细胞周期（共10篇）
细胞周期 篇1
细胞周期的研究是细胞生物学的重要研究课题，在某些工作中，如对于肿瘤的研究等也常会涉及到细胞周期长短的测定。因此，在近几年的高考及各地的竞赛试题中，时常会出现与细胞周期测定相关的试题。现将细胞周期测定的基本方法和相关问题的解答方法作一梳理，供高考复习参考。
测定细胞周期时间的基本原理是选择细胞周期中有变化规律的物质作标记，通过观察这些标记物在细胞周期中的变化，间接计算细胞周期及各时相的时间。
一、标记有丝分裂比率法
标记有丝分裂比率法（PLM）是最经典的测定细胞周期各时相时间的方法。其实验过程是：利用3H-TDR (TDR：胸腺嘧啶核苷）短暂的脉冲标记待测细胞群体，然后洗脱标记物，置换新鲜培养液继续培养。随后，每隔半小时或一小时定期取样，进行细胞放射自显影，以M期的3H-TDR标记指数为指标，测定有丝分裂细胞中已被标记的细胞比率，根据该比率变化发生的时间，计算细胞周期及各时相的时间。
结果分析方法如下：（1）当脉冲标记后，因3H-TDR只掺入到S期细胞中，在该段时间内已处于S期的细胞被标记，处于其他时期的细胞均无标记。由于S期细胞经G2期才进入M期，所以一段时间内标记有丝分裂百分数为0（图1）。培养一定时间后，被标记的细胞将陆续进入M期。最先进入M期的标记细胞是原来处于S期最后阶段的细胞，所以从3H-TDR掺入时起，到开始出现被标记的M期细胞，就是S期细胞经过G2期到达M期的时间，即为G2期的时间（TG2）。（2）随着S期细胞逐渐进入M期，标记有丝分裂百分数逐渐上升，到达最高点时，说明原处于S期最后阶段的细胞已完成M期，进入G1期。所以从开始出现标记的M期细胞到标记有丝分裂百分数达到最大值之间所经历的时间为M期的时间（TM）。（3）由于S期的持续时间长于M期，所以标记有丝分裂比率的高峰要维持一定时间，直到处于S期最初阶段的细胞进入M期为止。当标记有丝分裂比率开始下降时，表明紧跟S期细胞后面的G1期细胞开始进入M期，所以从开始出现标记的M期细胞到标记的有丝分裂比率开始下降的时间间隔为S期的时间（TS）。（4）当S期标记细胞经过一个细胞周期再次进入下一个细胞周期的M期时，又重复前一个循环的过程。第一次出现标记细胞和第二次出现标记细胞之间所持续的时间间隔为细胞周期时间（TC）。G1期的时间（TG1）可由TC-（TS+TG2+TM）算出。
也可采用BrdU取代3H-TDR标记细胞，检测被标记的细胞可用抗BrdU抗体作免疫细胞化学染色。
二、流式细胞技术测定细胞周期
流式细胞技术的基本原理是细胞经DNA特异性荧光染色后，被分离的单个细胞逐个通过流式细胞仪的荧光探测装置，记录每个细胞的荧光强度。由于每个细胞结合的染料与DNA含量成正比，所以每个细胞受激发后发射的特异性荧光强度与它的DNA含量成正比。由于G1期细胞的DNA含量为2C, G2和M期细胞DNA含量为4C, S期细胞的DNA含量为2～4C，因此可以根据DNA含量的不同分选出处于不同时相的细胞，然后通过统计算出细胞各时相所占的百分比，从而确定细胞周期的时间长短。
三、相关试题的解答方法
关于细胞周期测定问题的解答，下面以实例说明之。
[例1]在某生物细胞培养液中加入用3H标记的胸腺嘧啶脱氧核苷酸，短暂培养一段时间后，洗去3H标记的胸腺嘧啶脱氧核苷酸。使在该段时间内已处于DNA复制期不同阶段的全部细胞中DNA被3H标记，而当时处于其他时期的细胞则不带标记。不同时间取样做细胞放射性自显影，找出正处于有丝分裂的分裂期细胞，计算其中带3H标记的细胞占有丝分裂细胞的百分数。得到图2（图甲～图丁中横轴为时间，纵轴为带标记细胞占总细胞数的百分数）：
(1）图乙中a点开始检测到带3H标记分裂期细胞，则O～a为期，理由是：。
(2）图乙中b点带3H标记分裂期细胞数开始达到最大值，则a～b段表示期，理由是：。
(3）图丙中c点时，带标记的细胞百分数开始下降，则a～c段表示期。
(4) 此后, 带标记的分裂期细胞数逐渐减少, 直到消失, 到第二次出现带有标记的细胞数时为图表中e点, 则一个完整的细胞周期为:。
解析:S期细胞经G2期进入M期;最先进入M期的标记细胞是原来处于S期最后阶段的细胞, 所以从3H-TDR掺入时起, 到开始出现被标记的M期细胞, 就是G2期的时间。从开始出现标记的M期细胞到标记有丝分裂百分数达到最大值, 说明原处于S期最后阶段的细胞已完成M期, 所经历的时间为M期的时间。由于S期的持续时间长于M期, 所以标记有丝分裂比率的高峰要维持一定时间, 从开始出现标记的M期细胞到标记的有丝分裂比率开始下降的时间间隔为S期的时间。而第一次出现标记细胞和第二次出现标记细胞之间的时间间隔为细胞周期时间。答案: (1) G2, 理由是:处于DNA复制最后阶段的细胞最先经G2期成为分裂期细胞; (2) 分裂期, 理由是:a点后, 原处于DNA复制期最后阶段的细胞完成有丝分裂; (3) S; (4) a～e。
[例2]在研究细胞周期时，可以用BrdU进行标记。将细胞置于含有BrdU的某种培养基中培养，当细胞的DNA复制时，BrdU可替代胸腺嘧啶脱氧核苷酸掺入到DNA的子链中。将处于不同细胞周期的中期细胞进行常规制片，经特殊染色后，在显微镜下观察每条染色体的姐妹染色单体的着色情况。由于掺入BrdU的情况不同，着色的深浅也不同：在染色单体中，若DNA只有一条单链掺有BrdU，则着色深；若DNA的两条单链都掺有Brd U，使DNA双链螺旋程度降低，从而着色浅。请分析回答：
(1）若观察到置于含有BrdU的某种培养基中培养的细胞中所有染色体上的两条姐妹染色单体着色深，则该细胞正处于第个细胞周期的中期。
(2) 若细胞中的所有染色体上的两条姐妹染色单体一条着色深、一条着色浅, 则该细胞正处于第个细胞周期的中期。判断的理由是。
(3) 科学研究表明, 在细胞周期中, 染色体的两条姐妹染色单体之间可能发生部分交换。若用显微镜观察, 如何判断姐妹染色单体已发生了部分交换?答:。
解析：（1）着色深说明DNA只有一条单链掺有BrdU，即DNA只经过一次复制，细胞处于第一个细胞周期。（2）第一次分裂产生的DNA一条链掺有BrdU，一条链没有BrdU，以这两条链分别为模板，在含有BrdU的培养基中进行第二次复制，结果子代一个DNA的两条链都掺有BrdU，另一个DNA的一条链掺有BrdU，一条链没有BrdU，使细胞中的所有染色体上的两条姐妹染色单体一条着色深、一条着色浅。（3）如果染色体的两条姐妹染色单体之间发生了部分交换，用显微镜观察时会发现同一条染色单体的着色深浅会不一样。答案： (1) 一； (2) 二，理由是这时细胞内的所有染色体中，一条染色单体的DNA分子只有一条单链含有BrdU，另一条染色单体的DNA分子则两条单链都含有BrdU； (3）染色体上着色深的染色单体中含有着色浅的染色单体片段，着色浅的染色单体中含有着色深的染色单体片段。
[例3]细胞周期包括分裂间期（分为G1期、S期和G2期）和分裂期（M期）。图3标注了甲动物（体细胞染色体数为12）肠上皮细胞的细胞周期各阶段的时长及DNA含量。请回答下列问题：
(1）若用含放射性同位素的胸苷（DNA复制的原料之一）短期培养甲动物肠上皮细胞后，处于S期的细胞都会被标记。洗脱含放射性同位素的胸苷，换用无放射性的新鲜培养液培养，定期检测。预计最快约h后会检测到被标记的M期细胞。
(2）从被标记的M期细胞开始出现到其所占M期细胞总数的比例达到最大值时，所经历的时间为期的时间，处于该期的一个细胞中染色体数目的变化情况是。
(3) 若向甲动物肠上皮细胞培养液中加入过量胸苷, 处于S期的细胞立刻被抑制, 而处于其他时期的细胞不受影响。预计加入过量胸苷约h后, 细胞都将停留在S期。
(4）乙动物肠上皮细胞的细胞周期时长为24h, M期时长为l.9h。若要在显微镜下观察细胞有丝分裂过程中染色体形态的变化，选用（填“甲”或“乙”）动物肠上皮细胞更合适。
解析和答案: (1) S期最后阶段的细胞经G2期后最先变为M期细胞, 故检测到被标记的M期细胞最短时间为G2期, 即2.2h。 (2) 被标记的细胞从M期开始出现, 到其所占M期细胞总数比例达到最大值后, 变为间期细胞, 故经历的时间即为M期时间。 (3) 刚结束S期的细胞, 经过G2、M、G1期后再次到达S期时会受到抑制, 经历时间共为7.4h, 其他各期细胞到达S期的时间均短于该时间。 (4) 观察染色体形态变化主要是观察分裂期的细胞, 而分裂期细胞的多少与其所占细胞周期的时间比例呈正相关。甲、乙动物肠上皮细胞分裂期所占时间分别约为12%、8%, 因此选甲动物作为观察材料。答案: (1) 2.2; (2) M 12→24→12; (3) 7.4; (4) 甲。
