细胞周期蛋白T

细胞周期蛋白T（精选7篇）

细胞周期蛋白T 篇1

T细胞克隆 (T cell clone) 指将单个T细胞从细胞群中分离出来后单独培养, 使之重新繁殖成为单一克隆的T细胞群体。凭借T细胞克隆技术, 可获得遗传背景一致且T 细胞受体 (T cell receptor, TCR) 均一的单克隆T细胞群体。甲胎蛋白 (alpha-fetroprotein, AFP) 是一种糖蛋白, 主要由肝细胞粗面内质网上的核糖体合成。它只是胎儿时期肝脏内合成的一种糖蛋白, 成人后血清中水平很低, 而发生恶变的肝细胞则又可恢复其合成的能力。因此AFP的血清含量变化对于肝癌的早期发现、疗效的检测有着重大意义。

1 T细胞克隆应用研究进展

近年来T细胞克隆在免疫学研究中已取得了重要进展, 它有力地促进了对各种T细胞特性、结构、功能、分类及遗传方面的研究, 不仅为细胞免疫学的发展做出了巨大贡献, 也为许多疾病的发病机理研究提供了重要的理论基础。建立体外可长期培养的抗原特异性T细胞系及克隆在T细胞受体、T细胞治疗、T细胞表位、移植免疫以及细胞因子分泌和细胞间的协调作用等研究领域具有广阔的应用前景, 并已取得重要进展。

1.1 T细胞受体研究

TCR是T细胞表面识别MHC、肽复合物的重要分子, 有αβ和两种γδ。鉴定TCR链-α/β或γ/δ的配对, 通常要建立T细胞克隆, 但又不易获得。 Kurokawa等[1]应用一种新的方法, 直接从单个T细胞进行TCRα/β基因的配对克隆。他们分选出单个T细胞, 从中提取mRNA。然后采用RT-PCR从单个 T细胞的cDNA扩增出TCRα/βCDR3区, 经测序鉴定证实了TCRα/β基因的配对, 并通过细菌表达系统重建了TCR分子。该方法使从单个T细胞获得重组TCR分子成为可能, 有力地推动了T细胞抗原特异性研究。为了解对共同抗原产生慢性T细胞应答的TCR受体库 (TCR repertoire) 多样性特征, Lim[2]等用MHC.肽多聚体, 自EB病毒 (EBv) 阳性个体分选出外周血淋巴细胞 (PBL) 或滑液淋巴细胞后, 获得了一个HLA-A2限制性EBV优势表位 (GI , A2) , 并进行了识别该表位的TCR分析。尽管GLC/A2+特异性T细胞TCRβ链具有广泛的多样性, 但在大多数细胞系中他们仍鉴定了几个常见的亚基 (Vβ2、Vβ4、Vβ6) 。这些亚基具有高度保守的TCRβ链互补决定区3 (CDR3) 的长度和连接基序, 代表GLC/A2应答细胞的l1%～98% (平均50%) 。由它们组成的, TCRβ链显示有限的CDR1、CDR2和CDR3同源性, 而TCRα链则含有相同的TCRα区, 说明在对MHC.肽复合物识别中, TCRα链和β链利用程度不同。

1.2 T细胞治疗

T细胞治疗提供了增加抗原特异性免疫的有效手段。以特异性抗原为刺激诱导产生的细胞毒性T淋巴细胞 (CIL) 在临床免疫治疗中展示了诱人的前景。Chamoto等[3]应用含T 细胞受体 (TCR) α和β基因的逆转录病毒转染后, 从非特异性活化的, Th细胞制备了小鼠抗原特异性Thl细胞, 发现转导来自I-A (d) 限制的卵清蛋白 (OVA) (323-339) 特异性T细胞克隆 (DO11.10) TCRα、β基因的Th1细胞对OVA (323-339) 肽或 A20 B淋巴瘤 (A20.OVA) 细胞 (表达OVA作为肿瘤抗原) 的刺激产生TNFγ应答, 但没有应答。TCR转导的Thl细胞以抗原特异性的方式表现出抗肿瘤细胞毒性, 在体内产生有效的抗肿瘤活性。Van der Aa等[4]用灭活的自身髓磷脂碱性蛋白 (MBP) 反应性T细胞克隆免疫MS患者, 观察了TCV效应。在此基础上, 他们为进一步了解TCV的安全性、可行性和免疫效果, 又用来源于MS患者脑脊髓液 (CSF) 活化的CD4+T细胞进行了TCV临床试验。先体外培养CSF淋巴细胞58周, 获得了几乎是纯的Th1/Th0类型的α/βTCRCD4+T细胞系 (TCL) 。这些TCL能识别MBP、MOG和/或PLP, 其结果与EI PSPOT试验一致。然后, 用灭活的CSF-TCL作疫苗 (107个细胞) 每隔2个月免疫1次, 共免疫3次。结果发现, 接种的TCL完全耐受, 未发现细胞毒性或副作用。在治疗期间或治疗后, 所有患者的临床症状得到改善, 复发频率减少。在3例患者 (3/5) 观察到对CSF疫苗的增殖应答。在所有患者观察到抗动力型T细胞应答 (anfierogotypic T cell responses) , 但对MBP, PI MOG应答反应仍较低。目前, TCV除应用于MS治疗外, 在实验性自身免疫甲状腺炎、实验性自身免疫眼色素层炎和类风湿关节炎等自身免疫病的预防和治疗上也具有一定的疗效。

1.3 T细胞表位研究

T细胞表位 (T cell epitope) 是指抗原经过抗原提呈细胞 (APC) 加工后, 由MHC分子提呈给TCR的短肽。鉴定T细胞表位的常用方法是用抗原特异性T细胞克隆作效应细胞对靶细胞进行细胞毒杀伤试验, 根据特异性裂解靶细胞的百分率来确定抗原的T细胞表位。它在疫苗研制、免疫诊断、抗原特异性T 细胞治疗、疾病发病机理、免疫应答分析和T细胞谱系研究等方面有着广泛应用, 并有力地推动了蛋白质分子之间的相互作用研究, 成为免疫学研究的热点。Puumala virus (PUUV) 是肾综合征出血热 (HFRS) 的病原体。Van Epps等[5]研究了芬兰 HFRS患者PUUV记忆性CTL应答, 其中7例 (7/13) 可检测到抗PUUV核蛋白 (NP) 的特异性CTL反应, 并自特异性较高的2例中建立了61株NP特异性CTL克隆。经细胞毒杀伤试验, 鉴定了NP上6个新的CD8+CTL表位:NP164.78、NP173-81、NP204-12、NP212-20、NP236-50、NP243-510, 受mA限制的等位基因包括:A2、A28、B7、B8。该结果为HFRS的免疫发病机理研究和疫苗研制奠定了基础。EBV核蛋白1 (EBNA1) 是在EBV相关恶性疾病中表达的病毒蛋白, 在感染细胞中对病毒DNA的复制和病毒游离体的维持起重要作用。由于CD4+Th细胞在抗病毒感染和肿瘤中对免疫应答的始动、调节和维持起关键作用, 因此 Kruger等[6]先用 TEP1TOPE软件预测了EBNA1上HLA-Ⅱ类候选表位, 然后通过T细胞对合成多肽应答的体外分析, 鉴定了几个HLS-DR限制性多肽, 同时建立了其中一个多肽特异性的T细胞克隆, 并对这个克隆进行了功能分析。HLA-DR15限制性表位EBNM (482) (AEGLRALLARSHVER) 特异性CD4+Th细胞克隆能识别自然加工的EBNA1蛋白, 该表位由HLA-DR4、DR7和DR11呈递。可见, 在疫苗结构中包含通用的自然加工的EBNA1 (482) 表位能增强抗EBV阳性肿瘤的免疫应答。目前, 多种病原体抗原的T细胞表位已被鉴定, 为这些疾病的预防、治疗和诊断奠定了基础。

