单核细胞增生李斯特菌

单核细胞增生李斯特菌（通用6篇）

单核细胞增生李斯特菌 篇1

单核细胞增生李斯特菌 (Listeria monocytogenes, LM) 属人畜共患病的病原菌, 其致病性强。近几年来许多国家报道从多种食品中分离到LM或因食品污染LM而引起食物中毒爆发事件。为此, LM作为新的食源性疾病的病原菌, 受到WHO和各国政府的高度重视[1]。为了解食品中LM污染状况, 防范由LM引起的食物中毒事件在本省发生, 笔者于2006年在本省6个具有代表性城市的集贸市场和大型超市随机抽取了75份熟肉制品进行LM的污染调查。

1材料与方法

1.1 样品来源

随机在本省6个具有代表性城市的集贸市场和大型超市中抽取熟肉制品共75份。

1.2 培养基及试剂

培养基及部分生化试剂购自北京陆桥生物技术有限公司。 系列生化鉴定试条API Listeria 购自北京威泰科公司 (法国生物梅里埃公司生产) 。

1.3 仪器及设备

VITEK32全自动微生物鉴定系统, GPI卡购自法国生物梅里埃公司, 在有效期内使用。

1.4 标准菌株

LM, 标准号为54005, 购自中国药品生物制品检定所。

1.5 方法

参照国标GB/T 4789.30-2003《食品卫生微生物学检验 单核细胞增生李斯特菌检验》进行操作。国标替换法:在国标法的基础上用李斯特菌显色培养基代替MMA培养基对全部样品进行检测, 并选择李斯特菌显色培养基上绿色带白晕圈的可疑菌落接种SIM、TSI琼脂。选择动力呈伞状或月牙状, 三糖铁上、下层产酸不产硫化氢的菌落做革兰染色镜检并接种木糖、鼠李糖、甘露醇、七叶苷, 同时接种绵羊血平板观察溶血情况[2]。用标准菌株作对照, 凡染色和生化与单增李斯特菌的生化相吻合者, 再用VITEK32全自动微生物鉴定系统和API Listeria鉴定试剂条进行鉴定。

2结果

对本省6个具有代表性城市的集贸市场和大型超市随机抽取熟肉制品共75份, 分离出单增李斯特菌5株, 总检出率为6.67%, 均来自肉灌制品、烤肉。肉灌制品污染率为8.89%, 其中粉肠污染率最高, 达13.33%, 火腿肠和红肠均为6.67 %;烤肉污染率为8.33%;酱卤熟肉未检出。根据统计学分析, 肉灌制品、烤肉检出率差异无统计学意义 (χ2=0.00, P>0.05) 。见表1。

3讨论

LM造成的食品污染是目前国际上极为关注的问题, 此菌在本省熟肉制品的污染状况目前仍为盲点, 且也未进行过系统调查。本次调查的75份熟肉制品中在肉灌制品和烤肉中检出了LM, 其中肉灌制品检出率为8.89% (4/45) , 说明肉灌制品LM污染的情况较严重, 粉肠、火腿肠、红肠的检出率差异无统计学意义 (χ2=0.37, P>0.05) 。

由于LM广泛存在于自然界, 在土壤、污水、粪便中均易分离到, 该菌生长温度范围5～45℃, 既耐冷也耐热[3], 这些特性决定了LM对熟肉制品的污染是多环节的。但本文的酱卤类熟肉制品却未检出, 提示可能与加工方法不同有关。酱卤熟肉蒸煮的时间很长, 而灌肠类在蒸煮时为防止生物性肠衣破裂必须严格控制加热的温度和时间, 且灌肠的肉糜含有大量的淀粉和蛋白质, 在加热时凝固, 影响了热传递;烤肉因烤得时间不够, 肉的中心未达到温度要求。因此, 建议食品监督部门加大对肉灌制品及烤肉类卫生监管力度, 从而减少该菌引起的食源性疾病的爆发疫情, 保证消费者的卫生安全。

本次调查75份熟肉制品中LM阳性率达6.67%, 提示在食品卫生监测中不能放松对LM的检测, 而熟肉制品多由小作坊生产, 原料和生产过程中缺乏有效的卫生质量控制, 导致污染。因此, 要加强对熟肉制品的监督监测, 加大熟肉制品高温烹调后方可食用的宣传力度, 确保人民的身体健康。

参考文献

(1) 辛生, 刘桂华, 杨红, 等.近3年来吉林省食品中沙门菌和单增李斯特菌主动监测及结果分析 (J) .中国卫生检验杂志, 2006, 16 (10) :1227-1228.

(2) GB/T 4789.30-2003, 食品卫生微生物学检验单核细胞增生李斯特菌检验 (S) .

(3) 袁宝民.食品微生物及其检验 (M) .沈阳:东北大学出版社, 1993:96-100.

