离体组织

离体组织（精选9篇）

离体组织 篇1

百合是观赏价值较高的花卉, 花色、花型各异, 许多品种香味幽雅, 是名贵的切花材料, 百合约有80余种, 其中有39种原产我国, 但某些种类已濒临绝灭。随着百合在国内外鲜切花市场走俏, 百合花生产和消费逐年递增, 但由于普繁百合商品球繁殖率低, 病毒浸染造成种球退化严重, 难于满足切花生产需要, 本试验在前人研究的基础上, 对兰州7个百合优良品种进行离体快繁研究。

一、材料与方法

试验材料为甘肃省定西市临洮新兴花卉公司提供的7个品种, 艾德林娜、西伯利亚、瑞塔、元帅、索蚌、普丽安娜、普莱托, 取健康的百合磷片, 先用洗涤剂清洗干净, 再用70%的酒精处理30秒~60秒后, 用1.5克/升汞将百合的外部、中部、内部鳞片分别消毒8分钟、6分钟、4分钟, 最后用无菌水冲洗5次, 在无菌条件下, 将鳞片接种在附加不同浓度的NAA、IAA、BA生长调节剂的MS培养基上, 蔗糖浓度为20克/升、p H调整到5.8, 琼脂浓度为4.5克/升~5克/升, 培养室温度为 (25±1) ℃, 每日光照12小时~16小时, 光照强度为1000勒克斯。

二、结果与分析

㈠百合小鳞茎的诱导

接种后3周~5周在鳞片的边缘上诱导出淡黄色的不定芽原基呈环状突起, 每块一般有2个~4个, 多的可达8个, 再经过4周后, 这些不定芽原基继续普长形成绿白色小鳞芽, 然后把这些小磷芽转移到新的分化培养基上, 2周后便可形成小苗。

1. 不同品种的差异。

供试7个品种的百合鳞片, 除索蚌外, 均可分化出鳞芽, 但各个品种差异较大 (见表1) , 在相同的培养条件下, 西伯利亚分化率最高达86.0%, 其次为普莱托, 瑞塔最低仅为13.0%, 鳞片分化小鳞茎的也是西伯利亚, 普莱托为最高, 分别为4.2和4.0个芽, 瑞塔和普丽安娜比较低仅为1.7和1.8, 这说明不同百合品种的分化能力有较大差异, 其分化能力依次为西伯利亚、普莱托、艾德林娜、元帅、普丽安娜、瑞塔、索蚌。在相同条件下, 不同品种分化小鳞茎的能力有差异, 其原因有二:一是不同品种的内源激素水平不同, 因此在离体培养中所需要的外源生长调节剂也不一样, 这与杨增海等报道相似;二是有些材料对消毒处理有不同的反应, 例如供试的索蚌, 百合鳞茎球, 在相同的消毒条件下, 反应敏感, 故其诱导率为0。

注:培养基为MS+BA0.1毫克/升+I AA0.05毫克/升, 材料为中层鳞片。

2. 不同部位的百合鳞片分化鳞茎能力差异。

把7个优良品种的鳞片分成外层、中层、内层三部分, 分别接种在MS+BA0.1毫克/升+IAA0.05毫克/升的培养基上。3周后发现西伯利亚百合的分化能力强, 中层、外层鳞片开始出现乳黄色突起。8周后检查各个部位的鳞片分化小鳞茎的数量 (见表2) 。

注:品种为西伯利亚, 培养基为MS+BA0.1毫克/升+NAA0.05毫克/升。

3. 不同激素配比对百合鳞片分化小鳞茎能力的影响。

本试验共设四个配比对百合鳞片分化小鳞茎能力的影响。

4. 不同激素配比对百合鳞片分化小鳞茎能力的影响。

本试验共设四个配比对百合鳞片分化小鳞茎能力的影响本试验共设计四个配比: (1) MS+BA0.5毫克/升+NAA0.05毫克/升; (2) MS+BA1.0毫克/升+NAA0.05毫克/升; (3) MS+BA1.5毫克/升NAA0.05毫克/升; (4) MS+BA0.5毫克/升, 结果表明, 4个配比的激素均可诱导百合鳞片分化小鳞茎, 但各个的分化率不同 (见表3) 。

注:品种为西伯利亚。

从表3可见, 不同激素配比对百合鳞片分化小鳞茎能力有明显差异, BA0.5毫克/升+NAA0.05毫克/升配比最适合西伯利亚鳞片的分化, 其分化率可达81.0%, 其次是BA0.5毫克/升。因此, 对于西伯利亚鳞片诱导适宜的BA浓度大约在0.5毫克/升左右。杨增海等 (1987) 认为MS+BA0.5毫克/升+NAA0.5 (1.0) 毫克/升有利于兰州百合鳞片分化小鳞茎, 新美芸1985认为MS+NAA0.1毫克/升+BA0.5毫克/升对姬早百合鳞片离体培养的效果最好。因此, 可以认为不同配比的培养基及激素的对百合鳞片诱导分化小鳞茎的能力有不同影响, 但普遍认为, MS培养基较适合各种百合离体培养, 生长素和细胞分裂素以BA与NAA配合为佳。

㈡百合小鳞茎的继代培养

不同激素对百合小鳞茎继代培养的影响。将诱导的小鳞茎, 接种到不同生长素和细胞分裂素配比的MS培养基上培养1个月后, 每块小鳞茎即可分化出1个~5个新的小鳞茎 (见表4) 。

表4表明, BA1.5毫克/升+NAA0.05毫克/升的配比繁殖系数为5.1, 小鳞茎多呈丛生状态, 苗较矮小瘦弱, BA1.0毫克/升+NAA0.05毫克/升的配比繁殖系数次之为4.3, 但苗长势良好, 整齐度也较高, BA0.5毫克/升+NAA0.05毫克/升的配繁殖系数最低, 仅为2.1, 苗生长较缓慢, 大部分有长根现象。因此, 从工厂化育苗的角度来考虑拟选BA1.0毫克/升+NAA0.05毫克/升配比, 由此可见, 每个小鳞茎1个月至少可增殖成4个新的小鳞茎, 如果每年平均继代培养10次, 则1个小鳞茎在1年内即可繁殖410个小鳞茎。

注:培养基为MS。

三、讨论

通过7个百合优良品种的离体快繁实验研究表明, 百合鳞片的离体繁殖在生产中有很好的应用前景, 影响百合鳞片的诱导的因素是多方面的, 与激素种类及用量、繁殖品种及鳞片部位均有密切关系, 不同品种的百合鳞片分化能力有一定差异, 这是由于各个品种的内源激素水平不同而异, 使用激素浓度应略有差别, 鳞片不同部位分化小鳞茎能力也有较大差异, 鳞片中层分化能力最强, 因此在工厂化育苗拟采用中层鳞片培养, 在激素配比中, BA和NAA是首选的常用激素, 效果好, 价格相对便宜, 试验结果表明, 最适宜百合鳞片分化小鳞茎的激素配比为BA0.5毫克/升+NAA0.05毫克/升, 小鳞茎继代培养的最佳激素配比为BA1.0毫克/升+NAA0.05毫克/升, 苗长势良好, 整齐度也较高。

榅桲离体培养繁殖的研究 篇2

关键词:榅桲;愈伤诱导;植株再生;生根诱导

中图分类号:S661.94+3文献标识号:A文章编号:1001-4942(2010)01-0005-05Research

on Propagation in Vitro of Quince

WEI Guo-qin1,2,DAI Hong-yi1*,SUN Yu-gang2,LIANG Mei-xia1,AN Miao2

(1.College of Horticulture, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China;

2.Shandong Institute of Pomology,Taian 271000,China)

Abstract The regeneration system in vitro of quince (Cydonia oblonga Mill.) was established. The results indicated that the optimal medium for calli induction via leaves was 1/2MS+KT 0.5 mg/L+ 2,4-D 1.0 mg/L+sucrose 30.0 g/L+agar 6.5 g/L. The optimal medium for the differentiation of calli was 1/2MS+TDZ 3.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L + sucrose 30.0 g/L+agar 6.5 g/L. The optimal medium for plant regeneration via leaves was MS+TDZ 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+sucrose 30.0 g/L+agar 6.5 g/L. The optimal medium for root induction was 1/2MS+IAA 0.3 mg/L+sucrose 30 g/L+agar 6.5 g/L.

Key words Quince; Callus induction; Plant regeneration; Root induction

榅桲(Cydonia oblonga Mill.)属蔷薇科、榅桲属(cydonia)果树,原产于伊朗、土耳其[1]。其果实营养丰富,具有特殊芳香味,是食品工业的重要原料。榅桲在欧洲被用作西洋梨的矮化砧木,如榅桲A、榅桲B和榅桲C[2]。榅桲还可用作药材和观赏树木[3～4]。

目前国外对榅桲的研究较多,对其组织培养及离体再生方面的研究也较成熟[5～12]。国内对榅桲的研究较少,仅局限于对植物学和生态学特性、栽培管理、茎尖组织培养[13～14]及榅桲果实中一些成分的研究[3,4],有关榅桲愈伤组织诱导及叶片再生培养的研究在国内尚未见详细报道。

青岛农业大学于1991年从英国引进榅桲A的种子,经播种获得少量植株。为了加速繁殖,我们对其进行了组织培养快繁研究,并建立了榅桲的离体再生体系。1 材料与方法

1.1 材料

2009年4月份自田间取榅桲枝条,剥取芽内约0.5 mm大小的茎尖,用75%酒精表面消毒10~15 s、0.1% HgCl2灭菌4 min,经蒸馏水冲洗5~6次后,接种于MS+6-BA 0.50 mg/L+NAA 0.05 mg/L+蔗糖 30.0 g/L+琼脂6.5 g/L培养基中进行初代培养,30 d后将成活新梢茎段转接至MS+6-BA 0.30 mg/L+IAA 0.03 mg/L+蔗糖30.0 g/L+琼脂6.5 g/L培养基中继代增殖,40 d后苗高4~5cm,以后每30 d继代一次。试验所用材料均取自榅桲继代苗(图版A)。

