紫外线诱变育种

紫外线诱变育种（精选9篇）

紫外线诱变育种 篇1

摘要：目的:筛选水产品加工用蛋白酶产生菌,为酶的的分子改造和水产品加工提供材料基础。方法:通过在富含水产品蛋白的场所的针对性采样,菌落平板筛选结合发酵上清液平板验证以及Folin-酚试剂定量检测确认筛选结果,并通过紫外诱变提高产中性蛋白酶菌株的产酶能力。结果:从12份土样中分离187株具有明显蛋白酶活性的单菌落。在挑取的11株透明圈明显的蛋白酶产生菌中,菌株W9在所有菌株中可以稳定产生较高的蛋白酶酶活力,约为1 594U/ml。通过对其进行紫外诱变后,在突变株中筛选得到一株酶活约为1 845U/ml的W9UV突变株,比野生菌株酶活提高了15.6%。结论:突变菌株W9UV可稳定产生较高的蛋白酶酶活力,发酵性能优良。

关键词：筛选,蛋白加工,中性蛋白酶,酶活,紫外诱变

蛋白酶是重要的水解酶类,也是目前工业化运用最成功,产量最大的一类酶,占酶制剂市场的65%以上[1],其种类繁多,广泛存在于动物内脏、植物茎叶果实以及环境微生物中[2]。近年来,蛋白酶开始显现出其在水产品加工过程中的作用,由于水产品蛋白酶解产物具有较高的营养价值和功能特性,含有丰富的生物活性肽、氨基酸以及牛磺酸和高度不饱和脂肪酸等保健成分,被广泛应用于饲料、食品、化工、医药等各个领域[3]。国内已有报道利用蛋白酶对水产品及其加工过程中产生的下脚料进行水解来生产高附加值的产品,如利用蛋白酶水解生产生物活性肽、鱼露、鱼鳔胶等[4]。

近年来,欧美、日本等发达国家非常注重用于食品蛋白加工用蛋白酶制剂的研发,如Novozymes公司就专门开发出酶解产物具有较低苦味值和较高风味的食品蛋白加工用风味蛋白酶(Flavour ZymeTM)[5,6];而日本天野制药推出的肽酶R、中酸性米曲美蛋白酶M和新日本化学推出的肽酶Sumizyme FP则专门适应于生产无苦味蛋白质水解物。国内目前在食品蛋白加工用蛋白酶制剂的研究开发方面与国外仍有较大差距。中性蛋白酶作用底物广泛,对Gly、Arg、Lys、Phe等氨基酸形成的多种肽链有断裂作用,并且由于其反应条件温和,加工废水不会对环境造成酸碱污染,是目前用于各种蛋白质水解处理的重要蛋白酶种[7]。本实验首先从福建省各种富含水产品蛋白的环境和土壤中筛选中性蛋白酶产生菌株,在此基础上,通过复筛确定产酶能力较强的活性菌株,并进一步通过紫外诱变提高其产酶的能力,以期获得较好的水产品加工用蛋白酶产生菌株,为将来的分子改造提高酶活性和水产品加工提供材料基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

样品采集于福建省不同地区富含蛋白质的环境,如水产品加工厂、鱼类加工厂及加工下脚料堆积场所[8]。

1.1.2 试剂

干酪素、矿物油及各种化学试剂均为国产分析纯或化学纯。

1.1.3 仪器

冷冻台式高速离心机(贝克曼,美国);Ultrospec 2100 pro UV/visible Spectrophotometer(美国通用电气);ZHWY-2122B双层全控温摇床(上海智诚分析仪器有限公司);光学显微镜(Leica DM500)等。

1.1.4 培养基

斜面牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏0.3%,蛋白胨1%,Na Cl 1%,p H值7.0,琼脂粉1.5%。

酪蛋白分离筛选培养基:酪素0.5%,牛肉膏0.3%,蛋白胨1%,Na Cl 1%,p H 7.0~7.5,琼脂粉1.5%。

液体培养基:酪素0.5%,牛肉膏0.3%,蛋白胨11%,Na Cl 1%,p H 7.0~7.5。

酪蛋白琼脂平板:酪素2%,琼脂粉2%,p H7.0~7.5。

1.2 方法

1.2.1 产酶菌株的分离

每份样品取土样5g加入到装有45ml无菌水的三角瓶(6~8颗玻璃珠)中,37℃震荡培养15min。土壤样品混合液进行梯度稀释,得到10-1~10-8稀释度的稀释液。分别取1m L涂布于分离培养基平板上,37℃恒温培养16~24h。挑取具有蛋白水解圈的菌落于另一个平板上划线纯化,经斜面培养后于4℃冰箱中保存。

1.2.2 产酶菌株的筛选

1.2.2.1 平板透明圈初筛与确认[9]

将分离得到的菌株分别在两个酪蛋白分离筛选培养基上平行划线,37℃培养16~24h。在其中一个平板上加上适量的0.1mol/L TCA溶液,根据蛋白水解圈直径的大小初步确定不同菌株降解蛋白质的能力,选择水解圈直径较大的菌落,挑取另一平板对应位置的的菌落经斜面培养后于4℃冰箱中重新保种,作为进一步复筛的出发菌株。

1.2.2.2 液体发酵复筛[10]

用接种环挑取初筛得到的菌接种至5m L液体发酵培养基中,37℃、230r/min条件下振荡培养40 h,5 000r/min离心30min,取上清液,用酪蛋白水琼脂平板进一步确定不同菌株降解蛋白质能力大小,筛选出产酶活力最好的菌株。

1.2.3 产蛋白酶菌株的发酵实验[11]

将出发菌株和突变株分别接种至5ml的牛肉膏蛋白胨培养基中,37℃、230r/min过夜摇12~16h,按5%接种量接种至50ml的液体发酵培养基中,每株接3瓶,每隔4h取样,3次重复测定所产蛋白酶活力,计算蛋白酶产生菌的菌体生长量和酶活力。酶活数据为3次重复实验的均值,并采用Sigma Stat2.03软件进行数据统计和分析,进行差异显著性分析。

1.2.4 蛋白酶产生菌株的紫外诱变

1.2.4.1 诱变菌悬液的制备

将诱变出发菌接入液体发酵培养基,37℃、220r/min振荡培养过夜后,离心,弃上清,加入无菌生理盐水,重新振荡悬浮菌体,再离心,弃上清,重复上述步骤加入。最后加入5ml生理盐水恢复成菌悬液,用血球计数板在显微镜下直接计数,逐步添加生理盐水调整细胞浓度为108/m L。取诱变前的0.5ml菌悬液进行10-1~10-7稀释分离,取10-5、10-6、10-7三个稀释度,每一梯度取100μl菌液涂布平板,37℃倒置培养24h,进行平板菌落计数ml。

1.2.4.2 紫外诱变

将每5ml菌悬液置于9cm的无菌培养皿中,将待处理的培养皿置于诱变箱内,培养皿距离20W紫外灯的距离为30cm左右,轻轻摇匀后打开皿盖,分别处理1min、3min、5min,照射完毕后先盖上皿盖,再关闭紫外灯;取0.5ml处理后的菌液进行10-1~10-5梯度稀释分离,取其中的10-3、10-4、10-5三个稀释度各取100μl菌液涂布平板,用黑色包装袋包好37℃倒置培养(避光培养)。诱变过程在暗室红灯下进行。当长至合适大小时,进行平板菌落计数m2,计算致死率。

观察菌落水解圈大小,挑取水解圈较大的单克隆在平板上划线,放入37℃培养8~10h取出,4℃冰箱保存。

1.2.5 蛋白酶活性的测定

1.2.5.1 平板定性检测

将发酵上清液点于2%酪蛋白平板上,放入37°水浴锅温浴一段时间,观察透明圈大小。在复筛与活性确认过程中,可以在平板上加入0.1mol/L TCA突出水解圈效果。

1.2.5.2 Folin-酚试剂定量检测[12]

标准曲线制备:以酪氨酸为反应底物,配制不同浓度的酪氨酸溶液(10μg/ml~80μg/ml),采用福林酚法定量检测680nm的吸光值,并以蒸馏水作为对照。以酪氨酸溶液作为横坐标,680nm的吸光值作为纵坐标绘制标准标准曲线和回归方程。

蛋白酶活性的检测:采用改良的Folin酚试剂显色法测定酶活力。

酶活力单位(U)定义为37℃下,1min水解Casein蛋白底物产生1mg酪氨酸的酶量为一个酶活力单位。

2 结果与分析

2.1 产蛋白酶菌株的筛选

从12份土样中,一共分离挑取187株具有明显蛋白酶活性的单菌落,通过对比水解圈大小,观察菌落形态和颜色,初筛,确认得到11株透明圈明显的蛋白酶产生菌,依次编号为W1~W11(见图1、2)。进一步复筛结果显示,W5、W7、W8、W9、W10酶活性较高并且稳定。

2.2 产蛋白酶菌株的发酵实验

经过初筛,确认得到11株透明圈明显的蛋白酶产生菌,复筛结果显示W5、W7、W8、W9、W10酶活性较高并且稳定,其中W9酶活较高且多次发酵实验证明产酶能力稳定。发酵结果如图3所示。

2.3 蛋白酶产生菌W9的酶活和生长曲线

图4为筛选得到的具有产蛋白酶能力的的野生菌株W9酶活曲线和生长曲线。由发酵过程曲线可知,W9在0~3 h处于短暂的延迟期,菌体细胞进入分裂繁殖前期,菌体量很少,蛋白酶活力几乎没有产生;3~28h处于对数生长期,菌体细胞迅速分裂繁殖,菌体积累量急剧增加。蛋白酶的产生急剧上升;28~40h处于稳定期,菌体细胞分裂繁殖保持相对稳定,菌体和蛋白酶的积累均达到最高,菌体OD600达到3.4±0168,蛋白酶活力达到1 594.346±32.54(U/ml);从40h开始,W9进入衰亡期,菌体细胞裂解自溶菌体量递减,但蛋白酶活力稳定在1 400(U/ml)左右。

2.4 蛋白酶产生菌W9的紫外诱变育种

选取10-3、10-4、10-5三个稀释度各取100μl菌液涂布平板,与对照组同时计数,实验结果表明随着紫外照射时间的延长,菌株W9的平均致死率提高,在5min时候致死率达91.07%,而1min时致死率为56.55%,3min时的致死率为80.20%。已有的报道表明低剂量处理能提高菌的正突变率,负突变率一般出现在较高的剂量中。我们在实验过程中分别采取1min、3min、5min对不同的出发菌株进行诱变。

