od 54.78cM, 另外控制全茧量的1个主基因Q (wc) -q (wc) 与sch未发生交换, 故与sch有同一位点。Mase K等[18]以C108和Sawa-J构建BC1群体利用rflp对Sawa-J品种中的偏食基因进行了鉴定连锁分析和定位结果证明摄食行为主要受一个定位在RFLP连锁图的9连锁群20.2cM处的一个隐性基因控制, 发现了距离4.2cM处的一个新的分子链锁标记e73。
2.3 家蚕DNA指纹分析和品种鉴别
蚕业生产中常需要对家蚕品种真伪及纯度进行鉴别, 传统方法依据形态特征或经济性状, 但形态特征区分度不高, 经济性状大多是数量性状, 受环境影响较大, 鉴别准确性差, 效率低下。分子标记技术多态性丰富, 重复性高, 准确可靠, 通过建立典型品种的指纹图谱, 适于对品种快速有效的鉴别。
钟伯雄等[19]对6个家蚕品种秋丰×白玉、丰一×54A、菁松×皓月、春蕾×镇珠、薪杭×白云、夏7×夏6 (正反交) 用AFLP分子标记技术进行分析, 筛选到5对引物, 在6个品种中扩增得到157条带, 其中54条具有多态性, 据一些特异性的条带能够准确地将6个家蚕品种区别开来。程道军等[20]利用RFLP标记技术构建了家蚕9个现行品种的标准DNA指纹图谱, 可以可靠区分鉴定不同的家蚕品种。廖富蘋等[21]以RAPD技术对家蚕“932”×芙蓉、“7532”×湘辉杂交原种和四元杂交种 (“932”×芙蓉) × (“7532”×湘辉) 的纯度进行检测, 得到可做鉴别的分子标记, 结果表明应用RAPD技术进行检测家蚕多元杂种的纯度是可行的。
2.4 分子标记辅助选择
家蚕的经济性状大多为数量性状, 易受环境影响, 常规方法难以获得较好的选择效果。1991年Goldsmith提出“国际蚕分子育种计划”, 将分子标记技术引入到家蚕育种工作中来。该计划分两步, 第一步是绘制家蚕的分子基因图, 第二步是数量性状定位分析。最后利用分子标记在DNA水平上进行重要经济性状的选择、固定, 短时间内育成高抗、强健、丝质优、易扩繁等特性的新品种。分子标记辅助选择 (Molecular marker-assisted selection, MAS) 是借助与目标性状或基因紧密连锁的分子标记在育种过程中对育种材料进行淘汰、选择, 与传统育种相比, 分子标记辅助选择不受时间限制, 可以进行早期选择, 提高选择强度并缩短年限, 使育种效率得到极大提高。
赵巧玲等[22]发现RAPD标记S-24724与粗纤度茧丝基因连锁, 汪琳等[23]筛选到一个与家蚕龙角基因K连锁的RAPD标记OPV-10700。姚勤等[24]以高抗NPV材料NB和敏感材料306组配近等基因系, 以RAPD技术获得标记再转换成SCAR标记进行辅助选择, 以平均死亡率作为抗性评判标准, 通过比较常规添毒选择和SCAR分子标记辅助选择选育抗NPV品种效果发现, 分子标记选择的效果相当, 甚至优于常规育种。陈克平等[25]以含有耐氟主效基因的家蚕品种T6和敏感品种733新及其近等基因系NF733新为材料, 用200个RAPD引物扩增得到与耐氟性有关的标记OPB-10900, 在各回交世代的耐氟个体中都能检测到特异片段, 证实了分子标记的可靠性。Ashwath SK等[26]为改良日系品种的消化能力和生命力, 由供体亲本将淀粉酶Amy d (iv) 和d (v) 等位基因导入到轮回亲本建立近等基因系, 在包括供体亲本、轮回亲本和近等基因系的6个家蚕品种以27个RAPD引物进行分析, 结果在这些引物中6个引物的扩增产物与近等基因系中供体亲本的淀粉酶基因连锁, 而在各自的轮回亲本中不存在, 3个扩增片段, 分别为1584bp、1904bp和1232bp, 在淀粉酶等位位点Amy d (iv) 特异扩增, 1个1776bp片段与Amy d (v) 连锁, 两个PCR产物 (2628bp和1375bp) 与d (iv) 和d (v) 都相关。Srivastava PP等[27]为了鉴定家蚕的热耐受性, 选择了15个多化性品种, 以15条引物对其基因组进行ISSR-PCR分析, 聚类结果形成5个类群和1个隔离群;通过逐步多重回归分析鉴定的5个条带经T检验和显著性分析表明和热处理后的化蛹率相关, 其中标记8083000在家蚕品种中与化蛹率相关性最高, 经鉴定的标记被用来发展用于以分子标记辅助选择热耐受性家蚕品种的DNA标记。
3 家蚕遗传育种研究中分子标记技术应用展望
分子标记技术作为一种强有力的技术手段, 已全面渗入到家蚕遗传育种研究领域的各个方面, 主要有高密度遗传连锁图谱的获得和重要质量性状及数量性状QTLs的精细定位;不同家蚕品种的鉴定和亲缘关系分析;家蚕种质资源评价和分子标记辅助选择育种。分子标记育种是将现代分子生物学技术和传统遗传育种结合起来的新的育种手段, 在其它动植物育种中已得到许多成功应用, 由于家蚕的许多生态性状和经济性状大多为数量性状, 在家蚕中还处于探索阶段。今后需要解决的问题主要是发展分子标记的技术手段和分析方法, 增加遗传连锁图谱的标记密度, 整合分子遗传图、形态标记连锁图和基因组精细图, 提高分子标记与质量性状和QTLs的关联度以及定位和效率估算的精度, 提高多位点、高通量检测技术的准确性和可靠性, 降低育种技术成本。虽然目前取得的成果还不多, 还存在着许多问题, 我们仍相信分子标记技术随着技术手段和分析方法的的日益成熟, 在家蚕遗传育种研究中将有极大的应用前景。
摘要：介绍了分子标记的类型, 简述了分子标记技术在家蚕的分类、进化及遗传多样性分析、遗传图谱构建及基因定位、品种鉴别和分子标记辅助选择方面的应用进展, 并对分子标记技术在家蚕遗传育种研究领域的应用前景进行了展望。
分子育种遗传 篇3
目前用于种质资源鉴定和遗传育种研究的分子水平标记技术主要包括:以Southern杂交为基础的限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)标记等;以PCR为基础的随机扩增多态性DNA(Randomly amplified polymorphic DNA,RAPD)标记、扩增片段长度多态性(Amplified fragment length polymorphism,AFLP)标记、序列特征化扩增区域(Sequence characterized amplified regions,SCAR)标记和随机引物PCR(Random primer PCR,RP-PCR)标记等;以重复序列为基础的简单重复序列(Simple sequence repeat,SSR)标记和简单重复序列多态性(Inter-simple sequence repeat,ISSR)标记等;以mRNA为基础的表达序列标签(Expressed sequence tag,EST)、基因表达序列分析(Serial analysis of gene expression,SAGE)和序列标签位点(Sequence tagged site,STS)等;以单核苷酸多态性为基础的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)标记等。