1.4 移植免疫

移植免疫 (transplantation immunity) 是指器官、组织移植时所出现的免疫排斥现象。当宿主免疫功能严重缺损时, 无力排斥植入的器官, 此时植入器官中的免疫活性细胞 (主要是T细胞) 可被宿主组织相容性抗原活化, 而产生针对宿主组织细胞的免疫应答, 导致宿主全身性的组织损伤, 即移植物抗宿主病 (GVHD) 。GVHD使同源造血干细胞移植更加困难。在干细胞移植前, 如能鉴定与该种疾病有关的同种反应性T细胞 (aUoreactive T cel1) 克隆, 然后对它们定量监控, 那么在GVHD明显发作前就可以开始进行免疫抑制。Miehalek等[7]基于这一思路, 在干细胞移植前, 他们鉴定了供体的一个同种反应性CD4T细胞克隆, 然后采用克隆型实时定量PCR监控了移植后它在受体外周血中的频率。结果发现, 该克隆的数量在临床GVHD发作前就已明显增加, 并与GVHD的发生密切相关。提示单独的同种反应性T细胞克隆与体内GVHD的发生有关。由此可见, 在干细胞移植前, 鉴定和监控可能导致GVHD的T细胞克隆, 将有助于对GVHD进行早期诊断和干预, 以提高移植的成功率, 延长植入器官的存活时间。同种反应性T细胞与移植肾的慢性排斥亦有一定的关系, Matsutan[8]分析了PBMC中TCR Vα、Vβ受体库和T细胞克隆形成能力。结果发现, 在24例肾移植受体中, TCRVα、Vβ片段的检出率分别为13/24和 15/24。提示TCR利用偏斜 (skew) 与克隆T细胞扩增水平之间有相互关系。TCR利用偏斜的水平和克隆T细胞的扩增, 在移植失败的受体中明显大于移植成功的受体 (P=0.008 1, P=0.012) 。表明在外周血中, 克隆扩增的T细胞与移植排斥有关, 并对移植物长期发挥作用产生不利影响。因此, PBMC中克隆T细胞的扩增对移植肾的命运提供了重要资料。

1.5 研究细胞因子的分泌以及细胞间的协调作用

细胞因子是指主要由免疫细胞分泌的、能调节细胞功能的小分子多肽。在免疫应答过程中, 细胞因子对于细胞间相互作用、细胞的生长和分化有重要调节作用。淋巴细胞分泌的生长激素 (GH) 是淋巴细胞的自分泌和旁分泌生长因子, 除了影响神经内分泌系统的功能以外, 可能对自身的发育、活化和增殖产生效应。Sojka等[9]应用小鼠细胞因子捕获实验 (eytokine capture assay) 检测了初始T细胞 (naive T cells) 和记忆T细胞 (memory T cells) 被抗原刺激后IL-2分泌的动态变化。结果表明, 初始T细胞6～8h内达到最大, 而记忆T细胞则需1～2h。两类细胞在20～24h后, 体内IL-2的分泌很快终止。为了阐明DC对抑制信号的易感性机制以及DC和应答T细胞的命运, Frasca等[10]将人同种反应性T细胞或抗原特异性CD4+T细胞克隆 (与抗CD3抗体孵育变为无能) 与自身DC或应答T细胞共同培养。结果表明, 无能T细胞影响DC的抗原呈递功能或存活, 这取决于APC是成熟的DC还是不成熟的DC。在被应答T细胞活化的不成熟DC上, MI-IC和共刺激分子的表达被抑制, 而在成熟DC和应答T细胞中, 则可依次诱导凋亡程序。CD95与缺乏CD40-CD4L (CD154) 相互作用的无能T细胞表达的CD95L交联, 是诱发两种Dc和应答T细胞凋亡的关键参数。这些发现提示, CD95L+ CD154-缺陷的无能T细胞对DC上CD40的缺陷性活化, 在决定T细胞抑制中可能是主要因素, 同时也说明了CD40在控制DC的调节和存活中具有信号传导的作用。

2 AFP的相关研究及进展

甲胎蛋白 (alpha-fetroprotein, AFP) 是一种糖蛋白, 分子量为7.2万, 含有3%～4%的碳水化合物, 主要由肝细胞粗面内质网上的核糖体合成。它只是胎儿时期肝脏内合成的一种糖蛋白, 成人后血清中水平很低, 而发生恶变的肝细胞则又可恢复其合成的能力。因此AFP的血清含量变化对于肝癌的早期发现、疗效的检测有着重大意义。随着研究的深入, AFP在免疫治疗和基因治疗方面的研究也取得突破性进展。

2.1 AFP促进肝癌细胞增殖的机制

(1) AFP的免疫抑制作用。AFP结构和成人血清白蛋白相似, 是胎儿体内的主要蛋白质, 具有免疫抑制作用, 它能有效抑制母体对胎儿的排斥, 能抑制原发性肝癌患者和肝癌小鼠的免疫系统功能, 这是由于AFP具有改变CD4+和CDs等T淋巴细胞亚群的比例和导致淋巴细胞死亡的作用。有人用AFP基因的某些碱基片段作为表位 (抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团) 目的基因, 发现表达这些表位基因的蛋白质具有抑制T淋巴细胞的免疫应答功能[11]。 (2) 促进肝癌细胞生长。以往认为给哺乳动物体内注射AFP会增加动物对各种实验性肿瘤的易感性, 并认为该易感性是由于AFP具有免疫抑制作用, 体内免疫体系被抑制后, 会使移植的肿瘤细胞生长, 甚至会导致体内发生肿瘤。但是许多关于AFP促进肝癌细胞生长的研究均在体外进行, 体外不存在免疫体系应答问题, 因而可以肯定AFP对肝癌细胞生长的调节并不仅是AFP具有免疫抑制作用所能解释。例如体外发现, 小剂量的AFP对人肝癌HepG2细胞的生长有明显促进作用[12], 也有研究表明AFP对人肝癌HepG2细胞和Ehrlich腹水癌细胞有直接促增殖作用[13], 这可能是通过细胞膜AFP受体介导。 (3) AFP对癌细胞逃脱免疫监视的作用。AFP能诱导淋巴细胞凋亡, 导致机体免疫功能下降[14]。正常细胞或肿瘤细胞的凋亡, 主要由肿瘤坏死因子 (tumor necrosis factor , TNF) 家族及其受体 (TNER) 介导。研究表明, 用反转录PCR法检测肝癌细胞的TNFR, 发现癌细胞TNFR的表达停止或丢失, 患者均有AFP表达量升高[15], 提示 AFP可能通过调节TNER的表达, 导致肝癌逃避机体的免疫监视。即肿瘤细胞TNFR减少有利于细胞存活, 而AFP的升高可能抑制淋巴细胞免疫功能以及增加淋巴细胞凋亡产生上述影响。