挑取诱变后酪蛋白平板上具有明显透明圈的突变菌株,进行酶活测定,并与野生菌株进行酶活比较,最终在W9经诱变后产生的具有明显透明圈的菌株中筛选得到了1株比野生菌株酶活具有明显提高的突变株。由酶活过程曲线(图6)可知,突变菌相比野生菌来说,酶活有所提高,在前30h酶活提高得较多,30h过后,酶活提高平稳,28h突变菌酶活达到最高,相比野生菌的1 594.346(U/ml)提高至1 845.33(U/ml),提高了15.6%。

3 讨论

国内外已经有很多关于蛋白酶产生菌株筛选的报道,但是筛选专门应用于水产品加工用蛋白酶生产菌株的工作并不多。目前用于水产品加工的蛋白酶除了Flavour ZymeTM等少数几个品种外,大多并不是专门用于食品加工过程,如Alcalase主要是用于洗涤剂和皮革加工工业。因此尽管这些酶具有很高的降解效率,但它们的使用也存在不少问题,如水解产物苦味重、废水处理污染以及加工过程中受到原料的抑制等[3],而一些植物蛋白酶由于其来源少,效率低,不适合工业化生产[13]。

筛选实验中,我们有目的的采集不同地区富含蛋白质的环境,如水产品加工厂、鱼类加工厂及加工下脚料堆积场所中的样品,使得筛选得到的蛋白酶及其产生菌株对水产品蛋白原料具有更好的适应性。在对样品观察中发现腐烂的蛋白加工下脚料中并没有明显的真菌菌落,初步镜检也发现主要是细菌,因此我们的筛选是以细菌为主。另外,我们发现筛选中虽然在酪蛋白平板上可以大致比较透明圈的大小,但通过后续的Folin-酚试剂定量检测方法发现透明圈大小与酶活力并不呈现正比关系,原因可能是水解透明圈易受到多种因子的影响,如盐分等。因此我们在筛选过程中通过反复回复验证,菌落平板筛选结合发酵上清液平板验证以及Folin-酚试剂定量检测来确认筛选结果。进一步扩大筛选范围,以及对一些有潜力的菌株不断地育种可以帮助我们得到所需产酶菌株,也为下一步有针对性的通过基因工程和分子改造方法得到理想的水产品加工用蛋白酶提供丰富的材料基础。

紫外线诱变育种 篇2

【教材分析】

本节是在学习生物遗传变异的基础知识、了解遗传变异基本规律的基础上，进一步引导学生认识遗传学的知识是怎样用于指导生产实践、提高和改善生产技术，最大限度地满足人类不断增长的物质需要的。本节内容与遗传的物质基础、遗传的基本规律以及生物的可遗传变异等知识密切相关，是遗传和变异的基本原理在生产实践中的应用。通过本节学习不仅使学生学会怎样将遗传变异的有关知识应用于生产实践，而且通过该内容的分析学习，可以训练学生各方面能力。【教学目标】 ㈠ 知识方面

1.简述杂交育种和诱变育种的概念，举例说明杂交育种和诱变育种方法的优点和不足 2.举例说明杂交育种和诱变育种在生产实践中的应用。3.讨论遗传和变异规律在生产实践中的应用 ㈡能力方面

通过对杂交育种和诱变育种的实例的分析和比较，提高运用遗传和变异规律解决生产、生活中的问题的能力。㈢情感态度和价值观

1.讨论育种科学技术发展是科学、技术与社会相互作用

2.体会科学技术在发展社会生产力、推动社会进步等方面的巨大作用 3.通过对我国杂交育种和诱变育种成果的了解，关注我国的育种技术的发展及在国际的竞争能力，认同育种技术的改进对解决粮食危机等问题的重要性。【教学重点】

遗传和变异规律在改良农作物和培育家畜品种等方面的应用 【教学难点】

杂交育种和诱变育种的优点和局限性 【教学方法】：谈话法、讨论法、引导分析法 【教学用具】：教师课件 【课时安排】：1课时 【教学过程】

问题情境导入：出示各种育种图片，导入复习课育种方法。教授袁隆平的超级水稻就是用杂交育种交育种方式选育的，导出杂交育种。

一、杂交育种 问题探讨：

小麦有高杆和矮杆，由D控制的高秆对由d控制的矮杆为线型。我们知道矮杆的小麦抗倒伏，是我们需要的形状。小麦经常受到一种真菌的感染出现锈病。由T控制的抗锈病对由d控制的感锈病为显性。抗锈病是我们需要优良性状。现在高杆抗锈病和矮杆不抗锈病的两纯系品种。你用什么方法能把两个品种的优良性状结合在一起，又能把双方的缺点都去掉？我们肯定要获得的是能够稳定遗传的矮杆抗病品种。将你的设想在草稿纸上用遗传图解表示出来。然后我们请同学把他的设想给我们介绍一下。

以下是杂交的育种参考方案：杂交Ｐ自交Ｆ１选优Ｆ２高抗自交选优高抗DDTT矮不抗ddtt思考：要培育出一个能稳定遗传的植物品种至少要几年？高抗DdTt高不抗矮抗矮不抗ddTTddTt矮抗ddTt矮抗ddTT矮抗矮不抗ddTTddTtF3矮抗ddTT 子二代出现了我们所需要的矮杆抗病，它们都是可以稳定遗传的吗？要想获得能稳定遗传的矮杆抗病品种，接下来还要怎么做？

我们选择出子二代中的矮杆抗病植株自交。得到的子三代情况是怎样的？ 经过多次自交、选育、自交、选育。我们可以获得大量矮杆抗病純合子。学生回答后展示遗传图解。

问：子二代中矮杆抗病占全部子二代个体比率是多少？ 问：子二代的矮杆抗病中杂合子占多大比例？ 刚才大家设计的育种方法就是杂交育种。

出示选择隐性纯合子的杂交育种方式，并且提问是否需要自交选择纯合子？

讲授超级水稻育种是选择杂合子，原理是杂种优势。不需要获得稳定遗传的纯合子。总结杂交育种的概念、方法、原理、有点、缺点。1.概念：

杂交育种是将两个或多个品种的优良性状通过交配集中在一起，再经过选择和培育，获得新品种的方法。杂交育种是改良农作物品质，提高农作物产量的常规方法。2.原理：

（基因重组）3.方法：

通过刚才的例子我们可以总结出杂交育种的过程是怎样的？ 杂交——自交——选育——自交——选育——自交（测交）杂交育种要培育出一个能稳定遗传的植物品种至少要几年？ 4.优点：

杂交育种可将不同品种的优良性状集中在同一生物体上。5.不足：

但是在实际操作中会遇到不少困难，请从杂交育种后代可能出现的类型，以及育种时间等方面分析杂交育种的不足。

杂交后代会出现性状分离现象，育种进程缓慢，过程复杂。有没有缩短育种年限的方法导出单倍体育种

简单说明单倍体育种的做法。出示单倍体育种的具体过程，提问各个阶段的方法步骤。方法、原理、优点、缺点

二、单倍体育种 1.原理：染色体变异

2.方法：花药离体培养

秋水仙素处理 3.优点：明显缩短育种年限 4.缺点：

染色体数目可以成倍减少，也可以成倍增加，导出多倍体育种。出示无籽西瓜的动画，分析各个过程，并且提出：无籽西瓜为什么没有种子？一粒也没有吗？无籽西瓜性状能向下传递吗？属于可遗传变异吗？总结多倍体育种的原理、方法、优点、缺点

三、多倍体育种 1.原理：染色体变异

2.方法：秋水仙素处理萌发的种子或幼苗

3.优点：器官较大，提高产量和营养成分，抗逆性强，抗病性强 4.缺点：发育迟缓、结实率低。

出示一道习题，提问答案。根据习题导出单倍体育种、多倍体育种、杂交育种都需要杂交手段，杂交原理基因重组，只是使控制不同性状的基因重新组合，并没有创造新基因，有没有能创造新基因的育种方法？导出诱变育种。

四、诱变育种

创设情境：出示太空育种的图片，提问 * 诱变育种的原理是什么？

* 太空育种为什么选择正在萌发的种子？

* 太空中诱发基因突变的条件有哪些？

* 诱变育种有哪些优点？

* 诱变处理后能否一定得到优良变异品种?

* 有哪些因素可以诱导生物产生基因突变？ 提示学生总结诱变育种的的概念、优点、缺点。1.概念：

利用物理因素如X射线、紫外线、激光等或化学因素（亚硝酸、硫酸二乙酯等）处理生物，使生物发生基因突变的育种方法。2.原理：基因突变

3.方法：物理方法(紫外线、α射线、失重等)或化学方法(亚硝酸、硫酸二乙酯等)处理生物 4.优点：提高突变频率，加速育种进程。创造新基因，产生新性状。5.缺点：有利变异少，需大量处理生物实验材

为了检验大家这节课学习的情况，我们来看几道练习题。

教学反思：

1． 对课程资源的充分发掘

课程资源既包括图片，动画，教材内容，也包括学生已有的知识和经验、家长的支持态度和能力等无形的资源。

本课从知识角度讲并无太多新的内容，而能力训练和情感态度价值观的形成又必须让学生自愿、自主的形成，这并非是一节课可以全部达成的。

为学生呈现这样的资源是考虑到了教学对象大多数生活在芳村，有几个学生的家中庭院里甚至还种有嫁接的花地杨桃。学生对此有着及其浓厚的兴趣，甚至在课后还激发了他们利用家中植物动手尝试的兴趣，还有学生要求下学期开设花地杨桃的研究性学习课。

