紫外诱变（精选3篇）
紫外诱变 篇1
纳豆是一种日本传统食品, 具有助消化、预防心血管疾病、延缓衰老等功效。1987年日本学者须见洋行首次对纳豆及其提取物作了系统研究[1]。纳豆激酶是在纳豆发酵过程由纳豆生产菌产生的一种具有纤溶活性的丝氨酸蛋白酶[2], 具有很强的溶解纤维蛋白和血浆酶底物活性, 它不但能作用于纤维蛋白, 而且还能激活动物体内纤溶酶原, 从而增加内源性纤溶酶的量与功能, 表现出较强的溶血栓作用, 可用于治疗和预防血栓病[3]。获得纳豆激酶的主要途径是利用可以代谢产生纳豆激酶的菌株发酵获得, 因而用于纳豆激酶生产菌的产酶性能就显得至关重要[4]。
纳豆激酶生产菌属细菌科, 芽孢杆菌属, 是枯草芽孢杆菌的一个亚种[5], 常用的提高纳豆激酶产量的途径主要有3种:对野生菌种的诱变选育;优化纳豆激酶生产菌的发酵条件;通过基因工程技术改造纳豆激酶的相关基因[6]。本研究通过对纳豆激酶生产菌菌株进行紫外线诱变处理, 选育溶栓活力较高的纳豆激酶生产菌, 为今后的纳豆激酶扩大化生产奠定基础。
1 材料与方法
1.1 菌种
纳豆激酶生产菌 (吉林农业科技学院生物工程学院实验室保藏) 。
1.2 试剂
琼脂糖购自Spanish公司, 纤维蛋白原, 凝血酶及尿激酶购自Sigma公司, 其他常规试剂为国产分析纯。
1.3 培养基
肉汤液体培养基:牛肉膏0.5%, 蛋白胨1%, 氯化钠0.5%, p H 7.0~7.2, 0.1Mpa灭菌20min。
加倍肉汤液体培养基:牛肉膏1%, 蛋白胨2%, 氯化钠1%, p H 7.0~7.2, 0.1Mpa灭菌20min。
纤维蛋白平板:纤维蛋白原20mg溶解于10m L PBS缓冲液中, 50℃水浴待用。取凝血酶50μL (浓度为200μL/m L) 的加入到10m L含2%琼脂糖的PBS缓冲液中50℃水浴待用。将纤维蛋白原和含有凝血酶的溶液迅速混匀, 倒入直径6cm的平板内, 放入4℃冰箱备用。
1.4 试验方法
1.4.1 紫外线物理诱变
挑取纳豆激酶生产菌1环于盛有5m L肉汤的三角瓶中, 置30℃过夜。
次日添加5m L新鲜的肉汤培养液, 充分混匀后, 继续培养5h, 分装于2瓶三角瓶中。
任取1支5m L培养好的菌液倒入离心管中, 1350转/分离心10min。
弃去上清液, 打匀沉淀, 加入生理盐水, 稀释为细胞浓度为108个/m L的菌悬液。
20W紫外灯预热30min后, 取制备好的菌悬液3m L移入无菌培养皿内 (含一无菌转子) , 置于紫外灯下30cm处的磁力搅拌器上, 开启培养皿盖后, 在搅拌的条件下, 紫外线照射分别为30s, 60s, 90s, 120s和150s。
紫外线处理后的平皿中加入3m L加倍肉汤培养液, 即用无菌遮光布包裹后放置于30℃恒温培养箱内, 避光培养24h。
计算致死率与正突变率, 并使用纤维蛋白平板测定酶活力, 并以相同的操作取未经诱变处理的菌液作为对照, 选取产酶活最高的菌液转接到发酵培养基中进一步摇瓶复筛, 筛选出产酶较高的突变菌株。
1.4.2 致死率与正突变率的计算
紫外线物理诱变后菌株的致死率与正突变率计算公式[7]如下:
致死率 (%) =[ (未诱变平板菌落数-诱变后平板菌落数) /未诱变平板菌落数]×100
正突变率 (%) = (酶活增加的菌株数/总菌株数) ×100 (正变株指酶活高于出发株的变异株)
1.4.3 纳豆激酶酶活性检测方法