单核细胞增生李斯特菌 篇2

1 材料和方法

1.1 样品来源和种类

2005—2009年分别对集贸市场、超市、酒店等进行采样。其中生肉类126份、熟肉类30份、水产品81份、蔬菜91份, 沙拉酱9份、速冻米面食品21份、非发酵豆制品10份、奶制品9份, 共计377份样品。

1.2 检测项目

单核细胞增生李斯特菌。

1.3 培养基和试剂

增菌液、三糖铁 (TSI) 琼脂、SIM动力培养基、羊血琼脂培养基、显色培养基 (由北京路桥技术有限责任公司和青岛海博生物技术有限公司提供) , API LISTERIA生化试纸条 (由法国生物梅里埃股份有限公司提供) 。

1.4 检验方法

增菌试验:按照GB 4789.30-2003检测方法, 无菌取样品25g放灭菌的均质袋中, 加入225 ml LB1增菌液, 充分均质后30 ℃培养24 h。吸取0.1ml LB1增菌液加入10 ml LB2增菌液中增菌24 h, 2次增菌后, 再将LB2增菌培养物接种在改良的MC Bride 琼脂 (MMA) 和海博LM显色培养基进行分离, 30 ℃培养24～48 h。

LM的鉴定:挑取MMA琼脂和显色培养基上5～6个蓝色可疑菌落接种于三糖铁 (TSI) 琼脂、SIM动力培养基及羊血琼脂平板上, 动力实验成伞状并在TSI斜面和下层产酸不产硫化氢的菌株、溶血试验阳性的菌株做革兰染色和过氧化氢酶实验, 对革兰染色阳性的短小杆菌和过氧化氢酶阳性的菌株用API LISTERIA生化试条鉴定, 凡革兰染色阳性、溶血试验阳性、SIM半固体上呈伞状, API生化试验附和者确定为LM。

2 结果与分析

2.1 食品中LM检出情况

2005—2009年共从377份食品中分离到LM 16株, 总检出率为4.24%。熟肉类、生肉类、水产品及蔬菜的检出率分别为10.0%、8.73%、1.23%、1.10%;21份速冻米面食品、10分非发酵豆制品、9份奶制品均未分离到LM。8类食品中, 检出率最高的是熟肉类, 检出率为10.0% (3/30) , 明显高于其他7类食品, 经统计学分析, 总的差异有统计学意义 (χ2=16.473, P<0.05) ;熟肉LM检出率与与生肉类经统计学分析差异无统计学意义。熟肉与其他6类检品比较, 经统计学分析, 差异有统计学意义 (χ2=14.749, P<0.05) ;见表1。

2.2 生肉类LM检出情况

4种生肉中检出率最高的是生鸡肉, 检出率为16.67% (11/126) , 经统计学分析, 总的差异无统计学意义 (χ2=5.881, P>0.05) , 见表2。

2.3 各年度LM检出情况

2005年食品中LM检出率为12.68%, 明显高于其他4年, 经统计学分析, 总的差异有统计学意义 (χ2=17.553, P<0.05) , 各年度检出率不同;2007年食品中未检出LM。5年来的检测, 我市食品污染状况呈逐年好转情况, 这与我市疾控中心和卫生监督所加大对超市、餐饮业等的主动监测和监督力度, 对检测不合格的产品进行封存、禁止销售并据具体情况对照有关标准和规范进行修改, 使食品卫生质量有较大的改善, 从而避免和减少了我市食源性疾病的暴发。见表3。

3 讨论

LM是一种人畜共患病的病原菌。它能引起人、畜的李氏菌病, 感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界中, 食品中存在的LM对人类的安全具有危险, 该菌在4 ℃的环境中仍可生长繁殖, 是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。我国已经把该菌列为食品污染菌, 并作为必检项目。

本次调查主要在生肉和熟肉中检出, 与有关报道相一致[2], 显示邯郸市生肉和熟肉制品存在LM的污染, 是食物中毒潜在的危险;本次检测的8类食品377份样品, 共检出16株LM, 检出率达4.24%。在各种熟肉、生肉制品、蔬菜、尤其是水产品中都分离出LM, 其中生肉制品LM检出率高达8.73%, 与有关报道相一致[3];熟肉制品LM检出率最高为10.0%, 提示熟肉制品很易受该菌污染, 应引起高度重视。

肉制品不合格原因是生产经营者卫生意识淡薄, 食品敞开销售、器具、餐具消毒不严, 生熟不分, 防蝇防尘设施不全, 个人不良的卫生习惯等导致食品污染。卫生监管人员应增加监督频率, 对卫生设施不完善、生熟不分, 特别是冷藏、消毒设施不全要加强控制措施, 加强运输工具及运输过程的管理, 运输工具要定时清洗消毒, 离地存放, 以防污染;加强从业人员的卫生知识培训, 使其自觉遵守法律法规, 才能从根本上提高产品质量。1999年底, 美国发生了历史上因食用带有LM的食品而引起的最严重的食物中毒事件, 据美国疾病控制和防治中心资料显示, 在美国密歇根州有14人因食用被该菌污染的“热狗”和熟肉而死亡, 另外22个州中有97人患此病, 6名妇女流产;虽然在我国尚未见LM在这些食物中引起中毒的报道, 但仍不可忽视该菌的污染问题, 应引起我国食品卫生管理方的高度重视。