笔者认为本课的课程资源的发掘是较为成功的，为能力目标和情感目标的达成奠定了良好的基础，并且自然的使学习延伸到课外。

2．对学习任务难度的恰当把握

关于各种育种方式要求学生自己说过具体方法，原理，引导学生对已有知识的复习回顾。

要求学生自己写出遗传图解。3．对教学效果评价估计不足

花椒化学诱变育种初探 篇3

目前, 国内花椒育种均采用选择 ( 优选) 育种方法。耀德等人通过10 年时间, 选育出了短枝型、早熟、采摘容易、优质、丰产性显著、抗逆性强、适生范围广、遗传性状稳定的优良品种———“秦安一号”。吴宗兴等人利用选择育种方法, 选育出了适应阿坝州立地条件的花椒品种———六月椒 ( 大红袍) , 该品种具有异花授粉的作用, 现存椒树具有分布广、寿命长、变异丰富、选择潜力大等特点。原双进等人在对韩城大红袍产量、品质等进行调查的基础上, 通过选优对比试验, 选育出了狮子头、无刺椒及南强1 号等优良品种, 这些品种具有丰产性能好、品质优、易采摘 ( 无刺或错开集中成熟期) 等优良特性。但由于花椒为单性结实, 属于无融合生殖, 不易进行杂交育种。在自然状态下的优选育种方法, 选育的时间太长, 且没有目的性, 育种效果不佳。

2 国外研究现状

花椒属植物在全球约250 种, 我国有39 个品种、14 个变种。花椒原产我国, 亚洲的许多国家先后引种栽培, 目前在日本、韩国、朝鲜、印度、马来西亚、尼泊尔、菲律宾等国均有分布, 其中以日本和韩国的栽培面积较大, 加工技术较领先。

2. 1 日本花椒研究

日本花椒有许多品种, 除栽培面积最大的朝仓花椒, 还有琉锦花椒、冬花椒、葡萄山椒、稻花椒、无刺花椒等。日本花椒各品种都具不同的优点, 如日本无刺花椒种子的含油量在25% ~ 30% , 椒油经处理后既可食用, 又可做为工业用油; 在日本餐厅或家庭中, 花椒作为一种具丰富营养价值的高档蔬菜, 其消费量极大。花椒加工产品形式包括干花椒果皮和鲜花椒果两种, 且鲜果在日本占有一定的市场。但由于花椒也具较高药用价值, 所以日本主要利用花椒这一特殊价值。目前, 日本将花椒作为一种调味料和药用植物进行研究开发, 研究主要涉及苗木繁殖、优良品系的选择、田间管理、产品开发应用等。日本医药株式会社等各医药教学与科研机构, 投入很大精力对花椒开展攻关研究, 发现花椒具有降低血压的功效。

在日本, 花椒繁殖以嫁接为主, 一般认为实生苗多为雄株, 有刺, 果实小, 且着生方式散, 产量低。由于冬花椒、稻花椒具有根系深、抗病、抗干旱能力强等特点, 所以嫁接多以冬花椒、稻花椒作砧木。嫁接采用劈接法, 最佳嫁接时间为3 月中旬至4 月初。接穗要求有2 ~ 3 个饱满芽, 长度5 ~ 7cm, 嫁接时将砧木地上10cm以上部分截断, 嫁接后至成活前, 最好进行覆盖, 这样当年嫁接苗高可长到60 ~ 100cm。

在育种技术方面, 日本研究者通过研究探明, 利用茎尖培养与人工选择相结合的方法, 将成为选育富含芳香物的花椒品系的有效途径。利用这种综合方法的优点是: 通过茎尖培养朝仓花椒所得的后代, 不仅可保持原本芳香物的生产力, 而且部分品种经多次继代培养后, 内含的芳香物呈逐步增加趋势, 花椒的经济价值得以显著提高。

2. 2韩国花椒研究

在韩国, 与世界各地相似, 花椒一直作为食用和药用植物在全国范围广泛使用。在科研方面, 韩国林木遗传研究所已选出13 株优树, 并建立优树无性系测定林。这13 株优树具多果穗、果粒大、无刺的优良性状。全部优株经济性状均优于对照1. 5 ~2 倍。

国外这些育种方法虽然在一定程度上使花椒产量、品质得到提升, 但都属于常规选择育种方法, 具有相当大的局限性。

2. 3 创新技术探讨

总结历史经验和国内外育种技术的情况, 花椒育种研究需要采用新的方法和途径, 即诱变育种。

化学诱变育种是利用化学诱变剂人工诱发植物发生变异, 在分离后代中对突变体进行选择和鉴定, 培育出生产上能直接或间接利用的农作物品种的方法。化学诱变育种已经广泛应用于大豆、玉米、水稻、油菜、花卉、蔬菜、杉木、茶树等植物育种, 还应用于部分微生物育种上。但是, 目前仅有一篇文献论述花椒化学诱变育种方面的相关研究。薛惠丹等人以凤县大花炮花椒的愈伤组织为材料, 以EMS为诱变剂进行人工诱变试验: ①在对花椒愈伤组织EMS诱变用100m L浓度为0. 1% 的Hg Cl2溶液与0. 1m L Tween 20 的混合溶液对花椒叶片和韧皮部进行消毒时, 在对韧皮部消毒过程中, 当消毒时间超过8min时, 其致死率急剧上升。由于叶片较韧皮部敏感, 且本身污染少, 所需的消毒时间相对较短。当消毒时间小于4min时, 污染率较高, 当消毒时间超过4min时致死率急剧上升。在此消毒过程中, 8min为花椒韧皮部最佳消毒时间, 4min为花椒叶片最佳消毒时间。②以EMS为诱变剂用不同方法处理花椒韧皮部和叶片来源的愈伤组织。结果表明: 叶片来源的愈伤组织对EMS的敏感性高于韧皮部, 培养基法比浸泡法对愈伤组织伤害大。说明韧皮部为愈伤组织的合适来源, 浸泡法为较好的诱变处理方法。③用不同EMS浓度和EMS处理时间组合处理合适来源愈伤组织, 结果表明: EMS诱变花椒愈伤组织的半致死剂量为: 0. 3% EMS处理6h, 0. 5% EMS处理4h, 0. 7% EMS处理2h。诱变后的愈伤组织经增殖和再分化形成完整植株, 经诱变处理的再生植株在叶长、叶宽、叶色和生长势等方面均表现出不同程度变异, 其中以叶长的变异尤为显著, 变异系数为41. 8% 。通过筛选得到花椒变异植株340 株。因此, 利用化学诱变的方法对花椒进行育种研究, 能克服选择育种方法的局限性, 增加遗传物质变异重组几率, 缩短育种周期, 提高育种效率。

花椒为单性结实, 属于无融合生殖, 不易进行杂交育种。在此之前科技工作者对花椒的育种研究都是采取自然状态下的优选育种, 进行新材料选育的时间太长, 且没有目的性, 育种效果不佳。利用化学诱变的方法对花椒进行育种研究, 克服选择育种方法的局限性, 有利于增加遗传物质变异重组几率、缩短育种周期、提高育种效率。

3 结论

利用化学诱变方法能提高育种材料的突变几率, 丰富花椒突变库资源, 做好花椒种质创新工作, 为花椒优良性状品种选育提供材料。花椒化学诱变育种在育种过程中能大幅度降低育种成本, 缩短优选时间。在生产上能为农户和生产企业提供优良新品种, 提高产量, 增加经济社会效益, 使花椒产业化发展得到进一步提升。

参考文献

[1]王双贵, 赵京献.国内外花椒的研究现状及发展趋势[J].内蒙古林业科技, 2003, 2.

[2]曾新华.不同诱变方法对油菜种子诱变效果及突变体的研究[D]:[博士学位论文].武汉:华中农业大学, 2010.

[3]安学丽, 不同诱变剂与不同诱变方法对玉米诱变的研究[D]:[硕士学位论文].重庆:西南农业大学, 2003.

[4]杜连恩, 魏玉昌, 可福存, 等.大豆化学诱变育种及其规律的研究[J].华北农学报, 2959, 4 (2) :39-43.

[5]彭波, 徐庆国, 李海林, 等.农作物化学诱变育种研究进展[J].作物研究, 2007, 21 (5) .

[6]王彩芬, 安永平, 张文银, 等.水稻种子化学诱变剂EM S浓度筛选研究[J].宁夏农业科技:2011, 52 (10) :22-23.

[7]薛惠丹.花椒人工诱变与种质创新[D]:[硕士学位论文].西安:西北农林科技大学, 2011.

[8]耀德.花椒短枝型新品种──秦安一号[J].林业科技通讯, 1994.09.

“杂交育种与诱变育种”教学设计 篇4

人教版高中生物（必修2）遗传与进化第6章第1节“杂交育种和诱变育种”，主要包括杂交育种的概念、过程、基本原理、应用以及优缺点和诱变育种的概念、过程、基本原理、应用以及优缺点等内容，其中教学重点是遗传和变异规律在改良农作物和培育家畜品种等方面的应用；教学难点是杂交育种和诱变育种的优点和局限性。本节采取以育种技术的发展递进历程来组织教学内容。教学过程中始终抓住育种技术的不断突破和不断改进这一主线，重点引导学生利用遗传学原理分析不同育种阶段育种技术，发现其优缺点，应用所学的遗传学知识，尝试设计突破已有育种技术局限的途径。充分利用教材所介绍的许多具体生动的育种方法的实例，培养学生的阅读理解能力、归纳总结能力和分析思考解决问题的能力。运用小组合作的方式，收集育种的相关资料，通过成员汇报，提高小组的凝聚力；再采取各组互评的方式，进一步培养学生们的合作意识。

二、教学目标

1.知识目标

简述杂交育种的概念；

说明杂交育种的遗传学原理；

举例说出诱变育种的基本原理及其在生产中的应用。

2.能力目标

尝试将信息用图表、遗传图解的形式表达出来运用遗传和变异原理，解决生产和生活实际中的问题。

3.情感态度和价值观目标

（1）讨论从选择育种到杂交育种，再到诱变育种中，科学、技术和社会的相互作用。

（2）通过对杂交育种和诱变育种成果的了解，关注育种技术的发展。

（3）体会科学技术在发展社会生产力、推动社会发展中的巨大作用。

三、教学过程

自从孟德尔的遗传规律问世之后，人工杂交的方法就被广泛应用到动植物育种。随着科学技术的进步，人工诱变技术的应用进一步推动了育种的步伐，后来基因工程的诞生，使人们能够定向地改变生物的遗传特性，创造出新的生物类型。育种在农业生产上的地位越来越重要了。请同学们结合我们学过的遗传和变异的相关知识以及平时对这方面的认识，说一说选育新品种的方法有哪些？（让学生分小组互相讨论一段时间后，学生起来回答。）