1.2 方法

1.2.1 叶片愈伤组织诱导

选取试管苗顶部3~4片新叶,用手术刀沿垂直于叶脉方向划伤叶片,伤口间距约2 mm,分别接种于愈伤组织诱导培养基中,在恒温(26℃)暗环境下进行愈伤组织诱导。

1.2.2 愈伤组织不定芽分化 取生长较快的愈伤组织,接种于添加不同植物生长调节剂组合的MS培养基上,置于光照培养室中诱导分化不定芽。

1.2.3 叶片不定芽再生 选取试管苗顶部3~4片新叶,用手术刀沿垂直于叶脉方向切割,间距约1~2 mm,并保持叶片的完整性,分别将叶片接种于不定芽诱导培养基中,并进行不同时间的暗处理,30 d后观察不定芽分化情况。

1.2.4 不定根的诱导 取生长健壮、高约3 cm的茎段接种于生根培养基中,40 d后统计生根情况。

1.2.5 培养条件 本试验所用基本培养基有MS、3/4MS、1/2MS,其中蔗糖浓度30.0 g/L,琼脂6.5 g/L,pH 5.8,培养温度26℃。光照培养时光照周期为16 h/d,光照强度为1 500~2 000 lx,暗培养采用黑暗恒温(26℃)培养箱。

2 结果与分析

2.1 叶片愈伤组织的诱导

将叶片接种到愈伤组织诱导培养基中,结果发现C4~C7培养基中的叶片7 d后开始在切口处形成浅黄色愈伤组织,随着培养时间的延长切口处的愈伤组织不断增大,35 d左右叶片完全愈伤化。其余培养基中的叶片在接种10 d后开始形成愈伤组织,生长速度较慢。由表1可见,8种培养基均能高效诱导出愈伤组织。叶片在添加KT和2,4-D的培养基中出愈率均达100%,以在C5培养基中形成的愈伤组织体积最大,说明C5培养基最适合诱导榅桲愈伤组织。对比C2、C7培养基可以看出,2,4-D诱导愈伤组织的效果优于IBA。不同的植物生长调节剂组合诱导的愈伤形态不同:C1~C3培养基诱导出白色、坚硬、致密愈伤组织(图版C),继代生长慢,有轻微褐变现象;C4~C7培养基诱导出浅黄色、松散愈伤组织(图版B),继代增殖快,不褐变;C8培养基诱导出黄色、坚硬、致密愈伤组织,继代生长较快,不褐变(图版D)。3种形态的愈伤组织在原培养基上均无不定芽发生。

表1 植物生长调节剂对叶片愈伤组织诱导的影响

培养基植物生长调节剂浓度(mg/L)BAKTIBA2,4-D外植体数愈伤组织诱导率(%)愈伤形成量

C11.0-0.5-4052.5 d多

C20.5-1.0-4087.5 ab多

C30.5-0.5-4085.0 bc多

离体组织 篇3

肿瘤热疗技术已成为治疗肿瘤的一种重要手段,其与放、化疗结合使用能大大缓解放化疗给患者带来的副作用和并发症,并成倍提高有效率[1,2]。要达到抑制或杀死肿瘤细胞而又不能损伤正常组织的目的,要有准确可靠的温度实时监控系统。目前临床上采用的有创测温技术[3]是将温度传感器插入待监测部位进行单点或多点的直接测量,精度较高,但存在测量方面的局限及探头可能带来的副作用[4]。为克服有创测温存在的问题,国内外对无创测温技术进行了大量的研究,采用的方法有超声波测温、核磁共振测温、X线CT测温、微波测温及电阻抗成像法测温。

电阻抗成像测温法是根据组织的电阻抗温度特性,通过监测电阻抗参数的变化计算得到温度的变化来实现温度间接测量[5]。与其他方法相比,电阻抗成像法(electrical impedance tomography,EIT)具有成本便宜、便携、易与热疗设备配合等优点。课题组前期已经完成了对动物多种组织、人体颅骨、人体乳腺等电阻抗频谱测量[6,7,8,9]。国外学者也开展了生物肝组织阻抗温度相关性的相关研究[10,11],由于方法、实验条件不一样,生物肝组织的阻抗温度相关性没有一个国际公认的标准。

我们前期已经对生理盐水、琼脂和新鲜离体兔肝在模拟热治疗过程中的阻抗频谱特性、电阻率与温度间的相应关系等问题进行了系统的研究[12]。本研究是基于腹部物理模型,对加热和冷却过程中的猪肝进行EIT监测,研究分析EIT图像变化与温度变化之间的关系,为今后肿瘤热疗中采用EIT对加热区进行快速定位并实时估计体内温度分布奠定基础,为肿瘤热疗中的EIT无创温度监测提供方法和技术。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 物理模型

如图1所示,实验所用物理模型为内直径为284 mm、高为240 mm的圆柱形有机玻璃容器,16根电极条等间隔摆放于圆周内壁,每根电极条上有8个中心间距为20 mm的镀金圆电极,电极直径为8 mm。

2.1.2 实验对象

新鲜猪肝切成45 mm×30 mm×60 mm小块,每块肝质量为25 g。

2.1.3 加热元件

单头加热管,直径为Ф6 mm,长为100 mm,工作电压为220 V,功率为150 W,温度由温控装置直接读出(T1),反映了加热管内部的瞬时温度。

2.1.4 数字温度表

采用了1个Fluke 17B型(USA)T2和2个MS6051数字温度表(东莞华仪仪表科技有限公司)T3、T4对肝组织内温度监测。采用的TP-01电热偶探头,其测量范围为-50~150℃,分辨率为0.1℃。在0~99.9℃范围内准确度±1℃。测量前,仪器需要预热30 s。

2.1.5 EIT图像监护系统

实验所用EIT图像监护系统为本课题组研制,系统的驱动电流幅度设置为1 250μA,频率设置为50 kHz,采用对向驱动模式。成像算法为加权阻尼最小二乘法,单元重建,云图显示。监护成像速度为1帧/s。

2.2 方法

由文献可知,腹部电阻率的平均值为500Ω·cm[13],该实验将盐溶液(480Ω·cm)注入物理模型来模拟腹部阻抗分布。该盐溶液由3 000 m L蒸馏水和1.5 g NaCl配置而成,盐溶液高度超过最底层电极,高为50 mm。

热电偶测温探头T2与加热管底端固定,并插入肝30 mm处,由智能PID温控仪控制加热管的温度,T2反映的是加热中心点的温度。整个实验过程是从T2温度为20℃时开始加热,直到其上升到69℃时停止加热,让猪肝温度自然冷却回到20℃。2个热电偶测温探头T3、T4插入肝30 mm处,T3距发热管10 mm,T4距发热管20 mm,以监测肝不同位置的温度变化。水银温度计T5靠近猪肝置于盐溶液中以监测溶液温度。

猪肝位置固定于11电极与中心2点间,支架标尺16 cm处。将猪肝泡在模型盐溶液中大约2 h后再进行升温实验,减少测量猪肝组织内残留血扩散的影响。普通的实验室环境,室温大约为20℃,实验时尽量减少外界扰动。

3 结果

3.1 EIT重建图像与温度的定性关系

图2为肝组织及探头物理模型中位置示意图,图中a、b、c分别表示T2、T3、T4探头所处位置,他们位于一条水平线上,插入组织深度相同。T2处为加热管与组织接触部位;T3离加热管10 mm;T4离加热管20 mm;d点为水银温度计T5所在位置,其监测的是背景溶液温度。

图3表示加热过程中T2监测的整点温度下的猪肝的EIT重建图像。在本实验的所有EIT图像中,红色表示该区域电阻率下降;蓝色的表示电阻率上升;绿色的为基线。加热管刚得电工作时的数据设定为背景数据(第7 936帧)。从一系列图像中可以看到,随着温度的上升感兴趣区域颜色逐渐变红,并有扩大趋势。这表明图像变化与组织温度的变化存在一定的关系。

3.2 EIT边界电压均值与温度关系

我们对T2温度边界电压值变化曲线进行拟合,以边界电压值为x,温度值为y,获得拟合的曲线方程。拟合结果如图4所示,图中实线表示拟合的曲线,圆代表实验数据。由图4可以看出,实验数据曲线与拟合曲线吻合较理想。拟合的曲线方程为:

Goodness of fit:

我们常用剩余平方和来评价对曲线拟合的效果,∑(Y-Y2)2为剩余平方和,∑(Y-Y1)2为均方差,其中Y为所测真实值,Y1为均值,Y2为曲线拟合求得的理论值。当剩余平方和与均方差之间的比值越小,那么拟合求得的理论值则与真实值越接近,表明曲线拟合得越好。检验曲线拟合的标准通常用相关指数R2表示:其值越接近1表明曲线拟合得越理想。

3.3 感兴趣区域重构值与温度间关系

导入物理模型实物尺寸,按实际大小剖分,形成图5(a)所示剖分重构域。

图5表示的是根据实物尺寸,以T2为中心的感兴趣区域(ROI)中重构值随温度变化关系,其中(b)(c)(d)图形分别表示猪肝刚开始加热(T2=30℃)、猪肝加热(T2=69℃)、猪肝冷却(T2=20℃)的重构图像,在这3张重构图像中小圆圈表示选择的感兴趣区域。

图5(e)表示升降温过程中,以T2为中心的感兴趣区域内重构均值与温度变化曲线,其中矩形表示的是加热过程,星形表示的是降温过程,左右两边的纵坐标分别表示加热过程与冷却过程。图5(e)中的箭头b、c、d分别表示猪肝刚开始加热(T2=30℃)、猪肝加热(T2=69℃)、猪肝冷却(T2=20℃)。由图我们可知升温过程中的ROI值变化幅度远大于降温过程。升温过程随着温度的上升ROI的值单调下降,降温过程中随着温度的下降ROI的值先下降再上升。

我们对T2温度的感兴趣区域重构值变化曲线进行拟合,获得拟合的曲线方程并分析T2温度与感兴趣区域重构值之间的关系。拟合结果如图6所示。拟合的曲线方程为:

图6中实线表示拟合的曲线,圆代表实验数据。由图可以看出,实验数据曲线与拟合曲线吻合较理想。

Goodness of fit:

本实验中根据拟合值与其实际值,算出的相关指数为:R2=0.9973,说明拟合程度较好。我们将所得感兴区域重构值代入拟合曲线方程,求得拟合温度值。实测温度与感兴趣区域重构值拟合温度值对照,得出最大温度误差为-1.19℃。

3.4 图像像素灰度值与温度的关系

对T2各整数点温度时的EIT图像进行分析,在EIT图像上叠加一矩形,其位置大小按实际猪肝位置及形状,沿中心点画一条直线,通过自制软件计算出不同温度的EIT图像上该直线各点像素的灰度值。