在水产品、蔬菜中首次检出LM, 检出率分别为1.23%、1.10%, 虽然没有生肉和熟肉中检出率高, 但表明蔬菜和水产品很易受到LM污染, 在运输、储存和销售等各个 环节要严把卫生质量关, 避免LM的污染, 从而有效的防止食物中毒的发生。

通过检测, 基本掌握了LM在我市各种食品中污染状况及其污染趋势, 确定了本市的高危食品;传统的食品安全控制方法不能有效防止食品污染, 餐饮业应积极推广HACCP (危害分析和控制关键点) 系统理论并使其普及和应用, 通过对食品全过程的各个环节进行危害分析, 找出能控制产品卫生质量的关键控制点 (CCP) , 并采取有效措施防止食品被污染, 保证上市食品的安全, 从而保障广大消费者的身体健康。

参考文献

[1]龚运伟, 郭红.食品中单增李氏菌污染的调查.现代预防医学, 2007, 34 (10) :1903.

[2]王春东, 陆俊荣, 李顺利, 等.沧州市2006—2007年食源性致病菌污染状况调查.职业与健康, 2008, 24 (20) :2160.

单核细胞增生李斯特菌 篇3

1材料与方法

1.1 材料

LM菌种 (54001和54002株) 购于中国药品生物制品检定所;SP2/0细胞为吉林出入境检验检疫局自行保存;清洁级Balb/c 小鼠由吉林大学动物繁育中心提供;RPMI1640、HAT、HT 、PEG 4000和胎牛血清等培养基均为鼎国产品;蛋白A亲和层析柱HiTrap rProtein A FF 购自Amersham Biosciences公司;抗体亚类测定试剂盒为SIGMA公司产品;氯金酸和柠檬酸三钠均为分析纯, 国产;牛血清白蛋白 (BSA) , 中国惠氏生化试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 LM抗原提取

将LM增菌后培养液离心、收集;用PBS洗3次;加SDS缓冲液 (2%SDS、0.5%β-ME巯基乙醇) , 离心, 弃上清;加PBS, 用去离子水透析48 h;再用卡马斯亮蓝法测定蛋白浓度, 并制作蛋白标准曲线, 595 nm处比色, 读取吸光度, 查标准曲线, 得到蛋白浓度;将抗原溶于生理盐水中, 配制浓度为1μg/μl, 免疫Balb/c小鼠, 4～6 w, 加强免疫。其余-80℃冻存。

1.2.2 杂交瘤细胞的建立

以纯化抗原25 μg/只免疫Balb/c小鼠, 取免疫后小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞, 采用50% PEG 4 000融合, 用间接ELISA法筛选阳性克隆, 经有限稀释法3次克隆化, 鉴定抗体分泌水平。取生长良好、分泌稳定的杂交瘤细胞株, 扩大培养后入液氮保存。

1.2.3 细胞融合实验

培养骨髓瘤细胞NS-1, 将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10混合, 在50 ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次, 1 000 r/ min, 离心5 min。弃上清, 用食指轻弹离心管底部, 使细胞沉淀团块稍松散, 同时加入0.5 ml 50%PEG作用, 加预热的不完全培养液, 终止PEG作用。每隔2 min, 分别加入1、2、3、4、5和10 ml。离心, 1 000 r/ min, 5 min, 弃上清, 用含有小牛血清的培养液轻轻混悬。根据96孔板培养板数量, 补加培养液。将融合细胞悬液加入含饲养细胞的96孔板, 100 μl/孔, 37℃、5% CO2孵箱培养。用有限稀释法克隆杂交瘤细胞, 筛选出2株单抗杂交瘤细胞株F5、F9。

1.2.4 酶联免疫吸附试验 (ELISA)

包被:蛋白抗原按比例加包被液, 每孔100 μl, 加96孔板, 4℃放置过夜。PBS洗4次 (2 ml吐温/ 1 L PBS 水) 。封闭:10%封闭液 (1 ml小牛血清+9 ml PBS) , 250 μl/每孔, 封闭1 h, -20℃保存备用。弃上清, PBS洗3次。试验加阴性对照、阳性对照和需检测克隆上清标本, 并放置1 h, 弃上清, PBS洗4次。二抗酶标抗体2 μl+5 ml封闭液, 放置1 h。PBS洗6次, 底物溶液每孔100 μl, 避光放置30 min。加终止液观察, 酶标仪读数。

1.2.5 单克隆抗体的制备与提取

以腹水诱生法制备单抗, 检测收集蛋白峰。小鼠腹水的诱导:取10周龄的健康Balb/c小鼠, 腹腔注射灭菌液体石蜡, 每只0.5 ml。7～10 d后, 收集杂交瘤细胞, 离心, 去上清, 加入不含血清的培养基, 调节细胞密度为3×107个/ml, 每只小鼠注射1 ml。设阴性对照、盐水对照。约10 d后, 小鼠腹部增大, 开始收集腹水。分装, -20℃冻存。