该文对ISSR分子标记技术的原理和特点做了简要介绍,对其在植物,特别是蓖麻遗传育种研究中的应用进行综述,旨在指出目前研究中存在的问题,并对ISSR标记技术在蓖麻研究中的应用前景进行展望。
1 ISSR标记的原理和特点
ISSR(简单重复序列多态性)又称作锚定简单序列重复(Anchored simple sequence repeat,ASSR)或微卫星引物PCR(microsatellite-primed PCR,MP-PCR),该技术是1994年Zietkiewicz等[1]提出的一种微卫星类分子标记技术。其来源于植物基因组中丰富的简单重复序列,在微卫星序列的3’或5’端锚定2~4个随机核苷酸,组成单引物进行重复序列间DNA的PCR扩增。在PCR反应中,锚定引物可以引起特定位点退火,导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增。所扩增的inter SSR区域的多个条带通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或者琼脂糖凝胶电泳得以分辨。
ISSR标记技术操作简单、快速、高效,不需要繁琐地构建基因文库、杂交和同位素显示的步骤;遗传多态性高,可同时提供多位点信息和揭示不同微卫星座位个体间变异的信息;采用的引物较长(17~24 bp),退火温度较高,因此引物具有更高的专一性,降低了条带的干扰,随之提高试验结果的可重复性;ISSR标记为显性标记,符合孟德尔遗传规律;ISSR标记技术结合了RAPD和SSR的优点,耗资少,模板DNA用量少。
2 ISSR技术在植物研究中的应用
2.1 构建遗传连锁图谱与基因定位
遗传图谱研究目的是寻找足够的多态分子标记,从而将所有基因定位到特定染色体的特定区域。ISSR技术因具有较高的准确性、重复性和高度多态性,并遍布在整个染色体上,可将特定PCR标记锚定在染色体的已知位置,而被广泛应用于绘制遗传连锁图谱和基因定位。Lu Jiangjie等[2]用细茎石斛和铁皮石斛的杂交F1,通过拟测交理论,包括74个ISSR引物在内的共422个引物构建基因图谱,细茎石斛图谱总长1127.9 cM,共17个连锁群,165条标记位点;铁皮石斛图谱总长1 210.9 cM,19个遗传连锁群,169条标记位点。Zhang Fei等[3]利用ISSR技术与其它分子标记技术相结合,绘制了菊科植物‘雨花落英’和‘奥运含笑’的连锁图谱。Chen Danwei等[4]利用ISSR和AFLP标记腊梅花F2,共标记了84个父本特异性条带51母本特异性条带绘制亲本基因链锁图谱,母本遗传图总长2 417.8 cM,平均相邻间距25.61 cM,最大相邻遗传间距48.2 cM;父本连锁遗传距离1 184.2 cM,平均相邻连锁间距25.7 cM,最大相邻间距49.0 cM。曹娴等[5]用ISSR标记技术鉴定出草莓的一个与抗灰霉病基因连锁的标记UFFa01H05,该标记与抗性基因间的遗传距离为15.9 cM。
2.2 种质资源鉴定
种质资源是选育新品种的基础材料,包括各种植物的栽培种、野生种的繁殖材料以及利用这些繁殖材料人工创造的各种植物的遗传材料。种质资源鉴定评价的传统方法主要是通过植株观察和试验,这种方法会因外界环境因子的影响而出现偏差。而分子标记鉴定能较好地克服外界的影响。近年来,ISSR标记技术已经广泛应用在小麦、玉米、甘蓝、马铃薯和柑橘等植物的种质资源鉴定,并取得了较好的结果。例如,徐菲等[6]应用ISSR标记将33个秋海棠属植物品种划分为3大聚类。He F等[7]应用ISSR技术和RAPD技术相结合,对560种拟南芥进行种群间多样性和遗传距离分析。LIU Benying等[8]以8个种群134份云南茶树资源为材料,应用ISSR标记方法,应用Nei-Li相似系数法估算了134个材料间的相似系数为0.445~0.819,平均为0.512,说明茶树资源间的遗传基础较宽。Prevost等[9]用4个ISSR引物,就区分开30多个马铃薯品种。
2.3 遗传多样性和系统进化关系
遗传多样性是生命系统的基本特性,包括种内两个隔离地理种群间及单个种群内个体间的遗传变异,是物种适应自然和发生进化的遗传基础。ISSR标记可以有效地揭示种群间及种群内的遗传多样性,分析其系统分化规律,并研究群体多样性程度及遗传结构,了解基因频率发生的变化,为种源划分提供DNA分子水平上的依据。LIU Benying等[8]对云南茶树资源分析检测,共获得475条稳定的谱带,其中多态性谱带470条(占98.9%),有效地说明了遗传多样性丰富。大厂茶等8个种群间的遗传相似系数介于0.850~0.987,平均相似距离0.92,表明不同种群间的遗传差异较小。Li Zuo等[10]分析了莲属的87个品种,包括70个中国观赏莲种,7个泰国野生莲种、2种美洲黄莲、8个中国莲和美洲黄莲的杂交品种,遗传多态性达91.2%。Cai Yu[11]等利用ISSR技术研究224个麻疯树属品种,在219个中国品种中,扩增多态性条带占75.15%,Nei基因多态性指数为0.19,平均香农信息指数为0.292。Li Huiying等[12]利用29个ISSR引物研究了95个中国野生狗牙根品种的遗传多态性,特异性条带(242条)占97.6%,遗传相似系数0.51~0.97。Ali Shahi-Gharahlar等[13]对39种樱桃属植物用12条引物共扩增出151条特异多样性条带,扩增多态率达81.8%~100.0%,并发现欧洲甜樱桃和小果樱桃的相似率最低(0.04)。孙小琴[14]等采用ISSR标记分析寒兰的遗传多样性,结果表明不同开花季节寒兰的遗传多样性存在明显差异。
3 ISSR技术在蓖麻遗传育种中的应用
ISSR分子标记是蓖麻品种鉴定和遗传多样性研究的有效手段,对蓖麻种质资源、遗传多样性与亲缘关系鉴定,以及在遗传育种等方面的研究都能起到重要的指导作用,进一步为蓖麻分子育种积累一定的理论基础及实践依据。
