人单核细胞

人单核细胞（精选12篇）

人单核细胞 篇1

巨噬细胞(Macrophage)能吞噬感染异物并诱导T细胞活化,启动免疫应答[1],在机体损伤修复、抵抗病原入侵[2]等方面起重要作用,是机体先天免疫的重要部分[3]。巨噬细胞属于无颗粒白细胞的一种,是由单核细胞(Monocyte)分化而来的。单核细胞来源于骨髓,成熟后释放进入血液并随外周血循环进入组织,分化成为巨噬细胞发挥相应的功能[4]。研究者可以对人外周血进行分离,获取单核细胞后进行体外分化,分化得到的巨噬细胞可用于进行各种功能研究。

目前常用的获取人外周血单核细胞的方法是密度梯度离心法。基于Ficoll-Hypaque的单次密度梯度离心可以将红细胞,粒细胞,血小板以及单个核细胞逐层分开。其中,外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)主要包括淋巴细胞和单核细胞,进一步对PBMC离心清洗并用贴壁方法去除悬浮细胞后,可得到单核细胞[5]。但该方法对于液层吸取操作要求较高,获得的单核细胞中会存在较多淋巴细胞,粒细胞以及血小板的污染。通常的解决方法是用抗体标记结合免疫磁珠对PBMC中的单核细胞进行纯化富集。然而不论基于抗体阴选还是阳选的方法,都不可避免对单核细胞产生一定程度的免疫刺激或者机械损伤;分选操作过程较长,在实验过程中要对细胞进行反复洗涤离心等操作,也会造成目的细胞的遗失,对于少量的临床样品难以操作。另外也可以选择基于Percoll分层液的连续密度梯度离心分离法,可以直接将单核细胞与淋巴细胞、红细胞、粒细胞分层,但是操作繁琐,耗时较长,对试剂的消耗量也比较大。因此,寻找一种简便、快捷而又高效的单核细胞分离方式对于单核-巨噬细胞相关研究的开展至关重要。

单核细胞是体积最大的白细胞,其内容物的颗粒形状与淋巴细胞以及粒细胞等具有显著的差别。本文中尝试对外周血白细胞直接进行流式细胞分选,根据细胞组分的分群特征,直接获得其中的单核细胞,并通过单核细胞表面标志物CD14染色进行验证,该方法对于单核细胞的分选效率能达到85%以上,可以简单快捷的获得纯度较高的单核细胞用于实验。

1 材料与方法

1.1 实验材料和试剂

人外周血白细胞成分血来自军事医学科学院附属医院输血科。红细胞裂解液(10×,#420301)购自Biolegend公司。人CD14抗体(130—091—242)购自Miltenyi Biotec公司。流式细胞分离管购自BD公司。人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子GM-SCF购自R&D公司。RPMI1640 培养液(C11875),进口胎牛血清,购于 Invitrogen 公司。

1.2 红细胞裂解

人外周血白细胞成分血中仍含有大量红细胞,在流式分选前需要进行红细胞裂解处理。将白细胞成分血与稀释为1×的红细胞裂解液按照1∶10的比例混合,避光室温裂解15 min,300 g 离心10 min,PBS洗涤一次。细胞计数,将细胞用流式缓冲液重悬(1×107细胞用500 μL缓冲液重悬)。

流式缓冲液:高压灭菌的PBS,pH值为7.2,加入0.5%的牛血清白蛋白以及 2 mol EDTA。

1.3 流式抗体标记

取1×106细胞,即50 μL上述细胞悬液,加入1 μL CD14-PE抗体,避光冰上标记10 min,向离心管中加入1 mL流式缓冲液终止染色,迅速离心去除上清后将细胞重新用100 μL 流式缓冲液悬起,通过细胞滤网后进行流式细胞分析。其余经红细胞裂解处理的细胞按照细胞计数结果直接用流式缓冲液重悬,通过细胞滤网后放置于冰上,准备进行流式分选。