（选择育种、杂交育种、诱变育种、单倍体育种、多倍体育种、基因工程育种）

1.选择育种

教师在上课之前先收集一些关于选择育种和杂交育种的图片，在上课的时候首先展示这些图片，让学生仔细观察这些图片，教师根据这些图片设计问题：

根据图片分析古印第安人培育玉米的方法所隐含的遗传学原理及其优缺点是什么？

看完图片提出问题后，教师先让学生阅读教材上的基础内容，并组织学生分组讨论，然后让每一小组选出代表来回答问题。在回答问题过程中若学生不能很好地回答所提出的问题，教师可以通过对问题的分解来进行引导：

教师提示：（1）古印第安人培育玉米的方法称为什么？（2）这时出现的选择的具体含义是什么？（3）选择育种的优缺点是什么？

最后再找同学起来补充回答直到答得全面为止，教师在必要的时候可以给予适当的提示，使学生牢固掌握这部分的内容。

2.杂交育种

每种生物都有不少性状，这些性状有的是优良性状，有的是不良性状，而且不同的优良性状存在于不同的品种中。人们一直设想如果能想办法去掉不良性状，让优良性状集于一身，创造出自然条件下没有的新性状组合，突破选择育种的局限，培育出具有优良性状组合的新品种。会有什么办法呢？（学生思考、分组讨论之后回答），在此基础上，教师提出问题：

有两个小麦品种：一种是高产不抗病（aabb），另一种是低产抗病（aabb），两对性状独立遗传，你们用什么方法能培育出高产抗病的小麦新品种呢？请将你们的设想用遗传图解表示出来。（课本例子）

学生思考，分组讨论，讨论完成后自己画出，同时找两位同学到黑板上来画，先让学生互相批改他们做的结果，并说明理由，在学生汇报的时候老师给予适当的引导，让学生展示出自己的方案，最后通过生生、师生间的交流研讨，总结出可行性的方案。共同完善写出课本例子遗传基因型图解。

师生共同总结：f2高产抗病植株继续自交，淘汰性状分离的类型，选育纯种。但是，在水稻育种过程中，我们直接利用f1代的杂种优势。

通过问题展示和解答，教学课件辅助，展示学生所写的遗传图解。最后由学生归纳杂交育种的概念，所利用的原理及我国在杂交育种方面的成就。

（杂交育种就是将两个或多个品种的优良性状通过交配集中在一起，再经过选择和培育，就得到新品种的方法；基因重组，成就略）

学情预设：与选择育种比较，杂交育种有什么优点？

学生思考、分组讨论回答：能将两个不同品种的优良性状集中在一起，产生新的性状组合的新品种；育种的目的性较强。

思考与讨论：综上所述杂交育种的优点是很明显的，但是在实际操作中，会遇到不少困难。请从杂交后代可能出现的类型，以及育种时间等方面，分析杂交育种方法的不足。有没有更好的育种方法来弥补这些缺点呢？

学生思考，分组讨论回答：杂交育种只能利用已有基因的重组，按需选择，并不能创造新的基因。杂交后代会出现性状分离现象，育种进程缓慢（一般需5至7年），过程繁琐。这些都是杂交育种方法的不足。

思考与讨论：有没有更好的育种方法来弥补这些缺点呢？

学生回忆学过的知识，并交流和讨论：

3.诱变育种

教师引导学生回忆基因突变的内容。

利用基因突变的原理应用在育种中，就发展为一种新的方法――诱变育种。

教师引导学生阅读教材p100页，教材列举了哪些诱变育种的实例？

学生阅读教材并回答：如黑农五号；卫星“87-2”青椒、“航育1号”水稻、“豫麦13号小麦”等；青霉菌高产菌株等。

教师通过大量的图片资料介绍了诱变育种的实例。

教师总结：诱变育种的概念指什么？

诱变育种就是利用物理因素（如x射线、γ射线、紫外线、激光等）或化学因素（亚硝酸、硫酸二乙脂等）来处理生物，使生物发生基因突变。

教师引导，组织开展生生、师生的讨论：与杂交育种相比，诱变育种有什么优点？联系基因突变的特点，谈谈诱变育种的局限性。要想克服这些局限性，可以采取什么办法？

诱变育种的优点是能够提高突变率，在较短的时间内获得更多的优良变异类型。诱变育种的局限性是诱发突变的方向难以掌握，突变体难以集中多个理想性状。要想克服这些局限性，可以扩大诱变后代的群体，增加选择的机会。

教师小结：

农业育种的空间诱变技术浅析 篇5

经过宇宙空间环境下基因诱变的太空种子和转基因种子有本质区别。 从基因结构的改变方式来说, 转基因技术是将一种生物基因引入到另一种生物中, 与另一生物的基因进行重组, 从而产生特定性状的物质, 作为一种新兴的生物技术手段, 它的不成熟和不确定性, 使得转基因食品的安全性成为人们关注的焦点。空间诱变育种只是利用宇宙高能粒子辐射、微重力及弱地磁场等太空特殊环境因素的诱导, 使作物染色体产生缺失、重复、易位、倒置等基因突变[2], 回到陆地上, 经过多代筛选、培育, 形成特性稳定的新品种。 在正常情况下, 植物种子的这种变异也会发生, 只是在自然环境下要经历甚至上百年漫长的过程, 而航天育种只是使这个速度加快而已, 并不存在安全问题。 传统育种可能要经过长达十年的努力, 才能得到一个适宜推广的新品种。 而太空育种通过个别基因的改变, 在3~5 年就可以稳定下来, 得到新品种。

我国的空间诱变育种技术研究始于1987 年, 由我国第9 颗返回式卫星把多个水稻和青椒品种的种子送入太空, 探索太空环境对生物遗传的影响, 研究发现经历太空环境的种子基因变异较为显著, 有变异频率高, 变异幅度大, 有益变异增多等特点, 于是开启了我国利用太空环境的空间诱变育种事业。 截至目前, 空间诱变育种在我国粮食作物、经济作物、园艺作物、水产品、生物制品等多个领域都有成果, 其中育成审定的太空农作物优良品种已达数百个之多[3]。

经历各地多年实验研究, 已经证明, 空间诱变新技术在农业育种上的应用, 可获得常规育种难以获得的特殊优异的经济性状, 可创新选育出优良的新品种和优异的种质资源, 使航天高新技术与农业遗传育种相结合成为培育优质农作物新品种和新种质的有效途径。曾经有40 多个黄瓜品种和茄子及大葱品种种籽, 采用搭载返回式卫星、神舟飞船、实践8 号育种卫星方式, 进行太空环境诱发经济性状变异, 选育新品种, 通过对培育筛选出的优良自交系和种质资源, 进行田间试验、配合力测定、抗病性测定和品质测定等综合性状鉴定, 已培育出早熟、高产和耐低温的蔬菜新品种。 选育的过程证明, 空间诱变育种技术在创造丰富的遗传变异类型, 快速有效的培育早熟、高产、抗病、优质及耐低温等综合性状优良的新品种上效果显著, 经济效益高。

在选育过程中观察发现太空环境诱发的植物的经济性状变异, 存在变异频率高, 变异幅度大, 有益变异增多的优势和特点, 可获得常规育种难以获得的优异性状, 主要表现为以下特征:

1 幼苗茎叶生长迅速, 植株健壮

经2、3、4 代连续观察, 太空黄瓜种籽出苗早, 一般可较未经搭载的对照提前1~2d, 其幼苗生长速度快, 植株健壮, 出苗后8d, 太空黄瓜各品种系株高较对照增高1.5~3.1cm, 出苗后29d, 株高85.6cm, 较对照平均增高30.8cm。 其茎叶生长迅速, 生长势强, 茎长增长迅速, 叶片大、叶面积系数高、植株结构合理、光合效率高成为增产的重要因素。对多个太空品系生育情况的测定证实, 出苗后29d茎长分别较对照增高44.4~86.4cm, 叶片数量增加显著, 叶片数量分别增加2.2~8 个, 亩产量分别达6875.5~9315.1kg, 较对照增产47.3~99.4%

2 特早熟、结瓜、采收期早

根据三年的田间试验表明, 育成的黄瓜品种具有特早熟的优良性状, 在夏茬露地栽培的条件下, 有九个品系连续三代, 从播种至第一雌花期仅需27~31d, 播种后32~37d, 即可采摘鲜黄瓜上市, 而现有常规早熟栽培品种, 则需50~60d。 太空黄瓜鲜瓜生长速度快, 雌花开花后5~6d, 单瓜重可达200~250g, 瓜长30~35cm, 7~8d单瓜重可达300~400g, 且瓜肉仍十分新鲜, 口感依然可口。 播种43 天后, 鲜瓜亩产可达3000kg。单瓜重可达1200g, 长57cm, 最大达1.8kg。 茄子和大葱在选育过程中也有较为相似的表现。

3 耐低温、低温栽培增产显著

黄瓜的生长适宜温度是18~30℃, 其正常发育所需的最低气温是12℃, 低于12℃植株的光合作用、呼吸作用、光合产物的运转等生理活动都受影响, 甚至停滞, 在露地栽培的条件下, 太空黄瓜的耐低温能力与常规对照品种比较, 耐低温能力表现突出, 在10 月份的低温条件下, 曾做过为期68 天, 有效积温1052.7℃的抗寒性试验 ( 常规品种黄瓜生长期间要求有效积温为2610~5600℃) 。 试验期间, 太空黄瓜的发芽生育天数为4d, 有效积温为92.8℃。 对照品种则需10~13d, 有效积温210~270℃, 其完成幼苗期~抽蔓期生育天数为35d, 有效积温630.2℃ ( 一般品种则需50d, 有效积温870℃) 结瓜前期生育天数为29d, 有效积温仅270.7℃, 但其前期产量仍可达747kg, 较对照品种分别增产824.0%、533.2%和823.6%。 在低温条件下对照品种产量很低, 亩产普遍在120kg以下, 有的甚至绝产。 说明常规品种在低温条件下, 不能完成正常生长发育, 产量很低, 太空品种则表现出较好的抗寒性。

4 皮色性状变异, 雌瓜数量性状变异

通过选育, 获得一个白色自交系, 变异频率为4.2%, 皮色为白色, 多雌型, 瓜形好, 雌瓜多, 较对照增产66.7%, 结瓜数较对照增加66.7%, 是优良的鲜食型材料, 市场前景看好。 单株雌瓜数量是重要的产量因素, 通过田间试验, 获得的多个自交系, 出现雌花数量增多的性状变异, 单株结瓜数量较对照提高27.3~112.1%, 占自交系总数48.7%, 有三组自交系属强雌型品种, 从中选育出结瓜数量高、多雌型、综合性状优良的自交系和育种材料应用于黄瓜育种。