图7为直线上各点在不同温度下的灰度值变化曲线,其横坐标表示直线上从左上到右下各点的位置,其中36表示的是猪肝中心位置,即T2温度探头所处位置;纵坐标表示的是各像素的灰度值。从图中可以看出,随着温度的上升,直线上各点像素灰度值都在上升,其中处于肝组织中间位置的灰度值增加的幅度大于两侧。图中可见30~40℃灰度值变化最小;50~60℃的灰度值变化幅度最大。

图8为3个不同位置的像素灰度值8随着T2温度的变化曲线。采用的加热方式为电热管插入肝组织中心位置加热,因热传导作用,肝组织从中心到边缘的温度由高到低分布。各部分组织的温度不同,导致其电阻率变化也不相同。图中可见在同一时间,T2、T3、T4温度不同,肝组织EIT图像上相应位置的灰度值也不同,表明了EIT能够较好地反映肝组织内温度的分布。

注:T2为肝组织中心点;T3为距中心10 mm处;T4为距中心20 mm处

4 讨论

基于物理模型上应用EIT监测高温热疗实验中,随着温度的上升,目标区域越来越红,表明其电阻抗在下降,同组织电阻率-温度特性测量实验结论[12]吻合。

在升温过程中,总边界电压值随着温度的上升逐渐下降,说明随着温度的上升,猪肝电阻抗的值在逐渐下降。在降温过程中,当T4温度开始下降的时候,总边界电压值才开始随着温度的下降逐渐上升。根据T4所处猪肝的实际位置,T4温度下降也就表明此时整个肝的温度在下降,此时总边界电压值在缓慢上升说明猪肝电阻抗在上升。当T4回到升温前温度时,总边界电压值仍远小于起始的总边界电压值,这反映了猪肝组织在升温过程中有部分组织发生了变性。将实验过后的肝剖开,可见加热管附近5 mm的肝组织颜色明显发白,表明这部分肝组织明显变性。

成像结果、数据分析后均证实,阻抗变化与温度间存在确定性关系,但是并不是大多数文献中报到的恒常数关系或线性关系,而是呈现了非线性关系,同前面组织阻抗温度特性的测量结果一致。

曲线拟合后的结果显示,用边界电压、感兴趣区域重构值等表征温度时,可以获得较好的拟合效果,边界电压的最大拟合绝对误差在3.6℃左右,感兴趣区域重构值的最大拟合绝对误差在1℃左右,提示EIT在应用中有可能准确监测温度变化及其分布。

总之,物理模型实验表明EIT监护系统能够快速准确地反映模型内部的温度场的位置分布。

摘要：目的:获得肝组织的EIT图像与温度的关系,为采用电阻抗成像法监测在肝肿瘤热疗时的体内温度奠定基础。方法:将新鲜离体猪肝放入装有盐溶液的物理模型中,测温探头插入肝组织的不同位置用于监测过程中的温度分布,用EIT实时图像监测肝组织的阻抗变化。结果:EIT图像显示组织温度上升时,组织阻抗逐渐下降。随着温度的上升,EIT图像目标区域颜色明显有变红,并呈扩散趋势。用边界电压、感兴趣区域重构值等表征温度时,可以获得较好的拟合效果,边界电压的最大拟合绝对误差在3.6℃左右,感兴趣区域重构值的最大拟合绝对误差在1℃左右。结论:温度变化与图像变化之间存在一定的关系,高温时组织电阻抗特性发生显著改变,在临床热疗中有可能通过EIT来实时监测热疗时的温度。

柱花草花药离体培养研究 篇4

分类号 S541.04

In Vitro Anther Culture of Stylosanthes

SHAN Guoyan1，2） ZHENG Jinlong1，2） GAO Jianming1，2，3）

CHEN Helong1，2，3） ZHANG Shiqing1，2，3） YI Kexian1，2）

（1 Environment and Plant Protection Institute，CATASs，Haikou，Hainan 571101，P.R. China；

2 Ministry of Agriculture Key Laboratory of Tropical Crop Biotechnology， Haikou， Hainan 571101；

3 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，CATAS，Haikou，Hainan 571101，P.R. China）

Abstract In order to establish an efficient anther culture system of Stylosanthes， get regenerate plantlet and provide basic materials for the research of ploidy， genomics and molecular biology of Stylosanthes. This experiment taking the anther of Stylosanthes guianensis cv， Reyan2 as explants to study the effect of plant growth regulator， medium and low temperature pretreatment on Stylosanthes anther culture. The results indicated that low temperature pretreatment for 24 h was better than other treatments. N6 medium supplemented with 2，4-D 0.5 mg/L，KT 1.0 mg/L was the best for induction of cullus. MS +NAA 0.2 mg/L + 6-BA 3.0 mg/L was the best for regeneration culture.

Keywords Stylosanthes ； anther culture ； callus induction ； division of adventitious bud

柱花草（Stylosanthes spp.）又名笔花豆，是全球热带地区栽培面积最大、应用最广泛的优良豆科牧草。柱花草原产于南美洲，该属有44个以上的种或亚种[1]。柱花草炭疽病是威胁其推广种植的主要障碍，近年来国内外在柱花草种质资源的收集、引种选育，从体细胞变异或体细胞融合技术中获得抗炭疽病植株以及利用遗传工程获得抗病转基因植株等方面展开了多项研究[2-6]。国外在20世纪60年代就开展了柱花草的组织培养研究[7-8]，但由于所使用的基因型有限，成效不显著。随着遗传工程技术的日益成熟，通过该技术培育更多优良的柱花草品种希望较大。同科柱花草不同品种的组织培养技术国内外已有成功的报道[9-13]。但是目前关于柱花草花药培养研究尚未见报道。

花药培养作为一种新的育种手段，在很多作物育种中得到应用。通过花药培养可诱导花粉发育形成单倍体，快速获得纯系，缩短育种周期，还有利于诱导花药形成隐型突变体，提高选择效率。所诱导出的单倍体仅有一套染色体，它具有特殊的遗传学特征：（1）遗传的（染色体的）稳定性和变异性；（2）小孢子无性系变异；（3）遗传基因型在纯合的植株水平上充分表达。所以，不仅是研究遗传、变异、重组和表达等遗传学问题的一个理想体系[14]，通过它还可以迅速得到DH 群体、克服远缘杂交不育性、提高育种效率。本试验主要研究影响柱花草花药培养的因素，旨在建立柱花草花药培养技术体系，为今后开展柱花草遗传育种研究积累资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

材料为‘热研2号’柱花草的花药，取自中国热带农业科学院热带牧草研究中心。

1.1.2 试验用品

2 结果与分析

2.1 愈伤组织的诱导

2.1.1 愈伤组织形成

柱花草花药离体培养1周左右开始膨大，部分花药颜色由黄色变淡黄色至黄褐色，个别花药出现晶状小水珠。2周左右某些花药颜色发亮，经过1～2 d，发亮的花药逐渐开裂，并从缢痕处生出小白点，逐渐扩大体积，颜色由白变淡黄或黄绿色，这就是愈伤组织。大多数在20 d左右形成愈伤组织，刚开始愈伤组织生长缓慢，但以后逐渐加快，接种20～30 d为愈伤增殖高峰期，35 d后逐渐有褐化现象出现。愈伤组织的形态大致可以分为2种，一种是质地疏松的白色组织，另一种是质地致密的黄绿色组织，有紧实型和疏松型，紧实型中又分表面光滑和不光滑2种。前者颜色较深，在培养过程中慢慢老化死亡，或不分化；后者生长旺盛，分裂能力强，分化成苗的潜力大。故紧实表面不光滑、黄绿色的愈伤组织，具有分化成带有绿色芽点和植株的能力。

2.1.2 不同基本培养基对柱花草花药愈伤组织诱导的效应

培养基类型对花药愈伤组织的诱导率有明显影响，花药在不同培养基上的长势也不同（表2）。在2种基本培养基比较试验种，以N6培养基的愈伤组织诱导率最高，MS次之。同时，N6培养基上的愈伤组织发生时间最早，愈伤组织直径也大于MS培养基所诱导的愈伤组织。N6培养基对柱花草花药愈伤组织诱导的效果优于MS培养基。试验说明，不同基本培养基对诱导柱花草花药愈伤差异较大。以N6培养基最适合柱花草花药愈伤诱导。

2.1.3 培养基及附加成分对愈伤组织形成的影响

柱花草花药接种于12种培养基上（表3），2.3 生根培养

在分化培养基中的苗长到4～5 cm的时候，将丛生芽由愈伤组织上切下，在无菌条件下分成细小的单株和健壮的单株，分别转接到生根培养基M13和M14中。转接后约过10 d开始生根，生根率均可达90%以上。

3 讨论与结论

（1） 低温预处理对柱花草花药培养的影响

有研究认为，低温预处理的作用是能够提供一个更适合的环境，以利于愈伤组织诱导和诱导期花药存活。接种前的低温处理有利于提高花药培养效率，但确切的机制尚不清楚，可能与一种分子量为32 ku的蛋白质有关[16]。自Nitsch等[17]于1973年首次发现低温预处理可提高毛叶曼陀罗花药培养中胚状体的形成以来，水稻、小麦、大麦等多种作物的花药培养用低温预处理后均可不同程度地提高花粉愈伤组织或花粉胚状体的诱导频率[18-20]。本试验中，分别对柱花草花药进行4℃低温预处理24、48、72 h，其愈伤组织诱导率均高于对照，在这一点上，与大多数植物的花药培养相似。

（2） 基本培养基对柱花草花药愈伤组织诱导的影响

培养基是植物组织培养的物质基础。选择不同的基本培养基，对柱花草花药愈伤组织诱导有着明显的影响，因此有人研制专门的培养基及其附加物，如针对烟草花培的H和T培养基[21]。本实验选取MS、N6两种培养基对花药诱导进行比较，结果表明，MS培养基的诱导率最高，愈伤组织发生时间最早，而且愈伤组织在继代培养过程中色泽、质地均优于N6培养基。因此，在进行柱花草花药培养时，可选择MS培养基作为基本培养基，以提高花药培养效率。

（3） 激素处理对柱花草花药培养愈伤组织诱导的影响

在培养基中加入不同的激素种类及浓度，对柱花草花药愈伤组织的诱导有不同的影响。培养基中激素的种类、用量和配比，对诱发小孢子启动、分裂、生长和分化起决定性作用，一般低浓度的生长素类物质可提高胚状体的诱导率[22]。有研究[23]表明，愈伤组织的诱导形成，生长素是必需的，其中2，4-D应用较多，附加一定浓度的细胞分裂素效果可能更好。本试验结果表明：在柱花草花药培养中，2，4-D对愈伤组织的形成是必不可少的，并且2，4-D与KT配合使用比单独使用KT、6-BA的诱导效果好。不同激素配比对柱花草花药培养的效果有待进一步研究。