通过ISSR标记技术,王亚[15]对单雌蓖麻材料做了分子水平的分析,以单雌蓖麻和两性蓖麻以及杂交后的F2群体为材料,初步得到了与蓖麻雌性控制位点紧密连锁的分子标记UBC844750。郑鹭[16]通过对81份蓖麻品种的ISSR分析,共筛选出20条多态性较好的ISSR引物,扩增多态条带252条,多态条带比率(PPB)为53.17%,遗传相似系数范围为0.45~0.94。吕二锁[17]对33个蓖麻材料,利用4条ISSR适宜引物进行PCR扩增,得到多态性条带25条,多态性条带百分率为75.7%,表明33个供试材料具有丰富的多态性。并在此基础上研究了蓖麻不同亲本及F1间的遗传相似度和遗传距离。黄文霞[18]等应用ISSR标记,对国内外17份蓖麻材料的亲缘关系进行分析,筛选出11条能扩增出清晰条带并具有多态性的引物,且这些引物共计扩增出90条DNA条带,平均每条引物扩增的DNA条带数为8.18条,其中,多态性DNA条带57条,占63.33%。17份蓖麻材料的遗传相似系数在0.52~0.97,且明显分为2个大类群,遗传相似性相对较高。Bhavesh[19]用5条ISSR引物在22个蓖麻品种中共扩增出47条带,其中32条多态性条带,平均每条引物扩增6.4条,扩增条带数从8~13不等,扩增条带长度从240~2 700 bp不等。多态性水平从33.3~100不等,平均多态性水平为68.1%,展现出丰富的遗传多样性。
4 存在问题及应用前景展望
综上所述,ISSR分子标记作为多位点标记,已在蓖麻遗传多样性研究、亲缘关系及系谱分析、蓖麻品种和种质鉴定及遗传图谱构建和标记辅助育种等方面已取得较大进展。但同样也存在着一些技术缺陷。如ISSR标记大多数为显性标记,多数情况下不能提供检测位点的纯合与杂合状态。ISSR的多态性低,绘制的遗传图谱饱和度低和标记间距离大等。
ISSR技术对研究蓖麻资源所能提供的DNA水平上的信息是有限的,因此应针对蓖麻生产中的突出问题,加强交流与合作,将分子标记与传统育种有机结合起来,开展RFLP、AFLP、EST和SNP等多种分子标记,将多种标记技术统一综合研究,筛选出多态性更高、稳定性更好的引物和探针,降低试验成本,解决分子标记研究与育种实践联系不密切等问题,从而加速蓖麻遗传改良的进程。
分子育种遗传 篇4
1 DNA分子标记技术概述
DNA分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的又一种较为理想的遗传标记。其本质上是指能反映生物个体或种群间基因组中存在差异的特异性DNA片段,直接检测DNA本身的序列变化,以蛋白质、核酸分子突变为基础,反映了包括DNA的编码区和非编码区、保守区和高变区、核DNA和细胞器DNA的遗传变异。10多年来,在人类基因组研究计划的推动下,分子标记的研究与应用得到了迅速发展。
DNA分子标记与其它遗传标记相比有以下优越性:①直接以DNA的形式表现,不受季节、环境等的限制,取材范围广泛,在发育的不同阶段,不同组织的DNA均可进行检验,不影响目的基因的表达,与不良性状无必然联系,使得对植株基因型的早期选择成为可能(毛健民等,2001)。②检测位点多,遍及整个基因组,多态性高。③许多分子标记表现为共显性,能够鉴别纯合基因型与杂合基因型,提供完整的遗传信息(徐崇志等,2006)。
常用的分子标记有RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR等。下面首先对这几种标记技术进行简要介绍。
1.1 限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)标记
RFLP标记是由美国学者Bostein等于1980年提出的一种最早的分子标记。其基本原理是利用限制性内切酶酶切不同生物个体的基因组DNA,得到大小不等的DNA 片段,经电泳分离,转移于支持膜上,与放射性核素或某些非放射性标记的探针进行Southern杂交,通过放射自显影或其它显色技术显示杂交结果,即获得反映个体特异性的RFLP图谱。RFLP是一种共显性标记,可区分纯合基因型和杂合基因型,结果稳定可靠,重复性好,适用于构建表达图谱、分析群体内和群体间遗传变异度及亲缘关系等(杨玉珍,2006)。但是RFLP对DNA多态性检出的灵敏性不高,需要大量的DNA,检测步骤较多,周期长、成本较高,尤其需要使用放射性同位素,影响了该技术的广泛应用。
1.2 随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD)标记
RAPD技术是由Willams和Welsh两个研究小组于1990年分别建立,以PCR技术为基础的一种遗传标记技术。其基本原理是以基因组DNA为模板,以随机排列碱基顺序的寡核苷酸序列(通常为10个碱基对)为引物,通过PCR扩增反应对所研究的基因组DNA片段进行体外扩增,扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳等分离,经溴化乙锭(EB)染色,于紫外灯下摄影来检测扩增DNA片段的多态性,扩增DNA片段的多态性反映了基因组DNA的多态性,从而根据对所产生的扩增DNA片段多态性的分析就可以进行遗传作图和品种鉴定。RAPD技术操作简便、快速,可免去RFLP中的克隆制备、同位素标记、Southern杂交等步骤;对DNA质量和数量的要求低,不需要克隆DNA探针,所用的引物的碱基序列是随机排列的,无需专门设计,也不受物种限制;检测灵敏方便,多态性强,但RAPD技术是显性标记,不能区分纯合子和杂合子,而且受反应条件影响较大,检测的重复性较差,因此在实验中要严格控制实验条件,才能得到可重复、理想的扩增效果。
1.3 扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism,AFLP)标记
AFLP是由Zabean和Ros于1992年发明的一项利用PCR技术检测DNA 多态性的技术,已获欧洲专利局的发明专利。其基本原理是将DNA用限制性内切酶酶切,然后连上一个接头(Adaptor),根据接头的核苷酸和酶切位点序列设计引物,即引物=接头+酶切位点+2～3个随机核苷酸,利用两个选择性引物进行特异性PCR扩增,扩增结果最终经过变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳显示。AFLP技术实际上是将RFLP和PCR相结合的一种技术。该技术既继承了RFLP的稳定性,又具有PCR反应快速、灵敏的特点,同时克服了RFLP和RAPD的缺点,且扩增的带纹多(50～100条),是多态性最丰富的一项技术。AFLP标记不足之处在于:得到的主要是显性(约占多态位点数的85%～96%)而非共显性标记,此外,扩增产物需要同位素检测,实验所用试剂盒为专利产品,成本较高,操作过程繁琐,实验周期较长,这都限制了该技术的使用(吕志华,2006)。