5 产量性状变异, 产量高、增产显著

空间诱变技术对黄瓜品种和自交系的产量提高十分显著, 其变异频率高, 变异幅度大, 占自交系总数80.2%的品种表现出增产, 有四组平均增产50%以上, 分别较对照平均增产277.1%、78.2%、50.7%、53.4%, 也有少数几组自交系出现雄花增多, 雌花减少的不利性状变异。 经过选育可获得多雌型自交系育成品种, 育成品种植株生长势强, 结瓜数多, 产量性状稳定, 其鲜瓜亩产量可达7520.5~11281.0kg较对照组增产61.1~133.2%。 在多地推广种植, 也增产显著, 表现良好。

此外, 太空育成品种, 在品质上也表现优良, 结瓜数多, 瓜形好, 顺直整齐, 瓜肉绿色, 肉质脆嫩可口, 食味佳。有皮色为白色的品种出现, 且高产, 商品性状良好。 太空品种也表现出较好的抗病性状, 抗霜霉病、白粉病、病毒病、抗早衰。

由此可以表明, 空间诱变育种技术, 将航天高新技术与农业遗传育种相结合, 是培育优质农作物新品种和新种质的有效途径, 具有变异频率高, 变异幅度大, 可获得常规育种难以获得的优异性状, 如早熟性变异, 抗寒性强变异, 雌花增多, 高产等性状变异尤为突出, 可选育出具有丰产、多抗、稳产、优质、结瓜早和抗寒性强优良作物品种, 效果显著, 经济效益高。

摘要：空间诱变育种是利用宇宙高能粒子辐射、微重力及弱地磁场等太空特殊环境因素的诱导, 使作物染色体产生缺失、重复、易位、倒置等基因突变, 回到陆地上, 经过多代筛选、培育, 形成特性稳定的新品种。太空环境的种子基因变异较为显著, 有变异频率高, 变异幅度大, 有益变异增多等特点, 易于快速有效的培育早熟、高产、抗病、优质及耐低温等综合性状优良的新品种。

关键词：空间诱变育种,太空特殊环境,基因变异

参考文献

[1]沈桂芳.我国的农作物航天诱变育种与研究[J].中国航天诱变育种, 2007.76-80.

[2]蒋兴村.空间诱变育种研究15年 (1986-2001年) 体会[J].中国航天育种, 2007.71-75.

紫外线诱变育种 篇6

1 实验材料

1.1 菌株

产黄青霉菌618#

1.2 培养基[2]

(1) 斜面培养基 (%)

甘油0.75;甘油蜜糖0.75;酵母浸处粉0.5;NaCL 1;CaSO40.025;部分微量元素;琼脂2.7;pH 6.8

(2) 菌丝培养基 (%)

玉米浆6.1;蔗糖2.0;CaCO30.5 (调PH后加入) ;pH 5.8

(3) 再生培养基 (%)

NaNO30.3;MgSO4·7H2O 0.05;FeSO4·7H2O 0.001;KCL 0.05;KH2PO40.1;

葡萄糖4;酵母膏0.2;琼脂2.7;pH 6.8 (用稳定剂配制)

(4) 稳定剂

0.7M NaCL

(5) 种瓶培养基

以蔗糖、玉米浆为主要碳、氮源, pH5.8

(6) 发酵瓶培养基

以乳糖、玉米浆为主要碳、氮源, 加无机盐类组成, pH5.9

1.3 酶

纤维素酶+cellulase R—10

2 实验方法

2.1 原生质体的制备

(1) 菌体培养

将618#菌种新鲜斜面加入适量无菌水, 刮下菌株孢子制成孢子悬液, 经玻璃珠打散过滤后取1m L接种于40m L的菌丝培养液中, 28℃, 240rpm条件下培养36h, 得到菌丝体。

(2) 胞壁酶处理

用4层无菌纱布过滤收集菌丝体, 无菌水洗2-3次, 再用稳定剂洗两次, 取1g左右的菌丝体悬浮于5m L稳定剂中, 加入5mg纤维素酶和5mg cellulase R-10, 30℃恒温水浴振荡摇床60rpm, 1.5-2h, 镜检有大量原生质体释放后, 用200目尼绒网滤除菌丝碎片和未酶解的菌丝体, 滤液经1000rpm离心5min, 弃上清, 加10m L稳定剂重复离心两次, 加入5m L稳定剂悬浮原生质体, 备用。

2.2 紫外线诱变处理原生质体

取原生质体悬浮液适量, 进行紫外线 (253.7nm) 诱变处理, 分别照射25′′和40′′。

2.3 高产菌株的检出

将处理后的原生质体悬浮液涂于再生培养基平皿中, t=25℃, Φ=45±5%, 恒温培养7天。带菌落长出后, 挑选结构紧密, 形状规则的单菌落传斜面培养后, 进行发酵摇瓶的筛选。

3 实验结果

3.1 紫外线对原生质体的致死作用

我们对产黄青霉菌618#进行了紫外线处理, 并分别采用25′、40′的计量处理原生质体, 由表1可以看出, 随着照射时间的增加, 致死率也相应提高。

3.2 发酵相对效价与相对产量的变化

经摇瓶发酵筛选得到701#菌种, 该菌种在发酵效价与总产量方面均高于出发菌株618# (表2) 。

3.3 限氧条件下的摇瓶考查

用改变瓶口纱布层数来改变供氧的方法考查76#菌株在限氧条件下发酵效价的变化情况 (表3) 。

由表3可以看出, 随着纱布层数的增加、供氧量的减少, 701#菌株的发酵效价变化不大。

3.4 单位菌丝合成能力的比较

单位菌丝合成能力的比较是考查一个新菌株是否有推广生产价值的主要参数之一, 为此我们将菌株701#和菌株618#进行了对比考查 (表4) 。

从表3可以看出701#菌株单位菌丝的青霉素合成能力明显高于618#菌株。

3.5 稳定性考查

将701#菌株传代后, 进行摇瓶考查, 结果表明其F1代、F2代、F3代发酵效价与总产量均无明显变化, 说明该菌株的稳定性较好。

4 讨论

本试验采用的方法筛选青霉素高产菌株, 试验证明, 产黄青霉菌的细胞壁被去除后, 对紫外线的敏感度增强, 随着照射时间的增加, 致死率相应提高, 在引起绝大多数原生质体致死的同时, 存活个体中的变异频率大大提高, 处于对数生长期的菌丝体最容易酶解, 通过摇瓶筛选我们得到701#菌株, 该菌株除发酵效价和总产量有所提高外, 对氧的需求也有所降低, 取得了很好的效果。

摘要：青霉素G发酵生产过程, 菌种的制备是关键, 随着生产菌种不断的传代与使用往往产生衰退现象, 利用紫外线诱变原生质体的方法, 选育青霉素高产菌株, 使发酵效价与总产量分别提高了8.2%和6.4%, 为青霉素生产奠定了坚实的基础。

关键词：紫外线,诱变,原生质体,选育

参考文献

[1]熊宗贵.发酵工艺与原理[M].中国科学技术出版社.

紫外线诱变育种 篇7

为了培育出品质优良的谷子新品种, 实现高新科技自主创新, 朝阳县农产品质量安全检验检测中心一直把谷子作为主要任务来研究, 并协助高新所承担了国家“谷子空间环境诱变育种与关键技术研究”课题。通过航天育种创研出高产、优质、多抗、广适性强的谷子新品种, 进一步提高了谷子的产量和品质。几年来, 我们从航天卫星搭载的变异后代中, 已选育出8个优秀新品系:有朝谷5号后代的黄苗变绿苗新品系;有朝谷2号后代的高秆、长穗型新品系;有晋谷27变异后代的早熟紧码型新品系;有稀有品种毛毛斗谷子变异后代的抗倒伏、活秧熟、优质大粒白米新品系;有山西红变异后代的早熟黄谷子新品系;以及从吨谷1号变异后代的红穗红秆新品系等等。在这些变异材料中, 有的是颜色方面的变化, 有的是形态方面的变化, 有的是生物性状方面的变化等等, 变异形式多种多样。

“HG-27” (代号) 是我们采用航天诱变技术选育出的新品系之一, 本品系原型是“晋谷27号”。“晋谷27”植株高大、茎秆粗壮、抗病、抗倒、产量高、绿秧熟、白谷黄米, 米质特别好。其缺点是生育期偏长, 在本地区需要125~130天, 稍遇晚播或低温寡照就成熟欠佳。如何选育出即能保持其优良特性, 又能早熟的新品系, 一直是我们的主要任务目标。2004年这一品种经过航天卫星搭载;2005年扩繁为一代 (HP1代) 2006年将HP1代全部作为群体观察圃, 以晋谷27为原型对照。在HP2代中出现了大量的矮化变异株, 从矮化变异株中选育出一些株高株型基本一致的优良单株作为HP3代。到2007年的时候, HP3代长相已基本趋于一致, 再经过严格的纯化选择, 作为HP4代留种。2008年, HP4代田间表现已十分整齐, 无一杂株, 长相十分喜人, 秋季测产为487.6千克/亩。2009年, 在本所品比试验中, HP5代小区产量比对照增产72%, 差异极为显著。而对照晋谷27也属高产品种, 由于当年播种偏晚 (6月10日) , 又遇特大旱灾而影响了产量。这也显示出“HG-27”抗逆性强, 适应性广的特征。

紫外线诱变育种 篇8

从啤酒废酵母泥中分离所得到的原始酵母菌株用于生产SCP时,无论从产量还是质量上考虑均不乐观。如果单纯依靠自然选育,由于自然突变率低、突变幅度小,获得高产菌的几率非常小。利用紫外线诱发突变处理菌株是最为可靠的微生物菌种选育方法,具有便捷、经济且高效等特点[2]。