2.2 AFP与肝癌免疫治疗

目前围绕AFP基因的肿瘤免疫治疗和基因治疗方兴未艾。AFP基因位于4号染色体q臂 11～22区, 含14个内含子和 15个外显子, 转录mRNA 全长1 827个碱基, 编码609个氨基酸残基, 第1～57位碱基 (1～19位氨基酸) 编码信号肽, 第58～1 827 位碱基 (20～609位氨基酸) 编码功能肽段。AFP抗体的获得是通过用人肝癌AFP免疫动物 (如小鼠) , 取出其脾细胞与骨髓细胞系融合, 从而得到抗人甲胎蛋白单克隆抗体 (AFP-McAb[1]) 。Grimm CF[16]在小鼠肝癌模型应用AFP-DNA疫苗诱导出特异性的细胞毒性T细胞 (CTL) , 能够抑制肿瘤的生长, 并且对正常肝细胞无损伤。Butterfield等[17]分析AFP基因及蛋白结构, 发现4个 HLA-A2.1 分子结合肽段, 并使用合成的抗原肽HLA-A2.1 分子复合物免疫小鼠, 诱导出特异性T细胞免疫和肝癌保护性免疫反应。Vollmer等[18]将AFP基因转染树突状细胞, 观察到AFP特异性CTL, 并显示出杀伤肿瘤细胞作用。Charles等[19]使用AFP基因腺病毒载体转染小鼠树突状细胞, 观察到特异性 T辅助细胞 (Th1) 免疫反应和特异性CTL细胞以及γ-干扰素 (IFN-γ) 的释放, 在接种 El4 (mAFP) 肝癌细胞的89只小鼠中, 12只 (13.5%) 小鼠获得完全的保护性免疫。也有通过构建AFP-cDNA真核表达载体, 体外转染DC (树突细胞) 、制备AFP-DC 疫苗、诱导出针对表达AFP的肝癌细胞株HepG2的特异性免疫反应[20]。免疫荧光检测可见 AFP-DC胞浆及胞膜有AFP抗原分子表达;活化的CTL能够对表达AFP肝癌细胞起特异性杀伤作用, 杀伤效率可达84.05%, 与空载体组和空白对照组比较, 差异显著 (P<0.05) 。从而说明:AFP作为靶点治疗肝癌具有可行性, 可作为肝癌靶向治疗的新的突破点;AFP-DC疫苗可以作为表达肝癌的一种免疫治疗手段, 为DC肿瘤疫苗的临床应用奠定了基础。

因此, AFP不仅具有临床诊断价值, 而且具有临床治疗价值, 其作为肝细胞癌 (HCC) 的标志物已广泛用于肝癌的筛检、诊断、早期诊断、鉴别诊断、疗效评价、提示预后等多方面。而AFP的临床治疗价值在于其可作为肝癌免疫治疗的靶抗原, 实验研究表明, 个体发育中T细胞库内针对AFP的特异性CTL克隆却并未清除, 适当条件或方法可使之激活, 以AFP为靶抗原的DNA疫苗或多肽疫苗能诱导特异性细胞毒性T细胞免疫应答, 并杀灭产生AFP的肝癌细胞, 建立体外AFP特异性T细胞的克隆, 为研究T细胞特性、结构、功能及疾病的发病机制等研究领域提供了广阔的应用前景, 同时, 其在肝癌免疫治疗中也极具研究和临床应用价值。

关键词：T细胞克隆,甲胎蛋白,相关性

细胞周期蛋白T 篇2

正常的细胞周期不同发展阶段严格受控于细胞周期蛋白依赖性激酶和细胞周期蛋白功能的调节[5]。细胞周期蛋白E (cyclin E, CE) 是G1/S期转变的一种重要调节因子, 诱发加速细胞进入S期。CE在其他肿瘤 (例如乳腺癌和膀胱癌) 中的高表达与预后差及较短的无复发相关[6], 但尚未确定CE预测脑膜瘤复发的作用。

本研究旨在评估手术切除后肿瘤复发与细胞增殖指数 (cell proliferation index, CPI) , 血管密度 (vascular density, VD) 、EP、PR和组织中CE表达的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2003年1月1日-2004年12月31日在郑州人民医院手术治疗的脑膜瘤患者42例, 收集肿瘤组织并进行巢式病例对照研究。本研究不包括手术前接受化疗或放疗的患者。

1.2 术后随访

本研究进行10年的术后随访, 通过影像检查确定是否复发。其中17例复发 (复发组) , 25例无复发 (无复发组) 。根据辛普森评分系统测量手术切除范围, 记录肿瘤位置和重量。

1.3 组织病理学研究

用10%甲醛固定部分活检样本, 5μm石蜡包埋切片。根据2002年世界卫生组织分级确定伊红染色样本的组织学类型和肿瘤等级。

1.4 血管密度和细胞增殖

采用免疫组织化学SP染色, 伊红复染。以多克隆小鼠或兔抗Ⅷ因子相关抗原的抗体 (美国Dako公司) 作为内皮细胞标记物, 以抗增殖细胞核抗原的抗体 (proliferating cell nuclear antigen, PNCA) (美国Dako公司) 作为DNA合成的标记物, 室温下培养组织样本1 h。通过统计10个不同视野中FⅧ阳性毛细血管数量 (×40) 和PCNA阳性肿瘤细胞核 (×40) 计算VD值和CPI。由2名对样本来源不知情的病理科医师进行独立阅片分析。

1.5 雌激素和孕激素受体

分别使用单克隆抗体6F11和PGR312进行激素受体ER和PR的免疫组织化学检测。所有抗体稀释至1g/ml, 安照过氧化物酶聚合物检测试剂盒说明书 (美国加州戴利城, Immunovision公司, Power Vision+) 进行检测。

1.6 细胞周期蛋白E

使用抗CE单克隆抗体 (Novocastra实验室) 分析组织中CE的表达。在培养箱中用柠檬酸缓冲液预处理样本切片。将抗体稀释到1∶40并滴加到切片上, 室温培养1 h。按照En Vision试剂盒说明书进行操作。CE标记指数为显示核免疫反应性的肿瘤细胞百分比, 通过每1 000个肿瘤细胞中CE染色细胞核的肿瘤细胞来计算CE标记指数。显微镜下研究≥2个细胞CE阳性强度最高的区域并对该区域≥5个视野的细胞进行计数。

1.7 统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析, 计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 用t检验, 计数资料用单因素Logisic回归分析, 用多因素方差分析检验参数值二元相关性, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床特征比较

41%的患者行肿瘤完全切除术。两组患者的年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤重量比较, 差异无统计学意义 (P=0.079、0.742、0.323和0.571) 。复发时间为 (32.12±5.34) 个月。切除程度与脑膜瘤复发显著相关 (P=0.003) 。根据患者手术报告的描述, 发现完全和部分切除术患者的肿瘤复发率比较差异有统计学意义 (P=0.003) 。见表1。

2.2 肿瘤组织病理学特征比较

45%的患者组织学类型为脑膜上皮型。91% (38/42) 的脑膜瘤分化等级低。两组患者的WHO分级、组织类型、CPI比较, 差异无统计学意义 (P=0.631, 0.244和0.121) 。见表2。

2.3 血管密度

所有患者的VD值为 (9.25±3.61) 。两组患者的VD值比较差异有统计学意义 (P=0.004) (见图1和表2) 。17例行完全切除术患者中, 复发和未复发患者VD值分别为 (12.81±3.44) 和 (5.52±3.54) , 差异有统计学意义 (P=0.038) (见图2) 。