1.4 简单序列重复(Simple Sequence Repeat,SSR)标记
SSR又称微卫星DNA(micro-satellite DNA)标记,是指以几个核苷酸(一般为1～6个)为单位,多次串联重复的DNA序列。广泛分布于真核生物基因组中,大约每隔10～15kb就存在1个微卫星。SSR标记的基本原理是每个SSR的重复序列和重复单位数在不同基因型间差异很大,因而形成了每个位点上的多态性。SSR 两端有一段保守的DNA序列,可以通过设计一对与该保守序列互补的寡核苷酸引物,经PCR检测供试材料中SSR的多态性。SSR标记的优点在于:SSR在基因组中分布较均匀,信息量大,比RFLP和RAPD标记所检测的多态性频率高,重复性好且稳定可靠。对DNA质量要求不高,仅需微量即使是降解的DNA也能进行有效的分析,且为共显性标记,可以区分纯合基因型和杂合基因型。但是筛选重复序列和设计合成引物投入高、难度大,因而其开发受到限制,随着很多引物序列公开发表,这一限制因素在逐渐消除,SSR技术也因此将得以广泛的推广应用。
1.5 简单序列重复区间扩增多态性(Inter-Simple Sequence Repeats,ISSR)标记
ISSR 标记是由Zietkiewicz 等提出的一种标记技术,采用17～22碱基的重复锚定引物扩增重复序列之间的片段(蒋彩虹,2007),经检测后根据谱带的有无及相对位置来分析不同样品间ISSR 标记的多态性。ISSR标记是利用在植物基因组中经常出现的重复序列本身设计引物,无须预先克隆和测序,降低了开发费用,并且可以在不同物种间通用,不象SSR标记那样具有较强的种属特异性。与RAPD和RFLP相比,ISSR揭示的多态性较高,可获得几倍于RAPD的信息量,精确度可与RFLP相媲美。因而是一种非常有发展前途的DNA指纹技术。其不足之处在于:ISSR标记大多是显性标记,在解决交配系统、计算杂合度与父系分析等问题时效果不佳。
1.6 其他标记技术
除了以上介绍的5种常用分子标记技术,还有SNP标记、STS标记以及SCAR标记等。
SNP是动植物基因组中普遍存在的一种标记,是同一物种不同个体间染色体上遗传密码单个碱基的变化,被称之为第3代分子技术。基因组DNA序列的变异是物种遗传多样性的基础。较普遍的DNA序列变异是单个碱基的差异,包括单个碱基的缺失和插入,但更多的是单个碱基的置换,即单核苷酸多态性(SNP),这是等位基因间序列差异最为普遍的类型。检测SNP的最佳方法是DNA芯片技术,如果能将所有SNP全部信息载入DNA芯片,就可制造基因组扫描仪,用来扫描各个个体并分析它们在基因组成上的差异,从而将具有不同遗传组成的样品加以区分。
STS(序列标志位点)标记,引物的序列是特定的,对于任何一个能克隆测序的位点都可以设计特定的引物,进行扩增。因此RFLP标记、AFLP标记及RAPD标记又都可以通过测序转化为STS标记。
SCAR(Sequence characterized amplified region,又称特征序列扩增区)标记,是由RAPD技术派生出来的,是根据测定的RAPD克隆片段的末端序列,在RAPD引物的基础上加上14个碱基形成24个碱基的特定引物,以扩增特定区域。SCAR技术类似于STS技术。
2 DNA分子标记在沙棘遗传育种研究中的应用
2.1 遗传多样性及亲缘关系的研究
遗传多样性一般是指种内的差异水平,它反映着一个物种适应环境的能力及其被改造和利用的潜力。遗传多样性是生命系统的基本特征,高的遗传多样性是维持物种长期生存的基础。对沙棘遗传多样性进行分析,以揭示不同沙棘间的遗传关系,可为杂交育种过程中的亲本选择、子代测定以及优良树种的选育提供科学依据。
刘雨娜等(刘雨娜等,2007)以24个大果沙棘品种(Hippophae rhamnoides)为材料,利用RAPD方法进行沙棘的遗传多样性分析。从120个随机引物中筛选出多态性丰富的18 个引物用于扩增反应,在24个大果沙棘品种中检测到171个RAPD位点,其中多态性DNA 带112条,多态位点百分比为65.5%,表明大果沙棘品种具有丰富的遗传多样性,进行聚类分析可将供试的种质分为4 类。
Chengjiang Ruan等(Ruan C.J.等,2004)用RAPD分析了来自中国、俄罗斯、蒙古的14个品种的遗传关系,用9个引物对14个品种通过PCR扩增共产生了114个RAPD标记,其中多态性位点103个,百分率90.35%。各品种间遗传相似系数在0.45 ～0.80,平均值0.67。遗传距离在0.23 ～0.80,平均值0.40。利用UPGMA方法进行聚类分析,认为中国沙棘是一个非常独特的品种,甚至与来自中国的沙棘品种红果、中国优、辽阜2号遗传距离也较远,来自俄罗斯的、蒙古的7个沙棘品种品种和来自中国的辽阜1号等聚为两大类,作者依此对14个品种间亲缘关系进行了分析。因此,RAPD标记可以为品种资源的选择和管理以及沙棘杂交育种策略的确定提供科学的依据。
V.Bartish等(Bartish I.V.等,2000)用RAPD标记对沙棘(Hippophae rhamnoides)种内及种间的遗传多样性进行了研究。用9个引物进行RAPD扩增,共检测到219条多态性标记,发现了16个稳定的标记,这些标记中一部分用于分析种间的亲缘关系,另一部分可用于种的分类的标记。用聚类分析的树状图分析的结果与沙棘分类学的研究结果是一致的。在种间存在着丰富的遗传多样性。早期的研究发现,沙棘大部分的变异(59.6%)产生于亚种间,而种群内的基因可变性也是非常可观的,RAPD多态位点的百分率与林和莫奇种内多样性的估测表明许多高价值的种起源于中亚附近的一些种,其多样性与地理的相关性高。对一个种群每8个种进行分析时,没有发现遗传距离和地理的相关性。