1.2.6 单克隆抗体特性的鉴定

取Balb/c小鼠腹水, 参照说明书用抗体亚类测定试剂盒检测单抗的型别, 拍照, 用酶标仪在490 nm处读数记录, 检测结果见表1和图1。

1.2.7 单克隆抗体的纯化

小鼠腹水可通过亲和层析方法获得所需的纯化单克隆抗体, 用分光光度计测蛋白含量, 为2.3 mg/ml。

1.2.8 胶体金的制备

采用柠檬酸三钠还原法[4], 取1%氯金酸溶液, 加双蒸水配置氯金酸溶液的终端浓度为1‰ , 加入1%柠檬酸三钠溶液。快速搅拌直至颜色彻底变为紫红色, 置4℃ 冰箱保存备用。测定胶体金在525 nm波长具有最大吸收峰, 确定胶体金直径大小为20 nm。

1.2.9 胶体金探针制备

取新鲜制备的胶体金溶液50 ml, 然后加入适量的已纯化好的抗体, 使抗体浓度为12 μg/ml。缓慢搅拌10 min, 加入牛血清白蛋白 (BSA) , 使BSA的终浓度为1%, 继续搅拌10 min。将上述胶体金-抗体-BSA液进行4 000 r/min离心20 min, 收集上清。将收集的上清进行4℃、10 000 r/min离心60 min。弃上清, 沉淀用含1% BSA 的0.01 mol/L pH 7.4 PBS悬浮。同上4℃, 10 000 r/min离心60 min两次, 最后将沉淀用5 ml PBS-T溶解。并加入少量的NaN3, 4℃ 冰箱保存备用。

1.2.10 检测灵敏度

选用阳性单核李斯特菌54001, 为标准菌株, 用盐水以10倍系列进行稀释, 阴性对照为盐水, 检测下限为107 cfu/ml。

2结果

2.1 单抗样品在490

nm处的吸收结果 由表1、图1可以看出经过单抗样品经1∶10 000稀释后在490 nm处仍有吸收, 而且样品与阴性腹水比较差别明显的是IgM和IgG3。

2.2 胶体金颗粒大小及分布

通过比较各法制备的胶体金的可见光吸光度[5], 分析胶体金颗粒大小和分布, 得知20 nm直径大小的胶体金, 在525 nm波长具有最大吸收峰, 由图2 可确定胶体金直径大小为20 nm。

3讨论

本试验对Balb/c小鼠进行免疫, 制备杂交瘤细胞株, 制备腹水抗体。抗体纯、效价高, 同过去的方法比较, 提高了敏感度和准确度。胶体金标记LM抗体制备免疫层析检测试剂板, 对LM进行检测, 具有快速、便捷的优点。综合本实验的结果和国内外研究资料可发现, LM的快速检测方法仍不够完备, 现有的检测技术方法仍存在如下不足:标本仍需增菌培养, 本方法仍只可对LM感染的标本进行阴性筛查, 阳性标本的确定试验仍然采用传统的细菌培养及生化反应来进行鉴定。本课题研究的是LM的单克隆抗体制备, 仅是课题研究的一部分, 还要进行下一步研究, 将络合后胶体金络合物与检测方法的研究。经典的李斯特菌分离培养和鉴定技术需要10 d时间, 人力物力花费较大, 不适应实际检测工作的需要。目前, 对LM快速检测方法的研究, 绝大部分尚停留在实验室阶段, 很大程度局限于ELISA法和PCR法, 而免疫胶体金层析法检测LM具有快速、便捷的优点[4], 可广泛应用于质检、卫生、边检、医院, 也可用于家庭进行简易检测。其良好的特异性, 较高的灵敏度, 可靠的重现性和稳定性, 为今后的食品中LM检测提供了一个更为理想的快速检测方法。

胶体金免疫层析技术是20世纪90年代发展起来的将层析法与免疫胶体金相结合的诊断技术, 具有快速、操作简便、与酶联免疫法相似的特异性及灵敏度的优点, 广泛用于样品的检测[5]。采用免疫胶体金层析技术, 对LM进行检验分析, 可取得良好的效果。免疫胶体金技术与酶免 (EIA) 相比有着许多优越性。首先, 它不需要酶联免疫法中所要求的底物 (显色剂) , 因而可省去一些操作步骤, 如洗涤、终止等, 使操作简单化。因此胶体金检测只需10～20 min, 而酶免 (EIA) 需要60 min以上;其次, 胶体金法无污染, 不会危害操作者以及污染环境, 而这些问题在酶免法中常遇到;此外胶体金技术还具有检测迅速、灵敏、不需要复杂仪器设备、产品永不褪色等优点[6]。胶体金免疫层析法可在食物、农产品测定中作为一个粗筛的快速检测方法。

摘要：目的制备胶体金标记单核细胞增生李斯特菌的单克隆抗体 (McAb) , 用于检测食品中的致病性单核细胞增生李斯特菌。方法以纯化的单核细胞增生李斯特菌 (标准菌株号54001、54002) 为抗原, 免疫Balb/c小鼠, 制备单克隆抗体, 建立胶体金标记的单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体的制备方法。结果筛选出2株单抗杂交瘤细胞株F5、F9, 并获得免疫球蛋白, 测定免疫球蛋白亚类为IgM。通过选用柠檬酸钠法制备胶体金标记单核细胞增生李斯特菌抗体, 测定其最适蛋白结合浓度为12 g/ml。结论成功制备了胶体金标记的单核细胞增生李斯特菌的单克隆抗体, 为建立食品中病原性单核细胞增生李斯特菌检测技术奠定基础。

关键词：单核细胞增生李斯特菌,单克隆抗体,胶体金

参考文献

(1) 刘秀峰, 陈平, 吴护华.单核细胞增多性李斯特菌病研究近况 (J) .实用预防医学, 2001, 8 (1) :79-80.