2.4 激素受体和细胞周期蛋白E比较

脑膜瘤组织中ER、PR和CE的表达阳性率分别为28%、62%和91%。两组患者ER、PR和CE的表达阳性率比较, 差异无统计学意义 (P=0.452、0.177和0.855) 。见表2。

†与复发组比较, P=0.004

1) 与复发组比较, P=0.140;2) 与复发组比较, P=0.038

3 讨论

虽然91%的脑膜瘤为良性, 但是复发率较高[7], 即使行根治性切除术, 仍有12%~70%的患者复发[8], 尚无有效标志物能够用于脑膜瘤复发预测。本研究发现患者的年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤重量、组织学评分、类型和CPI等指标与复发无相关性。与预期不一致的是组织中ER、PR和CE的阳性表达与复发无相关性;和预期一致的是复发仅与切除程度显著相关 (P=0.003) 。

VD值能够定量反映包括肿瘤在内的多种病理过程中的血管生成, 广泛用于分析部分恶性肿瘤, 被认为是多种癌症的预后标志物[9]。有研究已经通过使用内皮标记物, 如FⅧ、CD31和CD34来确定脑膜瘤的VD[10]。有学者也发现VD和肿瘤等级间的关系[11]。本研究结果表明, VD值和脑膜瘤复发呈正相关 (P=0.000) 。即使对行完全切除术的脑膜瘤患者亚组进行分析, VD值也能可靠预测复发 (P=0.038) 。

细胞周期蛋白T 篇3

1 材料和方法

1.1 主要试剂

鼠抗人IFN-γ单抗(mouse anti-human IFN-γm Ab,R&D公司),生物素化的鼠抗人IFN-γ单抗(anti-human IFN-γbiotinylated m Ab,R&D公司),链霉亲和素-碱性磷酸酶(streptavidin-alkaline phosphatase,R&D公司),硝基四唑氮蓝(nitroblue tetrazolium,NBT,R&D公司),5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸-4-甲苯胺盐(BCIP,R&D公司),淋巴细胞分离液(上海化学试剂厂),RPMI-1640(GIBCO公司)、胎牛血清(fetal calf serum,FCS,GIBCO公司),植物血凝素P(PHA-P,Sigma公司),96孔聚乙烯板(polyvinylidene diflu oride-backed plates,PVDF:MAIPS4510,Milloipore公司)。

1.2 HTNV NP C端合成多肽

参照人HTNV 76-118株NP序列(GeneBank accession No.P05133),由上海申友生物技术有限公司合成C端15个氨基酸长重叠9个氨基酸的多肽,纯度大于95%。合成多肽的序列和位置见附表。

1.3 外周血单个核细胞的分离

13例肾综合征出血热患者均为2007年12月～2008年10月本院收治的住院患者(经临床和流行性出血热特异性IgM和IgG抗体检测确诊)。恢复期时,抽取9 m L静脉血加1 m L肝素钠(500 u/mL)抗凝。采用Ficoll密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),计数,留2 m L PBMC悬液用于ELISPOT实验和T细胞增殖实验,其余3 m L冻存(15%DMSO,85%FCS)。

1.4 IFN-γELIs pot实验

参照文献[6]进行。简要步骤如下:每孔用100μL含0.5μg/m L的鼠抗人IFN-γ单克隆抗体包被96孔PVDF板,置4℃过夜。PBS洗板后,取10μL200μg/m L肽溶液添加至PVDF板的每孔中,每条肽作4个复孔。然后每孔添加100μL HFRS患者的PBMC悬液(含2×105细胞/m L)。阴性对照加10%FCS的RPMI 1640(R10)和PBMC悬液,阳性对照加R10、PBMC悬液和5μL PHA-P(1μg/μL)。将培养板置37℃5%二氧化碳孵箱过夜(16～18 h)。PBS洗板后,每孔添加100μL含0.5μg/m L的生物素化的鼠抗人IFN-γ单克隆抗体,置室温孵育1h。PBS洗板,添加抗生蛋白链菌素-碱性磷酸酶(1∶2 000稀释)100μL于PVDF板的孔中,置室温孵育1 h。PBS洗板后,各取100μL NBT和BCIP于10 m L Tris缓冲液(pH9.5)中,混匀后,加100μL至PVDF板的孔中,室温避光显色15～20 min。自来水冲洗3次,以终止显色反应。晾干后,用ELIspot读数分析系统(德国,ELR03)统计蓝色斑点数。特异性斑点呈边缘模糊、规整的蓝色圆点。每一个斑点代表一个特异性分泌IFN-γ的T细胞。阴性对照的斑点数一般在0～3个,斑点数在3或3个以上者为阳性。特异性分泌IFN-γT细胞(SFC,spot forming cells)的数量=实验孔斑点数-阴性对照孔斑点数。T细胞频率通常用SFC/106 PBMCs为单位。

2 结果

2.1 ELIs pot实验结果

用IFN-γELIspot实验测试了13名HFRS患者对23条合成肽的T细胞反应,在5名患者(3、4、7、10和12号)检测到不同程度的肽特异性IFN-γ分泌。其余8名患者未检测到肽特异性T细胞应答。见图1。

2.2 肽特异性T细胞频率

3、10号患者对No.70肽反应较强,T细胞频率分别为51和55 SFC/106 PBMCs;4、7和12号患者对No.51肽反应较强,T细胞频率分别为90、65和95 SFC/106PBMCs。见图2。

注:实验中,输入细胞数为2×105 PBMC/m L。A、C、E为No.51肽分别诱导4、7、12号患者的T细胞反应;B、D为No.70肽分别诱导3、10号患者的T细胞反应;G为阴性对照。

3 讨论

在诱发免疫应答过程中,T细胞识别靶细胞表面抗原表位的同时,必须识别同一靶细胞所表达的MHC分子,否则免疫应答不会发生。与MHCⅠ类分子结合的多肽通常为8～10个氨基酸,一般为9个。而与MHCⅡ类分子结合的多肽通常为13～34个氨基酸。但在T细胞表位鉴定中,长度为12～20个氨基酸残基范围内的多肽均能满足初筛的需要[7,8],通常都选择15个氨基酸长的多肽进行表位筛选[5～7]。HV NP序列总的同源性为50%,但C端100个氨基酸更为保守,同源性可达85%左右,如汉滩和汉城病毒为82%。因此,鉴定C端T细胞表位有利于交叉反应性T细胞表位的研究。其次,NP被B细胞和T细胞识别的表位分布存在明显的差异。B细胞抗原表位主要位于NP N端[9,10],而T细胞抗原表位似乎主要位于NP C端[3,5]。本室既往研究表明[11],C端CTL反应较N端强,提示C端可能含有较多的T细胞表位。因此,笔者前期工作选择了NP 1/3的C端为研究对象,并合成了23条15个氨基酸长的短肽作为抗原,体外诱导HFRS患者的T细胞反应,以筛选该段可能的T细胞表位。