1.4 流式细胞仪分选

本室购置的流式细胞仪为BD FACS AriaTMII 。根据外周血各个成分细胞的分群,确定单核细胞在流式细胞仪中的大小以及颗粒度等特征,限定分选条件,获取单核细胞。同时对CD14-PE抗体标记的细胞进行流式分析,确定单核细胞分群中CD14阳性的细胞所占比率。

1.5 单核细胞体外培养分化

上述分选得到的单核细胞经300 g离心后用含有10%进口胎牛血清以及双抗的RPMI—1640培养基重悬,种于细胞培养皿中,加入10 ng/mL GM-CSF 共培养(5~7)d,镜下观察分选得到的单核细胞体外分化的巨噬细胞形态。

2 实验结果

2.1人外周血流流式细胞检测分群以及CD14抗体预染分析

外周血白细胞成分血经过红细胞裂解处理并进行CD14抗体预染,流式细胞仪分析,结果见图1,左图为样品直接流式分群结果,其中左上角为粒细胞群,中间圈定细胞群(P1)为单核细胞,占白细胞总数的8%左右;居中偏下的为淋巴细胞群。右图为CD14抗体阳性细胞(P2),该阳性细胞群占左图中单核细胞分群(P1)的85%~90%左右。结果证明,根据目的细胞群的大小以及颗粒度的差异通过流式细胞分群方式可以分离并获取单核细胞。

2.2流式细胞仪直接分选得到的单核细胞CD14抗体标记分析

将其余的外周血白细胞成分血根据细胞分群直接选择单核细胞群进行分选。将分选得到的单核细胞进行CD14抗体标记后,再次进行流式分析。结果如图2,左图为分选后细胞经流式细胞仪直接分析,R1即分选得到单核细胞;右图显示该群单核细胞分选后CD14抗体标记的结果, CD14阳性的细胞占分选获得所有细胞的比例为85%左右。如在后期实验中进一步优化条件,预期可以获得纯度更高的单核细胞。

2.3流式细胞仪分选得到的单核细胞体外培养分化

上述流式分选得到的单核细胞经过体外分化培养7 d,镜下观察细胞形态与文献报道一致[6]。证明基于流式细胞分选得到的人外周血单核细胞分化正常,可以用于对巨噬细胞进一步的功能研究。

3 讨论

单核巨噬细胞的相关研究是当前免疫学研究的热点,2011年底,免疫学国际顶级期刊《Nature.Reviews Immunology》对近年来单核巨噬细胞的的相关研究进行专刊评述,对巨噬细胞的极化过程[7],巨噬细胞与感染和免疫[8]、巨噬细胞与机体保护和致病[9]以及巨噬细胞与重要疾病[10]的关系等列为免疫学的前沿领域的热点问题进行了全面的总结和述评。

传统方法对于单核细胞的分离过程需要反复离心清洗,会造成大量细胞在操作过程中的遗失,而且操作时需要对抗凝血作适当稀释,在血量较多时要分成数管进行离心,对于分离试剂的需求较大。如需获取纯度较高的单核细胞进行实验操作,则需要进一步利用抗体以及磁珠等技术方法加以纯化,增加了实验成本,而且获得的单核细胞容易被激活而给实验结果带来影响。

基于流式细胞仪的功能,根据细胞的大小以及颗粒度等特征,对白细胞直接进行分选获取人外周血中的单核细胞的方法,避免了多次重复离心,节省了梯度离心的试剂。经重复验证,本方法能够分选得到纯度在80%~90%之间的单核细胞用于实验。该方法可以用于在少量临床血液样本中获取高纯度的单核细胞,为深入研究单核-巨噬细胞与疾病之间关系提供了良好的技术平台。

参考文献

[1] Gordon S,Taylor P R.Monocyte and macrophage heterogeneity.NatRev Immunol,2005;5:953—964

[2] Mantovani A,Sozzani S,Locati M,et al..Macrophage polarization:tumor-associated macrophages as a paradigm for polarized M2 mono-nuclear phagocytes.Trends Immunol,2002;23:549—555