[例4]细胞增殖过程中DNA含量会发生变化。通过测定一定数量细胞的DNA含量，可分析其细胞周期。根据细胞DNA含量不同，将某种连续增殖的细胞株细胞分为三组，每组的细胞数如图4。从图中所示结果分析其细胞周期，不正确的是：
A.乙组细胞正在进行DNA复制
B.细胞分裂间期的时间比分裂增长
C.丙组中只有部分细胞的染色体数目加倍
D.将周期阻断在DNA复制前会导致甲组细胞数减少
解析和答案：乙组中DNA含量从2C达到了4C，反映了细胞中DNA的复制过程，即S期。甲组细胞DNA含量为2C，是G1期，处于甲组和乙组状态的细胞较多，说明间期较长。丙组细胞DNA含量为4C，说明已完成DNA复制，为G2期和M期细胞，但染色体数目加倍只发生在有丝分裂后期，所以丙组中只有部分细胞染色体数目加倍。如果将DNA的复制阻断，则会导致甲组细胞数增多，而乙、丙细胞数相对减少。答案：D。
[例5]科学家在研究蚕豆根尖分生区细胞的有丝分裂周期时，分别用放射性同位素15N标记胸腺嘧啶脱氧核苷酸（15N-TdR），用32P标记尿嘧啶核苷酸（32P-UdR），把两种核苷酸被细胞利用的速率绘成曲线如图5所示。已知蚕豆根尖细胞有丝分裂周期为20h。下列对结果的分析，不正确的是：
A.b点时，细胞正在大量合成RNA
B.d点时，细胞中DNA含量达到最大值
C.ce段，细胞最容易发生基因突变
D.蚕豆根尖细胞有丝分裂周期中，分裂期时间不超过6h
解析和答案：b点时，对32P-UdR的利用率最高，说明细胞正在大量合成RNA;d点时，DNA复制速度最快，DNA的复制到e点结束，e点时DNA的含量才达到最大值；基因突变发生在DNA复制过程中，ce段正是DNA复制的阶段；蚕豆根尖细胞有丝分裂周期为20h, G1期和S期的时间超过14h，因此分裂期时间不超过6h。答案：B。
细胞周期 篇2
肿瘤抑制基因Rb与细胞周期调控研究新进展
Rb与人类多种肿瘤发生关系密切,是一种重要的肿瘤抑制基因.Rb蛋白参与细胞周期调控,与p16、CDK4/6、cyclinD1等形成复杂的反馈调节网络,在G1/S关卡调控中处于中心环节,决定着细胞周期的进程.Rb又是核内信号与胞外信号相互作用的`界面,受到胞内外多种因素的调控,使Rb功能与细胞生长、分化状态相适应.
作 者：范祖森 敖世洲 FAN Zu-Sen AO Shi-Zhou 作者单位：中国科学院上海生物化学研究所,分子生物学国家重点实验室,上海,31刊 名：生物化学与生物物理进展 ISTIC SCI PKU英文刊名：PROGRESS IN BIOCHEMISTRY AND BIOPHYSICS年，卷(期)：199926(5)分类号：Q2关键词：Rb基因 细胞周期 关卡调控 肿瘤
细胞周期 篇3
〔关键词〕HSV;CDK;细胞周期蛋白;CDK抑制剂
〔中图分类号〕R373〔文献标识码〕A〔文章编号〕1009-6019-(2010)04-81-04
单纯疱疹病毒(herpessimplexviruses,HSV)是最早被发现的疱疹病毒,也是被研究最深入的病毒之一,但对其生物学特性仍然不很清楚。HSV的最主要的特征是其与宿主细胞的相互作用复杂并且为保持长期生存有着双重的生命周期〔1〕。由于其与宿主细胞复杂的相互作用,HSV已成为研究蛋白质的转位、神经系统中突触连接、膜结构、真核基因的表达调节、基因治疗、病毒与宿主细胞相互作用及其他生物学问题的重要模型和工具〔2〕。本文就近年来HSV复制与细胞周期蛋白的关系的研究进展进行综述。
1HSV概况
HSV属于α疱疹病毒科,包括HSV-1和HSV-2两种,以HSV-1为代表(以下简称为HSV)。HSV是大型的有包膜的双螺旋DNA蛋白,基因组全长约152kb,GC含量占68%以上。HSV基因组为一线性双链DNA分子,由共价连接的长片段(L)和短片段(S)组成,两者分别占病毒DNA的82%和18%,每一片段由中间的独特序列(分别称为UL和US)和两端的倒置重复序列(RL和RS)组成。HSV基因组共约含有74个基因,编码近90种蛋白质。根据其动力学性质可将HSV病毒基因分为立即早期基因(immediate-early,IE或α),早期基因(early,E或β)和晚期基因(late,L或γ)3类〔3〕。HSV感染包括增殖性感染和潜伏性感染两种,除引起皮肤和粘膜的疱疹样病变外,还能引起诸如中枢神经系统、呼吸系统、生殖器官以及流产、死胎和肿瘤等多种疾病〔3〕。
2HSV与细胞周期
在正常的情况下,周期中细胞分为分裂期(M期)和分裂间期,分裂间期包括Gl、S、G2等3个时期。细胞仅在S期含有DNA半保留复制所需的代谢底物、酶和蛋白因子,因此不编码大部分DNA复制所需蛋白的DNA病毒纷纷采取独特的策略克服这一变化的核环境问题。小DNA病毒采取的生存策略就是当被感染的细胞进入S期、条件合适时再复制其病毒DNA〔4〕。对比之下,象HSV这样的大DNA病毒,不仅能在分裂细胞中繁殖,而且还能在静止细胞及终末分化的神经细胞中繁殖,因此长期以来一直认为大DNA病毒复制与细胞周期相关蛋白无关。但近年来的研究发现,HSV复制不仅需要细胞周期相关蛋白,而且己进化到能诱导静止细胞产生细胞周期相关蛋白,HSV感染后诱导宿主细胞停滞于细胞周期某一特定时相,抑制宿主细胞DNA合成,抑制细胞凋亡,但支持HSVDNA的复制,完全为HSV服务。
2.1HSV感染引起细胞周期阻滞1988年deBruyn和Knipe用原位杂交技术确凿的证明HSV感染引起细胞DNA合成的抑制〔5〕。人们认为这种DNA合成的阻滞是因为HSV感染使细胞周期阻滞于G1/S期检验点导致的。流式细胞仪分析表明HSV感染的确能引起细胞周期阻滞,G1期细胞增加。Dargan等用无DNA的HSV蛋白感染细胞也能引起细胞周期阻滞,且并不导致细胞凋亡。说明不是因为HSVDNA的合成导致细胞周期阻滞的,是HSV外壳蛋白对细胞周期相关因子起到了抑制作用。多项研究综合表明是HSV中的ICPO和ICP27蛋白的作用引起的细胞周期阻滞〔6〕。
HSV具有高度的易感性,其宿主细胞广泛,能感染分裂期或非分裂期细胞,是较理想的基因治疗载体。HSV能引起细胞周期阻滞某种程度上说是对细胞有一定毒性作用的。鉴于这种细胞周期的阻滞作用是由于ICPO、ICP27引起的,基于ICPO/ICP27的基因表达载体构建对于病毒的基因治疗将有重要意义。
HSV既能在静止细胞也能在周期细胞中繁殖,而且本身还编码DNA聚合酶等复制相关蛋白,HSV感染使细胞周期阻滞是否是为了本身的繁殖目前还不清楚。有报道说细胞组蛋白与HSVDNA结合会抑制病毒DNA的复制和转录〔7〕。也有人认为细胞周期阻滞是宿主对抗病毒的一种平衡。我们更倾向于认为是由于HSV对细胞代谢的改变亦即通过抑制细胞DNA的合成,减少原料、细胞因子的浪费,而使细胞被动的停滞在G1/S期检验点。
2.2HSV复制需要细胞周期相关蛋白的活性曾一度认为HSV复制不需要细胞周期相关蛋白。但研究发现,HSV在周期细胞中的复制效率远远高于静止细胞,HSV虽然编码DNA聚合酶等DNA合成相关蛋白,但不编码拓扑异构酶、DNA连接酶,而且可在病毒复制蛋白缺乏的条件下复制,那么此时HSVDNA复制蛋白只能由宿主细胞来提供。而HSV感染能引起细胞周期阻滞在并不表达这些酶和蛋白的G1期,并且HSVDNA得到复制,说明HSV可能诱导了S期相关蛋白在Gl期的表达。这就促使人们研究HSV细胞周期相关因子在HSV繁殖中的作用。
早在1978年Yanagi等研究发现,HSV不能在非允许温度下阻滞于G1期的温度敏感型幼仓鼠肾细胞(tsBHK)突变株tsAF8中繁殖,但能在允许和非允许温度下阻滞于S期的tsBHK突变株tsHJ4中繁殖。对这一结果最简单的解释就是HSV复制需要S期相关蛋白。后经一系列的实验证实tsAF8中编码细胞周期相关蛋白HCF-l(Themammaliantranscriptionalcoactivatorhostcellfactor-1)的基因发生了突变,亦即细胞周期的重要调节因子HCF是HSV繁殖所必需。现证明HCF与oct-1及间层蛋白V16结合作用于立即早期基因增强子核心序列TATGRAT上促进立早基因的转录〔8〕。
E2F是促进Gl/S期以及S期相关基因转录的主要转录激活因子,关于E2F在HSV感染细胞中活性变化的报道结果不一。有报道说HSV感染后代表GO/G1期特征的抑制性复合物E2F/pRb、E2F/p107增加,许多依赖转录因子E2F的S期相关基因转录下降〔9〕。ICP4、ICP27功能缺陷型HSV感染宿主细胞后不能引起E2F以及S期标志物EZF/p107活性的升高。说明可能是HSV中ICP4、ICP27蛋白起到了诱导宿主细胞E2F基因表达的作用。Song等的结果进一步证明抑制性复合物E2F/pRb和E2F/p107增加是由于HSV中ICP4、ICP27、ICP0的作用结果。因此认为E2F以及S期标志物E2F/p107可能在HSV基因复制和转录中起重要作用。