(2) 范红结.李斯特氏菌快速检测方法的研究进展 (J) .中国人兽共患病杂志, 1997, 13 (1) :50.

(3) 王刚, 邱阳.单核细胞增生性李斯特菌及其快速检测 (J) .微生物学杂志, 2001, 21 (1) :52-53.

(4) 罗立新, 缪珑, 潘力, 等.快速检测产单核李斯特菌免疫胶体金层析法的研究 (J) .中国卫生检验杂志, 2006, 16 (2) :154-156.

(5) 宋农, 李君文, 王新为, 等.胶体金探针制备及滴金免疫法检测产肠毒素金葡菌 (J) .中国公共卫生, 2002, 18 (9) :1143.

单核细胞增生李斯特菌 篇4

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 监测哨点的选择

监测点选择基本按东、南、西、北、中不同方位, 选择了6个具有代表性的大城市作为采样点, 分别是哈尔滨、齐齐哈尔、佳木斯、牡丹江、大庆、鸡西。

1.1.2 样品来源

2005~2007年由省疾控中心专业人员在6个监测城市以无菌方式采集6类市售食品, 包括生畜禽肉 (猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉) 、熟肉制品 (卤肉等) 、生牛奶、淡水产品 (以鱼类为主) 、冰激凌、生食蔬菜 (以叶生菜为主) 共760份。

1.1.3 培养基

LB1、LB2 增菌液、TSA-YE、SIM动力培养基、TSI和其他鉴定用的生化培养基均购自北京陆桥生物技术有限公司;吖啶黄, 萘啶酮酸由北京陆桥生物技术有限公司进口分装;CHROMagar (科玛嘉) 李斯特菌显色培养基产自法国, 由郑州博赛生物技术研究所分装;血琼脂基础购自广州市乐通泰生物科技有限公司;系列生化鉴定试条API Listeria购自北京威泰科公司 (产地是法国生物梅里埃公司生产) 。

1.1.4 标准菌株

L.m, 标准号为54005, 购自中国药品生物制品检定所。

1.2 方法

1.2.1 增菌

以无菌操作将25g样品加入到225mL LB1增菌液中, 30℃培养24小时;取0.1mL加入到10mLLB2增菌液中30℃培养24小时。

1.2.2 分离培养

无菌取LB2增菌液转种到CHROMagar李斯特菌显色培养基琼脂平板上, 35℃培养24小时。菌落特征为中心绿色, 周围带白色晕圈。可疑菌落同时接种于SIM和TSI培养基中, SIM 25℃培养5天, TSI 37℃培养24小时。L.m动力呈伞状或月牙状生长, 产酸不产气。

1.2.3 纯培养

将以上可疑菌落接种于TSA-YE琼脂培养基中, 37℃24小时培养。

1.2.4 鉴定试验

将TSA-YE培养基内的菌落做革兰氏染色镜检, 做氧化酶、触酶试验, 并接种鼠李糖、木糖、甘露醇、七叶苷, 同时点种血平板观察溶血情况, 用标准菌株作对照, 凡染色镜检和生化与L.m相吻合者, 再用API Listeria鉴定试剂条进行鉴定。

2 结果

2.1 不同食品种类L.m监测结果

6类食品中L.m检出率最高为生畜禽肉, 其次为熟肉制品、淡水产品、生食蔬菜, 冰激凌、生牛奶均未检出单核细胞增生李斯特氏菌 (表1) 。

2.2 生畜禽肉食品中L.m污染状况

生畜禽肉食品中以猪肉污染最为严重 (13.60%) , 其次为禽肉 (12.00%) 、牛肉 (8.87%) , 羊肉为最低 (12.00%) 。 (表2)

2.3 各类食品中L.m污染状况

2005~2007年连续3年的监测中, L.m年检出阳性率分别为3.79%、4.47%和7.92%。从6类食品L.m污染年检出情况看, 熟肉制品、淡水产品有逐年上升趋势, 尤以熟肉制品上升的幅度最大, 2005年均未分离出, 熟肉制品2006年、2007年检出阳性率分别为5.71%和12.00%;淡水产品, 2006年、2007年检出阳性率分别为2.86%为7.14%;生食蔬菜次之, 2005、2006两年均未分离出, 到2007年检出阳性率为3.03%;生畜禽肉每年均有检出, 无明显变化;冰激凌、生牛奶均未检出 (表3) 。