在纤维蛋白平板上打直径2mm的圆孔, 吸取发酵液上清3μL点样, 静置10min后放入37℃恒温培养箱中, 培养18h, 测定透明圈的垂直直径。根据尿激酶纤维蛋白溶解酶标准曲线, 计算纤维蛋白溶解酶的酶活[8,9]。
2 结果与讨论
2.1 紫外线诱变条件的确定
紫外线广泛地被用作微生物诱变剂, 它可使DNA分子形成嘧啶二聚体, 阻碍碱基正常配对, 并可能引起突变或死亡[10]。为研究紫外线照射时间对诱变效果的影响, 本研究使用的紫外灯功率为20W, 照射距离为30cm, 照射时间分别为30s, 60s, 90s, 120s和150s, 紫外诱变时间与正突变率与致死率关系的曲线见图1和图2。结果表明起初正突变率随着紫外诱变时间的增加而升高。当紫外线照射时间为90s时, 正突变率为2.12%, 此后, 正突变率随诱变时间增加而下降。随着紫外线照射时间的延长, 菌体细胞内的DNA分子所形成的嘧啶二聚体持续增加, 从而影响菌体细胞分裂与增殖, 导致致死率逐渐增加, 当照射时间为90S时, 致死率为79%。
2.2 紫外线诱变结果
通过对纳豆激酶生产菌株进行紫外线诱变共筛选出3株产纳豆激酶活力较高的突变株。紫外线诱变结果见表1。其中菌株2的纳豆激酶活力最高, 为498.84U/m L, 菌株1和菌株3的产纳豆激酶活力分别为495.36U/m L和486.23U/m L, 均低于菌株2, 而作为对照的纳豆激酶生产菌出发菌株产酶活力为467.18U/m L。因此, 本研究中经紫外线物理诱变得到产纳豆激酶活力最高的正突变菌株为菌株2, 其纳豆激酶活力比原始菌株提高了6.78%。
本试验研究了纳豆激酶生产菌紫外线物理诱变的条件。确定了紫外线诱变条件为20W紫外灯照射距离30cm, 照射时间90s, 正突变率为2.12%, 致死率79%, 获得了一株产酶活力为498.84U/m L正突变株, 比原始菌株提高了6.78%。在本研究的基础上, 可以进一步进行复合诱变, 并优化菌株的发酵条件, 用于之后的纳豆激酶扩大生产。
参考文献
[1]Sumi H, Hamada H, Tsushima H, et al.A novel fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese Natto;a typical and popular soybean food in the Japanese diet[J].Experientia, 1987, 43 (20) :1110-1111.
[2]杨艳燕, 李顺意, 高尚, 等.豆豉中纳豆杆菌的筛选和纳豆激酶的初步分离[J].沈阳药科大学学报, 2001, 18 (6) :436-438.
[3]刘柳, 彭喜春.纳豆激酶与豆豉纤溶酶酶学性质比较研究[J].中国酿造, 2010, 29 (8) :88-90.
[4]夏丽, 沙维, 张丽萍.紫外线诱变选育高产纳豆激酶菌株的研究[J].农产品加工 (创新版) , 2010, 206 (4) :9-34.
[5]刁建中, 陈桂光, 马波, 等.纳豆激酶的最新研究进展[J].轻工科技, 2012 (3) :7-8.
[6]陈志文, 徐尔尼, 肖美燕.纳豆激酶的研究进展[J].山西食品工业, 2002 (1) :26-35.
[7]赵斌, 何绍江.微生物学实验[M].北京:科学出版社, 2002:187-191.
[8]江晓, 董明盛.一种食源性纤溶酶 (纳豆激酶) 酶学性质研究[J].中国酿造, 2002 (1) :23-25.
[9]谢秋玲, 郭勇.纳豆激酶活性测定方法[J].广东药学, 2000, 10 (6) :8-10.