T细胞通过其表面的T细胞受体(TCR)对抗原和MHC进行双识别后,才能活化和启动免疫反应。IFN-γ主要由CD4+Th1和CD8+Th1细胞分泌,这些细胞统称为Th1样细胞。Th1应答主要是增强巨噬细胞和CTL的抗感染能力。随着酶免疫分析技术在医学和生物学领域的广泛应用,80年代中期建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和细胞因子(cytokine,CK)分泌细胞的固相酶联免疫斑点试验(enzyme-linked immunospot,ELIspot)。该技术是ELISA技术的延伸,通过检测CK来评价T淋巴细胞功能和特异性的新方法。它不仅具有检测活化(activated)或记忆(memory)T细胞的优点,而且在单细胞水平能检测CK的释放,并直接记数外周血中抗原特异性T细胞,尤其是CTL的频率。其次,敏感性高,足以检测到1/105个IFN-γ分泌细胞,并可同时分析大量标本。因此,灵敏、高通量和容易操作使ELIspot法适于监控和定量检测抗原特异性T细胞应答,被国内外学者广泛用于T细胞表位筛查和疫苗疗效监测等。本研究用该方法测试了13名HFRS恢复期患者对HTNV核蛋白23条多肽的T细胞反应。结果表明,5名患者有不同程度的多肽特异性T细胞应答。其中,3、10号患者对No.70肽反应较强,T细胞频率分别为51和55 SFC/106 PBMC。4、7、12号患者对No.51肽反应较强,T细胞频率分别为90、65、95 SFC/106PBMC。这种表位识别的差异提示抗病毒免疫应答的性质和组成不同,说明不同个体具有不同的表位特异性优势T细胞群,其原因可能是由于不同个体具有不同的HLA单倍型。有趣的是,VAN EPPS等(1999)[3]鉴定的受HLA-A1限制的aa421～429表位(ISNQEPLKL)刚好位于No.70肽(aa415～429:DVKVKEISNQEPLKL)内。笔者筛选的No.70肽,其表位最适大小及HLA限制性是否与上述相同,尚有待进一步证实。其余8名患者未检测到多肽特异性T细胞应答,原因可能是这些多肽特异性T细胞频率低于检测极限,也可能是在ELIspot实验中使用的15氨基酸肽的刺激不是最理想的。另一个很重要的原因是笔者仅合成了NP 1/3的C-端多肽,这8名患者体内NP多肽特异性T细胞反应可能不在此范围内。此外,由于表位肽受HLA限制,未检测到多肽特异性T细胞应答的8名患者可能没有与之相匹配的HLA型别。

本实验以恢复期的HFRS患者为研究对象,测定了PBMC中的T细胞频率。由于此期患者体内病毒已基本清除[4,12],激活的T细胞因凋亡而死,仅有一部分存活下来成为记忆性T细胞。因此,本研究测定的是记忆(memory)T细胞而非活化(primed)T细胞。事实上,T细胞应答的动力学研究也证实了这一点。病毒感染后CD8+T细胞迅速活化,6 h即可测出活化的T细胞,48 h后开始杀伤感染的细胞[13]。活化一般持续48～96 h后结束[14]。此外,本文报道的T细胞频率可与EBV、HIV等一些抗原表位特异性T细胞频率相比[15,16],这些病毒由于持续感染而定期再活化,通常都有很高的CTL频率。较高的抗原特异性记忆T细胞频率可能是人不会再次感染汉坦病毒(HV)的原因。动物实验已证实[1],鼠持续感染HV与病毒特异性CD8+T细胞缺乏有密切的关系。因此,本实验为进一步研究HFRS发病机理、疫苗研制及抗病毒免疫反应提供了重要资料。

摘要：目的测定汉滩病毒(HTNV)核蛋白(NP)C-端多肽诱导肾综合征出血热(HFRS)患者的特异性T淋巴细胞反应,为HFRS发病机制、疫苗研制及抗病毒免疫反应研究提供资料。方法采用Ficoll密度梯度离心法,分离HFRS恢复期患者外周血单个核细胞(PBMC),用IFN-γ酶联免疫斑点试验(ELIspot)测试13名患者对23条多肽的T淋巴细胞反应,筛选出反应较强的肽段。结果5名患者有不同程度的肽特异性T细胞反应。No.70肽可诱导3号和10号患者分泌IFN-γ,T细胞频率分别为51和55SFC/106PBMC,No.51肽可诱导4、7、12号患者分泌IFN-γ,T细胞频率分别为90、65、95SFC/106PBMC。结论No.51肽和No.70肽可诱导较强的T淋巴细胞反应,可能是NPC端的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位。

细胞周期蛋白T 篇4

1 资料与方法

1.1 临床资料

本组患者均为我院2011年10月至2012年5月期间收治的活动性肺结核病患者, 临床随访资料完整。排除标准: (1) 有其他严重的内脏器官疾病的患者; (2) 伴有风湿免疫系统疾病的患者; (3) 伴有恶性肿瘤的患者。共观察90例, 其中男性50例, 女性40例, 年龄14～79岁, 平均45.3岁。其中菌阳性结核患者45例, 菌阴性结核患者45例。

1.2 检测方法

患者抽取清晨空腹静脉血10mL, 应用酶联免疫斑点试验检测对结核杆菌特异抗原刺激反应, 分泌γ-干拢素的效应T细胞数量方法。同时分离血清后于当日检测, 采用速率散射比浊法测定血清中的hs-CRP的表达;应用酶联免疫吸附实验 (ELISA法) 检测IL-6的表达, 实验用试剂均购自美国RND systems公司, 所有标本均由同一检验师进行实验, 严格质控。

1.3 统计学方法

所有实验数据应用SAS6.12进行统计分析, 两组间比较采用t检验或卡方检验, 均以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结核菌阳性与菌阴性患者T SPOT-TB的阳性率的比较

结核菌阳性与菌阴性患者T SPOT-TB的阳性率的比较, 差别有统计学意义, 见表1。

2.2 hs-CRP和IL-6在结核菌阳性和菌阴性患者中表达量的比较

hs-CRP和IL-6在结核菌阳性患者中的表达量明显高于菌阴性患者, 见表2。

2.3 hs-CRP和IL-6在T SPOT-TB阳性和阴性患者中表达量的比较

hs-CRP和IL-6在T SPOT-TB阳性患者中的表达量明显高于T SPOT-TB阴性的患者, 见表3。

3 讨论

全球结核病控制策略的原则是通过诊断和治疗传染性病例来减少结核分枝杆菌的传播, 因此, 强调对活动性疾病诊断方法的发展。而T SPOT-TB试验就是特异、敏感性的指标, 并已应用于临床[2]。T SPOT-TB的原理是从单细胞水平检测细胞因子, 尤其是特异性的细胞因子IFN-γ[3], 因此技术层面涉及到炎性因子的改变。hs-CRP和IL-6在炎性反应中具有重要促进作用, 而且在结核病发展时具有促进作用, 二者与T SPOT-TB实验的表达情况具有相关性[4,5]。Hs-CRP是存在于人类血清中的一种微量蛋白, 在肝脏合成, 由5个相同的亚基以非共价键结合形成环状共聚体, 其检测具有很好的稳定性及精确性, 是一个很好的生化指标。有研究显示hs-CRP的高表达对炎症的发展有促进作用, 而结核病的发展过程是炎性反应的过程, 其变质、渗出、增生为主的炎性基本病变作用于疾病的始终。hs-CRP可能是结核病复发或进展的重要危险因素之一, 也有观点认为hs-CRP的表达程度对判断结核病变的严重程度有一定价值[6]。IL-6是近年来发现的一种异源二聚体分子, 主要由单核、巨噬细胞及B淋巴细胞对细菌产物及细胞内寄生物发生反应而产生的, 它作为早期的非特异性先天性免疫与后期抗原特异性的适应性免疫之间的桥梁, 在感染、肿瘤、自身免疫性疾病中起重要作用[7]。