柱花草花药培养是获得无毒苗的途径之一，其优点是脱毒率高、安全可靠。在提高花药培养诱导率的基础上，将花药培养技术与细胞离体筛选、诱变、转基因技术相结合，可在短时间内培育出柱花草新品种。特别是以花药培养单倍体愈伤组织或植株作为转化受体，可以实现外源基因的稳定转化，在柱花草转化研究中具有广泛应用前景。

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离体组织 篇5

关键词：弹性,弹性测量,应力,应变,杨氏模量,剪切模量,泊松比,粘弹性,力学测试,压缩,拉伸,扭转,弯曲,膨胀

1 材料弹性测量背景介绍

我们在此专栏第一期文章中概括地讨论了组织弹性测量的意义,在这一期我们主要介绍离体组织弹性测量的常用方法,包括一些所谓“标准”的测试方法,例如压缩等,也包括一些比较特殊的方法,例如膨胀测试法。标准的测试方法受测量本身和外在因素的影响小,可以认为是组织弹性测试的“金”标准(gold standard)。弹性是生物组织很重要的一种材料特性,生物组织虽然跟工程固体材料例如金属和塑料有很大的不同,但本质上也是一种材料,所以在材料力学和弹性力学当中,一些常用的测试方法作一些适当的处理就可以直接推广到生物组织的弹性测量上面。相对于固体工程材料,软组织包含水分,某些组织的结构如胶原蛋白纤维网络的排列方向会随位置或者深度方向的不同而不同,因此它的材料性质也比较复杂,实际当中要完全精确地测量组织的力学特性不太现实,需要简化组织的模型获得尽量少,但是有效的弹性参数。先从最简单的弹性固体模型说起,传统的连续介质固体弹性理论证明,假设被测物体是各向同性的材料,在小形变下应力/应变表现为线弹性,遵从胡克定律(Hooke's Law),那么反映其应力/应变基本关系的本构方程(constitutive equation)可以表示为[1,2]:

其中ε为应变,σ为应力,下标代表笛卡尔直角坐标系下不同的三轴x、y和z,E为杨氏模量(Young's modulus),μ为剪切模量(Shear modulus),ν为泊松比(Poisson's ratio)。在各向同性的假设下,三个材料参数里面只有两个是互相独立的,它们之间的约束关系可以表示为:

这些基本的材料参数需要通过实验进行测量,测量的方法包括下面介绍的压缩、拉伸、扭转、弯曲测试等。当把生物组织简化到均匀的各向同性并且忽略其随时间变化的粘性特征的时候,就可以用这些基本的实验方法来测得组织的弹性参数。实际应用当中,因为组织力学特性的复杂性,这样简单化的模型不能满足测量需求。为了更进一步获得组织的非线性粘弹性系数,必须假设更加符合材料特性的本征方程然后结合相对应的实验进行测量[3],例如实际应用当中经常使用的两个模型——超弹性模型(hyperelasticity)[4,5]和加了时间特征的准线性粘弹性(Quasilinear viscoelasticity,QLV)模型[6,7,8],就可以用来更好地预测组织的力学行为,获得更好表征组织力学行为的非线性粘弹性参数。

离体组织测试的缺点也是显而易见的,因为离体组织已经脱离了它本身所在的生物体,周围环境变化以及新陈代谢的中断,其力学特性很可能已经跟活体组织情况产生了很大的变化,所以测得的参数可能并不能很好地代表该组织在生物活体情况下的弹性特征。实际测量当中可以通过优化的标本保存方法,尽量避免这种情况的发生,或者尽量减小这些离体因素的影响。对于某些组织来说,这两种情况的差别可能很大,譬如对于那些有包膜的组织,例如淋巴结,离体小样本测量的时候可能已经破坏了外面的被膜,再加上离体情况下淋巴液流动的停止,所以在离体和活体情况下测量出的弹性参数可能会有很大的区别。而对于某些组织例如软骨[9]或脚底软组织[10],通过合适的低温保存,弹性特征的变化不显著。所以对于活体和离体情况下的差异,不同组织受其生理结构和组织功能的不同而有很大的不同,实际当中需要对每种组织作不同的评估,然后决定合适的测量方法。本文首先介绍离体组织弹性测量的常用方法,然后重点以软骨测试为例具体说明这些测试方法在生物医学领域相关的应用,最后小结全文。

2 软组织弹性常用测试方法

本节着重介绍几种常用的离体组织弹性的测量方法。我们这里需要特别指出的是印压(indentation)测试,它既可以应用在离体测量,又可以用在活体组织测量上,是一个非常有用的弹性测量方法。对于印压,因为非常广泛的应用还有其可用于活体组织测量的特殊性,本文不作重点介绍,我们会在接下来的两期里面单独讨论。对于下面介绍的常用测量方法(除了膨胀),我们主要介绍最简单化的组织模型下(各向同性、均匀和小形变固体)测量组织弹性参数例如杨氏模量或者剪切模量的公式。对于更加复杂组织的非线性粘弹性模型,我们在2.5中作简要介绍。

2.1 压缩和拉伸测试

压缩或拉伸是最常用的离体组织弹性测量方法,这里我们只讨论简单的单轴压缩或拉伸测试。非受限单轴压缩(unconfined uniaxial compression)实验将外形规则(一般是圆柱体)的标本放在两个夹板之间进行压缩,在横向让组织自由膨胀,然后测量组织在小形变情况下的应力/应变关系,算得组织的杨氏模量。在单轴压缩情况下,应力除σxx外,其它都为0,公式(1)可以简化为:

也就是说,组织杨氏模量可以通过以下公式求得:

其中F为被测样本所受总外力,A0=πr2为样本受压横截面积,l0样本初始厚度,l为样本形变。实验当中为了防止压缩时样本失稳,样本高度和直径之比(l0/2r)可取1.5~2.0[11]。在压缩之后,组织会在横向有膨胀,假设横向应变为εyy,那么所测组织的泊松比也可以通过以下公式求出:

组织在横向的应变可由多种方法求得。Jurvelin等[12]利用光学显微镜方法观察软骨在压缩测试时横向的应变,然后直接求得软骨的泊松比。Lu等[13]利用超声来观察样本在横向的形变情况,同样可以求得所测样本的泊松比。实际测量当中需要注意夹板跟组织之间的摩擦力对测量结果的影响。这是因为摩擦力的存在使得靠近压板附近的组织横向扩张受到限制,跟理论的压缩模型产生了差异[14,15],这种差异会随着摩擦系数的增大显得更加明显。有限元分析表明,当接触表面摩擦系数为0.5的时候,应力/应变曲线相对于零摩擦力情况下的差异可达到50%或以上[15],该影响不能忽略。实际操作中,通常可以使用摩擦力小的抛光压板[4]或者在夹板上加一层光滑薄膜,如聚四氟乙烯(PTFE)[5],或者利用添加润滑剂[13,14]来减小摩擦力对测量的影响。

受限压缩(confined compression)是另外一种常用的生物组织弹性测量方法。在四周受限压缩情况下,横向的应变为0,也就是说,εyy=εzz=0,根据胡克定律的另外一种形式[3],此时:

式中,

称为整体模量(aggregate modulus),代表材料在横向受限压缩情况下的弹性特征。可以看到假如材料体积完全不可压缩(ν→0.5),整体模量会趋向于无限大(实际组织测试当中不会发生),当材料体积压缩性很大时(ν→0),整体模量就趋近于杨氏模量,所以整体模量也是组织体积是否具有可压性的一个直观的体现。受限压缩测试应用最多的组织是关节软骨[16,17,18,19,20,21,22],其次还有半月板[23]、椎间盘[24]等类软骨组织及皮肤[25]。受限压缩测试的特点是在把组织看成两相性(biphasic,固相和液相)时,可以控制组织液体流动的方向,并且结合松弛或者蠕变测试可以用来测试组织的液体渗透性(permeability)。实际测试当中,根据组织本身具体情况决定周围测试仪器的材料。例如在关节软骨受限压缩测试当中,通常横向包围软骨组织的选用密封无孔材料,模拟软骨在快速压缩下的低渗透率,软骨底部压头也选用无孔材料以模拟软骨底部骨头对液体的低渗透性,但是软骨表面压头一般选用孔状材料,允许软骨液体在测试中自由流出。在两相性组织模型里,组织最后稳定状态下测到的是其中固态结构的整体模量,它和组织杨氏模量的关系如公式(7)所描述,如泊松比已知,可互相转化。

拉伸实验跟压缩实验类似,可以用来测量组织的弹性特征。该方法通常使用在那些需要通过拉伸来完成其生物力学功能的组织,例如血管[26,27,28,29]、筋腱[30,31,32]、韧带[33,34]和皮肤[35,36]。实验中需要用拉头固定组织样品的两端,并且确保生物组织和拉头在拉伸测试中不会有相对运动。通常可以在拉头表面使用砂纸以增大拉头和组织之间的摩擦力,防止拉头和样品的相对滑动。对于中空的组织,例如血管,拉伸还可以在两个方向进行,一个是沿着血管方向的拉伸[28],测试血管组织沿着血管方向的弹性参数;另外一个是沿着径向的[29],可以模量实际当中血管中血压对血管的撑大膨胀作用,获得血管沿径向的弹性。对于某些微细的组织,例如结缔组织基本成份之一的胶原蛋白纤维,特别适合用拉伸来测试其弹性特征[37]。

2.2 剪切和扭转测试

活体生物组织在力学运动中所受的应力除了轴向的压缩或拉伸外,还伴随着剪切形变,例如不同心肌层之间存在的剪切形变是心脏在收缩期心肌增厚的原因之一[38],在大脑组织上也可以经常看到因为剪切产生的创伤[39]。因此生物组织的剪切力学性能也是组织很重要的一个特性参数,需要用剪切测试或者扭转测试来获得。纯剪切实验需要准备规则的长方体样本,根据公式(1),简单的小形变剪切测试只需要测量出剪切应力/应变就可以获得材料的剪切模量:

其中Fxy为组织表面沿y向所受剪切力,A0为剪切力作用面积,dxy为剪切方向位移,l0为组织的厚度。Dokos等设计一个用于剪切测试的三轴测量系统[40],并用于各向异性的心肌的剪切特性测量[41]。Tanaka等[42]研究发现颞下颌关节盘的动态剪切模量跟测试的频率有关,而且具有方向性。

在使用扭转测试时,需要准备标准的圆柱体样本,假设其截面半径为r,对应极惯性矩(polar moment of inertia)为J=πr4/2,长度为L,扭矩为M,那么圆周处的剪切应力为[43]:

假设此时样本扭角(twist angle)度为φ,那么圆周处的剪切应变为:

那么所测材料的剪切模量就可以通过以下公式算出:

为简单化,有时候也用扭矩/扭角比(M/φ)直接表征组织的扭转硬度[44]。标准的扭转测试可能只适合于相对硬度比较大的生物软组织,例如软骨[45]和韧带[44,46]等。

2.3 弯曲测试

虽然不是很常见,但是弯曲测试也可以用来测量软组织的弹性测量[47,48],例如血管壁[49,50]和脉瓣[51],这是因为这些组织在血流运动学中的受力状态有点类似于弯曲测试。简单的三点弯曲测试,假设受力组织为截面宽度b,高h的长方体,所受力偶矩(moment of couple)为M,受力后弯曲的圆弧半径为R,那么组织的有效杨氏模量可以通过以下公式求得[52]:

其中I=bh3/12为样本的贯性矩(moment of inertia)。Yu等[49]研究了动脉血管壁在弯曲测试里中性轴(neutral axis)的位置,并且发现血管内膜和中膜的硬度远远大于外膜的硬度。Roy等[53]用弯曲测试比较耳廓软骨和肋软骨的硬度,还比较了组织工程培养出来的软骨硬度与自然软骨硬度的区别,结果显示耳廓软骨硬度大于肋软骨硬度,人工培养的软骨硬度则小于自然软骨的硬度。

2.4 膨胀测试

膨胀测试就是利用组织内部离子浓度和外部溶液离子浓度不同引起的唐南渗透压(Donnan osmotic pressure)引起的形变,测量组织的力学特征参数[54]。该方法的优点是不需要借助外来负载直接利用组织内部产生的渗透力使组织产生形变,该方法被广泛应用于软骨组织的测试上[55,56,57,58,59,60,61,62,63]。当周围溶液离子产生变化的时候,因为离子浓度的不平衡,在软骨内部产生渗透压,使软骨产生膨胀,并最后通过胶原蛋白的拉伸产生的应力来达到平衡。膨胀测试已经被成功用于测量软骨的硬度特性。在计算中,应力由唐南压计算,需要知道软骨在不同层的固定电荷浓度(fixed charge density)、水分浓度分布和溶液浓度;对于软骨不同位置应变的测量,可用光学方法测量[62],但是其缺点是只能观察软骨样本外边界处的变化情况,无法观察样本中间任何截面上组织形变情况。Tepic等[64]用超声的方法观测软骨在渗透压负载下的形态变化情况,但是他们测量当中只使用了软骨表面反射的信息,没有在膨胀测试中对软骨内部进行观察。鉴于高频超声可以很方便观察软骨的内部变化,我们组采用了50MHz高频超声探头对软骨进行超声显微成像,成功测得软骨内部不同层在膨胀中的不同应变情况,并结合一个四参数三相软骨模型成功测得软骨不同层的整体模量分布情况[65,66,67,68,69,70],再一次验证了软骨整体模量随着深度的增加而增大的结论[20]。

2.5 粘弹性系数和本构方程

由于软组织结构的复杂性,简单的各向同性、均匀性的线弹性模型在实际当中很多情况下都不符合组织在生物体里面真实的力学行为。例如,简单的线弹性模型就很难解释组织的应力松弛和应变蠕变实验,也不能解释为什么生物体的弹性参数与激励的频率有关。生物组织普遍具有所谓应变硬化(strain hardening),也就是硬度随着应变增大而增大的现象,这就是软组织的非线性弹性,对于某些组织这种非线性在测试的时候也必须考虑。所有这些都可以在代表组织力学行为特征的本构方程得到体现。例如,为了模拟组织在大形变下的非线性力学特征,一个很常用的模型就是超弹性(hyperelasticity)模型[4,71,72,73]。该模型假设一个应变能量方程,描述应力/应变之间的非线性关系,然后结合实验数据进行逆问题求解,获得这个应变能量方程中的系数值,用它们代表组织的弹性特征,这些系数被证明可以用来区分正常和疾病组织[74]。另外一个常用的考虑组织粘弹性的模型就是准线性粘弹性(Quasi-linear viscoelasticity,QLV)模型[6]。QLV模型假设在应力松弛实验下利用一个代表弹性(T(λ))和一个代表粘性(G(t))的函数之乘积分离组织的粘弹性:

其中F为t时刻的应力,λ为零时刻对组织施加的阶跃形变。粘性方程可以用来求得跟组织粘性有关的松弛时间参数和常数,弹性部分则代表组织的暂态弹性特征。然后考虑形变随时间的函数为u(t)的组织所受的应力为f(t),根据力的叠加原理,它们之间的关系可以写成:

其中T上一点表示对时间τ求一次导数。根据实验测得形变u(t)和力f(t),我们就可以利用最优化方法求得弹性和粘性函数当中的代表组织弹性特征的参数,并用于特征化不同的组织。我们已经成功将该方法应用于比较腿部软组织在肌肉不同收缩状态下和颈部组织放疗后不同纤维化程度下粘弹性特征的不同[75,76]。QLV模型还可广泛用于其它类型软组织,例如脊髓[77]、韧带[78]、食道[79]和足部软组织[7,8]等的力学测量。除了这两个模型,在外力负载作用下组织的粘弹性行为,还可以用包含基本单元弹簧和阻尼器的复合结构(串并联)来描述[3],在该模型下,用一个弹性系数k代表每个弹簧的弹性,另外用一个阻尼因子η代表每个阻尼器的特性,描述它们力学特征的基本方程为:

公式中x为位移,x上一点代表求导,v代表速度。可以通过实验数据进行曲线拟合获得结构中基本单元的参数,用以表征组织测试表现出来的粘弹性行为。详细介绍组织粘弹性的本征方程已经超出了本文的范围,有兴趣的读者可以参考这方面的专著[80,81]。

3 软组织常用弹性测试方法的应用

上面介绍的这些离体软组织弹性的测量方法在应用方面,主要以基础研究为主,或者作为活体生物组织通过弹性进行疾病诊断的可行性研究。所谓基础研究,就是找到合适的力学模型,来描述组织在各种测量当中的力学行为。这些模型能让我们更加理解组织的生物力学行为,可用于计算机的虚拟现实(virtual reality)技术,例如模拟手术当中对组织的触感。对于疾病的诊断方面,准确的弹性力学模型可以预测弹性变化的机制,找到干预这些变化的有效手段。如果能够验证组织弹性在离体状态下可以作为疾病诊断的依据,那么这些弹性参数就有进一步的可能用于在活体上对疾病进行诊断。下面我们主要以软骨为例介绍离体弹性测量在这些方面的应用。

3.1 离体软骨弹性测试应用

软骨在人体运动力学上起到很关键的支撑和润滑作用。之所以要了解软骨的弹性特征,是因为由骨关节炎或者创伤引起的关节退化,是一种很常见的疾病,因为软骨本身自我代谢的速度比较慢,所以普通软骨创伤恢复的时间就比较长。对于软骨的退化,如果在晚期才检测出来,目前没有有效的医治方法。伴随着早期软骨退化的一个很重要的特征就是其硬度的变化,因此可以通过其硬度的测量来诊断其病变,做到早发现早治疗,治疗效果也就可能会相应提高。因为关节软骨所处的位置在关节腔内,空间比较小,所以活体测量软骨的弹性是一个比较有挑战性的课题。实验已经证明适当的低温冷藏和解冻技术对软骨样本的生物力学性能影响不是很大[9,82],所以离体测试也就成了很常用的可以深入了解软骨弹性特征的测试方法。

上面提到的这些离体组织的弹性测试方法都在软骨上获得了应用。其中应用最多的就是拉伸、自由压缩和受限压缩,可用来研究软骨弹性与其结构成分的关系。Kempson等[83]利用拉伸实验证明软骨的拉伸硬度跟里面的胶原蛋白纤维方向有关,顺着纤维方向拉伸的硬度明显大于跟纤维方向垂直方向的拉伸硬度[84],同时在软骨深度方向,拉伸硬度表层最大,随着深度的增加而减小。利用受限压缩,Schinagl等[20]发现整体模量表层最小,随着深度的增加而增加。拉伸和压缩硬度随深度变化的模式为什么有这样的不同呢?这可以归结为软骨两种主要成分胶原蛋白(collagen)和蛋白多糖(proteoglycan)随深度分布的不同。研究表明软骨拉伸硬度受胶原蛋白的影响大一些,而压缩硬度主要跟蛋白多糖浓度相关[85,86,87]。软骨中表层的胶原蛋白最多,蛋白多糖最少,而中下层却刚好相反[85],这就导致了拉伸和压缩硬度随深度变化模式的不同。另外,当软骨发生退化以后,其拉伸硬度和压缩硬度都会减小[85]。例如,Akizuki等[88]通过实验得到股骨髁(femoral condyle)处表层正常软骨拉伸模量均值为7.79MPa,但是同一位置具有骨关节炎退化特征的软骨拉伸模量则降到1.36MPa,显示退化后软骨硬度产生了明显的下降,这表示软骨的抗压性能下降,那么它就难以维持关节在正常活动中的生理负荷,这种超过极限的负荷随时间积累可能会加速软骨退化的速度。扭转测试也被用来测量软骨的弹性特征,使用小幅度扭角的时候,扭转测试结果跟软骨里面液体流动性无关,所以可以测得里面固态结构的本征弹性参数。Setton等[45]用前十字韧带切除手术动物模型来模拟关节退化,通过扭转实验发现手术之后6周软骨的剪切模量降到了手术前的60%左右,说明软骨质量也发生了明显的退化。为了确定软骨硬度跟临床上经常使用的软骨质量分数之间的关系,Kleeman等利用压缩测试软骨在终稳状态下的硬度,然后跟两个常用的软骨质量评分系统:Mankin score和国际软骨修复协会推荐的软骨质量分数(ICRS grade)进行相关性分析,得出软骨硬度跟Mankin score的相关度为R2=0.47,而其与ICRS grade之间的相关度为R2=0.69。正常的软骨跟ICRS grade为2级和3级的软骨可以通过硬度进行区分,但是和1级软骨之间硬度有重叠,区分就有困难。Zheng等结合自由压缩测试与超声测量技术对关节软骨作了一系列的测试[89,90,91]。他们发现经酶trypsin处理过的软骨有层状的硬度分布[89]。另外他们还观察到了软骨在应力松弛测量中存在应变的松弛现象,即在受压方向不同深度软骨组织的应变分布会随着时间的变化而改变[90]。这一发现验证了软骨两相理论所预测的结果。Zheng等还通过自由压缩测试与超声显微镜开发了超声弹性显微镜并成功应用于软骨弹性分布的测量[91]。总的说来,离体弹性测量已经成为一个研究软骨的基本工具,除了用来研究软骨的退化,还可以用在软骨的修复[92]以及组织工程软骨的质量评估[93,94,95]等方面。