V.Bartish等(Bartish I.V.等,1999)对10个海滨沙棘种群(Hippophae rhamnoides ssp.rhamnoides)和1个蒙古沙棘种群(Hippophae rhamnoides ssp.mongolica)进行RAPD标记变异分析,多态性标记大于89.7%,但是几乎没有稳定的,并且由于个体标记的频率差异,各种群间也因此有所差异。对156个多态性RAPD和63个多态性RAPD分析所得结果分别为0.192和0.159,后者能够达到3/N标准,对于一个远缘杂交品种而言,这个种内遗传多样性的结果是相对较低的。对海滨沙棘的分子变异分析结果为仅有15%的种间变异,这表明一个相对限制的种群间表现出的变异正如远缘杂交品种和另外几种分子变异分析研究中所应表现的那样。海滨沙棘各种群间区别较大,种内多样性较陆生沙棘少,这显示了种群分布对变异所带来的影响。通过裁减或者没有裁减3/N标准基础上RAPD位点的方法获得的各种群间的可能遗传距离,基本上是一致的。聚类分析和主坐标分析的结果表明,海滨沙棘各种群间的遗传距离很小,但却与蒙古沙棘样品种群相距甚远。海滨沙棘各种群间的遗传和地理距离没有相关性,这表明大范围的地理和生态型上的差异对RAPD分析并没有产生影响。
陈纹等(陈纹等,2007)应用12个随机引物对卧龙沙棘(H.rhamnoides L.ssp.wolongensis L i an , K. Sun et X. L . Chen)全部2居群共28个个体进行了RAPD分析。表明卧龙沙棘具有较丰富的遗传多样性,分布范围狭窄的卧龙沙棘在亚种水平的遗传多样性明显高于分布较广的中国沙棘。在居群水平上,卧龙沙棘同样具有很高的遗传多样性。
Chengjiang Ruan等(Ruan C.J.等,2005)用8对AFLP引物对15个在中国广泛种植的苏联、蒙古(H.rhamnoides ssp.mongolica)和中国沙棘(H.rhamnoides ssp.sinensis)品种进行分析,共检测到731个AFLP谱带,其中多态性谱带为645个,多态性位点的百分率为88%,各品种间遗传相似系数在0.29～0.78,平均值0.48。根据UPGMA树状图,在Jaccard系数0.47的水平上,将15个品种分为两大类。
孙燕琳等(孙燕琳等,2007)利用已报道的与沙棘同目不同科葡萄SSR引物筛选适用于沙棘(Hippophae rhamnoides)的SSR引物。结果表明,在供筛选的107对引物中,只有1对引物在沙棘中无扩增位点,有效扩增比率为99.07%;共有46对引物在中国沙棘和辽阜1号2个沙棘品种间表现明显多态性,扩增出了多态性位点,有效扩增比率为42.99%,扩增产物共表现出100个等位基因,其中差异等位基因数为70个,每对引物的等位基因数为1～4个,平均为2.174个。根据这46对引物的扩增结果,中国沙棘和辽阜1号间的遗传相似系数为0.413,遗传距离为0.587。这个结果与前人用RAPD、AFLP分子标记得出的研究结果相似。
Chunjie Tian等(Tian C.J.等,2004)用ISSR标记分析了分布在中国的15个沙棘(Hippophae rhamnoides L.)自然群落的遗传多样性,包括云南沙棘(Hippophae rhamnoides ssp.Yunnanensis)、中国沙棘(Hippophae rhamnoides ssp.sinensis)、江孜沙棘(Hippophae rhamnoides ssp.gyantsensis)3个亚种,共检测了300株。Shannon和Nei多样性指数估测各亚种群的遗传多样性结果表明,3个亚种的Nei遗传多样性指数的平均值分别为0.1944、0.2169和0.1372,差异不显著,说明亚种间遗传多样性指数的平均值之间没有差别。此外,7个云南沙棘亚种的基因分化系数(Gst)平均值为0.2790,7个中国沙棘的Gst 为0.4184,云南沙棘和中国沙棘亚种间的遗传变异分别占28%和42%,表明不同亚种的遗传结构不同。全部变异中14.5%来自亚种间,85.5%的变异来自亚种内,因此沙棘遗传变异主要存在于亚种内,但没有发现群落的遗传起源和地理距离之间有强相关性。所以建议在品种资源的收集保存中,对一个亚种内的个体保存要多于不同亚种群的保存。
Chunjie Tian等(Tian C.J.等,2004)用ISSR技术对来自中国东北和西北部的11个沙棘(Hippophae rhamnoides)自然群落进行了分析,了解其种群间及种群内遗传多样性,用了8个引物,共产生207个多态位点,在250～2500bp间,基因分化系数Gst是0.0679,种群内变异为93.21%,种群间为6.79%,表明这11个种群的分子遗传多样性主要存在于种群内,未发现遗传起源与地理距离的相关性。为进一步在种群水平上了解和保存沙棘的多样性提供了科学依据。
刘瑞香等(刘瑞香等,2007)采用ISSR标记,对中国沙棘(Hippophae rhamnoides Linn.ssp.sinensis Rousi)和俄罗斯沙棘(Hippophae rhamnoides Linn.ssp.turkest anica Rousi×Hippophae rhamnoides Linn.ssp.mongolica cv. Rousi)进行遗传多样性分析,结果显示,13 个随机引物共检测到96个位点,其中95个位点具有多态性;遗传多样性表现为俄罗斯沙棘雄株最高,其次为俄罗斯沙棘雌株,然后是中国沙棘雌株,最小的是中国沙棘雄株。从种间遗传关系来看,中国沙棘雌、雄株遗传上的亲缘关系近,俄罗斯沙棘雌、雄株的亲缘关系近,中国沙棘和外来种俄罗斯沙棘有一定的亲缘关系,但亲缘关系较远。
2.2 性别鉴定
DNA分子标记技术因其不受发育阶段、外界环境及组织特异性的影响,并能够提供多位点分析等优势,被广泛地应用于雌雄异株植物的早期性别鉴定研究中。
董莉娜等(董莉娜等,2007)应用RAPD技术筛选与棱果沙棘(Hippophae goniocarpa)性别相关的分子标记,对棱果沙棘雌雄株的基因组DNA进行混合分组分析(BSA),在194条随机引物中有50条引物能够在雌雄DNA反应池间形成多态性条带,应用这50条引物分别对棱果沙棘雌雄个体(雌雄个体各选取5个)进行RAPD分析,其中1个引物扩增得到一个约为1030bp的与雌性相关的RAPD标记。作者认为进一步利用该雌性特异位点设计出更加稳定的SCAR标记,可望用于棱果沙棘的早期性别的准确鉴别。
刘洪章等(刘洪章等,2006)共用13个引物对生长在同一生态条件下的中国沙棘、俄罗斯大果沙棘和蒙古大果沙棘品种雌雄株性别进行了RAPD 鉴定。结果表明,只用一个引物即可将三亚种沙棘中的任何一种雌雄株区分开,筛选出9个引物中的任何一个,均可将中国沙棘、俄罗斯沙棘和蒙古沙棘区分开,但不能同时区分开雌雄株。同时用2个引物,即可将3种沙棘及其雌雄株同时分开。经鉴定认为俄罗斯沙棘和蒙古沙棘在亲缘关系上较近。