目前,利用酵母生产SCP的研究工作国内外报道较多,但主要集中在生产工艺上的研究,对于高产SCP酵母的诱变育种国内少有报道,因此本试验为提高SCP产量寻找一条新的有效的途径提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为绵阳市某啤酒厂废弃的啤酒酵母泥。斜面及平板培养基:10 g/L酵母膏,20 g/L蛋白胨,20 g/L葡萄糖,20 g/L琼脂。液体种子培养基:10 g/L酵母膏,20 g/L蛋白胨,20 g/L葡萄糖。基础发酵培养基:组分同上,无机盐用量为0.5 g/L Mg SO4·7H2O,1 g/L KH2PO4,0.1 g/L NaCl,0.1 g/L CaC12·2H2O。主要设备及仪器:超静工作台、紫外分光光度计、水浴恒温振荡器、凯氏定氮装置、恒温培养箱、显微镜、血球计数板、分析天平、高压灭菌锅、高速冷冻离心机、摇床、pH计。主要试剂:葡萄糖、蔗糖、果糖、淀粉、玉米淀粉、柠檬酸、琼脂、酵母膏、蛋白胨、尿素、MgSO4·7H2O、KH2PO4、NaCl、CaC12·2H2O等,均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 从啤酒废酵母泥中分离纯化酿酒酵母。

酿酒酵母菌的分离:称取啤酒废酵母泥1.0 g,置入99 m L无菌水的三角瓶中,内装有无菌玻璃珠,振荡20 min,即成1%的稀释菌悬液,挑取上述菌悬液1环在平板上作连续划线,使酿酒酵母得以分散和稀释。划线后倒置平板于28℃恒温培养48 h。酿酒酵母菌的纯化:根据啤酒酵母菌的分离试验结果,用接种针挑取颜色均一、菌落直径较大的菌落,用划线法接种到斜面培养基上,28℃恒温培养48 h。通过镜检,得到较纯的酿酒酵母菌[3,4]。

1.2.2 紫外诱变。

紫外诱变操作方法:用接种环挑取1环出发菌株(培养48 h的斜面种子)置于装有玻璃珠和20 m L生理盐水的100 mL三角瓶中,振荡10 min左右,使孢子分散,然后用灭过菌的4层镜头纸过滤制成单孢子悬液。用直径为6 cm的培养皿装入5 mL单孢子悬液放入暗箱的磁力搅拌器上,并在15 W紫外灯下距离35 cm处照射30、60、90、120 s(紫外灯应预先照射30 min),为防止回复突变,紫外线诱变后的操作均在红灯下进行[5,6,7]。高产SCP菌株的初筛和复筛:将转入斜面上的诱变酵母菌株,于28℃的恒温培养箱中培养48 h,制备成种子液,按3%的接种量接入装有50m L基础发酵培养基250 mL三角瓶中,温度为30℃,转速为200 r/min的恒温摇床上振荡培养48 h,用分光光度计测定600 nm处的吸光度,筛选出吸光度大于出发菌株的诱变菌。将初筛得到的菌株制备成种子液,接到基础发酵培养基,30℃、200 r/min摇床培养48 h。将发酵液在4 500 r/min离心15min,用蒸馏水洗涤3次,收集菌体,在90℃干燥箱中烘干,研磨成粉,用凯氏定氮法测定其SCP含量,筛选出SCP含量较高的诱变菌株[8]。

1.2.3 诱变菌株培养条件的优化。

测定培养时间、起始p H值、培养温度、接种量、最佳碳源及其浓度和最佳氮源及其浓度等对诱变菌SY-5-7生物量的影响[9,10,11]。基础培养条件为温度30℃、接种量3%、自然p H值、培养时间48 h。按试验设计的不同培养条件对基础培养条件做相应改变,测定酵母生物量。

1.2.4 比色法测定诱变菌株生物量。

诱变菌株在600 nm下有最大吸收峰,将发酵液稀释一定倍数,在600 nm波长下测定OD值。选择对应的新鲜无菌的培养基作为空白对照[12]。

2 结果与分析

2.1 酵母分离结果和出发菌株的确定

酵母菌落在固体培养基表面一般呈湿润、透明、表面光滑、容易挑起、正反面边缘和中央部位的颜色均一,多以乳白色或矿烛色为主要特点。根据以上菌落特征,分离纯化出5株酿酒酵母。

出发菌株即用于诱变育种的原始菌株,其选择的好坏是决定诱变结果的关键。由表1可以看出,SY-5菌株的SCP含量优于其他酵母菌株,所以本试验以SY-5为出发菌株。

2.2 紫外诱变处理结果

2.2.1 诱变剂量的确定。

采用紫外线照射对酿酒酵母进行诱变处理,测定不同照射时间对菌株致死率的影响(用未经紫外照射的菌株作对照)。从图1可以看出,出发菌株对紫外线较为敏感,随着照射时间的增加,致死率显著增加。120 s照射时间的致死率已接近100%,90 s时致死率为83%。根据经验致死率为80%左右时,诱变效果较好,因此本试验选择90 s作为紫外诱变育种的最适剂量。

2.2.2 高产SCP诱变菌株的确定(初筛和复筛)。

从表2可以看出,使用紫外线对菌株进行诱变,可以获得一定量的正突变菌株。本试验对诱变菌经平板筛选后挑选出的若干支突变菌株进行摇瓶培养,筛选得到了8支OD600值超过出发菌株的菌株,说明其细胞生物量超过出发菌。进一步对初筛得到的生物量大于出发菌株的诱变菌株进行摇瓶培养,测定其SCP含量,发现SY-5-7的SCP含量均比其他诱变菌株高,比出发菌株提高7.84%。

2.3 诱变菌株SY-5-7培养条件的优化

2.3.1 培养时间对SY-5-7生物量的影响。

将诱变菌SY-5-7接种到发酵培养基后,每隔6 h取1次样,测定其OD600值,绘制成生长曲线。从图2可以看出,在0~70 h这段时间,随着发酵时间的延长,SY-5-7生物量逐渐增加;发酵70 h时生物量达到最大值,随后逐渐下降。其原因可能是,在菌体细胞生长过程中,随着有效成分的积累和营养物质的消耗,菌体代谢物中的有害物质抑制了菌体的生长,所以确定最适培养时间为70 h。

2.3.2 起始pH值对SY-5-7生物量的影响。

菌体只有在一定的pH值范围内才能正常生长,pH值除对细胞直接影响外,还通过与培养基中有机物的离子化作用而对细胞有间接影响。不同培养基初始pH值对SY-5-7生物量的影响见图3。从图3可以看出,诱变菌株SY-5-7在pH值3.0~9.0均能生长,在酸性条件下生长较好,最适起始pH值为5.0。

2.3.3 接种量对SY-5-7生物量的影响。

从图4可以看出,接种量对SY-5-7的生长影响较大。接种量为2%时,生物量达到最大。随着接种量的逐渐增加,生物量逐渐减小,原因可能是随着接种量的增加和细胞的快速繁殖,营养物质被快速消耗,酵母细胞对营养物质以及细胞之间的的竞争,导致生物量逐渐下降。

2.3.4 培养温度对SY-5-7生物量的影响。

从图5可以看出,发酵初期,随温度升高,SY-5-7生物量也随之升高,到26℃时生物量达最大,从28℃开始生物量逐渐减少,所以确定26℃为最适培养温度。

2.3.5 不同碳源及其浓度对SY-5-7生物量的影响。

碳源是菌体增殖和蛋白积累的主要基质,细胞的生长和蛋白产量均受碳源种类和含量的影响。本试验分别选择葡萄糖、果糖、蔗糖、柠檬酸、可溶性淀粉、玉米淀粉等6种不同单糖、二糖和多糖碳源(浓度为20 g/L),比较其对诱变菌株SY-5-7生物量的影响,结果如图6所示。在供试几种碳源中,多糖作为碳源时,SY-5-7生物量并不是很高,所以确定蔗糖为最适合碳源。

进一步选取蔗糖为碳源,在10~60 g/L的浓度下进行发酵,结果如图7所示。随着蔗糖浓度的增加,生物量也显著增加。当蔗糖浓度达50 g/L时,生物量增长缓慢,从生产成本考虑,选择蔗糖浓度50 g/L为宜。

2.3.6 不同的氮源及其浓度对SY-5-7生物量的影响。

作为构成生物体大分子蛋白质、核酸化合物的重要来源,氮源对生物体的生长、繁殖至关重要。本试验分别选择尿素、酵母膏、蛋白胨、(NH4)2SO4、NH4NO3等5种有机和无机氮源进行试验,结果如图8所示。相比无机氮源,有机氮源中的营养种类更丰富,更有利于细胞的生长繁殖。当氮源为酵母膏时,SY-5-7生物量远远优于其他氮源。原因可能是酵母膏属于有机氮源,其除含有丰富的蛋白质、多肽和氨基酸外,还含有糖类、脂肪、无机盐以及某些生长因子,能促进细胞的生长和繁殖,所以确定酵母膏作为最适氮源。

进一步选取酵母膏为氮源,在5~30 g/L的浓度下进行发酵,结果如图9所示。当酵母膏浓度为10 g/L时,生物量达最大值。

3 结论

用紫外线对出发菌株进行照射,选择适当的照射时间,经过初筛和复筛得到诱变菌株是本试验的关键。值得注意的是,一定要控制好照射时间,如果照射时间过长,可能导致菌体细胞大量死亡;如果照射时间过短,则起不到诱变的作用。

工业上生产SCP,多是用品种优良的酵母来进行大规模发酵,本试验最终得到的诱变菌株SY-5-7可以作为高产SCP的发酵菌株应用于工业生产。试验结果表明,诱变菌株SY-5-7的最佳培养条件为:起始p H值5.0、培养温度26℃、接种量2%、发酵时间为70 h,碳源为50 g/L蔗糖、氮源为10g/L酵母膏。

摘要：从啤酒废酵母泥中分离纯化出5株酿酒酵母,以其中单细胞蛋白(SCP)含量较高的SY-5为出发菌株,通过紫外诱变分生孢子,经过初筛和复筛,得到1株高产SCP的诱变菌株SY-5-7,比出发菌株高7.84%,达到48.67%。通过单因素试验对诱变菌株SY-5-7培养条件进行优化,结果表明,最适培养条件为培养基起始pH值5.0、培养温度26℃、接种量2%、发酵周期为70h,碳源为50g/L蔗糖、氮源为10g/L酵母膏。在此基础上进行培养,SY-5-7的生物量比初始条件提高了约35%。

关键词：酿酒酵母,单细胞蛋白,紫外诱变,培养条件

参考文献

[1]许倩,李宏菊,王秋京.单细胞蛋白的利用[J].食品工程,2007,12(4):22-25.