3.2 离体组织弹性测试的其它应用简介

除了在软骨上面的应用,离体弹性测试方法在其它组织方面的应用也是广泛的。作者在这里举几个例子以期在这方面可以起到抛砖引玉的作用。第一个例子是肝纤维化检测。为了证明肝硬度跟临床常用的肝纤维化评分标准具有一致性,Yeh等[96]利用压缩实验测试离体肝脏的硬度,然后跟METAVIR分数进行相关分析,可以得到显著的正向相关性,证明利用肝硬度评估肝纤维化水平具有可行性。第二个例子是脚底软组织的弹性测量,特别是糖尿病人的足部因为糖基化引起的血管供血不足和神经损伤,长期引起的后果是足部组织硬度会发生改变。Pai和Ledoux[97]通过离体压缩测得糖尿病人脚底组织平均硬度为(1147±446)kPa,而正常人脚底组织的平均硬度为(593±205)kPa,证明糖尿病人脚底软组织的确受到了病变的影响。最后一个例子跟癌症组织的硬度相关。Krouskop等[98]利用离体印压实验发现在乳腺组织和前列腺组织上,恶性肿瘤组织在大形变情况下弹性模量增加的程度比正常和良性病变组织大,证明恶性肿瘤组织具有很大的非线性弹性特征,因此测量组织的非线性弹性参数对于组织病变的诊断具有很大的潜力。

4 结束语

离体组织 篇6

1 材料与方法

1.1 扁桃无菌体系的建立

1.1.1 试验材料

试材为山西省农科院果树研究所扁桃园的晋扁1号 (Jin Almond No.1) 和晋扁4号 (Jin Almond No.4) 。

1.1.2 方法

取当年生新梢, 用自来水加少许洗洁精洗去其灰尘, 再用清水冲洗30min。将其剪成带有一芽的茎段及顶芽, 置超净工作台上, 再用无菌水清洗2～3次, 然后用75%的酒精进行表面消毒15～20s, 用无菌水冲洗3～5次, 再用10%的次氯酸钠 (NaClO) 消毒10～15 min, 无菌水冲洗3～5次, 最后再用解剖刀剥去芽鳞片, 取下芽体接种到MS+6-BA0.8mg/L+GA30.2mg/L+Suc30mg/L+Agar6.5 mg/L+NAOH1mol/L (调pH值至5.8) 的培养基上启动培养。

1.2 细胞分裂素类物质对扁桃叶片愈伤组织诱导影响

*同列不同的大小写字母分别表示在0.01和0.05水平上有显著差异

2 结果分析

细胞分裂素6-BA和KT对诱导晋扁1号和晋扁4号叶片诱导愈伤组织有重要的影响, 其诱导效果达到了极显著水平, 通过比较显示出, 当6-BA浓度分别为3.0mg/L与4.0mg/L时促进晋扁1号叶片愈伤组织的发生, 但是其质量不高。枯叶率随着6-BA浓度的增加而升高, 差异极显著, 当6-BA浓度为4.0mg/L时, 枯叶率高达50.69%。而6-BA浓度为1.0mg/L和2.0mg/L时, 叶片愈伤组织的诱导效果又不理想 (没有愈伤组织发生) 。不同浓度的KT对晋扁1号愈伤组织诱导差异显著, 且出愈率极显著高于用细胞分裂素6-BA时的, 愈伤组织质量也明显比用6-BA时的好。晋扁1号的出愈率最高是在KT浓度为1.0mg/L时, 达55.69%, 与其它两个KT浓度下的出愈率差异显著;一定浓度的细胞分裂素6-BA和KT对诱导晋扁4号叶片愈伤组织的效果与诱导晋扁1号叶片愈伤组织的效果呈现相似的变化规律, 其差异显著, 枯叶率最高出现在6-BA浓度4.0mg/L时, 达40.36%, 出愈率最高为10.40%;而KT浓度为1.5mg/L时, 最高出愈率为36.15%, 与其它两个KT浓度下的出愈率差异极显著, 且愈伤组织质量也明显比用细胞分裂素6-BA时的好 (表1) 。

3 结 论

通过对晋扁1号和晋扁4号的叶片出愈率与愈伤组织质量的调查发现, 这两个品种的最佳愈伤组织诱导的细胞分裂素分别是:KT浓度为1.0mg/L和1.5mg/L。

摘要：本研究以2个扁桃品种——晋扁1号和晋扁4号为试材, 分别以春季刚萌发芽的茎尖、生长季的一年生新梢茎段和顶芽为外植体建立无菌体系。研究了细胞分裂素对试管苗离体叶片愈伤组织诱导的影响。

关键词：扁桃,叶片培养,愈伤组织诱导

参考文献

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[6]刘祥林, 汤浩茹.桃组织培养及叶片愈伤组织诱导研究[J].四川农业大学学报, 2005 (05) :18.

长寿花离体快繁技术研究 篇7

1 材料与方法

1.1 试验材料

以市售盆栽长寿花作为供试材料。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体的采集、清洗和消毒。

用消毒后的解剖刀采集盆栽长寿花的叶片, 自来水仔细清洗后, 在无菌条件下用75%酒精消毒30 s, 再用0.1%升汞消毒7~8 min, 无菌水冲洗3~5次后接种于初代培养基上。

1.2.2 一次成苗培养。

配制培养基:MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA0.1 mg/L+蔗糖3%+琼脂粉6.5 g/L, 调节p H值至5.8左右。如无特殊说明, 培养箱温度白天保持25℃, 夜间保持20℃, 光照强度4 400 lx, 光照时间8 h/d。

1.2.3 继代增殖培养。

配制MS和MS+6-BA 5.0 mg/L 2种培养基, 对初代培养获得的试管苗进行继代增殖培养。

2 结果与分析

2.1 初代培养结果

叶片培养1周后进行观察, 发现用酒精和升汞结合起来的消毒效果比较理想, 叶片污染率很低。约2个月后再观察, 发现从长寿花叶柄处长出既有芽又有根的完整植株, 实现了一步成苗 (图1、2) 。

2.2 培养基对试管苗增殖的影响

试管苗在MS和MS+6-BA 5.0 mg/L 2种培养基上生长一段时间后观察, 发现试管苗在MS+6-BA 5.0 mg/L培养基上增殖率非常高, 植株密集 (图3) , 但是试管苗的质量很差, 生长瘦弱, 叶片很小, 植株的茎半透明, 发脆, 发生了玻璃化。一般玻璃化苗的移栽成活率都很低, 发生玻璃化的原因, 可能是该培养基中细胞分裂素6-BA浓度过高所致。而试管苗在MS基本培养基上长势良好 (图4) , 根系数量多且分布均匀 (图5) 。

3 结论与讨论

试验以长寿花叶片为供试材料, 进行了外植体的消毒、初代培养和继代增殖培养, 结果表明:长寿花叶片一步成苗的适宜培养基配方为MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖3%+琼脂粉6.5 g/L, 试管苗在MS基本培养基上增殖系数较高, 试管苗生长健壮。

细胞分裂素在试管苗的增殖过程中发挥着重要作用, 可以诱导芽的分化, 促进侧芽萌发生长。但并不是说细胞分裂素浓度越高越好, 该研究发现, 虽然长寿花试管苗在附加5.0 mg/L 6-BA的MS培养基上增殖率很高, 植株密集, 但是试管苗的长势差, 发生了玻璃化, 移栽之后一般都很难成活。所以数量不能作为衡量试管苗增殖的唯一指标, 还应结合瓶苗的长势进行评价。而衡量瓶苗质量的好坏, 主要依据苗的根系状况、整体感、出瓶苗高、叶片数4个方面进行判定[12]。其中, 根系状况对瓶苗质量影响最大, 也是最重要的指标, 其次是整体感、出瓶苗高和叶片数。

参考文献

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离体眼球体内环境模拟装置的研制 篇8

目前,作为离体眼球的保存装置,现有的离体眼球表面灌流系统中的各部分彼此独立,并未形成一台装置,且灌流装置使用了恒流泵,导致该系统结构复杂、操作不便、制作成本高。因此研制一种简单、使用操作简易的离体眼球体内环境模拟装置是必要的。

1 设计原理和技术方案

1.1 设计原理

正常动物泪腺不断分泌泪液,泪液通过动物的瞬目作用均匀涂布在眼球表面形成泪膜,从而对角膜外表面进行湿润和保护。泪液在完成上述功能以后,通过内眦部的鼻泪管开口流入鼻腔。离体眼球体内环境模拟装置利用仿生学原理,在体外模拟这一生理过程,以期维持离体眼球的正常形态及其对刺激物的反应能力。

1.2 技术方案

离体眼球体内环境模拟装置利用恒温水浴为离体眼球模拟体内温度,同时将特定离子浓度的滴加液按一定的速度滴加到离体眼球表面,以维持角膜的湿润状态。

2 离体眼球体内环境模拟装置整体及电路设计

2.1 整体的设计

如图1所示,离体眼球体内环境模拟装置包括滴加液水浴箱、滴定装置、湿房水浴箱及废液箱。滴加液水浴箱及湿房水浴箱分别由滴加液水浴箱温控仪和湿房水浴箱温控仪独立控制温度,滴加液水浴箱给滴加液加热并维持温度在32℃左右,湿房水浴箱用于加热湿房周围的水并维持湿房温度在32℃左右。滴定装置由流量开关、流量观察窗、流速控制阀组成,流量开关控制滴加液的开关,当流量开关开启,滴加液利用自重力滴加到湿房水浴箱湿房中眼球表面,流量控制阀控制滴加液的流速,观察窗用于观察滴加液的流速,最后废液流入废液箱中。