[10]李荣杰.微生物诱变育种方法研究进展[J].河北农业科学, 2009, 13 (10) :73-78.
紫外诱变 篇2
关键词：筛选,蛋白加工,中性蛋白酶,酶活,紫外诱变
蛋白酶是重要的水解酶类,也是目前工业化运用最成功,产量最大的一类酶,占酶制剂市场的65%以上[1],其种类繁多,广泛存在于动物内脏、植物茎叶果实以及环境微生物中[2]。近年来,蛋白酶开始显现出其在水产品加工过程中的作用,由于水产品蛋白酶解产物具有较高的营养价值和功能特性,含有丰富的生物活性肽、氨基酸以及牛磺酸和高度不饱和脂肪酸等保健成分,被广泛应用于饲料、食品、化工、医药等各个领域[3]。国内已有报道利用蛋白酶对水产品及其加工过程中产生的下脚料进行水解来生产高附加值的产品,如利用蛋白酶水解生产生物活性肽、鱼露、鱼鳔胶等[4]。
近年来,欧美、日本等发达国家非常注重用于食品蛋白加工用蛋白酶制剂的研发,如Novozymes公司就专门开发出酶解产物具有较低苦味值和较高风味的食品蛋白加工用风味蛋白酶(Flavour ZymeTM)[5,6];而日本天野制药推出的肽酶R、中酸性米曲美蛋白酶M和新日本化学推出的肽酶Sumizyme FP则专门适应于生产无苦味蛋白质水解物。国内目前在食品蛋白加工用蛋白酶制剂的研究开发方面与国外仍有较大差距。中性蛋白酶作用底物广泛,对Gly、Arg、Lys、Phe等氨基酸形成的多种肽链有断裂作用,并且由于其反应条件温和,加工废水不会对环境造成酸碱污染,是目前用于各种蛋白质水解处理的重要蛋白酶种[7]。本实验首先从福建省各种富含水产品蛋白的环境和土壤中筛选中性蛋白酶产生菌株,在此基础上,通过复筛确定产酶能力较强的活性菌株,并进一步通过紫外诱变提高其产酶的能力,以期获得较好的水产品加工用蛋白酶产生菌株,为将来的分子改造提高酶活性和水产品加工提供材料基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
样品采集于福建省不同地区富含蛋白质的环境,如水产品加工厂、鱼类加工厂及加工下脚料堆积场所[8]。
1.1.2 试剂
干酪素、矿物油及各种化学试剂均为国产分析纯或化学纯。
1.1.3 仪器
冷冻台式高速离心机(贝克曼,美国);Ultrospec 2100 pro UV/visible Spectrophotometer(美国通用电气);ZHWY-2122B双层全控温摇床(上海智诚分析仪器有限公司);光学显微镜(Leica DM500)等。
1.1.4 培养基
斜面牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏0.3%,蛋白胨1%,Na Cl 1%,p H值7.0,琼脂粉1.5%。
酪蛋白分离筛选培养基:酪素0.5%,牛肉膏0.3%,蛋白胨1%,Na Cl 1%,p H 7.0~7.5,琼脂粉1.5%。
液体培养基:酪素0.5%,牛肉膏0.3%,蛋白胨11%,Na Cl 1%,p H 7.0~7.5。
酪蛋白琼脂平板:酪素2%,琼脂粉2%,p H7.0~7.5。
1.2 方法
1.2.1 产酶菌株的分离
每份样品取土样5g加入到装有45ml无菌水的三角瓶(6~8颗玻璃珠)中,37℃震荡培养15min。土壤样品混合液进行梯度稀释,得到10-1~10-8稀释度的稀释液。分别取1m L涂布于分离培养基平板上,37℃恒温培养16~24h。挑取具有蛋白水解圈的菌落于另一个平板上划线纯化,经斜面培养后于4℃冰箱中保存。