[3] Gordon S.Alternative activation of macrophages.Nat Rev Immunol,2003;3:23—35

[4] Van Furth R,Cohn Z A.The origin and kinetics of mononuclearphagocytes.J Exp Med,1968;128:415—435

[5] Berthold F.Isolation of human monocytes by ficoll density gradientcentrifugation.Annals of Hematology,2004;43:367—371

[6] Li T,Morgan M J,Choksi S,et al.MicroRNAs modulate the nonca-nonical transcription factor NF-kappaB pathway by regulating expres-sion of the kinase IKKalpha during macrophage differentiation.NatImmunol,2010;11(9):799—805

[7] Lawrence T,Natoli G.Transcriptional regulation of macrophage po-larization:enabling diversity with identity.Nature Reviews Immunol-ogy,2011;11:750—761

[8] Shi C,Pamer E G.Monocyte recruitment during infection and inflam-mation.Nature Reviews Immunology,2011;11:762—774

[9] Murray P J,Wynn T A.Protective and pathogenic functions of macro-phage subsets.Nature Reviews Immunology2,011;11:723—737

[10] Chawla A,Nguyen K D,Goh Y P S.Macrophage-mediated inflam-mation in metabolic disease.Nature Reviews Immunology,2011;11:738—749

人单核细胞 篇2

2、难以及时清除体内衰老的死亡细胞。

3、难以及时发现和消灭体内发生变异的细胞，防止 恶性肿瘤的发生。

如果免疫功能低下，极易招致细菌、病毒、真菌等感染，甚至引发肿瘤。

免疫功能低下分为原发性和继发性两类，原发性是先天发育不全所致，大多数与遗传有关，多发生于儿童;继发性则由病毒、细菌、真菌等感染或药物、肿瘤、疲劳、失眠、营养不良等原因引起，可见于各种年龄的人群。

传染性单核细胞增多症1例 篇3

doi：103969/jissn1004-7484（s）201306192 文章编号：1004-7484（2013）-06-2969-01

1 病例摘要

患儿、男、11岁、以颈部淋巴结肿大11天，发热8天为主诉入院。患儿11天前无明显诱因地出现右侧淋巴结肿大，颈部稍有触痛，当时无发热，无皮疹，无咳喘，第2天到我院门诊就诊，化验血常规未见异常，做颈部彩超见右侧淋巴结肿大，左颈部、右锁骨上淋巴结显示。口服蒲地兰头孢克洛，并用仙人掌外敷，8天前出现发热，体温达385℃，每日发热2次，口服美林后热可退，又加红霉素口服3天，症状无明显好转，颈部淋巴结较前肿大，次日到我院门诊就诊，化验血常规见异型淋巴细胞，肝功发现谷丙转氨酶升高收入院。既往体健。查体：T389℃，P109次∕分，R29次∕分，BP100∕75mmHg，神志清楚，呼吸稍促，无发绀，周身未见皮疹，双侧颈部可触及肿大淋巴结，右侧较多，最大者约3CM×2CM，质软，轻触痛，活动度可，无粘连，咽充血，双扁桃体Ⅱo肿大，无脓点，颈软，双肺呼吸音清，无罗音，心音有力，律齐，腹平软，肝肋下未触及，脾肋下2CM，质Ⅰo，触痛（+），四肢末稍温。辅助检查：肝胆脾彩超：脾大，肝门淋巴结肿大。颈部淋巴结彩超：右颈部多发淋巴结肿大，左颈部、右锁骨淋巴结显示。血常规：WBC1151×109∕L，N%100%，淋巴细胞计数：70×109∕L，异型淋巴细胞分数：15%，HGB125g∕L，PLT132×109∕L，MP-Ab：1：80，IgM（+），IgG（-），嗜异凝集实验（+），肝功：ALT120u∕L，AST101u∕L，GGT53u∕L，ALP257u∕L，EB病毒抗体（+），入院诊断：传染性单核细胞增多症治疗上给予静滴头孢替唑、口服红霉素以抗炎，喜炎平抗病毒，静滴复方甘草酸苷、维生素C以保肝治疗。