2.2 离体眼球体内环境模拟装置的电路设计

在图2中, 离体眼球体内环境模拟装置的电路图由缺水保护电路、滴加液水浴箱电路及湿房水浴箱电路组成。市电经过变压器T、桥堆D1～D4及滤波电容C1转换成12V的直流电,该直流电给继电器KM1、KM2及周围电路供电,继电器触点KM1、KM2为常开触点,二极管D5、D6为继电器KM1、KM2瞬时通断时线圈所产生的大电流提供旁路,不至于烧毁三极管。以滴加液水浴箱为例,当水浴箱的水位超过电热棒高度时,缺水开关闭合,三极管Q1导通,继电器KM1通电,触点KM1闭合,水浴箱加热棒及潜水泵工作,当水浴箱水位低于电热棒高度时,缺水开关断开,三极管Q1截止,继电器KM1不通电,触点KM1断开,水浴箱电路不工作。湿房水浴箱电路同理。

3 离体眼球体内环境模拟装置各组件设计

3.1 滴加液水浴箱的设计

如图3所示,滴加液水浴箱包括有机玻璃箱、温度探头、缺水保护开关、滴加装置接口、加热棒、潜水泵、排水阀,滴加液的温度由滴加液水浴箱温控仪控制并维持在32℃左右,潜水泵主要用于搅拌滴加液使其温度更均匀。

3.2 湿房水浴箱的设计

如图4所示,离体眼球湿房水浴箱包括有机玻璃箱、温度探头、缺水开关、加热棒、潜水泵、湿房、滴加管、箱盖、废液管、排水阀,湿房水浴箱中有8个湿房,湿房周围水的温度由湿房水浴箱温控仪控制并维持在32℃左右,湿房中放置眼球支架,离体眼球固定于眼球支架上,箱盖可开启用于存取湿房中眼球支架,箱盖上对应于湿房上方的位置装有滴加管,滴加液通过滴加管滴加到湿房中的眼球表面,废液由废液管排出,潜水泵主要用于搅拌湿房周围的水使其温度更均匀。

3.3 眼球支架的设计

在图5中,眼球支架包括有机玻璃支架、莲花瓣状夹具及固定销,莲花瓣夹具由固定销固定在有机玻璃支架上,离体眼球瞳孔对着莲花瓣口放置于莲花瓣状夹具上,莲花瓣利用自身的伸缩性将离体眼球夹紧,它可作90°旋转,在滴定状态时莲花瓣口向上以便滴加液滴加到眼球角膜上,观察状态时整个支架连眼球可取出放于裂隙灯前,将莲花瓣旋转使眼球角膜在水平方向以便观察,支架底部有排水孔用于废液的排出。

4 离体眼球体内环境模拟装置维持效果实验评价

选取8只新鲜分离的家兔眼球,将离体眼球置于离体眼球体内环境模拟装置的眼球支架上,4 h后取离体眼球角膜常规制作病例切片HE染色观察,同时取新鲜分离的家兔角膜进行病例切片HE观察,以下实验重复3次。其评价结果如表1所示:

4 h后各角膜未见明显混浊和荧光素滞留,角膜水肿率均小于试验要求的5%,各组之间角膜水肿率差别无统计学意义,说明该装置可以稳定的维持角膜的形态。

注:*P>0.05,各组之间差别无统计学意义

5 小结

离体眼球体内环境模拟装置结构简单、使用操作简易,能维持离体眼球的正常形态及其对刺激物的反应能力,满足离体眼球实验的需要,并能较高效率地完成试验,可用在离体眼球替代方法实验中。

参考文献

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[4]林占江,林放,电子测理仪器原理与使用,电子工业出版社,2006

“小绿萼”梅离体快繁体系的建立 篇9

关键词：梅花;离体快繁;茎段;培养基

中图分类号： S685.170.4+3 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）04-0062-03

收稿日期：2014-05-09

基金项目：国家自然科学基金（编号：31070624）;国家“863”计划（编号：2011AA100207）。

作者简介：杨丽青（1986—），女，山西朔州人，硕士，从事园林植物遗传育种研究。E-mail：1270063665@qq.com。

通信作者：张俊卫，博士，副教授，从事园林植物遗传育种研究。E-mail：zjw@mail.hzau.edu.cn。

梅是原产中国的传统名花，有悠久的栽培历史和丰富的栽培品种，具有极高的观赏价值和经济价值。在生产上，梅花以扦插、嫁接等无性繁殖为主，虽然能保持品种的优良性状，但是繁殖系数小，周期长。利用组培快繁技术，不仅可在短期内快速大量繁殖基因型一致的优质苗木，而且可获得无病毒苗木，大大加快了育苗进程和提高了苗木质量。自Harada等[1]开展梅茎段离体繁殖以来，国内外在梅的离体快繁上取得了较快的进展[2-5]，但目前仍存在建立快繁体系的梅花品种少，部分品种在快繁过程中出现顶芽坏死、叶片黄化等难题。小绿萼是武汉地区的梅花老品种，具有极高的观赏价值。本研究旨在分析茎段采集时间、启动和增殖培养基对小绿萼离体繁殖的影响，以期建立其快繁体系，为该品种的应用推广提供一定的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料采于武汉市磨山中国梅花研究中心，除8—9月份停止采样，分别在3—11月中旬采集梅花品种小绿萼（图1-A）1年生枝条，用冰盒带回实验室。

1.2 方法

1.2.1 外植体灭菌及初代培养 采集回来的枝条剪成1～2 cm长的具节茎段，每茎段1～2个腋芽。用洗洁精浸泡 10～20 min，流水冲洗30 min后在超净工作台上用75%乙醇浸润30 s，转入0.1%HgCl2中消毒8～15 min，然后用无菌水冲洗6～7次，无菌滤纸拭干后接种于初代培养基（1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA）;为分析不同初代培养基对腋芽诱导的影响，以4月中旬采集的小绿萼枝条为材料，灭菌后接种至2种不同初代培养基：1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+01 mg/L NAA和1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L KT。每处理20个外植体，重复3次，接种30 d后统计诱导率，污染率在接种后10～15 d内统计。

1.2.2 腋芽增殖培养 将伸长到1～2 cm的腋芽切下，分别转入添加了1.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA的3种基本培养基和添加不同浓度6-BA和NAA组合的QL培养基中，观察腋芽的增殖，每处理10个外植体，重复3次，记录植株高度，生长情况，接种5周后统计腋芽增殖情况。

1.2.3 丛生长度对继代的影响 待腋芽增殖形成的丛生芽伸长到不同长度（0.1、0.5～1、1～2 cm）時，将其从基部切下，放入继代培养基（1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L KT）中观察其生长，每处理5个外植体，重复3次。

1.2.4 生根与移栽 选择生长健壮，株高超过2 cm的试管苗在5种生根培养基中进行生根培养。移栽时先将生根苗连培养瓶一起置于温室内进行为期10 d的炼苗，在此期间逐渐松开并揭去培养瓶的盖子，而后将植株根系上的培养基洗净，移栽到含有泥炭 ∶ 蛭石=1 ∶ 1 （体积比）的塑料盆中。移栽后的第1周塑料盆上覆盖塑料薄膜以保湿，1周后慢慢揭去。

1.2.5 培养条件 培养室温度为（23±2） ℃，空气相对湿度为60%左右，光照度为1 500～2 000 lx，光照周期为14 h/d。

2 结果与分析

2.1 采样时间对腋芽诱导率的影响

茎段接种1周后腋芽开始萌发，2周后腋芽开始伸长，叶片逐渐展开，叶色浓绿（图1-B）。不同时间采集的枝条在初代培养时，污染率和腋芽诱导率差异显著 （表1），4月至6月中旬是最佳采样时期，既可以保证较高的腋芽诱导率，而且污染率相对较低，其他时期采集的枝条污染率高，腋芽诱导率低，不适宜用作离体培养的外植体。

2.2 初代培养基对腋芽诱导的影响

4月采集的小绿萼枝条，接种于2种不同初代培养基中（表2），培养于添加KT的初代培养基中的外植体， 不仅腋芽诱导率高，而且芽伸长快，叶色浓绿，无顶芽死亡、黄化问题。

这与朱军等的结果[6]相一致，即KT对长蕊绿萼腋芽的伸长生长有促进作用。

2.3 基本培养基对腋芽增殖的影响

将伸长长度达到1～2 cm的腋芽接种到添加了1.0 mg/L BA和0.1 mg/L NAA的3种基本培养基（表3）中，芽的增殖和伸长表现出显著差异（表4），QL上培养的腋芽出芽数显著高于改良N6和1/2MS，伸长长度显著高于改良N6。比较3种培养基上腋芽的生长状态以及出芽数和丛生芽平均高度，在增殖培养中采用QL作为基本培养基。

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2.4 激素組合对增殖的影响

将伸长长度达到1～2 cm，且长势一致的的腋芽转入添加不同6-BA和NAA浓度组合的QL培养中基中（表5），在6-BA浓度为0.2 mg/L时，丛生芽平均高度随着NAA浓度的升高而下降，但没有达到显著差异，而增殖系数基本没有变化，表明低浓度6-BA不能诱导腋芽增殖;当6-BA浓度为 1.0 mg/L 时，丛生芽平均高度和增殖系数，随着NAA浓度的升高先上升后下降，但丛生芽平均高度的变化没有达到显著水平，而增殖系数达到显著差异;而当6-BA浓度为0.5 mg/L时，植株平均高度和增殖系数， 随着NAA浓度的升高先下降

表1 采样时间对小绿萼腋芽诱导的影响

取样时间 3月 4月 5月 6月 7月 10月 11月

诱导率（%） 16.70±0.15c 75.00±0.16b 80.00±0.06ab 95.00±0.00a 0.00±0.00c 3.70±0.06c 14.70±0.13c

污染率（%） 83.00±0.15a 10.00±0.08b 19.70±0.06b 19.60±0.06b 100.00±0.00a 96.30±0.06a 85.00±0.13a