Persson等(Persson H.A.等,1998)应用RAPD 技术和混合分组分析法(BSA),筛选与沙棘(Hippophae rhamnoides L.)性别相关的分子标记,对采自不同地区的沙棘杂交组合(‘Leikora’(雌性)בPollmix Ⅰ’(雄性)和‘Bhi10224’(雌性)ב2-24’(雄性))形成的F1代与亲本组成的雌雄反应池进行PCR扩增,筛选出78种引物,可以反映出雌雄反应池间的差异。
3 结论与展望
综上所述,近年来分子标记技术在沙棘遗传多样性和亲缘关系分析、品种鉴定、性别鉴定等研究中已得到很大发展。把沙棘的遗传多样性分析和性别鉴定等研究由宏观视角、形态水平推进到微观视角、分子水平,具有十分重要的积极意义。但与其他植物相比,仍然处于起步阶段。
(1)在沙棘遗传研究方面目前应用的分子标记种类较少,只有RAPD应用的较为普遍,ISSR、SSR和AFLP的虽有应用,但较少;
(2)在研究内容方面还很有限,诸如遗传图谱构建、基因定位、系谱分析、质量性状基因的分子标记、分子标记辅助选择育种等研究都较少甚至没有研究;
(3)沙棘的基因组研究与农作物相比还比较落后,且育种的周期长,许多共显性标记开发还比较困难。这些都严重影响了分子标记在沙棘遗传育种上的应用。
在今后的研究中,应加强以下几个方面的工作:
(1) 拓宽DNA分子标记在沙棘遗传育种研究上的应用种类和深度,继续推广应用RAPD技术的同时,加强ISSR、SSR和AFLP标记的应用,尝试将SNP、STS标记等技术应用于沙棘分子育种研究中;
(2)在加强常规杂交育种工作的基础上,构建高度饱和的遗传图谱;
(3)注重质量性状的研究,加强QTL作图;
(4)寻找与经济性状紧密连锁的分子标记,实现分子标记辅助选择育种;
(5)广泛注意分子标记在其它领域的应用动向,及时借鉴新的方法和技术,不断推动沙棘分子标记的发展,为沙棘新品种的定向选育、加速育种进程和提高选育效率提供新的技术手段。
玉米的遗传育种浅析 篇5
1 玉米育种技术在我国发展存在的问题
1.1 种质资源贫乏, 育种难度较大
在我国玉米培育技术的发展过程中, 大多数地区都是采用自交系间杂交种, 自由授粉已经基本不再使用, 来自地方品种的种质资源难有增加。这就说明我国种质资源贫乏, 育种难度不断加大, 虽然我国拥有大量的育种资源, 但在研究总缺乏充分的考虑, 在育种过程中可选择种质类型相对有限[4]。
1.2 基础理论研究较弱, 高新技术起步较晚
受到我国科研导向和科研投资的影响, 玉米遗传培育技术在应用中存在限制, 部分地区发展较弱, 尤其是经济落后地区的区域没有形成有效的育种技术发展机制。玉米遗传一种缺乏先进的技术支持;同时, 在我国玉米遗传育种技术应用中, 缺乏对高新技术的扶持政策, 玉米培育过于满足现状, 导致科研推动力较弱, 不能为玉米育种发展提供良好的支持。
1.3 培育中缺乏品质评估, 导致产量高品质差
在进行玉米品种的培育过程中, 单方面地追求产量, 缺乏对品质的考核, 导致品种培育缺乏品质性状的改良。在品种培育过程中, 不能根据产品价值选择相应的性状, 导致所开发的玉米品种不能满足市场多元化的需求[5];同时, 在玉米品种的选配中, 没有与市场形成配套体系, 导致所培育的玉米中不符合市场竞争要求。
1.4 玉米育种机制存在问题
在我国玉米培育中, 存在部分地区采用种子公司专营的模式, 导致地区内的育种受到垄断, 缺乏相应的监督, 不能提高育种技术的竞争性, 在发展中容易受到政策限制, 不能充分吸收先进技术, 阻碍先进育种技术的应用[6]。此外, 目前我国育种公司大部分采用承包地生产的模式, 导致育种过程中缺乏专业性, 不能彻底去雄。这就导致我国玉米育种整体能力不足, 技术水平偏低, 不能为玉米种植提供良好的培育支持。
2 玉米遗传育种及相关技术的应用分析
2.1 DNA指纹图谱
DNA指纹图谱能够进行绘制新品种指纹图谱, 并且发挥保护品种权的作用。该技术主要是借助品种DNA组成, 用可见的条码式谱带图谱进行检测。DNA指纹图谱能够利用新品种的基因型, 并保证DNA带谱的稳定性, 而避免受到栽培环境的限制, 且能够借助计算机管理[7]。玉米遗传育种技术中, 通过DNA指纹图谱就能够获取丰富的遗传信息, 保证遗传信息能够在玉米培育中起到标示作用, 且能够保证玉米品种的独特性, 对于优质玉米新品种, 可以借助DNA指纹图谱库进行辨别真伪, 分析该品种的质量, 在必要时可以进行司法鉴定, 保证品种开发者的权益。
2.2 基因系族分类方法
在进行评估玉米质量过程中, 根据亲本遗传真实性和玉米杂交种纯度就能够确定其品质。在玉米遗传培育中, 根据玉米的基因型进行判定, 按照系谱进行相应的分类, 确定玉米基因的关系亲疏, 获取遗传距离, 计算相应的系谱分析结果。因此, 玉米遗传培育中就能够按照基因系族分类的方案, 确定相应的培育方案, 从而推广相应的应用。
2.3 遗传图谱及寻找目标性状技术
遗传图谱能够在育种中起到选择分子的作用, SSR标记及检测技术就能够获取相应的检测结果, 在玉米培育中获得更高的多态性检测结果, 从而构建高密度的遗传图谱。其中, 遗传图谱能够以功能基因和数量性状位点进行连锁分析, 确定该功能基因和数量性状位点的位置。
2.4 转基因培育技术
转基因技术在当前的玉米育种中有着广泛的应用, 国外的转基因工程应用更为成熟, 且所应用的转基因方法越来越多。其中, 在玉米培育中容易实现的方法包括以下几点。
第一, 可以利用农杆菌的性特性进行介入。经研究, 有2种农杆菌可以应用到基因中。一种是根癌农杆菌, 另一种是发杆农杆菌, 这两种农杆菌均含有TI和RI质粒。其中, 在实际应用和研究中, TI质粒最为普遍。
第二, 基因枪介导转化法。这种方法的基本原理是将基因包在极其微小的金粒或者是钨粒中, 摄入到目标植株柱组织中, 表达出染色体性状, 达到转基因效果。玉米基因枪介导转化法就能够实现玉米的转基因过程, 从而实现遗传培育的作用, 且在该过程中无需重复培养原生质体, 受体材料、靶细胞来源广泛, 在实践中可推广性高。
3 结语
玉米遗传培育技术能够有效提高玉米的产量和质量, 为玉米作物种植提供保障。我国玉米遗传培育技术应面对当前存在的问题, 根据相关遗传培育技术的发展, 借助DNA指纹图谱技术、基因系族分类方法技术、遗传图谱及寻找目标性状技术、转基因培育技术等方法, 提高玉米遗传培育的能力, 为我国玉米种植技术的发展提供支持。
参考文献
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肉牛遗传育种技术探讨 篇6
1 地方牛品种的特点和改良的意义