2 讨 论

传染性单核细胞增多症是一种单核—巨噬细胞系统急性增生性传染病。小儿期常见。主要由EB病毒引起，特征为不规则发热、咽峡炎、淋巴结及肝脾肿大，且血液中出现大量异常淋巴细胞，血清中可出现嗜异凝集素及EB病毒特異性抗体等。6岁以下幼儿常表现轻度，甚至隐性感染，15岁以上感染者则多呈典型症状，超过35岁的患者少见。在临床症状颇为相似的IM病例中，90%以上由EB病毒引起，而其他5%-10%称之为类传染性单核细胞增多症的病例由巨细胞包涵体病毒、鼠弓形虫、腺病毒、肝炎病毒、HIV及第6型疱疹病毒等所致。由于其症状、体征的多样化和不典型病例在临床上逐渐增多，给诊断治疗带来一定困难，因此我们儿科医生要加强对IM疾病的认识，重视已出现的阳性特征及化验检查的结果，全面分析病情避免漏诊及误诊。

参考文献

[1] 诸福棠实用儿科学第7版

人单核细胞 篇4

1 材料与方法

1.1 主要药品、试剂及仪器

黄芪注射液 (成都地奥公司) ;低密度脂蛋白 (low density lipoprotein, LDL) ;佛波酯 (PMA, Sigma公司) ;胎牛血清 (杭州四季青公司) ;淋巴细胞分离液 (天津市灏洋生物公司) ;Hank’s缓冲液 (Genom公司) ;乙腈、异丙醇、正庚烷、正己烷 (美国天地公司) ;改良Lowry法蛋白定量试剂盒 (北京Applygen基因技术有限公司) ;丙二醛 (MDA) 测定试剂盒 (南京建成生物工程研究所) ;超速离心机 (OptionTM L-80 XP, Beckman, USA) ;ELX800酶标仪 (BIOTEK) , Nikon Microphot-FXA倒置显微镜 (重庆光学仪器厂) , 高效液相色谱分析系统 (美国惠普公司) 。

1.2 实验方法

采用密度梯度离心法和塑料吸附法从人外周血中分离出单核细胞, 以50 nmol/L佛波酯刺激48 h使之转化为巨噬细胞。细胞分为对照组与实验组。正常人血浆LDL的制备参见文献[3,4]进行改进。 人外周血单核细胞的制备, 对常规分离单核细胞的密度分离法[5]和塑料吸附法略作改进。 PMA诱导单核细胞转化为巨噬细胞, 待上述细胞静止12 h后, 换入含50 nmol/L PMA的RPMI-1640完全培养基刺激48 h使之转化为巨噬细胞[6], 换入无血清培养液待处理[7]。

1.3 实验分组

按黄芪注射液的终浓度分为0、0.000 1mg/mL、0.001 mg/mL、0.01 mg/mL组以及ox-LDL组。首先按不同浓度黄芪注射液预处理巨噬细胞1 h, 后加入ox-LDL, 使其终浓度为80 mg/L, 共孵育24 h。由以上结果确定黄芪注射液降低细胞总胆固醇/蛋白 (TC/Pro) 比值的最佳浓度, 作出量效关系曲线;以黄芪注射液的最佳浓度预处理巨噬细胞1h后, 加入ox-LDL (80 mg/L) 共孵育不同的时间, 即0、6 h、12 h、24 h。确定黄芪注射液降低细胞TC/Pro的最佳时间, 作出时效关系曲线, 检测相关指标。

1.4 观察指标

油红O染色观察细胞内脂滴变化, 高效液相色谱分析细胞内胆固醇酯的变化[8,9,10]。

1.5 统计学处理

实验结果采用均数±标准差$(\overline{x}\pm s)$表示, 组间差异进行方差分析后, 再用 t 检验。用SPSS 11.0统计软件进行统计学分析, 以P<0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 模型的建立