本实验结果显示结核菌阳性与菌阴性患者T SPOT-TB的阳性率差别有统计学意义, 且hs-CRP和IL-6在菌阳性患者中的表达量明显高于菌阴性患者, hs-CRP和IL-6在T SPOT-TB阳性患者中的表达量明显高于阴性患者, 提示T SPOT-TB对诊断结核病变有重要价值, 而且hsCRP和IL-6对结核病变的发生发展有重要作用。结核感染导致机体免疫应答反应以细胞免疫为主, 检测人外周血中的结核特异抗原刺激活化的效应T细胞, T SPOT-TB实验具有特异性高, 不受卡介苗接种与环境分枝杆菌影响, 灵敏度高, 个体免疫功能低下影响小, 且快速, 24h内可以出结果。在结核发展的过程中, IL-6表达增加, 同时能提高机体的炎性反应程度, 增加机体的抵抗力。机体感染结核分枝感菌后, IL-6也可以诱导保护性T细胞的产生, 激活干抗素家族各成员的大量分泌, 促进粒细胞和巨噬细胞增殖, 同时诱导肝细胞产生hsCRP[8], 而且在结核病灶中聚集的活性淋巴细胞、巨噬细胞等合成释放大量的炎症介质, 这些炎性介质也可以刺激上皮细胞增加hs-CRP的合成[9]。也有观点认为人体感染结核菌后, 细胞免疫是机体抵抗结核杆菌的主要机制, 活化的效应T细胞释放大量淋巴因子, 继而激活巨噬细胞, Ⅳ型超敏反应正是淋巴因子及巨噬细胞释放的细胞因子的作用下, 介导组织损伤, 引起血清中hs-CRP的表达升高。因此, 临床中hs-CRP和IL-6均可以作为结核病诊断、鉴别诊断及疗效评估的检测物质[10]。

总之, T SPOT-TB试验阳性对诊断肺结核患者有重要价值, 同时结核患者血清中hs-CRP和IL-6高表达, 尤其是结核菌阳性和T SPOT-TB阳性的患者, hs-CRP和IL-6对疾病的进展有促进作用。

摘要：目的 探讨结核感染T细胞斑点试验 (T SPOT-TB) 和超敏C反应蛋白 (hs-CRP) 、白细胞介素-6 (IL-6) 在肺结核病中诊断价值, 观察三者的关系及临床意义, 以指导临床工作。方法 选取我院收治的活动性肺结核病患者共90例, 其中菌阳性结核患者45例, 菌阴性结核患者45例。患者均进行T SPOT-TB和hs-CRP、IL-6的检测。结果 菌阳性与菌阴性患者T SPOT-TB的阳性率差别有统计学意义。hs-CRP和IL-6在菌阳性患者中的表达量明显高于菌阴性患者。hs-CRP和IL-6在T SPOT-TB阳性患者中的表达量明显高于阴性患者。结论 T SPOT-TB试验阳性对诊断肺结核患者有重要价值, 同时结核患者血清中hs-CRP和IL-6高表达, 尤其是结核菌阳性和T SPOT-TB阳性的患者, hs-CRP和IL-6对疾病的进展有促进作用。

关键词：肺结核,结核感染T细胞斑点试验,超敏C反应蛋白,白细胞介素-6,临床观察

参考文献

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细胞周期蛋白T 篇5

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2012年1月-6月我院门诊收治的急性盆腔炎患者为研究对象。纳入标准:①有明显的急性盆腔炎性疾病症状, 妇科体格检查与B超检查均符合美国疾病控制中心关于急性盆腔炎的最低标准、附加标准及特异标准[3];②首次发病, 就诊前未用过抗炎及影响免疫功能的药物。排除标准:①盆腔结核、盆腔肿瘤、子宫内膜异位症等其他妇科盆腔疾病患者;②高血压、糖尿病、恶性肿瘤, 以及严重的心脏、肝脏、肾脏等组织及脏器疾病患者;③妊娠或哺乳期妇女;④其他感染性或免疫性疾病患者, 以及进行抗炎、免疫治疗的患者;⑤不合作者或精神病患者等。共纳入56例, 设为观察组;患者年龄17～47岁, 平均 (36.6±12.5) 岁;病程3～21天, 平均 (11.0±9.5) 天;可能病因或检查结果:感染24例, 人工流产12例, 放置宫内节育器11例, 其他9例。另选取同期体检中心的健康女性50例为对照组, 年龄21～52岁, 平均 (36.5±10.5) 岁。本研究均已征得受试对象的知情同意, 并签署知情同意书。两组研究对象的年龄、体重指数 (BMI) 、月经、婚姻、妊娠及性生活史、职业等一般情况比较, 均无显著性差异 (P>0.05) , 具有可比性。

1.2 检测方法

所有受检者均于就诊或体检当日9时前, 观察组患者另于治疗后门诊复查时9时前, 分别空腹抽取肘静脉血5ml, 分注3管, 经枸橼酸钠抗凝、离心、分离血清。应用Array Protein System测定仪以免疫散射比浊法检测CRP水平;应用EPICS-XL型流式细胞仪以单克隆抗体醛化红细胞花环法检测T淋巴细胞亚群 (CD3+、CD4+、CD8+) 的百分率;应用全自动生化分析仪以EusA法检测IL-2水平;仪器均购自美国Beckman Coulter公司, 均使用仪器配套试剂, 严格按规程和试剂盒说明进行操作与判断结果, 试剂均在有效期内使用。

1.3 统计学分析

采用SPSS 15.0软件进行数据录入, 计量资料用表示, 两组比较采用t检验, 相关性使用Spearman等级相关分析, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组外周血CRP、IL-2与T淋巴细胞亚群水平比较

如表1所示, 可见观察组治疗前与对照组比较, CRP水平显著升高, CD8+水平升高, IL-2、CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平降低或显著降低, 差异均具有统计学意义 (P<0.05或P<0.01) 。观察组治疗后, CRP水平显著降低, CD8+水平降低, IL-2、CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平升高或显著升高, 差异均具有统计学意义 (P<0.05或P<0.01) 。观察组治疗后与对照组比较, 各指标水平相当, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。

2.2 急性盆腔炎患者外周血CRP、IL-2与CD4+/CD8+间的相关性

如表2所示, 经Spearman相关分析, 急性盆腔炎患者外周血CRP、IL-2与CD4+/CD8+间, 两两均具有显著的相关性, CRP分别与IL-2、CD4+/CD8+呈显著负相关, IL-2与CD4+/CD8+呈显著正相关 (P<0.05) 。

3 讨论

近年来, 急性盆腔炎发病率呈逐渐增高的趋势, 而且患者渐呈低龄化。在临床工作中, 以支原体感染较为常见, 可占60%～70%。在其病理生理机制中, 不仅与感染、炎症反应密切相关, 细胞因子的分泌、免疫功能的失调也参与了盆腔炎性疾病的发生、发展和转归[4]。