注：同行不同小写字母表示在0.05水平上存在显著差异。

表2 初代培养基对小绿萼腋芽诱导的影响

编号 培养基 萌芽率（%）

1 1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA 66.70±0.08a

2

1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+0.1 mg/L NAA 78.30±0.10a

注：同列不同小写字母表示在0.05%水平上存在显著差异。

表3 基本培养基对小绿萼腋芽增殖的影响

基本

培养基 平均芽个数

（个） 丛生芽平均

高度（cm） 生长状态

改良N6

1.17±0.29b

0.63±0.12b

叶嫩绿，簇生在基部，茎极度短缩

1/2MS 1.50±0.50b 1.20±0.08a 叶黄绿，愈伤团褐化

QL 3.16±0.77a 1.38±0.43a 叶嫩绿，平展，生长势很强

注：同列不同小写字母表示在0.05水平上存在显著差异。

后上升，且变化值均达到显著差异。最终选用QL+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA作为小绿萼增殖培养基，在此培养基上丛生芽的数量多，且生长正常（图1-C）。

2.5 丛生芽长度对继代培养的影响

将腋芽增殖培养后不同伸长长度的丛生芽，从基部切离后接种于继代培养基，生长表现出显著差异（表3），长度为1～2 cm的腋芽伸长长度最大，生长健壮，叶片平展;而长度为0.1～1 cm的腋芽生长瘦弱，叶片黄化脱落，最后死亡。

2.6 试管苗的生根培养和移栽

切取高度2～3 cm的试管苗，转入不同生根培养基（表6）中生根，培养30～40 d后形成根系（图1-D、图1-E）。植物生长调节剂的种类和浓度对试管苗生根有显著影响，只

表4 BA和NAA组合对腋芽增殖的影响

编号 6-BA浓度

（mg/L） NAA浓度

（mg/L） 丛生芽平均长度

（cm） 增殖系数

1 0.2 0.05 0.96±0.27cd 1.00±0.00d

2 0.2 0.1 0.85±0.10de 1.04±0.00d

3 0.2 0.2 0.63±0.08d 1.00±0.00d

4 0.5 0.05 2.02±0.25a 4.27±0.64a

5 0.5 0.1 0.95±0.05d 1.13±0.06d

6 0.5 0.2 1.28±0.14cb 1.50±0.35c

7 1 0.05 1.26±011cb 1.00±0.00d

8 1 0.1 1.52±0.27b 1.90±0.50b

9 1 0.2 1.43±0.03b 1.00±0.00d

注：同列不同小写字母表示在0.05水平上存在显著差异。

表5 丛生芽长度对继代培养的影响

编号 丛生芽长度

（cm） 继代培养后丛

生芽长度（cm） 生长状况

1 0.1 0.44±0.12a 叶极度卷曲，生长势差

2

0.5～1

1.76±0.53b

叶嫩绿，平展，有轻微玻璃化，边缘黄化

3 1～2 2.70± 0.56c 叶嫩绿，平展，生长势极好

注：同列不同小写字母表示在0.05水平上存在显著差异。

添加了生长素IBA的培养基生根率很低，仅为3.33%，且愈伤组织多。同时添加NAA和IBA的培养基以及添加IBA和活性炭的培养基，生根率、平均生根数和平均根长显著增加，但生根效果最佳的是试管苗先用200 mg/L IBA 浸渍，再培养于 1/2QL 培养基的处理，生根率达到最高（80%），与其他处理相比差异显著，且平均根长和根数也显著增加。生根后的植株先在温室炼苗10 d左右，然后移栽入塑料盆中（图1-F），移

表6 生根培养基对小绿萼试管苗生根的影响

编号 生根培养基 生根数（条） 根长（cm） 生根率（%）

nlc202309051242

1 1/2QL+0.2 mg/L IBA+0.3 mg/L NAA 1.60 ±0.17b 5.88±2.42a 36.67±0.15b

2 1/2QL+0.5 mg/L IBA 0.33±0.58b 0.84±1.46b 3.33±0.06c

3 1/2QL+0.05 mg/L IBA 0.33±0.58b 0.67±1.16b 3.33±0.06c

4 1/2QL+200 mg/L IBA 浸漬 3.81±1.78a 4.82±1.10a 80.00±0.10a

5 1/2QL+0.1 mg/L IBA+1 g/L活性炭 1.00±0.00b 3.29±1.14ab 36.67±0.06b

注：同列不同小写字母表示在0.05%水平上存在显著差异。

栽存活率可达90%。

3 讨论

3.1 外植体生理状态对启动培养的影响

3月份梅花枝条上的叶芽开始膨大，萌发抽生新枝，但此时的枝条过于幼嫩，容易受灭菌剂的影响而褐化死亡，同时污染率也较高，因此本试验中3月取样的茎段萌芽率低;4—6月为梅新梢生长旺盛期，本试验在此阶段取样的茎段萌芽率最高可达90%，且新叶嫩绿，生长强健。这一结果与傅萼辉等、曲春苗等的研究相一致，即早春萌动的腋芽是比较理想的离体培养外植体，因为此时内源IAA浓度较高[7-9]，有利于腋芽的萌发与生长。但与Yonemitsu等的试验结果相反，他们认为当年11月到翌年2月在休眠枝上采集的冬芽，离体繁殖的成功率高，造成这种差异的具体原因尚需进一步的分析[10]。

3.2 基本培养基对增殖培养的影响

在其他培养条件相同的情况下，果梅品种Nanko早春萌发的新芽，在WPM培养基上离体微繁时能增殖且生长健壮，而在MS培养基上的芽会逐渐褐化死亡[1]。而吕英民等离体培养铁骨红1年生枝具节茎段时，通过比较外植体在6种基本培养基（QL、MS、WPM、M1、M2、M3）上腋芽增殖系数、平均伸长长度等指标的差异，认为QL是适合铁骨红生长的最佳基本培养基[4，11]。本试验在小绿萼腋芽的增殖培养时，比较了改良N6、1/2MS和QL基本培养基对其增殖和生长的影响，也发现QL基本培养基显著优于改良N6和1/2MS。

3.3 KT和BA对腋芽萌发和伸长的影响

组织培养中常用的细胞分裂素有6-BA、KT和ZT，对梅花的增殖有不同的效果。从铁骨红试管苗增殖培养的结果看，6-BA和ZT优于KT，而且增殖系数差异显著。但增殖培养基中不添加IAA、IBA或NAA等生长素，增殖芽的伸长生长慢，影响试管苗正常生长。细胞分裂素浓度过高，增殖芽数量虽然明显增加，但多呈丛生状，茎难以伸长，且生长细弱，叶小且叶色异常，甚至出现玻璃化苗[12]。为克服增殖苗生长瘦弱，不得不采用壮苗培养基[7]。本试验在小绿萼腋芽增殖培养中所选用的3个6-BA浓度中，最适的浓度为0.5 mg/L，在添加此浓度6-BA的培养基中，不仅增殖系数最大，且丛生芽平均伸长长度也较大，当6-BA浓度提高到1.0 mg/L，虽然产生了大量的丛生芽，但是继代培养时丛生芽往往发生严重的褐化和黄化，渐渐死亡，同时玻璃化或畸形现象也逐渐加强，因此，在增殖培养中6-BA的浓度选定为0.5 mg/L。

3.4 浸渍法对生根培养的影响

在诱导梅试管苗生根时，既有单独使用IBA或NAA的报道，也有同时使用IBA和NAA的报道[1，4，6，11]。Harada 等在研究生长素对Nanko试管苗生根影响时发现，高浓度的IBA（1～2 mg/L）或NAA（0.9～1.9 mg/L）容易使试管苗基部形成愈伤，本试验在生根培养基中添加0.5 mg/L也易导致小绿萼试管苗形成大团愈伤。吕英民等在进行铁骨红试管苗生根培养时，观察到生长素种类对生根影响显著，其中NAA生根率较高，并且试管苗须根较多，但是根系比较细弱;添加IBA的试管苗根比较粗壮，但是根系较少;同时使用2种植物生长调节剂时不仅发根多，而且生长粗壮。但在本试验中，IBA和NAA同时使用虽然生根数和生根率较单独使用有所增加，但生根率偏低，而用200 mg/L IBA浸渍试管苗后培养于 1/2QL，其生根率可达80%，且平均生根数有显著增加，此结果与新疆野生巴旦杏的生根试验相似[13]，其试管苗用 100 mg/L IBA浸渍处理60 min后转入1/2MS培养基中培养，暗培2周后生根率可达100%。

参考文献：

[1]Harada H，Murai Y. Micropropagation of Prunus mume[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，1996，46（3）：265-267.

[2]傅萼辉，徐惠珠，王豫兰，等. ‘美人梅’茎段离体培养[J]. 北京林业大学学报，1995，17（增刊1）：75-78.

[3]蒋泽平，梁珍海，朱 军，等. 不同基因型梅花组织培养增殖率差异[J]. 北华大学学报：自然科学版，2005，6（6）：550-552.

[4]吕英民，曹 亮，张启翔. 真梅系梅花品种“铁骨红”离体培养[J]. 园艺学报，2007，34（4）：1047-1049.

[5]Ning G G，Fan X L，Huang W J，et al. Micropropagation of six Prunus mume cultivars through axillary shoot proliferation，and ISSR analysis of cloned plants[J]. Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica，2007，49（1）：25-31.

[6]朱 军，郭立春.“长蕊绿萼”梅花具节茎段组织培养初报[J]. 江苏林业科技，2003，30（2）：16-17.

[7]傅萼辉，徐惠珠，王豫兰，等. 梅花离体快速繁殖研究[J]. 武汉植物学研究，1991，9（3）：275-280，313.

[8]曲春苗，陈瑞丹，吕晓倩. 梅花杂交种茎段培养影响因素的研究[J]. 北京林业大学学报，2012，34（增刊1）：92-95.

[9]Murai Y，Harada H，Mochioka R，et al. Relationships between rooting in softwood cuttings of mume （Prunus mume Sieb. et Zucc.）and sorbitol in shoots[J]. Journal of the Japanese Society for Horticultural Science，1999，68（3）：648-654.

[10]Yonemitsu H，Nishi K，Sagan S，et al.In vitro propagation of mature Japanese apricot（Prunus mume Sieb.et Zucc.）[J]. Horticultural Research，2003，2：77-82.

[11]吕英民，曹 亮，张启翔. 不同种系梅花品种组织培养繁殖研究[J]. 北京林业大学学报，2008，30（3）：74-79.

[12]朱 军，张宇实，郭立春，等. ZT、IAA 对梅花试管苗增殖与生长的影响[J]. 江苏林业科技，2004，31（2）：18-19.

[13]曾 斌，罗淑萍，李 疆. 新疆野生巴旦杏的组织培养和植株再生[J]. 新疆农业大学学报，2006，29（4）：27-31.