2.4 不同城市食品中L.m污染情况

在6个城市生畜禽肉类食品中均检出L.m, 其中以佳木斯市污染最重 (20.00%) , 哈尔滨市次之 (15.00%) , 齐齐哈尔市最低 (2.86%) ;熟肉制品以哈尔滨市、牡丹江市、鸡西市污染严重 (10.87%、10.00%、10.00%) , 齐齐哈尔市、佳木斯市、大庆市均未检出;淡水产品齐齐哈尔市污染最重 (10.00%) , 哈尔滨市次之 (7.40%) , 其他市均未检出;生食蔬菜以哈尔滨市污染最重 (6.25%) , 佳木斯市次之 (4.17%) , 其他市未检出;生奶和冰激凌未检出L.m (表4) 。

3 讨论

本次为黑龙江省内不同地区不同食品中单增李斯特菌的首次主动监测, 监测样品主要来源于哈尔滨、齐齐哈尔、佳木斯、牡丹江、大庆、鸡西6个具有代表性的城市, 其中包括了经济发达的城市、旅游城市、边远地区, 这些样品能够较全面、真实地反映各个地区的食品中单核细胞增生李斯特菌的污染状况。

单核细胞增生李斯特氏菌在自然界分布广泛, 可由带菌动物或人的粪便污染食物 (主要是动物食品) , 经口感染造成食物中毒。据WHO报道:4%~8%的水产品, 5%~10%的奶与奶制品, 30%以上的肉与肉制品, 15%以上的家禽被污染。在4℃的冰箱内保存的食物中该菌也可生长繁殖, 从而增加了食物中毒的危险性[2]。2005~2007年连续3年的监测结果显示, 黑龙江省6个市所采集的6类食品, 除生奶和冰淇淋外, 均检出单核细胞增生李斯特氏菌, 特别是以生畜禽肉类食品污染较为严重, 污染率为10.94%, 其次是熟肉制品和淡水产品, 这一结果与报道的单核细胞增生李斯特氏菌在动物性食品中污染严重的结论一致[3]。2007年在生食蔬菜中检出了单核细胞增生李斯特氏菌, 阳性率为1.74%, 说明其污染的范围在扩大, 必须引起高度重视。3年来对6类食品760份样品进行了检测, 共检出L.m 43株, 总阳性率为5.66%, 此3年阳性率分别为3.79%、4.47%和7.92%, 2007年最高, 表明阳性率每年有连续增长趋势。同时也初步掌握了黑龙江省6市6类食品中L.m污染和分布情况, 在生畜禽肉、熟肉制品、淡水类产品、生食蔬菜中都分离到L.m, 表明主要食品中均受到不同程度的污染。以生畜禽肉污染最为严重, 污染率达10.94%, 其中猪肉最为明显, 污染率高达13.60%, 禽肉为12.00%、牛肉为8.87%, 羊肉最低, 污染率为4.44%。值得注意的是即食的熟肉制品, 在哈尔滨、牡丹江、鸡西污染率均达到10.00%, 有引起L.m食物中毒的潜在隐患, 提示监督部门必须特别警惕, 加大对该类食品安全的监管力度。

由于牛奶及其制品是由正规厂家规模生产, 其对原料乳及卫生状况控制较严格, 故未检出单核细胞增生性李斯特氏菌, 但仍不能放松警惕。美国曾发生过由巴氏消毒牛奶引起的该菌食物中毒, 目前美国已将单核细胞增生性李斯特氏菌作为进口食品必检项目之一[4]。应引起我国食品卫生监督检验部门高度重视。

建议在卫生控制方面, 不论是食品生产企业, 还是食品从“农田到餐桌”都要加强建立良好的卫生操作规范 (GHP) 和良好的生产操作规范 (GMP) , 并且使之得到较好的应用和执行, 使危害分析关键控制点 (HACCP) [5]能更好地发挥保障食品安全的作用, 将L.m暴发流行的可能性降到最低水平。

参考文献

[1]辛生, 刘桂华, 等.近3年来吉林省食品中沙门菌和单增李斯特菌主动监测及结果分析.中国卫生检验杂志, 2006, 16 (10) .

[2]袁宝民.食品微生物及其检验[M].沈阳:东北大学出版社, 1993:96-100.

[3]关怀.新的食源性疾病与食品安全[J].国外医学 (卫生学分) , 2001, 26 (1) :17.

[4]刘爱平、陈淑敏、阎可庭, 等, 市售鲜冻畜、禽肉中李斯特氏菌的分离和鉴定[J].肉类研究, 1991, 3:27~301.

单核细胞增生李斯特菌 篇5

关键词：产单核细胞李斯特菌,生猪屠宰,流通,流行病学

产单核细胞李斯特菌 (Listeria monocytogenes, Lm) 是一种重要的人兽共患食源性病原菌, 引起以脑膜炎、脑炎、败血症为症状的李斯特菌病[1]。该病虽然感染率较低, 但病死率高达30%～70%[2], 因此对于该病爆发的监测具有重要的公共卫生学意义。本研究采用周晓辉等[3]介绍的PCR快速检测产单核细胞李斯特菌的方法对生猪屠宰加工流通环节的产单核细胞李斯特菌进行分子流行病学监测, 取得了满意的结果。