注:观察组治疗前与对照组比较, *P<0.05, **P<0.01;观察组治疗后与治疗前比较, ▲P<0.05, ▲▲P<0.01

注:急性盆腔炎患者外周血CRP、IL-2与CD4+/CD8+之间, 两两指标比较, *P<0.01。

CRP是一种主要由肝脏合成的急性时相糖蛋白, 能激活补体, 促进粘细胞及巨噬细胞的吞噬作用, 在感染早期即迅速升高, 升高程度与感染程度呈正相关;而随着有效治疗, 恢复期血清CRP浓度一般可接近正常水平, 因此CRP被认为是感染性疾病和炎症一种敏感而非特异诊断指标[5]。在人体, 具有临床意义的T淋巴细胞亚群主要为胸腺依赖性T淋巴细胞 (Tc) 、辅助T细胞 (Th) 、抑制细胞 (Ts) 以及Th/Ts比值, Tc、Th、Ts分别表达为CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞, 是反映机体免疫系统功能状态的重要指标, 其数量和功能异常则导致机体免疫功能紊乱。刘瑞芬等[6]认为急性盆腔炎患者的免疫功能紊乱主要表现为胸腺依赖性T淋巴细胞 (Tc) 、辅助T细胞 (Th) 水平的降低和抑制细胞 (Ts) 水平的增高。这可能是病原体感染原因导致的机体免疫机能低下。许多研究[7,8]表明, 血清IL-2是参与机体炎症和免疫调控的重要细胞因子, IL-2水平的降低, 可使免疫应答明显降低。李红梅等[9]研究发现, 急性盆腔炎患者血清IL-2水平降低, 认为其原因在于炎症反应引起SIL-2R水平升高, SIL-2R是一种封闭因子, 具有直接与血循环中的IL-2、膜IL-2R竞争结合的能力, 因此影响IL-2与膜IL-2R结合, 阻断了IL-2生物学功能的发挥;此外, 患者IL-2水平的降低还与T细胞减少有关, 其原因在于几乎所有激发T细胞均可分泌IL-2, 其中Th占80%, 因此, IL-2水平高低反映Th细胞功能[10]。

本研究结果显示, 在急行盆腔炎患者, 急性期血清CRP、CD8+水平升高, IL-2、CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平降低, 与健康女性比较, 差异均具有统计学意义 (P<0.05或P<0.01) 。而有效治疗后, 患者的上述指标基本均恢复至正常水平范围。进一步的相关性研究表明, CRP、IL-2与CD4+/CD8+间, 两两均具有显著的相关性, CRP分别与IL-2、CD4+/CD8+呈显著负相关, IL-2与CD4+/CD8+呈显著正相关 (P<0.05) , 其原因在于急行盆腔炎的发生发展, 感染、炎症与免疫反应等参与其中, 且可能是快速和同步的。综上所述, 可见急性盆腔炎患者血清CRP、IL-2和T淋巴细胞亚群水平密切相关, 联合检测可以为疾病的早期诊断、疗效判定和免疫疗法提供可靠的参考依据。

参考文献

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细胞周期蛋白T 篇6

关键词：系统性红斑狼疮,T淋巴细胞亚群,免疫球蛋白,补体

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种伴有多种异常自身抗体和补体激活的自身免疫性疾病,同时细胞免疫学的改变与疾病的活性关系密切[1]。T淋巴细胞免疫功能的改变在很大程度上反映了SLE患者体内细胞免疫的活化状态。本研究对392名健康成年人和136例SLE患者外周血T淋巴细胞亚群和免疫球蛋白及补体水平进行检测,以了解其T淋巴细胞的功能和患者血清中免疫球蛋白及补体浓度的变化,从而为深入探讨SLE的发病机制和判断病程及预后提供客观的实验室指标。

1 对象和方法

1.1 研究对象

江苏大学附属医院2009年3月至2010年7月确诊的SLE患者136例。其中男性15例,女性121例,年龄18~76岁(其中平均年龄男性为51.6岁,女性为31.7岁)所有病例均符合1997年美国风湿病学会(ACR)修订的SLE诊断标准[2]。采用1992年欧洲SLE活动性评分标准判断SLE的病情活动性[3]。392例正常成人静脉血液标本自镇江市中心血站的正常献血者(记录研究对象的吸烟年限及习惯研究,并在获得研究对象知情同意后采集样本),无免疫性疾病,无症状,HBs Ag、HIV及梅毒检测均为阴性,肝、肾功能正常,血细胞计数正常。其中男性153例,女性239例,年龄18~83岁(其中平均男性为43.1岁,女性为38.9岁)。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂和仪器

1.2.1. 1 T淋巴细胞测定的主要试剂和仪器

EPICS-XL型流式细胞仪、LH750型全自动五分类血液分析仪(均为美国Beckman-Coulter公司产品),IMMUNOPREPTM全血溶解试剂,荧光标准微球Flow-Check;以上试剂均为美国Beckman-Coulter公司产品;标记单克隆抗体Ig G1-FITC/Ig G1-PE/Ig G1-PC5、D4-FITC/CD8-PE/CD3-PC为法国Immunotech产品。

1.2.1. 2 免疫球蛋白(Ig G、Ig A、Ig M)及补体(C3、C4)测定的主要试剂和仪器

IMMAGE型双光径免疫浊度分析仪(为美国Beckman-Coulter公司产品)采用该公司的配套试剂。

1.2.2 样本处理

1.2.2. 1 T淋巴细胞测定的样本处理

取新鲜抗凝血(1.8mg/m L EDTA-K2抗凝)进行白细胞分类计数测定,并取100μL置入样品测定管,进入荧光标记单克隆抗体D4-FITC/CD8-PE/CD3-PC5,震荡混匀,室温下避光孵育20~30min,应用COULTER Q-PREP工作站和全血溶血试剂盒对样品进行溶血处理;同时用相同方法对同型对照样本进行抗体标记(Ig G1-FITC/Ig G1-PE Ig G1-PC5)、溶血处理与检测。

1.2.2. 2 免疫球蛋白

(Ig G、Ig A、Ig M)及补体(C3、C4)测定的样本处理

*P<0.05,**P<0.01

*P<0.05,**P<0.01

采新鲜静脉全血,离心(转速3000rpm),取血清上机检测。

1.3 统计分析

应用SAS软件(6.12版)、采用非参数分析(Wilcoxon秩和检验),对检测数据进行统计分析,P<0.05,视为差异具有显著性。

2 结果

2.1 SLE患者与正常对照组T淋巴细胞亚群结果

如表1所示,SLE患者组CD3+、CD4+T淋巴细胞百分比降低,尤其是CD4+T淋巴细胞明显降低(P<0.05);CD8+T淋巴细胞百分比明显升高(P<0.05),CD4+/CD8+比值明显降低(P<0.01)。

2.2 SLE患者与正常对照组血清免疫球蛋白、补体检测结果

136例SLE患者与392例正常对照组血清Ig G、Ig A、Ig M、C3、C4测定结果见表2。SLE患者组血清Ig G、Ig A水平均明显升高(P<0.01,P<0.05),其中C3、C4水平显著降低(P<0.01)。

3 讨论

SLE是一种伴有多种异常自身抗体和补体激活的累及多系统、多器官的小血管及结缔组织的自身免疫性疾病,其病因和发病机制尚不明确且病情复杂,疾病多呈渐进性,病程中往往复发与缓解交替出现。大量研究表明,机体免疫功能紊乱在SLE的发生发展过程中起着至关重要的作用[4]。

SLE患者体内存在着免疫功能的紊乱,大量自身抗体的产生导致血清中免疫球蛋白含量的明显升高,这是由于SLE患者多克隆B细胞的过度活化,促使B细胞分泌大量免疫球蛋白,致使患者体内免疫球蛋白升高,其中以Ig G水平升高最为明显。Ig M水平正常可能与其通常在机体炎症的早期出现有关,同时也可能是不同学者观察到的SLE患者血清Ig M水平结果不一的原因之一。近年来部分学者报道Ig M水平在SLE活动中期下降[4,5]。故观察体内免疫球蛋白含量有助于SLE的诊断。本研究结果显示,136例SLE患者的Ig G、Ig A、Ig M较健康对照组升高,其中Ig G明显升高,Ig A也升高,而Ig M水平与健康对照组无明显差异,与巫翠云[6]等人的研究结果一致。