与正常细胞的Gl期不同,许多S期相关蛋白存在于HSV感染的处于G1期的细胞中。这种HSV能独立于细胞周期而诱导细胞S期基因表达但使细胞呈G1期状态,说明HSV能改变多种细胞周期相关蛋白的活性,为HSV复制服务。HSV与细胞周期有着广泛的相互作用,尽管详细的作用蛋白和作用机理尚未阐明,各家观点不一,但对这些研究进行综合所得出的一般结论是:HSV复制与细胞周期密切相关,细胞周期相关蛋白在HSV复制中起重要作用。其中细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(cyclindependentkinases,CDK)是HSV繁殖所必需。
3CDK在HSV复制中的作用机制
CDK:周期蛋白依赖性蛋白激酶,属丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族,它只有与相应的细胞周期蛋白(cyclin)结合后才有活性。1998年Shang等对很多抑制细胞周期相关蛋白、细胞某些信号转导途径抑制剂的抗病毒作用的筛选结果表明,只有能抑制CDK1、2、5、7的药理学CDKs抑制剂(pharmacologicalCDKSinhibitors,PCI)Roscovitine能抑制HSV的复制,此抑制作用发生于对细胞周期的抑制之前,且PCI对HSV的抑制程度与其对CDK的抑制程度相关〔10〕。也就是说不是细胞周期的阻滞,而是CDK活性的抑制使HSV基因的转录以及DNA的复制不能进行,说明了CDK在病毒复制中的重要性。
3.1CDK可能通过促进RNA聚合酶ⅡCTD的磷酸化而促进HSV基因转录的起始Roscovitine抑制HSV的转录可能是通过抑制起到转录调节作用的CDK进行的。RNA聚合酶Ⅱ在转录起始前先要形成转录起始前复合物,然后其羧基末端结构域(carboxyl-terminaldomain,CTD)被CDK7等磷酸化从而使RNA聚合酶Ⅱ从转录起始前复合物中释放出来起始转录。在转录过程中RNA聚合酶Ⅱ的CTD进一步被CDK9磷酸化。CDK1、2也参与RNA聚合酶ⅡCTD的磷酸化〔11〕。因此CDK活性的抑制可能影响到RNA聚合酶ⅡCTD的磷酸化从而抑制HSV基因的转录起始。体外提取HSV感染的细胞核,用Run-On实验证明Roscovitine能抑制HSV立即早期基因转录的起始,在转录起始后加入能抑制CDK1、2、5、7的Roscovitine并不影响HSV立即早期转录本的量,说明Roscovitine对转录的延长过程没有作用,只是抑制转录的起始。参与转录延长的是CDK9,CDK5的功能不涉及转录,而CDK1仅在HSV感染后期起作用。那么可能是CDK2、7是HSV转录起始所必需的。
3.2CDK可能通过影响HSV染色体的构象而促进HSV基因转录起始复合物的组装Roscovitine能抑制HSV基因的转录但对细胞基因的转录没有影响,甚至在Roscovitine存在下细胞转录本的量更多。说明可能Roscovitine并不是单纯通过抑制依赖于CDK的RNA聚合酶Ⅱ的CTD而抑制HSV基因的转录的。由于Roscovitine抑制基因的转录与启动子无关〔12〕,我们推论CDK可能通过影响HSV染色体的构象而影响HSV基因的转录。目前支持这一推论的实验还不多。我们的初步实验也发现:未用Roscovitine处理的转录活跃的HSV基因组能被DNA酶水解成弥漫状,而用Roscovitine处理的HSV基因组能够抵抗DNA酶的水解。说明Roscovitine处理和非处理的HSV染色体构象不同,CDK的确对HSV染色体的构象有影响。有学者研究,只要HSV启动子结合了各种转录因子及RNA聚合酶形成了转录起始前复合物,HSV基因的转录就不受Roscovitine的影响。说明Roscovitine并没有作用于HSV转录的起始过程,而是影响了HSV染色体的活化阻止了转录起始前复合物在HSV启动子上的组装从而抑制了HSV基因的转录。亦即CDK可能通过促进HSV染色体的活化而促进了HSV基因的转录。
3.3CDK可能通过使HSv调控蛋白磷酸化而促进HSV基因的转录蛋白质的磷酸化是调控蛋白质生物活性的重要方式。HSV基因组中仅编码两种蛋白激酶(UL13,US13)〔13〕,不能满足HSV调节蛋白磷酸化的需要。因此细胞蛋白激酶在通过磷酸化调控HSV蛋白中起重要作用,其中CDK可能通过促进HSV调控蛋白的磷酸化而促进HSV基因的转录和DNA的复制。
ICPO和ICP4是调控HSV基因转录的主要蛋白。Roizman等发现Roscovitine能抑制ICP0和ICP4的磷酸化。Davido等发现在Roscovitine存在下ICP0的电泳特性不同亦即ICP0的结构有所不同,Roscovitine影响了ICPO的转录后加工过程。进一步发现在Roscovitine存在下ICPO对早期基因ICP6转录激活作用大大下降。这一结果与前述Roscovitine即使在立即早期蛋白得到表达仍然能够抑制HSV早期基因的转录的结果一致,立即早期蛋白必须经过CDK的修饰活化才能促进早期基因的转录。
综上,与小的DNA病毒类似,HSV的复制也与细胞周期密切相关。HSV在周期细胞中的复制速度远远大于静止细胞。HSV感染引起细胞周期阻滞但诱导了细胞周期相关蛋白的表达和活性以促进HSV的的复制。CDK可能通过通过促进RNA聚合酶CTD的磷酸化、影响HSV染色体的构象、使HSV调控蛋白以及细胞蛋白的磷酸化等多种机制促进HSV基因的转录和DNA的复制。
4展望
目前发现能被PCI抑制的病毒越来越多,亦即众多的病毒的复制或转录都需要CDK〔14〕。说明CDK2在病毒复制中作用的普遍性。CDK似乎是病毒与宿主细胞抗衡的的焦点。因此CDK抑制剂正在作为抗病毒药物进行积极的研发中,PCI作为抗肿瘤药已进入临床二期实验阶段。虽然自从1998年首次发现PCI能抑制HSV的繁殖以来,关于PCI抗病毒作用的研究较多,但是具体哪种CDK在HSV繁殖中起作用,在HSV感染的哪一阶段起作用所知不多。正像过去HSV是研究真核生物转录机理及调控的模型一样,目前HSV也成了研究病毒于宿主细胞相互作用以及抗病毒药物研制开发的重要模型。深入研究CDK与HSV复制的关系将会对HSV以及其他重要疾病病毒在细胞内的活动过程有更清晰的认识,同时对PCI作为抗病毒药的研发具有重要意义。
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细胞周期 篇4
氯化锂对人体具有广泛的生理活性, 其活性涉及神经、免疫、内分泌、血液等组织系统。另有研究表明氯化锂是糖原合成酶激酶3β (glycogensynthase kinase 3β, GSK 3β) 的高度选择性抑制剂[1], 糖原合成酶激酶3β是一种丝/苏氨酸蛋白激酶, 参与许多细胞生命的过程。新近研究显示, 氯化锂可通过抑制GSK 3β从而减少化疗药物所致的细胞凋亡, 即氯化锂可能促进肿瘤细胞的生长[2], 但亦有与此相反的结论, 氯化锂能抑制肿瘤细胞增殖并导致周期阻滞[3]。但关于LiCl对人类胃癌细胞系MGC 803有何作用尚未见文献报道。本文在体外研究LiCl对MGC 803胃癌细胞增殖和细胞周期的影响, 以观察一定浓度的LiCl对MGC 803细胞增殖和周期的作用。
1材料和方法
1.1实验细胞
MGC 803细胞为人胃低分化粘液癌, 由内蒙古医学院分子生物学研究中心提供。
1.2试剂
RPMI—1640培养基 (CIBCO, USA) 4℃保存。小牛血清 (FBS) 灭活后分装, -20℃冻存。LiCl, 用1640配成1.0mol/L贮存液, 4℃保存。PI (碘化丙啶) MTT (美国SigmaCo.) 用PBS配成5mg/mL浓度。
1.3方法
1.3.1细胞培养
MGC 803细胞培养于含10%新生小牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI—1640培养液中, 置于37℃, 湿化的5%CO2孵箱中培养。每 (1～2) d更换培养液, 每周按1∶3比例传代 (用0.25%的胰蛋白酶) 1次。待培养的MGC 803细胞生长至70%～90%汇合状态时进行无血清化及加药 (LiCl) 处理, 每次实验均采用同一代细胞, 并用不同批次的细胞重复实验。