1.2.2 产酶菌株的筛选
1.2.2.1 平板透明圈初筛与确认[9]
将分离得到的菌株分别在两个酪蛋白分离筛选培养基上平行划线,37℃培养16~24h。在其中一个平板上加上适量的0.1mol/L TCA溶液,根据蛋白水解圈直径的大小初步确定不同菌株降解蛋白质的能力,选择水解圈直径较大的菌落,挑取另一平板对应位置的的菌落经斜面培养后于4℃冰箱中重新保种,作为进一步复筛的出发菌株。
1.2.2.2 液体发酵复筛[10]
用接种环挑取初筛得到的菌接种至5m L液体发酵培养基中,37℃、230r/min条件下振荡培养40 h,5 000r/min离心30min,取上清液,用酪蛋白水琼脂平板进一步确定不同菌株降解蛋白质能力大小,筛选出产酶活力最好的菌株。
1.2.3 产蛋白酶菌株的发酵实验[11]
将出发菌株和突变株分别接种至5ml的牛肉膏蛋白胨培养基中,37℃、230r/min过夜摇12~16h,按5%接种量接种至50ml的液体发酵培养基中,每株接3瓶,每隔4h取样,3次重复测定所产蛋白酶活力,计算蛋白酶产生菌的菌体生长量和酶活力。酶活数据为3次重复实验的均值,并采用Sigma Stat2.03软件进行数据统计和分析,进行差异显著性分析。
1.2.4 蛋白酶产生菌株的紫外诱变
1.2.4.1 诱变菌悬液的制备
将诱变出发菌接入液体发酵培养基,37℃、220r/min振荡培养过夜后,离心,弃上清,加入无菌生理盐水,重新振荡悬浮菌体,再离心,弃上清,重复上述步骤加入。最后加入5ml生理盐水恢复成菌悬液,用血球计数板在显微镜下直接计数,逐步添加生理盐水调整细胞浓度为108/m L。取诱变前的0.5ml菌悬液进行10-1~10-7稀释分离,取10-5、10-6、10-7三个稀释度,每一梯度取100μl菌液涂布平板,37℃倒置培养24h,进行平板菌落计数ml。
1.2.4.2 紫外诱变
将每5ml菌悬液置于9cm的无菌培养皿中,将待处理的培养皿置于诱变箱内,培养皿距离20W紫外灯的距离为30cm左右,轻轻摇匀后打开皿盖,分别处理1min、3min、5min,照射完毕后先盖上皿盖,再关闭紫外灯;取0.5ml处理后的菌液进行10-1~10-5梯度稀释分离,取其中的10-3、10-4、10-5三个稀释度各取100μl菌液涂布平板,用黑色包装袋包好37℃倒置培养(避光培养)。诱变过程在暗室红灯下进行。当长至合适大小时,进行平板菌落计数m2,计算致死率。
观察菌落水解圈大小,挑取水解圈较大的单克隆在平板上划线,放入37℃培养8~10h取出,4℃冰箱保存。
1.2.5 蛋白酶活性的测定
1.2.5.1 平板定性检测
将发酵上清液点于2%酪蛋白平板上,放入37°水浴锅温浴一段时间,观察透明圈大小。在复筛与活性确认过程中,可以在平板上加入0.1mol/L TCA突出水解圈效果。
1.2.5.2 Folin-酚试剂定量检测[12]
标准曲线制备:以酪氨酸为反应底物,配制不同浓度的酪氨酸溶液(10μg/ml~80μg/ml),采用福林酚法定量检测680nm的吸光值,并以蒸馏水作为对照。以酪氨酸溶液作为横坐标,680nm的吸光值作为纵坐标绘制标准标准曲线和回归方程。
蛋白酶活性的检测:采用改良的Folin酚试剂显色法测定酶活力。
酶活力单位(U)定义为37℃下,1min水解Casein蛋白底物产生1mg酪氨酸的酶量为一个酶活力单位。
2 结果与分析
2.1 产蛋白酶菌株的筛选