[2]岑沛霖,菜谨.工业微生物学(1版)[M].北京:化学工业出版社,2006:33-34.

[3]林加涵,魏文玲,彭宣宪.现代生物学实验(上册)[M].北京:高等教育出版社,2000:136-140.

[4]钱存柔,黄仪秀.微生物实验教程[M].北京:北京大学出版社,2001:71-72,101-102.

[5]成玉梁,姚卫蓉,钱和,等.类金属硫蛋白产生菌的诱变育种[J].食品研究与开发,2006,27(2):44-50.

[6]徐晓雪,李润国,董国斌,等.地瓜生粉培养高产酵母菌诱变条件的实验研究[J].食品科学,30(5):187-189.

[7]周欣,吕淑霞,代义,等.紫外诱变选育木聚糖酶高产菌株及产酶条件初步研究[J].生物技术,2009,19(1):71-74.

[8]钟娟,周金燕,冯吉,等.捷安肽素高产菌的紫外诱变模型的建立与选育[J].天然产物研究与开发,2003,15(6):504-507.

[9]IKRAM-UL-HAQ,MIRZA AHSEN BAIG,SIKANDER ALI.Effect of cultivation conditions on invertase production by hyperproducing Sac-charomyces cerevisiae isolates[J].World Journal of Microbiology&Bio-technology,2005(21):487-492.

[10]CHI Z M,ZHAO S Z.Optimization of medium and cultivation conditions for pullulan production by a new pullulan producing yeast strain[J].Enzyme and Microbial Technology,2003(33):206-221.

[11]ZENG X B,WANG H Y,HE L Y,et al.Medium optimization of carbon and nitrogen sources for the production of eucalyptene A and xyloketal A from Xylaria sp.2508using response surface methodology[J].Process Biochemistry,2006(41):293-298.

紫外线诱变育种 篇9

1 材料与方法

1.1 菌株与药品

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)DSM1412(购自德国生物材料资源中心,即the German Resource Centre for Biological Material);1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(1-Methyl-1'-nitro-1-nitrosoguanidine,NTG)和N-硝基-L-精氨酸甲酯(N-nitro-L-arginine methyl ester,AE)购自阿拉丁试剂公司;葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、Na C1、琼脂、玉米浆、(NH4)2SO4、KH2PO4、Mg SO4·7H2O、尿素、碳酸钙、K2HPO4·3H2O、Fe SO4·7H2O、Mn SO4·H2O、生物素、硫胺素盐酸盐、二乙胺、α-萘酚、无水乙醇、脲、纯溴、Na OH、HCl、Na2HPO4、Na H2PO4、L-Arg和正丙醇购自上海生物工程有限公司。

1.2 培养基

(1)琼脂完全培养基各成分:葡萄糖2.0%,牛肉膏1.0%,蛋白胨1.0,酵母膏0.5,Na C1 0.5%,琼脂2.0%,p H 7.0-7.2,115℃灭菌20 min。

(2)摇瓶种子培养基各成分:葡萄糖3.0%,玉米浆2.0%,(NH4)2SO42.0%,KH2PO40.1%,Mg SO4·7H2O 0.05%,尿素0.15%,p H 7.0-7.2,115℃灭菌20 min。

(3)摇瓶发酵培养基各成分:葡萄糖2.0%,玉米浆2.5%,(NH4)2SO44.5%,KH2PO40.1%,Mg SO4·7H2O 0.05%,碳酸钙3.0%,p H 7.0-7.2,115℃灭菌20 min。

(4)琼脂基本培养基各成分:葡萄糖1.0%,(NH4)2SO40.3%,KH2PO40.1%,K2HPO4·3H2O 0.2%,Mg SO4·7H2O 0.05%,Fe SO4·7H2O 0.002%,Mn SO4·H2O 0.002%,生物素50μg/L,硫胺素盐酸盐200μg/L,琼脂2.0%,p H7.0-7.2,115℃灭菌20min。

(5)选择性培养基:在基本培养基的基础上补加各种不同质量分数的精氨酸结构类似物AE。

1.3 谷氨酸棒杆菌生长曲线及最佳诱变菌液稀释浓度的确定

从完全平板培养基上接种菌种于装有40 ml种子液的500 ml三角瓶中,在培养0h、2h、4h、6h、8 h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h和24 h时,取0.1 ml种子培养液,加入10ml的试管,用蒸馏水定容,摇匀,用ND-1000分光光度计测OD562nm值。

取10 ml培养12 h的菌液,离心弃去上清液,加入等体积的无菌生理盐水,充分震荡,然后对菌悬液进行梯度稀释,分别为l00~10-9,将不同稀释度的菌悬液涂布在琼脂基本培养基平板(0.1 ml/个皿),每个稀释度3重复,30℃培养48h~72h观察菌落生长情况。

1.4 紫外诱变时间的确定[9]

取在种子培养基中培养12 h的谷氨酸棒杆菌菌液涂布于基础培养基上(0.1 ml/个皿),编号为1、2、3、4、5和6,分别在20 W紫外灯下50 cm处分别照射0s、5s、10s、20s、30s、40s和50 s,于30℃培养2d~3 d,观察菌落生长情况,选择致死率为80%的时间为诱变时间。

1.5 NTG诱变剂量的确定[8]

用0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml和0.8 mg/ml不同剂量的NTG处理谷氨酸高产菌谷氨酸棒杆菌。取6支1.5ml离心管。分别取种子培养12 h的种子培养液0.5 ml至离心管中离心,弃去上清液,菌体用灭菌的磷酸缓冲液离心洗涤3次,然后各试管依次加入灭菌的磷酸缓冲液1.0ml、0.95ml、0.90ml、0.80ml、0.70ml和0.60ml,再依次加入NTG溶液0 ml、0.05 ml、0.10ml、0.20 ml、0.30ml和0.40 ml,震荡摇匀,30℃保温10 min。无菌水离心洗涤3次以终止诱变剂的作用。最后加入无菌水至0.5 ml,振荡摇匀。每支离心管的菌悬液都作梯度稀释到10-6,选择10-6涂布基础培养基平板,0.2 ml/个皿,每个浓度3个重复。30℃培养72 h,观察菌落,选择致死率达到80%的NTG浓度为实验诱变剂量。

1.6 谷氨酸棒杆菌对AE的最低耐受浓度

配制琼脂基本培养基500 ml,分装于6个100 ml的小三角瓶中,每个三角瓶装50 ml,编号为1、2、3、4和5,在1、2、3、4和5中依次加入0g、0.1g、0.2g、0.3g和0.4g AE,混合均匀后倒板,制成含0mg/ml、2mg/ml、4mg/ml、6mg/ml和8mg/ml AE的梯度平板。将稀释至合适浓度的菌悬液涂布平板(0.1ml/个培养皿),30℃培养72 h后观察菌落的生长,刚好没长菌的AE浓度为结构类似物最低浓度。

1.7 紫外线和NTG的诱变。

(1)紫外线诱变:取谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)DSM1412培养12 h种子液5 ml,用高速离心机5000 rpm离心5 min,弃去上清液,用无菌生理盐水洗涤,菌种用玻璃珠打散,获得细胞悬液,在20W紫外灯下50 cm处照射30~40 s,将经过诱变的菌液涂布在含浓度为4 mg/ml AE的基本培养基平板上,30℃培养7~8 d,然后挑选长出的较大菌落为变异菌株。筛选出的菌落再经斜面培养、种子液培养、发酵摇瓶培养,最后用坂口改良法测定发酵液中的L-精氨酸含量。

(2)NTG诱变:取谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum DSM1412培养12 h种子液5 ml,用高速离心机5000rpm离心5 min,弃去上清液,用无菌生理盐水洗涤,菌种用玻璃珠打散,生理盐水洗涤后,用0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 6.0)洗涤2次,加入p H 6.0的0.1 mol/L磷酸缓冲液至6.5 ml,然后加入浓度为0.4 mg/ml NTG,30℃诱变15 min,用0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 6.0)洗涤3次,除去NTG终止诱变。将经过诱变的菌液涂布在含浓度为4 mg/ml NTG的基本培养基平板上,30℃培养7~8 d,然后挑选长出的较大菌落为AE的变异菌株。筛选出的菌落再经斜面培养、种子液培养、发酵摇瓶培养,最后用坂口改良法测定发酵液中的L-精氨酸含量。

1.8 遗传稳定性试验:

将L-精氨酸产生菌谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum ZD2009连续接种八代,摇瓶发酵考察产酸稳定性。

1.9 摇瓶发酵条件的优化

(1)种子培养基优化。采用三因素三水平L9(33)实验设计(三因素三水平,共九个实验组,记为L9(33)):因素A为葡萄糖,设2%、3%和4%三水平;因素B为玉米浆,设1%、2%和3%三水平;因素C为硫酸铵,设1%、2%和3%三水平。其他因素(KH2PO40.1%,Mg SO4·7H2O 0.05%,尿素0.15%,p H 7.0-7.2)保持不变。

(2)发酵培养基及接种量优化。采用七因素三水平L18(37)实验设计(七因素三水平,共十八个实验组,记为L18(37),):因素A为葡萄糖,设9%、12%和15%三水平;因素B为玉米浆,设2%、2.5%和3%三水平;因素C为硫酸铵,设3%、4.5%和6%三水平;因素D为KH2PO4,设0.05%、0.1%和0.15%三水平,因素E为Mg SO4·7H2O,设0.03%、0.05%和0.07%三水平,因素F为碳酸钙,设2%、3%和4%三水平;因素G为接种量,设6%、8%和10%三水平。

(3)最佳pH值确定。通过设置5个发酵培养基pH值梯度:6.0、6.5、7.0、7.5和8.0,测定不同pH对细菌产酸的影响。

(4)最佳装液量确定。通过设置4个梯度的发酵装液量(100 ml锥形瓶):5ml、10ml、15ml和20ml,测定不同装液量对细菌产酸的影响。

(5)最优条件验证。采用优化的种子培养基(葡萄糖3.0%,玉米浆2.0%,硫酸胺2.0%,磷酸二氢钾0.1%,七水硫酸镁0.05%,尿素0.15%,pH7.0)、优化的发酵培养基(葡萄糖12%,玉米浆2.5%,硫酸胺6.0%,磷酸二氢钾0.05%,七水硫酸镁0.05%,碳酸钙2.0%,pH 7.0)及优化的接种量(10%),最佳发酵培养基pH值(7.0)和最佳发酵装液量(15%)进行验证试验。