1.3.2 MTT比色法检测细胞增殖
以约5×103个/孔密度将等量细胞接种于96孔板上培养24h后, 处理组分别加入含不同浓度LiCl (10、20、40mmol/L) 的新鲜无血清培养液, 未处理组加入等量RPMI 1640培养基, 每个浓度平行接种3孔, 再培养24h后每孔加入5mg/mLMTT 20μL及PBS100μL, 37℃, 5%CO2, 饱和湿度培养4h后去除上清, 加入100μLDMSO, 充分振荡溶解甲瓒颗粒后用酶标仪 (波长570nm) 测定各孔的OD值, 实验重复3次。
1.3.3流式细胞术检测细胞周期
以10、20、40mmol/LLiCl作用MGC 803细胞24h后, 将MGC 803细胞分别进行消化, 制成细胞悬液, 计数达到 (1～5) ×106个/mL, 离心 (1 000r/min, 5min) 弃去培养液;PBS洗1次;离心 (1 000r/min, 5min) 弃去PBS, 加入-20℃预冷的70%乙醇, 置于-20℃固定过夜。上机前离心 (1 000r/min, 5min) 弃去固定液, PBS重悬5min×2次, 离心 (1 000r/min, 5min) 后弃去PBS;采用PI染色液, 室温避光染色5min后上样, 每个样本获得2.0×104个细胞, FACSCalibur型流式细胞仪检测MGC 803细胞在细胞周期各时相所占的百分比。每组实验重复3次。
1.4统计学分析
实验数据以表示, 采用SPSS 12.0统计分析软件进行单因素方差分析 (OnewayANOVA) 。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 LiCl对MGC 803细胞MTT值的影响
MGC 803细胞与不同浓度的LiCl培养24h后, 结果显示处理组的MTT值显著低于未处理组, 并呈剂量依赖关系 (图1) 。
2.2 LiCl导致MGC 803细胞周期阻滞于G2/M期
流式细胞术分析细胞周期变化结果显示, 不同浓度的LiCl处理MGC803后, S期细胞减少, G2/M期细胞增多, 与对照组比较差异有显著性 (P<0.05) (图2) 。
3 讨论
早期, LiCl被用于治疗狂燥型的精神病, 在治疗的过程中人们对LiCl治疗疾病的作用机制进行了大量研究, 认为主要与以下几个机制有关:①锂阻断磷脂酰肌醇循环[4], 用以治疗精神系统疾病;②锂直接抑制糖原合成酶-3β (GSK3β) 而活化Wnt信号途径[5];③抑郁性神经症和躁狂症的患者血中5-羟色胺 (5-HT) 降低, 锂能降低去甲肾上腺素的活性, 增加5-羟色胺的释放[6], 起到治疗作用;④锂提高谷氨酸转运体的功能[7]等。有研究者证实在肝癌细胞[8]、原代培养的牛主动脉内皮细胞[9]中, LiCl能使细胞阻滞于G2/M期进而抑制细胞生长, 此作用在一定范围内呈剂量效应关系。然而, LiCl对细胞生长和细胞周期进展的影响可能随细胞类型的不同而不同。但未见LiCl对人类胃癌细胞系MGC803细胞作用的报道。
本实验用不同浓度的LiCl刺激MGC803细胞株, 24 h后进行细胞增殖活性及细胞周期分析。发现LiCl能明显抑制MGC803细胞的增殖, 并呈剂量依赖关系, 使得细胞发生G2/M期阻滞。这种细胞增殖抑制作用可能与糖原合成酶激酶3β有关[10]。GSK3β是一种多功能的丝/苏氨酸磷酸激酶, 能磷酸化抑制或降解许多底物, 包括与调节细胞增殖有关的Cyclin D1蛋白及转录因子β-catenin等[11]。抑制GSK3β的功能将促进这些转录因子的活化, 从而促进相应基因的转录。作为GSK3β的特异性抑制剂, LiCl被广泛用于研究GSK3β的功能。本实验表明, LiCl减慢MGC803细胞增殖, 导致G2/M期阻滞, 提示在胃癌细胞中抑制GSK3β的功能具有抗肿瘤的作用, 但有关的信号通路不明, 其意义和分子机制有待进一步研究。
摘要：研究氯化锂 (LiCl) 在体外对MGC803胃癌细胞增殖及周期的影响, 以不同浓度的LiCl作用MGC803细胞24h后, 采用四甲基偶氮唑盐 (MTT) 比色法检测各组细胞的增殖活性, 利用流式细胞术进行细胞周期分析。结果:①不同浓度的LiCl (10、20、40mmol/L) 均对MGC803细胞具有抑制增殖的作用, 这种增殖抑制作用呈剂量依赖关系。②随着LiCl浓度的升高, 发生G2/M期阻滞, 与正常对照组相比, 差异具统计学意义。说明LiCl能抑制MGC803胃癌细胞增殖和导致G2/M期阻滞。
关键词：氯化锂,MGC803细胞系,细胞增殖,细胞周期
参考文献
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细胞周期 篇5
目的:为研究细胞周期蛋白(cyclin)在肿瘤形成过程中的分子机制,构建带FLAG标签的细胞周期蛋白B1、D1、E的真核表达载体,并检测其在293T细胞中的表达.方法:以乳腺cDNA文库为模板,分别扩增细胞周期蛋白B1、D1、E基因全长编码区序列,克隆到pcDNA3-FLAG真核表达载体上;用脂质体介导的基因瞬时转染法,将重组正确的表达载体转染293T细胞,检测细胞中的FLAG融合蛋白的.表达.结果:酶切鉴定和DNA序列分析显示构建了正确的FLAG-Cyclin真核表达载体,Western印迹分析表明克隆的载体都能在真核细胞中表达分子大小相符的重组蛋白.结论:构建了FLAG-CyclinB1、FLAG-CyclinD1、FLAG-CyclinE真核表达载体,为细胞周期蛋白及其相关蛋白的研究奠定了基础.
作 者：熊志红 丁丽华 袁斌 王朝云 李杰萍 杨丽萍 杨智洪 叶棋浓 XIONG Zhi-Hong DING Li-Hua YUAN Bin WANG Zhoo-Yun LI Jie-Ping YANG Li-Ping YANG Zhi-Hong YE Qi-Nong 作者单位：熊志红,XIONG Zhi-Hong(军事医学科学院,生物工程研究所,北京,100850;解放军总医院第二附属医院,结核病研究室,北京,100091)
丁丽华,袁斌,王朝云,李杰萍,杨丽萍,杨智洪,叶棋浓,DING Li-Hua,YUAN Bin,WANG Zhoo-Yun,LI Jie-Ping,YANG Li-Ping,YANG Zhi-Hong,YE Qi-Nong(军事医学科学院,生物工程研究所,北京,100850)
细胞周期 篇6
关键词：绵羊,多浪羊,阴道涂片,发情周期,细胞类型
多浪羊是新疆特有的地方品种,具有抗逆性强、繁殖性能高、繁育成活率高、生长发育快、母羊利用率高等特点,是研究季节性繁殖机制的良好素材。在季节性繁殖机理研究过程中,准确划分绵羊发情周期是关键。目前,有关绵羊发情周期不同阶段(发情期、发情后期、发情间期、发情前期)的划分主要是以试情法、阴道直接观察法等方法为主[1]。试情法能较准确地确定绵羊的发情周期,但是由于气候和环境等多种因素的影响,有时绵羊会表现出隐性发情,给试验带来较大误差[2]。阴道直接观察法能比较直观、快速地把握绵羊的发情情况,但是需要操作者有一定的临床经验,因此不能被大部分科研工作者接受。阴道涂片法是一种通过阴道细胞类型比例变化对发情周期不同阶段进行鉴定的细胞学检测方法,其优点是比较准确,许多学者在小鼠、猫、绵羊等动物模型上均取得了较理想的试验结果[3],但是中间利用染色来确定每种细胞需要1～2 h,甚至更长时间,耗时耗力。研究旨在提供一种简便而实用的阴道涂片直接镜检方法,该方法能够对阴道细胞类型变化进行快速、准确地分析,并判断多浪羊所处发情周期的不同阶段。
1 材料
1.1 试验动物
3～4岁多浪羊母羊10只,8月份购于新疆生产建设兵团农三师小海子种羊场。隔离饲养30 d,经观察均无异常后于新疆农垦科学院种羊场进行统一饲养,给予充足的饲料及饮水。
1.2 仪器及试剂
普通光学显微镜,Olympus公司生产;移液枪,Eppdendorf公司生产;生理盐水、载玻片,均由南通天盛实验器材有限公司生产。
2 方法
2.1 公羊试情及发情周期观察
分别于每天8:00、20:00进行公羊试情,观察记录每只试验羊的发情时间及其大致规律,持续观察1～2个情期,待其发情周期稳定后进行试验。
2.2 阴道分泌物采集
随机挑选发情表现正常的5只多浪羊进行正式试验。从第2个情期开始跟踪采集绵羊的阴道分泌物,制备涂片进行细胞观察,每天1次。具体方法为将移液枪(tip头内提前吸入20 μL生理盐水)插入绵羊阴道顶端,不要太深,吹打2～3次后吸取阴道分泌物,放入0.2 mL EP管中。