1 材料与方法

1.1 样品采集

根据生猪屠宰加工生产流程和HACCP系统原理[4], 选择待宰猪环境、宰前、屠宰过程、生鲜猪肉入库前、冷库肉、市场销售生鲜猪肉等六个关键环节采集样品共680份, 其中, 前5个环节各采集样品100份, 市场 (超市、专卖店和农贸市场) 销售生鲜猪肉180份样品。待宰猪环境采集棉拭样品, 宰前采集经冲洗后的猪体表猪毛样品, 屠宰过程中采集冲洗后的大肠样品, 其余环节均采集肉样, 进行产单核细胞李斯特菌监测。待宰猪环境棉拭样品用Cary-blair运送培养基运送, 其余样品置于4℃冰盒, 于16h内送达实验室, 并立即检测。

1.2 方法

1.2.1 样品处理

肉类样品取1g用消毒剪刀剪碎加入9ml李斯特增菌培养基LEB (美国DIFCO公司) , 培养24h后, 用铂耳取菌液划线, 接种于李斯特选择培养基OXFORD (美国DIFCO公司) 培养24h, 挑取可疑菌落于纯培养基BHI (美国DIFCO公司) 过夜培养, 提取基因组DNA作为PCR模板。

1.2.2 模板制备

参考周晓辉等[3]介绍的溶菌酶-蛋白酶K法提取基因组DNA:取250μl BHI培养基中过夜培养的菌液加入Eppendorf管, 13000rpm离心10min;弃上清液, 用95μl1×Buffer混匀;加4μl溶菌酶 (50mg/ml) , 颠倒混匀;室温孵育15min;加1μl蛋白酶K (20mg/ml) , 震荡数秒钟;58℃孵育, 直至菌液变请;95℃加热8min, 使酶失活;离心取上清液备用。

1.2.3 PCR扩增

参考Michel Doumith等[5]的报道, 选取李斯特属特异性基因prs合成一对引物;参考周哓辉等[3]方法, 针对产单核细胞李斯特菌溶血素基因hly合成一对引物。

PCR体系中各成分的量: (1) prs体系:10×buffer2.5μl, Mg Cl22μl, d NTPs (2.5μmol/l) 1μl, prs P1和prs P2 (10μm) 各为1μl, 模板溶液2μl, Taq酶0.3μl, 去离子水15.2μl。 (2) hly体系:10×buffer2.5μl, Mg Cl21.5μl, d NTPs (2.5μmol/l) 2μl, hly P1和hly P2 (20μm) 各为0.5μl, 模板溶液3μl, Taq酶0.2μl, 去离子水14.8μl。

PCR反应程序为: (1) prs基因:94℃2min, 95℃10s, 60℃30s, 72℃30s, 40个循环, 72℃10min。 (2) hly基因:94℃2min, 95℃10s, 60℃30s, 72℃30s, 35个循环, 72℃10min。

PCR产物电泳鉴定:配置1.0%琼脂糖溶液, 按0.3mg/L加溴化乙锭 (EB) 制胶, 取8μl PCR产物点样, 以DNA Marker做对照, 60V电泳1.5h。取出凝胶, 在凝胶成像仪上观察结果。

2 结果

整个流程共检测了680份样品, 其中有13份样品污染Lm, PCR结果见图1-1, Lm阳性率1.9%。整个屠宰-加工-销售环节销售过程的市场生鲜肉样品Lm污染率最高, 达5%, 明显高于其它各环节, 而宰前猪毛样品、屠宰过程大肠样品以及宰后入冷库前猪肉样品中均未检测到Lm, 污染率为0%。

M.DNA Marker DL2000;1.PCR product of standard strain;2-13.PCRproduct of the positive samples;15.PCR product of the negative control strain

(%)

3 讨论

本研究对生猪屠宰-加工-销售各环节Lm监测结果显示, 屠宰加工厂环境卫生条件的改善是避免发生交叉污染的关键环节。生产流程从宰前到猪肉入库均未检测出Lm, 说明此生猪加工厂对生产流程的控制和把关做得较好, 屠宰前对猪体表的淋浴有利于减少和清除病原微生物对猪胴体和生产线的污染, 此外, 生产流程中胴体产品在主生产线进行加工处理, 而肠道产品在副产品车间进行处理, 对二者采取两种不同的处理途径, 较好的控制了内脏冲洗加工对胴体生产加工流程的污染和其它加工环境的污染, 这是生猪屠宰加工流程中值得借鉴的地方[5]。另一方面, 待宰猪圈环境检测到Lm应该引起重视, 它是猪肉生产流通的首要关键环节, 这就提示了加强对猪圈环境定期消毒处理的重要性。一般而言, 冷库肉由于温度较低, 微生物污染问题不易受到重视, 受到的关注程度也相对较低。本研究的监测情况显示, 猪肉从入冷库前到入冷库后, Lm的污染率从0到3%大幅度提高, 这符合Lm能在低温繁殖的特性[6], 表明了冷库肉同样有受到Lm污染的可能性, 这就提示冷库环境卫生条件的改善同样应该受到相关部门和单位的重视。市场是此次屠宰-加工-销售各环节中Lm污染最严重的环节, 污染率高达5%, 这可能是由于猪肉在从生猪加工基地运往各市场进入流通环节的过程中受到自然环境和接触器皿上Lm的污染或加重污染所致, 也可能是由于市场内人员流动等原因造成污水、各种切割器具或其它各类生熟食品的交叉污染所致, 这就提示在生猪肉进入流通领域后应该尽可能减少各种外部因素造成的交叉污染。

综上所述, 本研究对生猪屠宰-加工-销售环节Lm的监测结果表明宰前环境、宰后销售前以及销售过程中均存在不同程度的产单核细胞李斯特菌污染, 为食品安全措施的制定提供了有用的流行病学数据。

参考文献

[1]Cristina M, Goncalo A, Luisa C, et al.Incidence of Listeria monocytogenes in different food products commercialized in Portugal.Food Microbiology.2004, 21:213-216.