2 结果与分析

2.1 谷氨酸棒杆菌生长曲线及最佳诱变液稀释浓度

微生物的种类不同,其群体生长规律也不同,主要表现为群体生长曲线的不同。测定出发菌DSM1412的生长曲线(图1)。培养4-14 h为谷氨酸棒杆菌对数生长期,经过12 h完全培养液培养,达到对数生长的中后期,此时细菌的细胞代谢旺盛,而且细胞对外界条件的敏感性较其它时期的高。检测菌液10-6稀释后的数量,平均为83个,细胞浓度控制在108~109个/ml之内,符合诱变要求,所以确定诱变的菌液稀释浓度为10-6。

2.2 紫外诱变时间、NTG诱变剂量和AE抗性浓度的确定

如表1所示,当紫外线诱变时间为30~40 s时,谷氨酸棒杆菌的致死率达83.3%,符合本试验要求,因此紫外线诱变时间定为30~40 s。当NTG诱变剂量为0.4 mg/ml,谷氨酸棒杆菌的致死率达79.5%,符合本试验要求,因此NTG诱变剂量定为0.4 mg/ml。当培养基中AE浓度为2 mg/ml时平板上谷氨酸棒杆菌长势微弱,而当培养基中AE浓度增加到4mg/m L时,平板上刚好无谷氨酸棒杆菌生长,当AE浓度在4mg/ml以上时,菌体不能正常生长,因此确定谷氨酸棒杆菌诱变中AE抗性浓度为4 mg/ml。

2.3 谷氨酸棒杆菌诱变菌及其遗传稳定性

以Corynebacterium glutamicum DSM1412为出发菌株,经过8次紫外线和1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍诱变,最后获得L-精氨酸产生菌谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum ZD2009。其产酸量为31 g/L。谷氨酸棒杆菌已保藏(保藏编号:CCTCC NO:M209260,分类命名:Corynebacterium glutamicum ZD2009)。从表1可以看出,将菌株Corynebacterium glutamicum ZD2009连续接种八代后,发酵产酸能力依然较强,该菌株遗传稳定性较好,且产酸性能稳定。

注:++表示生长良好,+-表示微弱生长,--表示没有生长

2.4 摇瓶发酵条件的确定

2.4.1 种子培养基的优化结果。

从表2的极差(R)可以看出,各因素对产物的影响顺序为:硫酸胺(C)>玉米浆(B)>葡萄糖(A)。硫酸铵对种子培养基影响最大,因为细胞生长对氮源的要求较高,一般需要丰富的氮源,有利于种子菌的生长,但也不能过多;而玉米浆由于含有生物素和多种氨基酸,也对种子有较大影响;对于葡萄糖,种子培养基中一般含量不高,因为糖分过多,菌体代谢活动旺盛,产生有机酸,使p H降低,容易引起菌种衰老,所以糖含量在低范围内变化对种子菌影响不大。由实验结果确定的各因素的最优水平为A2B3C2,即种子优化培养基各成分质量分数为:葡萄糖2.0%,玉米浆3.0%,硫酸胺3.0%,磷酸二氢钾0.1%,七水硫酸镁0.05%,尿素0.15%,pH 7.0。

2.4.2 发酵培养基及接种量的优化结果

从表3的极差(R)大小可以看出在这七种因素中,显著性结果为:硫酸铵>玉米浆>葡萄糖>磷酸二氢钾>碳酸钙>接种量=七水硫酸镁。结合图2和表4方差分析,可看出发酵培养基中各组分含量的不同对产酸是有影响的。如果培养基中营养物质过于丰富,会引起菌体生长过快,以致发酵产酸后劲不足;而如果营养物质缺乏,种子生长缓慢,代谢活力低,也对产酸不利。七种因素中硫酸铵、玉米浆、葡萄糖对产酸影响显著,其他因素不显著,这和表4的极差分析结果一致。由实验结果确定的各因素的最优水平为A1B3C3D1E1F1G1,即:葡萄糖9.0%,玉米浆3.0%,(NH4)2SO46.0%,KH2PO40.05%,Mg SO4·7H2O 0.03%,碳酸钙2.0%,接种量6%,pH 7.0~7.2。

2.4.3 不同pH值和装液量对发酵产酸的影响

微生物的生长及产物的形成必须进行多种多样的酶催化反应,pH的变化会引起各种酶活力的改变,对菌体形态和代谢途径影响都很大。因此,pH是影响细胞生长及产物形成的重要环境因素。试验考察了pH对发酵产酸的影响,如图3所示,发酵培养基pH值7.0时,产精氨酸量最高。结果还表明,pH在6.0~8.0范围内对产酸影响不大,但最佳pH在7.0左右。

L-精氨酸发酵属于好氧发酵,因此,在菌株Corynebacterium glutamicum ZD2009发酵生产L-精氨酸过程中必须保证一定的溶氧来满足菌体的需求。在摇床转速一定,相同的100 ml凹底三角瓶中,发酵培养基装液量不同,其溶解氧含量也不同,装液量越少,溶解氧含量越高。试验考察了不同装液量对发酵产酸的影响,如图3所示,装液量在15 ml/100ml时,产酸量最高。这说明,虽然装液量越少溶解氧含量越高,但是装液量过少,营养物质相应减少,也会影响菌体生长及产酸。

2.4.4 优化条件验证实验通过以上试验确定最优化的发酵条件为:

葡萄糖9.0%,玉米浆3.0%,(NH4)2SO46.0%,KH2PO40.05%,Mg SO4·7H2O 0.03%,碳酸钙2.0%,接种量6%,pH 7.0,装液量15 ml/100ml,转速100 rpm,30℃发酵培养96 h。设置5个实验组对确定的发酵条件进行验证,以优化前的条件为对照,结果显示,对照组,组1,组2,组3,组4,组5分别产酸31.0g/L,45.7g/L,44.3g/L,43.0g/L,44.7g/L,42.3g/L。这表明,优化后平均产酸达44 g/L,而优化前产酸31 g/L,优化后比优化前产酸量提高了41.9%。

3 结论与讨论

3.1 结论

以Corynebacterium glutamicum DSM1412为出发菌株,经紫外线和1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍逐级诱变处理和选育,并采用N-硝基-L-精氨酸甲酯进行抗性选育,获得一株高产L-精氨酸和遗传性稳定的菌株Corynebacterium glutamicum ZDNTG5。该菌种产L-精氨酸的量可达31 g/L,比出发菌提高了1.4倍。通过对发酵培养基优化,确定最佳摇瓶发酵条件为葡萄糖9.0%,玉米浆3.0%,(NH4)2SO46.0%,KH2PO40.05%,Mg SO4·7H2O 0.03%,碳酸钙2.0%,接种量6%,p H 7.0,装液量15 ml/100 ml,转速100 rpm,30℃发酵培养96 h。在此条件下发酵,产酸量达44 g/L,产精氨酸的量比未经优化时提高了41.9%,且产酸稳定。

3.2 讨论

工业微生物的菌种选育在发酵工业中占有重要的地位,是决定该发酵产品能否具有工业化生产价值及发酵过程成败的关键。对工业微生物菌种生产具有一定的要求:在遗传上必须是稳定的;容易产生许多营养细胞、孢子或其他繁殖体;必须是纯种,不带杂菌及噬菌体;种子生长旺盛、迅速;生产目的产物所需的时间短、杂质少,易分离提纯;有自身保护机制,抵抗杂菌能力强;能保持较长时间的良好经济效益;对诱变剂处理敏感,可选育出高产菌株;在规定时间内产生预期数量产物,并保持相对稳定[10]。本文所选的诱变出发菌谷氨酸棒杆菌DSM1412基本符合上述要求,目前还未见有关该菌种诱变生产L-精氨酸的报道。

L-精氨酸的生物合成受其自身的反馈抑制和反馈阻遏,选育结构类似物抗性突变株以解除L-精氨酸自身的反馈调节使L-精氨酸得以积累。AE的结构与L-精氨酸结构基本一致,因此AE可以作为L-精氨酸的结构类似物,选育已经解除代谢途径中精氨酸的反馈调节的突变株[11]。本文以谷氨酸棒杆菌DSM1412诱变出发菌株,经紫外线诱变和亚硝基胍多次诱变,并通过精氨酸甲基酯平板筛选,获得一株产L-精氨酸能力有较大提高的突变株谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum ZDNTG5,通过发酵条件优化,得出最佳产酸条件,产酸量达44.0 g/L,并具有较好的遗传稳定性。此出发菌为一国外菌种,有关此菌种诱变产酸的研究还未见报道,本研究提供了初步试验结果。

在选育方法上,本文对菌种采用物理方法与化学方法相结合来对菌种进行诱变。另外,据有关报道,对产精氨酸菌种进行基因改造的研究最早开始于上世纪八十年代,1983年,滕亦等将精氨酸生物合成有关的基因进行克隆。然后将含精氨酸生物合成酶系基因群及卡那霉素抗性基因的重组质粒p EArgl导人到宿主谷氨酸棒杆菌ATCC13032,哈库利棒杆菌ATCC13868及黄色短杆菌ATCC14067中,构建精氨酸工程菌,经72 h培养精氨酸产量分别为1.6 mg/ml、1.8 mg/ml和1.0 mg/ml[12]。近年来,国外很多科学家致力于产精氨酸基因工程菌的构建,但产酸量都很低[13],因此,应用基因工程技术构建精氨酸高产菌为选育工业生产精氨酸菌种的研究提供了另一条思路。

摘要：本文以Corynebacterium glutamicum DSM1412为出发菌株,经紫外线和1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍逐级诱变处理和选育,并采用N-硝基-L-精氨酸甲酯进行抗性选育,获得一株高产L-精氨酸和遗传性稳定的菌株CorynebacteriumglutamicumZDNTG5。该菌种产L-精氨酸的量可达31g/L,比出发菌提高了1.4倍。通过对发酵培养基优化,确定最佳摇瓶发酵条件为葡萄糖9.0%,玉米浆3.0%,(NH4)2SO46.0%,KH2PO40.05%,MgSO·47H2O0.03%,碳酸钙2.0%,接种量6%,pH7.0,装液量15mL/100ml,转速100rpm,30℃发酵培养96h。在此条件下发酵,产酸量达44g/L,产精氨酸的量比未经优化时提高了41.9%。