2.3 阴道涂片直接镜检
制备涂片时先将分泌物反复吹打均匀,然后吸取1滴放在载玻片上。每个个体用1个载玻片,确保无污染。将载玻片置于光学显微镜上,根据细胞特点区分不同细胞类型并对每种细胞逐一计数,同时记录结果。对试验结果进行t检验,确定差异是否显著。
2.4 绵羊发情周期不同阶段的判定标准
按照参考文献[4]介绍的阴道涂片中细胞类型变化特点来划分绵羊发情周期的不同阶段。
3 结果与分析
3.1 多浪羊适应性观察
在最初的2～3 d,试验羊均表现为食欲低下,警惕性高;5 d后食欲逐渐恢复正常,偶有食欲差的表现;10 d后所有羊完全恢复正常,精神状态及食欲表现良好;30 d内有10只羊先后出现发情状况。
3.2 多浪羊发情周期不同阶段阴道细胞涂片镜检
阴道细胞主要由角质化细胞、有核上皮细胞和白细胞组成。发情前期绵羊阴道涂片中主要以上皮细胞为主(见图1 A1、A2),形态为圆形、有核,而角质化细胞核白细胞数量很少;发情期绵羊阴道涂片中角质化细胞占大多数(见图1 B1、B2),角质化细胞形态不规则,无核,多为柳叶型,白细胞和上皮细胞数量很少;发情后期绵羊阴道组织涂片中上皮细胞、角质化细胞以及白细胞数量相近(见图1 C1、C2);发情间期绵羊阴道涂片中以白细胞居多(见图1 D1、D2),形态为圆形,体积小,而角质化细胞核上皮细胞数量很少。
绵羊无污染的阴道涂片在发情前期(A1、A2)、发情期(B1、B2)、发情后期(C1、C2)、发情间期(D1、D2)的显微镜照片,箭头所指的位置分别为白细胞、上皮细胞、角质化细胞;左图和右图分别 为10倍和40倍物镜下的视野图,无需聚光镜。
3.3 发情周期各阶段持续时间(结果见表1)
3.4 发情周期各阶段阴道涂片中3种细胞所占比例(结果见表2)
注:同列数据肩标大写字母不同表示差异极显著(P<0.01),大写字母相同表示差异不显著(P>0.05)。
由表2可知:发情前期的未角质化上皮细胞极显著多于其他2种细胞(P<0.01);发情期的角质化细胞占绝大部分(P<0.01),而未角质化的上皮细胞也极显著多于白细胞(P<0.01);发情后期3种细胞差异不显著(P>0.05);发情间期白细胞数量极显著多于其他2种细胞(P<0.01),未角质化的上皮细胞极显著多于角质化细胞(P<0.01)。
4 讨论
小鼠与大鼠阴道涂片法检测结果表明:小鼠与大鼠阴道细胞主要有上皮细胞、角质化细胞、白细胞,在发情周期不同阶段这3种细胞比例存在规律性变化[1,5]。刘丕刚等[2]研究发现:绵羊阴道细胞主要成分包括上皮细胞、角质化细胞、白细胞及细胞碎片。研究结果显示:多浪羊阴道分泌物中的细胞成分为上皮细胞、角质化细胞、白细胞,有文献报道不同种动物发情周期阴道分泌物主要成分基本相同,揭示了大部分动物生殖系统的关联性。
刘丕刚等[2]报道:在绵羊发情周期中,发情前期主要以有核上皮细胞为主,白细胞数量极少;发情期角质化细胞占大部分,几乎没有白细胞;发情后期有核上皮细胞数量最多,角质化细胞次之,白细胞最少;发情间期有核细胞数量最多,角质化细胞数量最少。试验结果表明:在多浪羊发情周期不同阶段,阴道分泌物中均可检测到3种细胞,但细胞比例有所变化,推测发情周期阴道腔脱落的细胞是一个连续的、逐渐变化的过程。发情后期与发情间期3种细胞所占比例与刘丕刚等[2]报道的有一定差异,造成这种差异的原因可能与不同绵羊品种其阴道腔细胞脱落过程受诸多因素影响有关。发情期角质化细胞占大多数,明显多于其他2种细胞;发情前期主要细胞成分为有核上皮细胞,远远多于其他2种细胞,这可能是由于发情周期雌激素水平的变化大幅度地影响了阴道脱落细胞结构的变化。因此,在绵羊中依据有核上皮细胞和角质化细胞的变化,可以简单、有效地区分和鉴定绵羊的发情前期、发情期、发情后期、发情间期[6]。
绵羊的繁殖周期即发情周期,是指绵羊生殖器官发生一系列周期性的变化,这种变化周而复始(非繁殖季节及怀孕期除外),一直到机能活动停止。根据卵巢、生殖道及母畜行为的一系列生理变化,可将1个发情周期分为相互衔接的4个时期,即发情前期、发情期、发情后期及发情间期。在动物生殖和激素水平测定的相关试验中,常常需要较准确地确定不同发情时期的具体范围[4]。研究根据阴道涂片法确定多浪羊的发情时间,发情后期(4±1)d、发情间期(9±3)d、发情前期(16±3)d、发情期(2±1)d,这与赵兴绪[7]报道的绵羊发情周期不同阶段时间长短相一致,说明根据细胞类型确定绵羊发情周期是可行的。
参考文献
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细胞周期 篇7
细胞周期 (cell cycle) 是指能持续分裂的真核细胞从一次有丝分裂结束后生长, 直至下一次分裂完成结束的循环过程。细胞周期阻滞是指真核细胞的细胞周期在形成的过程中需要大量的细胞内外的信号相互配合, 如果在这个过程中相应的信号有缺失, 细胞就不能继续从当前阶段向下一个阶段发展的现象, 这种现象称为G1/S, G2/M期阻滞。
1 将白血病细胞阻滞在G1期的调控基因
p16、p21以及p53基因使白血病K562细胞停滞在G1期的研究已经非常透彻。P16是1994年由美国冷泉实验室发现的新抗癌基因, 该基因又被称为p16/CDKN2基因或MTS1基因, 该基因可以直接参与细胞周期的调控, CDK4与该基因的产物p16蛋白特异性结合, 会导致CDK4失活, 对细胞的增殖和分裂负调节, 是可以直接作用于细胞周期的抑制癌细胞的因子[2]。p21基因是依靠性激酶抑制剂家族中的细胞周期蛋白。既能通过抑制CDKs复合物的生物活性, 影响DNA复制和修复、协调细胞周期, 又与肿瘤抑制作用有关系, 因此通过该基因影响细胞周期, 从而抑制肿瘤的形成。p53是人体抑癌基因, p53基因的失活在肿瘤的形成过程中起重要作用。
细胞周期被组织在G0/G1期还有可能是与Cyclin D1和Cyclin E有关。细胞周期蛋白 (cyclins) 为细胞周期正常运作中的一类重要调节因子, cyclins的作用发挥是由于在功能上要结合特定的细胞周期素依赖激酶 (CDKs) , 形成的复合物cycline-CDKs通过对特异性底物磷酸化的机制, 以细胞周期以来的方式促进细胞增殖作用[3]。Cyclin D1是G1期周期蛋白, 由定位于人染色体11q13的Cyclin D1基因编码, 含259个氨基酸, 相对分子量为34000。将抗Cyclin D1抗体向正常的G1期纤维母细胞内微量注入, 能有效组织细胞进入S期, 从而导致细胞生长失去控制。Cyclin E由定位于人染色体19q12-13的Cyclin E基因编码, 其表达总是在G1期高表达, 直至G1晚期的G1期、S期交界处达到最高峰, 随着细胞进入S期表达下降, 到G2/M期降为零。Cyclin D1和Cyclin E均在G1期与相应的CDKs结合, 促进细胞在G1期加速通过, 即细胞在G1期成正反馈, 因此又称G1期为正性调控因子。Cyclin D1和Cyclin E的表达过量可加速G1期进程缩短G1期时间, 甚至可以让细胞逃脱监测点的监控, 直接进入S期阶段, 导致细胞在生长过程中失控。
2 将白血病细胞阻滞在G2/M期的调控基因
随着时代的发展, 近几年营养因素也成为肿瘤形成的最重要因素之一, 饮食上也会促进肿瘤的生长, 像一些被分离出的碳水化合物, 则可能降低肿瘤继续生长的风险。一些苷元, 例如芹菜苷元7-葡糖苷, 会降低人早幼粒细胞性白血病的形成, 会诱导白血病HL-60细胞G2/M期增多, 并使细胞阻滞在G2/M期, 从而也使得白血病细胞发生细胞周期阻滞。
研究表明, CDKS是周期阻滞中的重要因子, Solomon等发现, 只要有足够的Cyclin B1存在, CDK1才能被激活, 允许肿瘤从G2期过渡到M期。Cyclin B1和Cyclin D1是周期阻滞中的两个重要的调节点, 所以通过调节Cyclin家族而调节CDKS家族可以使细胞周期阻滞在G2/M期, 从而也使得白血病细胞发生细胞周期阻滞。
3 将白血病细胞阻滞在G1期或G2/M期的调控基因
泛素-蛋白酶体通路 (Ubiquitin-proteasome Path-way, 简称UP通路) 是生物体内进行蛋白质选择性降解的重要途径之一, UP通路参与了例如细胞内信号的传递、细胞周期的运转、以及相关遗传基因DNA的修复等重要的生理生化过程。研究表明, 特异性蛋白酶体抑制剂也在凋亡调控中发挥重要的作用, 它可以可诱导多种人白血病细胞发生凋亡。理论上讲, UP通路主要降解与细胞生长、增殖有关的一些调节蛋白和转录因子, 例如G1期和S期的c-Jun以及Cyclins等调节蛋白的表达, 因此蛋白酶体抑制剂对细胞周期调控是导致细胞凋亡的重要原因之一。目前为止, 蛋白酶体抑制剂诱导细胞凋亡的机制目前正受到广泛的研究, 鉴于UP通路在细胞周期调控的重要性, 蛋白酶体抑制剂对细胞周期的影响可以作为研究药物的依据。