我国的地方品种很多, 他们具有共同的特点: (1) 适应性很强、耐粗饲能力强, 饲养管理条件差, 仍然可以保持一定的生产性能。 (2) 生长速度相对缓慢, 体格偏小, 生产性能不专一, 多是综合利用。 (3) 遗传性能稳定。 (4) 选育程度较高的, 性状整齐, 生产性能突出;选育程度较低的品种, 群体类型不一, 性状不整齐, 生产性能偏中等。为了发挥地方品种的特色, 在保护现有地方资源的基础上, 对地方品种进行选育提高, 合理的加以利用, 成为育种工作的重点。
2 常规育种技术
一般来说, 幼年时期以系谱鉴定为主, 同时结合生长发育鉴定;成年以后以体质外貌和生长发育评定为主;当有了生产力以后要以生产性能的测定为主。只有通过全面和综合的鉴定, 才能提高育种的准确性和可靠性。
2.1 生产性能测定
肉牛的生产性能是指肉牛的产肉数量、质量以及在生产过程中利用饲料和设备的能力。育种的目的是提高肉牛的生产性能, 生产性能的测定是育种工作的基础。对生产性能的测定既要兼顾产品的数量、质量和生产效率, 还要考虑到肉牛一生的生产性能, 不能凭短时间的生产指标作出轻率的判断。同时还要在同等的条件下进行评比, 否则很难作出正确的判断。
2.2 体质外貌和个体线性体型评定
体质外貌和生产性能有一定的联系, 同时又是生长发育和品质特征的外在表现, 体质外貌是进行选种的重要依据之一。体质就是身体素质, 是指外部形态、生理机能和经济特性的综合表现。外貌是体质的具体表现, 同时又可以反应牛的机能状况, 如肉用牛体型呈长方形, 四肢短小, 臀部丰满多肉。体质外貌鉴定有两种方法:肉眼观察法和评分测定法。肉眼观察肉牛的体型结构、品种特征、精神表现以及有无明显的缺陷等;评分测定就是根据评分标准对肉牛定出等级。然后根据综合评定, 选出优秀的品种来育种。
2.3 系谱鉴定
通过分析各代祖先的生产性能、发育情况以及其他材料, 来估测种牛的近似种用价值。同时还可以了解它们之间的亲缘关系、以前选配工作中存在的问题, 为以后的选配提供依据。我国的肉牛品种多, 群体大, 饲养分散, 流动性也较大, 对系谱的记录不全面, 品种的选育和育种工作也相对落后。随着计算机技术的推广应用, 系谱记录逐渐完善、管理制度也健全起来, 为系谱鉴定提供了科学的依据。
2.4后裔测定
后裔测定主要是用于评价种公牛, 常用的方法就是同期同龄比较法, 根据各公牛后代的生产性能的平均值来判断被测种公牛的生产性能。后裔测定比较可靠, 但是需要的时间长, 投入的成本高, 同时后裔测定也受到很多因素的影响, 例如被测公牛所配母牛的差别、后代的饲养管理条件的差异、后代的数量等都会对测量结果产生影响。我国后裔测定的进展缓慢, 参与后裔测定的数量、规模、范围都较小, 有待提高, 进一步推进育种工作的进行。
2.5 杂交育种
杂交育种就是利用杂交的方法, 来进行选种、选配和培育, 来达到改良品种和创造新品种的目的。杂交的方式常采用二元或三元杂交育种, 就是以地方品种作为母本、引进品种作为父本来进行生产。我国目前有夏南牛、延黄牛和辽育白牛三个专门化的肉牛品种。杂交育种是一项技术性很强的工作, 要进行周密的组织、有健全的繁育体系, 各个养殖场 (原种场、繁育场、商品场) 通力合作, 相互配合才可以把工作做好。
3 育种新技术
随着育种技术的发展, 逐渐出现了一种新型的技术———分子育种技术, 是对传统育种技术的补充和发展, 它主要包括两方面的内容:基因组育种和转基因育种。分子育种是在DNA水平上对性状的基因型或者基因进行选择, 准确率高, 时间短。传统的育种方法要通过几代的选育才可以培育出优秀的品种, 时间长而且引入新的性状也比较困难, 分子育种克服了这些缺点, 而且高效、迅速, 将会成为育种的主流。肉牛分子育种主要集中在肉用性状上, 目前研究的功能基因已经超过40个, 提高了育种的速度。
摘要：随着养牛业的迅速发展, 肉牛的育种技术、繁殖技术也受到重视。本文根据多年的生产实践经验, 和大家共同探讨一下肉牛的育种和繁殖技术。
紫糯玉米遗传与育种探析 篇7
笔者于20世纪60～70年代开始从事糯、甜玉米育种工作[1],80年代进行生物技术方面的研究,近年来对紫糯玉米的遗传与育种进行了试验。现将紫糯玉米遗传与育种工作简述如下。
1 玉米籽粒色素的分布与遗传
玉米籽粒的色素,分布在果皮、糊粉层与胚乳淀粉三部分。果皮的色泽有多种,至少受3个复等位基因控制,又分布在不同染色体上,基本属2对基因遗传,果皮由子房壁形成,其色泽属母本基因型,不显花粉直感效应。糊粉层的颜色多种多样,较为复杂。早在20世纪20～30年代,细胞学家倾注了极大的精力,经过半个多世纪的研究表明,玉米糊粉层的紫色受9个控制花青素形成的基因主宰,即A、A2、B2、B22、C、C2、In、R与Pr,此外还涉及到有关等位基因。这9对基因中有7对互补。以后又指出紫色素形成主要受7对基因的主宰,涉及到显性基因与抑制基因[2]。据扬金水报导[3],玉米R基因位点呈现多态性,影响玉米不同器官花青素的形成,并发现大量等位基因(近100个)以及紧密连锁基因S和P。这都与籽粒颜色有关。墨西哥黑玉米rRNA的基因转录的调控区(NTS)含有10个亚重复序列,各由165～232个核苷酸组成,同源性92%～96%,显示出丰富多样性,基因转录调控区的差异,同时也反应了基因编码序列相当保守[3]。多项研究显示,紫色素的表达较为复杂,尚待探讨。胚乳淀粉层的颜色比较简单,受1对基因控制黄色胚乳与白色胚乳,黄色为显性。
由玉米籽粒颜色的分布与遗传可以看出,常规糯玉米育种着力在配合力,不会受到粒色的干扰。而从事紫糯玉米育种,除关注配合力外,籽粒颜色的显现将带来一些困扰。
2 紫糯玉米色素遗传与转座子
近代生物技术工作,研究了转座子的一些遗传效应,给紫玉米育种又增添了难度。早在20世纪40年代,发现玉米籽粒的花斑纹变异是由不稳定因素引起,也就是讲糊粉层的紫色时有时无,或者红色的斑点在杂种后代可以存在,也可以消失,即花斑变异不稳定。麦克林托克[4]进行细胞学观察,发现花斑的突变与染色体断裂有关。以解离与活化的论点来解释,认为基因可以由一个位点跳到另一个位点称跳跃基因。60年代在大肠杆菌中发现有类似的现象,此后在果蝇、酵母中也发现类同的事例。80年代已探明了玉米糊粉层的花斑色突变,就是转座子控制的[5],并确认麦氏当年的解释是正确,所以他在1983年获得诺贝尔奖。