从12份土样中,一共分离挑取187株具有明显蛋白酶活性的单菌落,通过对比水解圈大小,观察菌落形态和颜色,初筛,确认得到11株透明圈明显的蛋白酶产生菌,依次编号为W1~W11(见图1、2)。进一步复筛结果显示,W5、W7、W8、W9、W10酶活性较高并且稳定。
2.2 产蛋白酶菌株的发酵实验
经过初筛,确认得到11株透明圈明显的蛋白酶产生菌,复筛结果显示W5、W7、W8、W9、W10酶活性较高并且稳定,其中W9酶活较高且多次发酵实验证明产酶能力稳定。发酵结果如图3所示。
2.3 蛋白酶产生菌W9的酶活和生长曲线
图4为筛选得到的具有产蛋白酶能力的的野生菌株W9酶活曲线和生长曲线。由发酵过程曲线可知,W9在0~3 h处于短暂的延迟期,菌体细胞进入分裂繁殖前期,菌体量很少,蛋白酶活力几乎没有产生;3~28h处于对数生长期,菌体细胞迅速分裂繁殖,菌体积累量急剧增加。蛋白酶的产生急剧上升;28~40h处于稳定期,菌体细胞分裂繁殖保持相对稳定,菌体和蛋白酶的积累均达到最高,菌体OD600达到3.4±0168,蛋白酶活力达到1 594.346±32.54(U/ml);从40h开始,W9进入衰亡期,菌体细胞裂解自溶菌体量递减,但蛋白酶活力稳定在1 400(U/ml)左右。
2.4 蛋白酶产生菌W9的紫外诱变育种
选取10-3、10-4、10-5三个稀释度各取100μl菌液涂布平板,与对照组同时计数,实验结果表明随着紫外照射时间的延长,菌株W9的平均致死率提高,在5min时候致死率达91.07%,而1min时致死率为56.55%,3min时的致死率为80.20%。已有的报道表明低剂量处理能提高菌的正突变率,负突变率一般出现在较高的剂量中。我们在实验过程中分别采取1min、3min、5min对不同的出发菌株进行诱变。
挑取诱变后酪蛋白平板上具有明显透明圈的突变菌株,进行酶活测定,并与野生菌株进行酶活比较,最终在W9经诱变后产生的具有明显透明圈的菌株中筛选得到了1株比野生菌株酶活具有明显提高的突变株。由酶活过程曲线(图6)可知,突变菌相比野生菌来说,酶活有所提高,在前30h酶活提高得较多,30h过后,酶活提高平稳,28h突变菌酶活达到最高,相比野生菌的1 594.346(U/ml)提高至1 845.33(U/ml),提高了15.6%。
3 讨论
国内外已经有很多关于蛋白酶产生菌株筛选的报道,但是筛选专门应用于水产品加工用蛋白酶生产菌株的工作并不多。目前用于水产品加工的蛋白酶除了Flavour ZymeTM等少数几个品种外,大多并不是专门用于食品加工过程,如Alcalase主要是用于洗涤剂和皮革加工工业。因此尽管这些酶具有很高的降解效率,但它们的使用也存在不少问题,如水解产物苦味重、废水处理污染以及加工过程中受到原料的抑制等[3],而一些植物蛋白酶由于其来源少,效率低,不适合工业化生产[13]。
紫外诱变 篇3
1 实验材料
1.1 菌株
产黄青霉菌618#
1.2 培养基[2]
(1) 斜面培养基 (%)
甘油0.75;甘油蜜糖0.75;酵母浸处粉0.5;NaCL 1;CaSO40.025;部分微量元素;琼脂2.7;pH 6.8
(2) 菌丝培养基 (%)
玉米浆6.1;蔗糖2.0;CaCO30.5 (调PH后加入) ;pH 5.8
(3) 再生培养基 (%)
NaNO30.3;MgSO4·7H2O 0.05;FeSO4·7H2O 0.001;KCL 0.05;KH2PO40.1;
葡萄糖4;酵母膏0.2;琼脂2.7;pH 6.8 (用稳定剂配制)