4 引起白血病细胞阻滞的其他调控基因
一些调节酶与相关作用产生的信号, 例如NO、缺氧及药物, 则成为了影响细胞周期阻滞的重要外因。所以, 随着科技的发展进步, 通过影响白血病细胞周期的阻滞来治疗白血病也成为了一个行之有效的方法。
结束语
综上所述, 使白血病细胞周期发生阻滞的因素多种多样, 既有内因, 也有外因。大量文献报道的细胞凋亡的三大通路可诱导多种人白血病细胞发生凋亡, 其诱因可能与细胞周期阻滞有关, 阻滞可能发生在G1期, 也可能在G2/M期发生阻滞。一些诱导细胞发生凋亡的凋亡促进或凋亡抑制家族可以引起细胞周期的变化, 进而引起细胞阻滞。因此, 多路径与多靶点是我们研究药物与白血病细胞周期阻滞关系的新思路。通过药物对肿瘤细胞周期的影响, 可以通过联合用药来放大相同剂量药物的作用效果。也就是说通过一种药物使肿瘤细胞全部处于G1期或某一个周期, 使针对某一周期的药物的受试群体得到进一步放大, 进而达到更好的治疗效果。这也将成为药物联合应用的又一里程碑。
摘要：细胞周期的循环过程是由许多基因共同协作而成的, 这是一个细胞物质积累与细胞分裂的循环过程。癌变的细胞以及特定阶段的胚胎细胞常常有异常的分裂周期。外源性基因, 例如p16、p21、p53、Cyclins等, 使白血病K562细胞周期停滞在G1期;CDKS因子会使细胞阻滞在G2/M期;UP介导通路可能使白血病细胞细胞阻滞在G2/M期, 也可能在G1期发生阻滞。不同的影响因子会使白血病细胞周期阻滞在不同时期, 能为治疗白血病提供更广阔的研究前景。多路径与多靶点是我们研究药物与白血病细胞周期阻滞关系的新思路。
关键词：细胞周期,细胞周期阻滞,白血病细胞,K562
参考文献
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细胞周期 篇8
p53是目前研究最为广泛、深入的一个抑癌基因。研究者普遍认为,p53在肝癌发病过程中起着十分重要的作用。流行病学资料表明,肝癌诱发因子HBV和黄曲霉素(AFB1)可通过作用于p53基因,使其249编码子突变而致肝细胞癌变[1～3]。那么,p53 249编码子突变到底是怎样致使肝细胞癌变的?目前国内外对其致癌机制尚未见报道,推测可能与p53 249编码子突变对p53蛋白结构、功能和信号传导影响有关[4],但未见相关研究报道。据此,我们利用基因打靶技术在p53中引入249 Arg到Ser突变,以期阐明该突变对P53蛋白结构和功能的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
鼠ES细胞由美国加州大学圣地亚哥分校分子生物学实验室Y.XU教授馈赠。ES细胞使用DMEM培养液加15%的胎牛血清、谷氨酰胺、非必需氨基酸、抗菌素、100μMβ-巯基乙醇和重组淋巴细胞抑制因子(LIF)进行培养。p53-Ab1鼠抗人单抗购自Neo Markers;p21鼠抗人单抗购自BD PharMingen;BAX Ab-7兔抗人多抗购自Neo Markers。
1.2 含p53 249突变的ES细胞的建立
用PCR方法在小鼠p53基因249编码子中引入点突变,使编码子249由Arg变成Ser,构建带有Neo及loxp的基因载体。电转染ES细胞,G418筛选阳性克隆。根据同源重组规律,采用PCR或Southern杂交方法筛选带有p53 249突变的阳性ES细胞,并通过测序确定该ES细胞的p53 249编码子已经由Arg变成Ser。该细胞用于以下实验研究。
1.3 细胞凋亡检测
处理组细胞分别用2.5、5、10和20 Gy的IR进行照射。照射后培养10 h,收集对照组和处理组细胞,离心,PBS洗2次,用Annexin V缓冲液重悬细胞,取3×105细胞加入5μL Annexin V-FITC(PharMingen)混匀,室温避光孵育10 min。离心,弃上清,用190μL Annexin V缓冲液重悬细胞,加入20μg/m L PI 10μL,用流式细胞仪检测凋亡细胞。
1.4 细胞周期分析
取对数生长期的细胞,以无血清的DMEM培养24h同步后,分为对照组和实验组,用20 Gy的IR进行照射细胞。照射后继续培养18 h,收集各组细胞,以PBS洗涤,用70%的冷乙醇在4℃以下固定24 h以上。用50μg/m L的PI(碘化丙啶)染色后,流式细胞仪(FACSsort,BD公司)分析周期细胞,方法同文献[5]。
1.5 蛋白印迹检测p53,p21,BAX蛋白的表达
用三去污试剂提取总蛋白,用Bradford方法测定蛋白质浓度。等量蛋白质分别采用8%(p53),15%(p21,BAX)SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳进行分离,然后转至PVDF膜上。5%牛奶室温下摇动封闭后,加入抗p53、p21、BAX抗体,4℃过夜。室温下洗膜后加入二抗,用ECL PLUS(Amersham)进行发光显影。
2 结果
2.1 用IR处理细胞后,含p53 249编码子突变的ES细胞凋亡百分数,较含野生型p53的ES细胞凋亡百分数明显减少,差异有显著性,P<0.05。
2.2 用IR处理细胞后,含p53 249编码子突变的ES细胞对IR诱导的G1/G0细胞周期阻滞作用减弱。
IR处理前,各细胞周期细胞百分数相比较没有显著差别P>0.05;IR处理后含突变P53的ES细胞G1/G0和S期的细胞百分数,分别与含野生型p53的ES细胞G1/G0和S期的细胞百分数相比较,差异有显著性,P<0.05。
2.3 用IR处理细胞后,含p53 249编码子突变ES细胞的p53的表达,与含野生型p53 ES细胞p53的表达没有差别,见图1。相反,含p53 249编码子突变的ES细胞BAX和p21的表达,较含野生型p53的ES细胞BAX和p21的表达减少,见图2、3。
3 讨论
人p53是一个由393个氨基酸组成的核蛋白。正常情况下,p53活性很低,当机体遇到各种引起DNA损伤的因素,包括UV、IR、致癌剂、霉菌毒素、端粒酶抑制剂及非DNA损伤因素,如低氧、核苷缺失、细胞黏附丧失等应激反应后,p53被激活,其活性和蛋白水平迅速提高。活化的p53为有活性的转录因子,根据应激信号及组织、细胞种类的不同,p53可通过结合到下游靶基因调控区特异的DNA序列上,调控该基因的表达而产生不同的应答。这些靶基因包括参与调控细胞周期、凋亡、分化、DNA修复、血管再生、氧化应激、化学趋化、免疫监控等方面的基因。当细胞受到基因毒性损伤时,p53则聚积阻止细胞增殖[6],同时启动并参与DNA修复[7,8]。若修复失败,则通过细胞内、外两条途径,启动细胞凋亡机制使细胞凋亡,不让该损伤下传给子代细胞而保持基因组的稳定性[9]。因此,p53被誉为基因组的守护神或分子警察。
几乎所有人类癌中都存在p53的异常,50%以上具有p53突变。错义突变累及200多个编码子。已发表的突变保存在一个国际研究机构,其网址为http://www-p53.iarc.fr/p53database.htm。这些突变主要位于p53基因的中心部位:DNA结合域,且有些突变具有肿瘤特异性。p53 249突变即为肝细胞肝癌(HCC)特有,且p53 249突变在肝癌发病中起关键作用。流行病学资料提示,20%～75%的肝癌有p53突变,而且大部分为249 Arg到Ser突变[1,3,10]。AFB1可以导致p53 249编码子突变,而肝癌中p53 249的突变与AFB1的污染程度成正相关。在欧美、日本等AFB1水平低的国家,p53这种突变的机率非常低,仅10%～20%,而且AFB1和HBV有协同作用。AFB1高的区域HCC发病机率高3倍,HBV阳性的区域HCC发病机率高达7倍,而两者都具备时HCC发病率高60倍。用AFB1处理培养的肝细胞,可使p53 249发生Arg到Ser突变[2]。本研究表明,249突变在ES水平即可损伤p53的抑癌功能,减低其下游基因如细胞周期抑制基因p21Waf1[1]、凋亡相关基因BAX的表达,其结果使肝细胞持续增殖而不凋亡[11]。因为p53 249突变位于p53 DNA结合域,直接影响p53作为转录因子的功能,p53功能的丧失使细胞不受细胞周期G1/S限制点的控制进而持续迅速增殖并抗凋亡,这可能是其在肝癌发生、发展中起关键作用的重要机制之一。然而,249编码子的突变并没有影响p53本身的表达,提示249突变对p53的影响是在转录后水平。总之,本文研究证实,p53 249突变对p53的抑癌功能会产生影响,其在肝癌的发病中起着非常重要的作用。