转座子位于染色体上,现已探明是可跳跃的DNA片段。当从一个位点跳入另一位置而插入某一功能基因时,引起该基因失活,而诱导出突变类型。如果转座子再次发生转座效应或切离该位点,则失去活性的基因又能复活。这样,通过遗传学研究,则可断定转座子引起的突变。玉米是转座子起始研究的材料,应用较多的是Ac/Ds、Spm/dspm转座子[6]。1978年,正值转座子Ac/Ds、Spm/dspm研究热潮,依阿华大学科学家Robertson[7]报导了Mutator转座子的发现及其遗传特点,引起了世界范围内从事转座子研究者的关注。笔者听到斯坦大学Walbot研究组人员的报告,知悉Mu转座子有关属性与作用。近年看到麦克林托克所在冷泉港、先锋种子公司等研究组的报导。Mu转座子经历20多年的研究,进展快速,成果卓著,Mu转座子已视为玉米的种质,具有独特性能的一种随机诱变剂,应用于种质创新。紫糯玉米育种将能获得紫色素稳定的性状,斯坦福大学Walbot研究小组利用转座子标签法,已分离与合成紫色素的bronze Z,预示着借助转座子诱变育种的日程即将来临。同时,随着基因克隆技术的进步,用转座子追踪(标签)(transposon tagging)方法,可改进自主转座子本身频率低、变异类型不稳定等缺陷。目前还可采用第2代转座子即非自主转座子追踪法(双转座子追踪法),以Ac/Ds作探针,筛选突变株染色体的基因库,从而选得突变的有关基因[8]。该项技术的兴起,是90年代以来转基因方法的长足进步,为获得生物突变型开拓了新途径,为创造优质、高产、抗性强的转基因玉米品种奠定基础。
3 市场需求与紫糯玉米的遗传
黑色稻米问世之初,人们渴望吃黑米以养生长寿,可惜为时不长,黑色稻米就逐步淡出市场。同理,紫糯玉米的胚乳并非黑色,不易加工成全黑色的糯玉米粉,原因在于胚乳是白色的,所以从事紫玉米粉的育种工作难以开展。从目前研究来看,诸多紫玉米1代种,皆难加工成黑色糯玉米粉,是满足市场的需求难以逾越的障碍。
有一种误解,认为育成的糯玉米的糯性品质不高,可以通过转基因的方法把wx基因转进去,以增强糯性。虽然糯性基因wx可主宰糯性,通过转基因,可以增加支链淀粉的含量,但也带来对产量及其他性状的影响。生物技术是一项较高层次的研究,一般育种单位难以承担,更有人认为wx基因可以对色素遗传产生影响,这是个误解,不再赘述。
4 紫糯玉米育种方法
回交育种一般用地方品种紫玉米(杂合体)为非轮回亲本,白糯玉米为轮回亲本,回交过程见图1。
在这样方式下对非轮回亲本选系,得到紫糯的自交系。这些紫粒自交系尚无法应用于生产,同时其紫粒的遗传性状不稳定,仍可在自交后代中出现紫色深浅、白粒、黄粒等系(见图2)。因此,还要对这些系进行改造。再从这个群体中挑选性状优良的有紫色系。就类型来看可以获得糊粉层多基因控制的紫糯玉米;若受到转座子的遗传效应,则难以得到。另外这些类型是紫色的糯玉米自交系,血缘亲近无法利用;还要另选性状优良的若干白糯玉米作轮回亲本,再行回交育种。由此看出,此育种方式不仅费时、费工、费钱,同时还受到转座子的效应,若做不好,可使多年工作受阻。但是,若选用群体较大,且工作精心,还是可以育成紫糯玉米的。
注:1为全紫色;2、3、4为紫、白粒相间,紫粒颜色深浅有异;5、6为黄白与紫粒相间,黄粒有花斑。
此外,采用二环系的方法选育紫糯玉米自交系,也是一种有效途径,应用轮回选择的方法先进行原始群体的改良,再进行选系。但代价较大,难以为育种者所接受。其他育种方法如转座子诱导法,是直接利用随机诱变剂紫粒转座子的原始材料自交选系。笔者曾在转座子的材料中选得性状优良的深紫色籽粒单株,通过二环系选择,获得配合力高的优系。组配的单交种已通过省级审定。此方法比回交育种过程简化很多。
在紫糯玉米的制种和青穗上市上也存在不少问题。如紫色受转座子的影响,出现花斑色,一旦隔离条件受到影响,粒色的变异是难以控制的。
5 花糯玉米形成的原因
鲜食嫩穗白色、紫色青玉米上市时节,市场上总有为数不少的花糯青穗(红色、淡红色、淡紫色、棕色与白色相间以及各色斑点的鲜嫩籽粒)上市(见图3),该品种属上乘,品级采取及时,口味尚佳,但外观稍差,影响了销量。为客观地说明花糯玉米形成的原因,笔者设计一个简单的试验,即在紫糯玉米鲜嫩幼穗发育不同时间,分期分批套袋授粉,观察其青穗发育过程颜色的显现过程。由图4可知,授粉后2周,嫩穗的颜色基本呈白色带微紫;授粉后第19天,嫩穗微呈淡紫带白色;授粉3周以后,嫩穗(可食用初期)紫色略显;到嫩穗可食用期(授粉后25d),颜色呈现紫色依然不深;至成熟期,紫穗才显露。即紫糯玉米紫色的显现与青穗发育时间密切关联,一般在鲜嫩可食佳期紫色不能充分显露,也就是市场称谓的花糯玉米。这个试验仅从表型说出其形成的原因,而真正的原因是玉米紫色素基因、转座子与环境三者共同作用形成的。
6 结语
瞻望特需商品紫糯玉米市场,前景乐观。清新产品有待开发,诸如紫糯玉米速冻青穗;速冻籽粒(小包装);罐装玉米粒、玉米糊;紫糯玉米粉加工产物;玉米羹;添加小麦糯性粉(WWS)制品[9]以及特殊营养型各类奶制产品等。充满财源的紫糯玉米的开拓,等待着育种工作者和市场开发商;期望开拓者们运用潜默知识,策划新意,钻研缺口,创造出新的杂交种。
注:1、2为成熟穗,紫色;3为授粉后25d,紫色不深;4为授粉后21d,略显紫色;5为授粉后19d,紫白色;6为授粉后16d,淡紫白色;7:授粉后14d,白紫色。
参考文献
[1]秦泰辰,邓德祥.作物育种学各论——玉米育种(全国高等农业院校教材)[M].北京:中国农业出版社,1997.
[2]SRB A M,Owen R D.General Genetics 2nded[M].San Fancisco,1956.
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[5]SPRAGUE G F.Corn and corn Improvement[M],Amer.Soci.of Agro,Inc.,Publisher Madison,Wisconsin,USA,1986.
[6]GEISER M,WECK E,DORING HP,et al.Genomic clones of a wild-type allele and a transposable etement-induced mutant allele of sucrosesynthase gene of zea mays L[J].EMBO.1982,1(11):1455-1460.
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[8]TAKESHI I,TOHRU O,TOSHITSUGU N,et al.Jansposon Taggingin rice[J].Plant Molecular Biology,1997(35):219-229.