(4) 稳定剂
0.7M NaCL
(5) 种瓶培养基
以蔗糖、玉米浆为主要碳、氮源, pH5.8
(6) 发酵瓶培养基
以乳糖、玉米浆为主要碳、氮源, 加无机盐类组成, pH5.9
1.3 酶
纤维素酶+cellulase R—10
2 实验方法
2.1 原生质体的制备
(1) 菌体培养
将618#菌种新鲜斜面加入适量无菌水, 刮下菌株孢子制成孢子悬液, 经玻璃珠打散过滤后取1m L接种于40m L的菌丝培养液中, 28℃, 240rpm条件下培养36h, 得到菌丝体。
(2) 胞壁酶处理
用4层无菌纱布过滤收集菌丝体, 无菌水洗2-3次, 再用稳定剂洗两次, 取1g左右的菌丝体悬浮于5m L稳定剂中, 加入5mg纤维素酶和5mg cellulase R-10, 30℃恒温水浴振荡摇床60rpm, 1.5-2h, 镜检有大量原生质体释放后, 用200目尼绒网滤除菌丝碎片和未酶解的菌丝体, 滤液经1000rpm离心5min, 弃上清, 加10m L稳定剂重复离心两次, 加入5m L稳定剂悬浮原生质体, 备用。
2.2 紫外线诱变处理原生质体
取原生质体悬浮液适量, 进行紫外线 (253.7nm) 诱变处理, 分别照射25′′和40′′。
2.3 高产菌株的检出
将处理后的原生质体悬浮液涂于再生培养基平皿中, t=25℃, Φ=45±5%, 恒温培养7天。带菌落长出后, 挑选结构紧密, 形状规则的单菌落传斜面培养后, 进行发酵摇瓶的筛选。
3 实验结果
3.1 紫外线对原生质体的致死作用
我们对产黄青霉菌618#进行了紫外线处理, 并分别采用25′、40′的计量处理原生质体, 由表1可以看出, 随着照射时间的增加, 致死率也相应提高。
3.2 发酵相对效价与相对产量的变化
经摇瓶发酵筛选得到701#菌种, 该菌种在发酵效价与总产量方面均高于出发菌株618# (表2) 。
3.3 限氧条件下的摇瓶考查
用改变瓶口纱布层数来改变供氧的方法考查76#菌株在限氧条件下发酵效价的变化情况 (表3) 。
由表3可以看出, 随着纱布层数的增加、供氧量的减少, 701#菌株的发酵效价变化不大。
3.4 单位菌丝合成能力的比较
单位菌丝合成能力的比较是考查一个新菌株是否有推广生产价值的主要参数之一, 为此我们将菌株701#和菌株618#进行了对比考查 (表4) 。
从表3可以看出701#菌株单位菌丝的青霉素合成能力明显高于618#菌株。
3.5 稳定性考查
将701#菌株传代后, 进行摇瓶考查, 结果表明其F1代、F2代、F3代发酵效价与总产量均无明显变化, 说明该菌株的稳定性较好。
4 讨论
本试验采用的方法筛选青霉素高产菌株, 试验证明, 产黄青霉菌的细胞壁被去除后, 对紫外线的敏感度增强, 随着照射时间的增加, 致死率相应提高, 在引起绝大多数原生质体致死的同时, 存活个体中的变异频率大大提高, 处于对数生长期的菌丝体最容易酶解, 通过摇瓶筛选我们得到701#菌株, 该菌株除发酵效价和总产量有所提高外, 对氧的需求也有所降低, 取得了很好的效果。
摘要：青霉素G发酵生产过程, 菌种的制备是关键, 随着生产菌种不断的传代与使用往往产生衰退现象, 利用紫外线诱变原生质体的方法, 选育青霉素高产菌株, 使发酵效价与总产量分别提高了8.2%和6.4%, 为青霉素生产奠定了坚实的基础。
关键词：紫外线,诱变,原生质体,选育
参考文献
[1]熊宗贵.发酵工艺与原理[M].中国科学技术出版社.