摘要：目的研究p53249编码子突变对p53结构、功能和信号传导的影响。方法利用基因打靶技术,在小鼠ES细胞p53基因249编码子中引入点突变,使编码子249由Arg变成Ser,根据同源重组规律,采用PCR或Southern杂交方法,筛选带有p53249突变的阳性ES细胞,并通过测序确定该ES细胞的p53249编码子已经由Arg变成Ser。利用细胞流式仪检测该突变对细胞周期及凋亡的影响,并利用Western印迹检测相关蛋白的表达。结果①用IR处理细胞后,含p53249编码子突变的ES细胞凋亡百分数,较含野生型p53的ES细胞凋亡百分数明显减少,P<0.05。②用IR处理细胞后,含p53249编码子突变的ES细胞对IR诱导的G1/G0细胞周期阻滞作用减弱。③与含野生型p53的ES细胞相比,用IR处理细胞后,含p53249编码子突变ES细胞的p53的表达没有差别,但其BAX和p21的表达,较含野生型p53的ES细胞少。结论p53249编码子突变可使p53的功能减弱,但对p53的表达没有影响。
关键词：肝癌,发病机制,抑癌基因p53
参考文献
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细胞周期 篇9
1 材料与方法
1.1细胞株来源与主要仪器和材料CHL由中科院上海细胞生物学研究所提供,RPMI 21640培养粉 (美国Gibco公司),总RNA提取试剂盒(北京普利莱基因有限公司),AMV第1条链c DNA合成试剂盒(上海生物工程技术服务有限公司),CO2电热恒温培养箱 (德国Heraeus公司),FACS420流式细胞仪(美国B&D公司)。
1.2 CTP溶液的配制 称取250 mg CTP粉, 溶解在50 ml二甲亚砜(DMSO)中,常规高压灭菌,使用时运用培养液稀释到相应浓度。
1.3 c-jun和fos m RNA表达检测将细胞接种于6孔板,待细胞融合度达到70%~80%时,给细胞换液,加入CTP浓度为20和40 mg/L的培养液,每个剂量组设2个复孔,同时设空白对照组。继续培养24和72 h后分别提取细胞的总RNA;取1~5μg总RNA,建立逆转录反应体系,将m RNA逆转录为c DNA(操作程序参考说明书)。
取逆转录产物1μl建立PCR反应体系,同时扩增fos、c-jun、EGFR和内参β-actin的基因片段。对PCR产物行琼脂糖凝胶电泳,以β-actin基因为内参检测c-jun和fos m RNA的相对表达水平。用于目的基因扩增的引物序列如下:c-jun:5′-ATGACT GCAAAGATGGAAACGACC-3′和5′ -TGATGTGCCCAT TGCTGGACTG-3′(265bp);fos :5′ -TAGTGCCAACTTT ATCCCCACGG TG-3′和5′ -CAGGAGATAGCTGCTCTA CTTTGC-3′(236bp);β-actin:5′ -TGACCCTGAAGTAAG TACCCCATTGAAC-3′和5’-ATGTCACGCACGATTTCC CTCT CA-3′(442 bp)。相对表达水平=目的基因条带亮度/ β-actin条带亮度,每个样品重复检测3次。
1.4细胞周期和细胞凋亡率检测常规消化细胞并调整细胞,将适当数量的细胞接种于培养瓶中,待细胞贴壁大约24 h后分别加入含CTP浓度为0、20和40 mg/L的培养液,每个剂量组设6个重复样品,分别加入抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)和N-乙酰半胱氨酸(NAC), 调整抗氧化剂的浓度为0、20和40 mg/L,CTP浓度保持不变,48 h换液1次;连续作用120 h后,常规收集细胞,用4℃预冷的70%的乙醇固定细胞,4℃存放备用。检测前先采用PBS洗涤2次,收集细胞沉啶,加入碘化丙啶,孵育3 h后上机检测细胞凋亡率和细胞周期的构成比。
1.5统计学分析采用SPSS 10.0进行数据分析。2组均数的比较采用独立样本t检验,多组均数的比较采用单因素方差分析。采用卡方检验对2组和多组之间的率和构成比进行比较。以α=0.05作为统计学的显著性水准。
2 结 果
2.1 CTP对c-jun、fos和EGFR m RNA表达的影响20和40 mg/L CTP作用24 h后,fos、c-jun和EGFR m RNA的表达水平显著增加,差异均有统计学意义(P<0.01)。40 mg/L CTP作用72 h后,fos m RNA表达水平显著增加(P<0.01);在20和40 mg/L CTP作用72 h后,c-jun和EGFRm RNA的表达水平显著增加(P<0.01)。见表1~3。
注:CTP—煤焦沥青。
注:CTP—煤焦沥青。
注:CTP—煤焦沥青;EGFR—表皮生长因子受体。
2.2 CTP及其与GSH和NAC相互作用对CHL细胞凋亡和细胞周期的影响CTP对细胞周期和细胞凋亡的影响见表4和表5。从表4可以看出,在无GSH或NAC作用下,20 mg/L煤焦沥青组的S期细胞构成显著高于0 mg/L组(P=0.037)。在NAC作用下,煤焦沥青20 mg/L组S期细胞的 构成比为13.7% ,显著低于0 mg/L组(P <0.05)。在20 mg/L煤焦沥青组,2.5和10 mmol/L GSH作用下的S期细胞的 构成分别 为20.3%和19.7%,显著低于0 mmol/L组(P<0.05);2.5和10 mmol/L NAC作用下的S期细胞的 构成分别 为17.1%和13.7%,显著低于0 mmol/L组(P<0.05)。在40 mg/L煤焦沥青组,2.5 mmol/L NAC作用下的S期细胞的构成显著低于0 mmol/L组(P<0.05)。
从表5可以看出,20和40 mg/L作用后,细胞凋亡受到抑制,但在CTP作用组,GSH和NAC对其抑制作用具有一定的拮抗效应,细胞的凋亡率增加,尤其是NAC的抑制效应更为明显。
的影响(n=100)
注 :CTP—煤焦沥青;GSH—谷胱甘肽;NAC—N-乙酰半胱氨酸。 CHL—中国仓鼠肺细胞;a与 0 mg/L 煤焦沥青组相比,P <0.05;b与 0 mmol/L GSH 或 NAC 组相比,P <0.05 。每个样本进行 3 次实验。
注 : CTP—煤焦沥青;GSH—谷胱甘肽;NAC—N-乙酰半胱氨酸; CHL—中国仓鼠肺细胞。
3 讨 论
CTP是一种混合物,其中所含有的苯并(a)芘是重要的致癌物,在职业环境下所导致的肺癌是我国的法定职业病,但该化合物对细胞增殖和恶性转化的机制尚不明确。本研究旨在揭示CTP对肺细胞相关癌基因表达和细胞周期和凋亡的影响,以抗氧化剂GSH和自由基清除剂NAC对煤焦沥青作用的影响。研究发现, CTP可以诱导fos、c-jun和EGFR m RNA的表达,同时抑制细胞的凋亡和周期发生改变,GSH和NAC对这种效应具有拮抗作用。
AP-1是参与基因转录活化的转录蛋白,其中fos和c-jun是构成该蛋白的重要成分,其表达水平增加可以促进基因的转录和蛋白表达的增加,通过检测该基因的表达水平可以了解基因转录活化的情况和细胞增殖的变化。本研究也发现,在CTP作用下,fos和c-jun的转录水平均显著增加,进而促进细胞的增殖。EGFR是参与细胞异常增殖的信号通路受体之一,该基因的异常表达可以促进细胞信号通路的活化,促进细胞细胞增殖的活性。本研究发现,在20和40 mg/L CTP作用24和72 h后,EGFR m RNA的表达水平显著增加。
研究表明,CTP可以诱导细胞内的脂质过氧化和自由基(ROS)水平增加[5],而自由基则可以细胞转导信号的活化,抑制细胞凋亡的发生,同时促进细胞的增殖活化,GSH和NAC作为常见的抗氧化剂和自由基清除剂,可以有效拮抗CTP的凋亡抑制效应,提高细胞的凋亡率。
细胞周期变化是细胞增殖活性变化的重要特征之一,其中S期是细胞基因组DNA合成的重要时期,S期细胞构成比的增加提示处于增殖状态的细胞比例增加。本研究发现,在20 mg/L CTP作用下,处于S期的细胞构成显著增加。而在GSH和NAC干预下,S期的细胞构成显著降低;尤其是在NAC作用下,S期细胞的构成比下降更为明显。提示GSH和NAC可以消除CTP的诱导效应,提示氧化水平和ROS水平增加,是细胞异常增殖的分子机制之一。