[2]Schlech WF, Lavigne PM, Bortulussi RA.Epidemic Listeriosis:evidence or transmission by food.N J Med.1983, 308:203-206.

[3]Zhou X, Jiao X..Polymerase chain reaction of Listeria monocytogenes using oligonucleotide primers targeting actA gene.Food Contral.2005, 16:125-130.

[4]朱冬冬, 黄金林, 焦新安等.生猪屠宰加工流通环节沙门氏菌的监测研究[J].畜禽业, 2006, 3:44-45.

[5]Michel D, Carmen B, Philipper G, et al.Differentiation of the major Listeria monocytogenes serovars by multiplex PCR.Journal of Clinical Microbiology.2004, 42:3819-3822.

单核细胞增生李斯特菌 篇6

1 病例摘要

患者, 女, 20岁, 于2011年12月7日因血小板严重减低 (PLT:7×109/L) 入院, 患者自诉于11月19日至今, 一直在外院定期监测血小板, 波动值在20×109/L左右。查体:体温39.4℃, 无皮肤黏膜出血, 无巩膜黄染等。入院诊断: (1) G1P0 38周宫内孕单活胎; (2) 血小板重度减少。病例摘要:17日:WBC:15.8×109/L、N:13.6×109/L、PLT:43×109/L、PCT:2.38ng/ml, 提示存在感染, 抽血培养 (双瓶) 送检, 并予以输注氨苄西林控制感染, 行剖宫产术, 术后补充血小板3个治疗单位等对症支持治疗。血培养一级报告:G+b, 当日改予以一代抗生素头孢硫醚抗感染治疗等;血培养二级报告头孢硫醚敏感;血培养三级报告为:产单核细胞李斯特菌 (双瓶报阳) 及药敏。19日:体温36.6℃、WBC:13.7×109/L、N:7.3×109/L、PLT:81×109/L、PCT<0.05ng/ml, 当日再次抽血培养 (双瓶) 送检, 结果无细菌生长。24日患者痊愈出院, 期间其新生儿送检的血培养 (双瓶) , 结果无细菌生长。

2 实验室检验

2.1 采用Bact/Alert3D自动血培养分析仪检测, 需厌氧双瓶报阳。

仪器报阳立即作涂片、革兰染色镜检:G+b, 电告主管医师血培养一级报告结果, 同时转种血琼脂平板置35℃、5%CO2培养箱培养, 过夜见血平板上圆形、光滑、有狭窄β溶血环的灰白色小菌落。

2.2 生化反应:

触酶、甲基红、七叶苷和25℃动力为阳性, 尿素、35℃动力为阴性。发酵葡萄糖、水杨苷, 不发酵甘露醇。法国梅里埃VITEK2全自动鉴定/药敏分析仪鉴定为产单核细胞李斯特菌, 鉴定率:98.2%;以上均有标准菌株做质控。

3 讨论

3.1 产单核细胞李斯特菌主要是通过污染的食品感染人, 可以散发和爆发流行。健康带菌者是本菌的主要传染源, 主要传播途径为粪-口, 孕妇以及有免疫抑制状况的人群是本菌的易感人群, 潜伏期平均为3～4周。妊娠妇女感染该菌后, 可按感染时期不同而导致流产、早产或足月分娩通过胎盘和产道感染胎儿, 引起新生儿化脓性脑膜炎、败血症等严重感染, 病死率较高。

3.2 据欧美等国家报道, 新生儿发病率接近0.52‰。该病例虽然未引起新生儿感染, 但从该病的感控出发, 对于李斯特菌感染防控知识应从孕期孕妇保健及饮食宣教即开始, 若孕晚期孕妇出现发热等表现需要警惕李斯特菌感染, 合理使用抗生素治疗, 并根据具体情况及早结束妊娠。同时对新生儿及时作相关细菌学检测, 以便早诊断, 合理用药治疗, 降低病死率和改善预后。

3.3 对于采用血培养瓶培养的无菌部位标本, 实验室应建立阳性结果的三级报告制度, 以便临床医师对患者病情尽早初步诊断, 有针对性的使用抗菌药物治疗, 有效控制感染和缩短病程。

关键词：孕晚期妇女,产单核细胞李斯特菌

参考文献

[1]焦颖, 张巍, 翟桂荣, 等.新生儿李斯特菌败血症临床分析 (J) .北京医学, 2010, 32 (9) :738-741.

[2]闫东辉, 陈力.产单核李斯特菌引起先兆流产一例报道 (J) .北京医学, 2005, 27 (8) :470.