在SLE发病机制中发挥重要作用,大量补体可通过经典途径或替代途径参与反应,但机体短时间内来不及制造和补充,致使C3、C4水平显著降低。虽然目前很少有将血清补体列入病情评估标准,但近年来国内外均有研究文献认为SLE患者血清C3、C4水平与疾病活动性相关[7]。本研究结果显示,SLE患者体内补体C3、C4水平均明显下降,其中C3水平下降更为明显,与既往研究结果一致[8]。

同时,有研究表明,T淋巴细胞亚群的紊乱可能在SLE的发生、发展过程中发挥重要作用,CD3+T淋巴细胞可表达与所有成熟T淋巴细胞表面,与TCR形成完整的TCR/CD3复合体,共同参与对抗原刺激的免疫应答[9],而T淋巴细胞亚群中的CD4+T细胞与CD8+T细胞的相互制约及平衡对机体免疫应答具有重要的调节作用。最近有研究表明,造成这种结果出现的机制可能是活动期SLE患者外周血中B细胞过量的产生抗体从而损害体内物质,CD4+T淋巴细胞参与了这一过程[10,11]。本研究结果显示,与正常对照组比较,SLE患者CD3+、CD4+T淋巴细胞百分比显著减少,CD8+细胞显著增加,CD4+/CD8+细胞比值明显下降,此于石永兵[12]等人的研究结果相符。

细胞周期蛋白T 篇7

1 资料与方法

1.1 一般资料

104例患者均为我院从2009年1月~2010年9月收治确诊的患者,入院诊断均符合第5版《妇产科学》标准,排除原发性高血压、肾病及各类炎症性疾病;分为轻、中、重度PIH,分别为36、48、20例。年龄24~37岁,平均27.5岁;孕周为32~40周,平均36.9周。对照组为随机选择的同期健康孕妇50例,年龄22~35岁,平均26.6岁;孕周为28~41周,平均33.7周;所有胎儿均为单胎。两组孕妇的年龄、孕周比较差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

1.2 检测方法

1.2.1 采集和处理血浆标本

采集孕妇空腹肘静脉血约6 m L,分别注入3个含枸橼酸钠的抗凝管,离心后分离出血浆,及时检测。

1.2.2 检测D-二聚体

用ACI Advance全自动血凝仪(美国Beckman Coulter公司),以免疫比浊法原理检测血浆D-二聚体。检测试剂均为仪器配套试剂,操作按说明书进行。

1.2.3 检测T淋巴细胞亚群

应用流式细胞仪(美国BD Facscalibur公司)以间接免疫荧光法检测T淋巴细胞亚群(CD3+、CD4+、CD8+)的百分率。

1.2.4 检测CRP应用

TBA-40FR型全自动生化分析仪(日本TOSHIBA公司)以免疫比浊法测定CRP,试剂由上海科华公司提供。

1.3 统计学方法

应用SPSS 13.0统计分析软件处理数据,计量资料以均数±标准差表示,多组间的比较采用方差分析,两两比较采用LSD-t检验;采用直线相关性分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组D-二聚体、T淋巴细胞亚群及C反应蛋白水平比较

妊高征组血浆D-D、CRP及T淋巴细胞亚群水平明显高于正常妊娠组,妊高征组随着病情的加重,血浆D-D、CRP的水平明显增高,重度妊高征组二者水平显著高于轻、中度妊高征组。见表1。

2.2 妊高症D-D、CD4+/CD8+与CRP的相关性

见表2。

注:*P<0.05

3 讨论

妊高征是多种因素共同作用的所致严重多脏器功能受损的妊娠并发症,包括遗传因素、免疫因素胎盘、各种细胞因子、钙离子、血管内皮损伤等。这些因素相互作用导致全身血管内皮细胞损伤和功能异常,凝血/纤溶系统功能失衡,从而引起一系列的临床症状[3,4,5]。

妊高征孕妇凝血与纤溶系统存在平衡失调,比健康孕妇更具有血栓形成倾向或出血倾向。一旦形成血栓,机体就会启动纤溶激活系统使已形成的血栓溶解,纤溶系统被激活后生成纤溶酶,纤溶酶降解交联的纤维蛋白逐渐被降解[6]。D-D是交联纤维蛋白的特异性可溶性降解产物,其水平增高反映继发性纤溶活性增强,D-D出现表明体内同时存在血栓形成和血栓溶解过程,是反映血栓前状态和继发性纤溶亢进的理想指标[7,8]。本文结果显示,妊高征组D-D水平高于健康妊娠组,且随着病情的加重D-D的水平明显增高。通过检测D-D水平,可以对临床不典型妊高征孕妇作出及时诊断并早期干预,对预防或治疗妊高征,降低围生期孕产妇及围生儿死亡率具有重要意义。

正常妊娠时孕妇外周血中粒细胞增加和淋巴细胞减少[9,10],本研究发现,妊高征患者的外周血中T淋巴细胞亚群百分率明显高于健康妊娠妇女。CD3+为T细胞表面重要的分化抗原,CD3+的细胞代表总T细胞分为辅助性T细胞(CD4+)和抑制性T细胞(CD8+)两个亚群;CD4+细胞通过分泌细胞因子调节免疫反应活性[11],CD8+可能抑制B淋巴细胞产生抗体进而抑制免疫应答。本研究发现,妊高征患者CD3+和CD4+细胞及CD4+/CD8+的比值明显增加,提示妊高征时主要为辅助性的增加,妊高征的发病可能与CD4+与CD8+的比例失调有关。与以往研究结果一致[12,13]。

C反应蛋白是1930年由Tiller与Francis首先发现的能对肺炎球菌细胞壁C-多糖发生反应的急性时相蛋白,具有多种生物活性,是最敏感的炎症反应的标志物之一。新近研究发现,CRP与心血管疾病、妊娠期糖尿病等密切相关,可能是心血管疾病独立的危险因子[14,15]。本研究显示,妊高征孕妇CRP水平显著高于健康孕妇,并且CRP水平与妊高征轻重程度密切相关。

综上所述,妊高征时,孕妇血浆D-D、T淋巴细胞亚群与CRP的水平与健康孕妇相比显著增加,且均随着妊高征的严重程度而增加,并且三者之间具有正相关性。除此之外,胱抑素C、抑制素、褪黑素等均与妊高征密切相关[16,17,18]。不同的指标反映了妊高征的不同致病因素,而它们之间的相关性说明不同因子之间具有协同作用或者因果关系。

摘要：目的 研究妊娠期高血压孕妇D-二聚体、T淋巴细胞亚群与C反应蛋白(CRP)的水平及其相关性。方法 检测104例妊娠期高血压孕妇的D-二聚体、T淋巴细胞亚群与CRP水平,同时检测50例同期健康孕妇以上3项指标进行对比,并做相关性分析。结果 妊娠期高血压孕妇的D-二聚体、T淋巴细胞亚群与CRP水平明显高于健康孕妇,差异有统计学意义(P<0.05),且均随疾病严重程度而增加,3项检测指标之间具有正相关性(P<0.05)。结论妊娠高血压综合征是多种因素共同作用所致的复杂病理过程,不同指标间的相关性说明不同致病因素之间具有协同作用或者因果关系。