细胞的凋亡是清除损伤和突变细胞的重要机制之一。本研究发现,在CTP作用下,细胞凋亡率出现下降。而在GSH和NAC的作用下,CTP对细胞凋亡的诱导效应受到抑制,细胞凋亡率上升。尤其是在NAC作用下, 其细胞凋亡的抑制效应更为显著,由此可以看出该抑制效应与ROS诱导的细胞凋亡有关[6]。本研究发现,在40 mg/L CTP作用下,处于S期的细胞构成却无显著变化,提示该剂量的CTP存在明显的细胞毒性,从而抑制了细胞的增殖活性。同时可以看出,不同暴露剂量的CTP产生不同的效应,低剂量下产生细胞增殖的诱导效应,但剂量较大时则产生细胞毒性,对细胞活性产生抑制效应,使细胞内的分子调控机制也受到抑制。
本研究结果提示,在GSH和NAC作用下,细胞的凋亡率出现上调,其中的机制与化学物的刺激和诱导作用有关,但具体的分子机制有待通过进一步的研究进行探讨。由此本研究得出以下结论:CTP可以诱导CHL细胞的c-jun、fos和EGFR m RNA表达上调,可能是其诱导细胞增殖的因素之一;CTP在适当浓度下具有抑制凋亡的作用,而具有抗氧化作用的GSH和清除自由基作用的NAC可以抑制促进细胞的凋亡效应。
作者声明本文无实际或潜在的利益冲突
摘要：目的 探讨煤焦沥青对中国仓鼠肺(CHL)细胞c-jun、fos和表皮生长因子受体(EGFR)m RNA表达和细胞周期和凋亡的影响。方法 常规培养CHL细胞,常规消化细胞后,将细胞接种于6孔板中,待其融合度达到40%左右时,加入含有煤焦沥青的培养液,调整浓度至0、20、40 mg/L,分别于作用24、72 h后提取细胞总RNA,采用半定量RT-PCR技术检测c-jun、fos和EGFR m RNA的表达水平;将等量的细胞接种在50 ml的培养瓶中,待细胞融合度达到40%左右时,加入含煤焦沥青的培养液,调整浓度为0、20、40 mg/L,每组设置6个重复样品,分别加入谷胱甘肽(GSH)和N-乙酰半胱氨酸(NAC),调整浓度至0、2.5、10 mmol/L,作用120 h后收集细胞,采用流式细胞术检测细胞凋亡率和S期细胞的构成比。结果 在20 mg/L煤焦沥青作用24 h后,CHL细胞的fos、c-jun和EGFR m RNA的表达水平均高于0 mg/L剂量组,差异均有统计学意义(P<0.05);作用72 h后c-jun和EGFR的表达水平显著高于0 mg/L剂量组(P<0.05)。在40 mg/L剂量组作用24和72 h后,fos、c-jun和EGFR m RNA的表达水平均高于0 mg/L剂量组,差异均有统计学意义(P<0.05)。煤焦沥青作用后,细胞凋亡率降低,在GSH作用下,凋亡率有所增加,NAC作用下的凋亡率增加的幅度更加明显,但以上差异均无统计学意义(P>0.05);20 mg/L的煤焦沥青作用120 h后,S期的细胞构成显著增加(P<0.05);GSH和NAC可以显著抑制S期的细胞构成改变,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 煤焦沥青可以诱导fos、c-jun和EGFR m RNA的表达水平和S细胞周期的构成增加、抑制细胞凋亡率,而GSH和NAC可以抑制这种诱导效应。
细胞周期 篇10
1 材料与方法
1.1 细胞株培养及试剂
人急性白血病细胞株KG-1购自中科院上海细胞库，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，37℃，5%CO2条件下培养。白藜芦醇购自美国Sigma公司，用二甲基亚砜（DMSO）配制成0.2 mol/L母液备用。
1.2 细胞增殖实验
采用MTT法。将细胞调整为1×105/ml，接种细胞于96孔板，每孔180μl,24 h后，空白对照孔加含10%胎牛血清的RPMI1640培养基20μl，实验组每孔分别加入20μl不同浓度RES（终浓度依次为12.5、25、50、100、200μmol/L），分别培养24、48、72 h，离培养终点4 h加入MTT（德国Serva公司）（5 g/L)20μl，继续培养4 h后，离心弃上清，每孔加入DMSO 150μl，酶标仪测定492 nm吸光度值，按下式计算对细胞的抑制率。抑制率（%）=（1-OD实验组/OD对照组）×100%。
1.3 细胞周期检测
取对数生长期的KG-1细胞，调整细胞浓度为1×105/ml，加入培养瓶中，每瓶10 ml，培养24 h后离心换液，空白对照组加含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，实验组每瓶分别加入不同浓度RES（终浓度50、100μmol/L），分别培养48 h后离心收集细胞，PBS洗涤，重悬细胞于70%乙醇，4℃固定过夜，经PBS洗涤，RNA酶37℃处理1 h，加入PI，室温反应10 min，用流式细胞仪（Epics-XLⅡ型）分析，应用Muticycle AV软件分析细胞周期分布及细胞凋亡率变化。
1.4 细胞形态学观察
同上述方法处理细胞，24 h后，空白对照组加含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，实验组加入RES（终浓度100μmol/L），继续培养48 h，离心收集细胞，冷PBS洗2次，4%戊二醛固定，2 000 r/min，离心10 min，加入琼脂糖搅匀，冷却后切块，1%四氧化锇固定，醋酸铀和柠檬酸铅双重染色后，透射电镜观察细胞形态。
1.5 统计学方法
实验数据用SPSS 13.0软件分析，结果以x±s表示，以α=0.05为检验水准。
2 结果
2.1 白藜芦醇对KG-1细胞增殖的作用
白藜芦醇作用于KG-1细胞后，细胞增殖水平较空白对照组明显下降(P<0.05)。抑制率与白藜芦醇呈剂量依赖性，作用时间越长抑制率越高，最高可达到76.15%（100μmol/L白藜芦醇作用72 h）。如图1。
2.2 白藜芦醇对KG-1细胞周期分布和细胞凋亡率的影响
白藜芦醇作用于KG-1细胞48 h后，随浓度的升高，S期细胞比率由41.4%上升至78.5%，凋亡细胞由（1.17±0.35）%增加至（18.21±2.1）%，与对照组比较，差异均具有统计学意义（P<0.01），见表1、2。
Compared with control,*P<0.01
2.3 白藜芦醇对KG-1细胞形态学的影响
经白藜芦醇作用后，KG-1细胞出现细胞核碎裂，部分核膜破损，胞质有大小不等的空泡，微绒毛数量减少，线粒体、粗面内质网等细胞器减少等细胞凋亡形态学改变；而对照组细胞核仁大而明显，稍微不整形。
3 讨论
利用中药、天然药物及从中提取的有效成分制剂治疗白血病，已经日益受到广泛重视。白藜芦醇作为一种天然提取物，有很好的抗癌作用且无明显毒副作用，但其抗癌作用的机制还不十分清楚，1997年，美国的科研人员发现白藜芦醇具有抗肿瘤的功效，表现为对肿瘤的起始、促进和进展三个阶段均有抑制作用[6]。目前研究表明白藜芦醇对小鼠皮肤癌、肝癌、白血病等多种肿瘤有不同的增殖抑制作用[7,8,9,10,11,12]。本研究发现白藜芦醇在12.5μmol/L浓度时就可以抑制KG-1细胞生长，这种抑制作用在一定浓度范围内（12.5～100μmol/L）呈剂量依赖关系，随着浓度的增加，对KG-1细胞的增殖抑制作用增强，最大抑制率可以达到76.15%。
电镜观察结果显示KG-1细胞出现细胞核碎裂，部分核膜破损，胞质有大小不等的空泡，微绒毛数量减少，线粒体、粗面内质网等细胞器减少等凋亡细胞形态学改变，进一步说明白藜芦醇能抑制白血病KG-1细胞增殖，诱导细胞凋亡。
本实验采用FCM分析发现白藜芦醇可改变KG-1细胞周期的分布，与对照组相比，G0/G1、G2/M期细胞的比例均减低，S期细胞所占比例增高，这表明白藜芦醇可阻断KG-1细胞由S期向G2/M期的进程，由此可见白藜芦醇作为以细胞周期因子为靶点的生化调节剂使用。
综上所述，白藜芦醇可以抑制人白血病KG-1细胞的增殖，并能有效地诱导人白血病KG-1细胞凋亡，但是白藜芦醇诱导细胞凋亡的具体机制还需继续进行深入的研究与探讨。
摘要：目的:探讨白藜芦醇诱导人白血病细胞株KG-1细胞凋亡的作用。方法:以不同浓度的白藜芦醇作用KG-1细胞,用噻唑蓝(MTT)比色法分析细胞生长状态;透射电镜观察KG-1细胞凋亡的形态学变化;流式细胞术(FMC)测定细胞凋亡率和细胞周期分布。结果:白藜芦醇可明显抑制KG-1细胞增殖(P<0.05),与对照组比较,白藜芦醇作用后,KG-1细胞发生S期阻滞(P<0.01),且细胞凋亡率增高(P<0.01)。结论:白藜芦醇能明显抑制KG-1细胞增殖,使细胞周期阻滞在S期,并能进一步诱导其凋亡。