2.1.1 单核细胞的形态学改变

单核细胞经50 nmol/L的PMA诱导48 h后, 10×10倍光学显微镜下观察, 部分细胞由圆形变成多角形状, 并易于聚集, 贴壁, 说明细胞已由单核细胞分化为巨噬细胞。

2.1.2 泡沫细胞模型的建立

分化成巨噬细胞的单核细胞与80 mg/L 的共ox-LDL孵育24 h, 结果显示细胞内胆固醇含量明显增加, 细胞内胆TC/Pro>50%, 且与对照组比较有统计学意义。油红O染色显示, ox-LDL处理组细胞内有大量的红色脂滴颗粒存在, 并且发现个别细胞由于吞噬的油滴过多而使得这些细胞体积增大符合泡沫细胞的形态特征, 而不加ox-LDL的组细胞内无明显红色油滴状颗粒。

2.2 不同浓度黄芪注射液干预后细胞内胆固醇含量与蛋白含量的改变

黄芪注射液在浓度为0～0.01 mg/mL, 细胞中TC/Pro随黄芪注射液浓度的增加呈剂量依赖性降低, 由24.2 mg/mL±1.1 mg/mL下降到6.0 mg/mL±1.0 mg/mL, 其中采用0.01 mg/mL的黄芪注射液处理细胞后降低细胞内TC/Pro的作用最为显著 (P<0.01) 。详见图1。

2.3 黄芪注射液处理后细胞内胆固醇与蛋白含量的改变

选定0.01 mg/mL浓度的黄芪注射液作为最佳处理浓度, 观察黄芪注射液与80 mg/L ox-LDL共同处理人单核细胞源性巨噬细胞不同的时间 (6 h、12 h、24 h) 后对细胞内TC/Pro的影响。在0 至24 h范围内, 细胞中TC/Pro随黄芪注射液处理时间的延长呈时间依赖性降低 (P<0.01) 。详见图2。

3 讨 论

黄芪具有利尿、降压、强心, 减轻蛋白尿、抗动脉粥样硬化以及增强机体免疫力等功效[11]。黄芪还被称为“生物调节剂”, 现代医学研究证明黄芪是机体自由基的清除剂和抗氧化剂, 具有调节血脂和抗动脉粥样硬化的作用。童红莉等[1]研究发现黄芪能使高脂血症大鼠血清TC、TG、LDL-C明显降低, 明显升高HDL-C, 同时能升高肝脏超氧化物歧化酶 (SOD) 、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) 及脂质过氧化物 (LPO) 。黄芪有良好的调脂作用和增强抗脂质过氧化的作用。

升高HDL-C治疗的潜在益处已经引起了人们的重视, HDL-C通过多种机制发挥其抗动脉粥样硬化作用, 其中最重要的是参与RCT, 阻止巨噬细胞转化为泡沫细胞, 防止胆固醇在动脉壁沉积, 并将胆固醇从血管壁运送至肝脏被清除, 但目前尚无升高HDL-C的特效方法。冠心病患者HDL-C亚组分的颗粒结构的变化亦与脾虚证密切相关[12]。中医认为脾主运化, 为后天之本, 气血生化之源。血脂乃血中之膏脂, 水谷精微和血中膏脂的化生和输布均依赖于脾的运化。脾气健旺, 运化正常, 水谷精微和膏脂输布正常, 痰浊不生, 血络通畅;血脂代谢异常可理解为脾虚失运, 痰瘀内阻。中医脾的运化和转输功能可能与HDL-C代谢及RCT有密切的关系。健脾益气和活血化痰浊的中药能降低TC和升高HDL-C[13], 也证明了这一点。为进一步揭示中医中药的作用机制, 从细胞水平观察和探讨中药黄芪的调脂机制。

本研究通过观察黄芪注射液对体外培养的人单核细胞源性泡沫细胞内胆固醇流出的影响, 发现经不同浓度黄芪注射液作用后, 细胞TC/Pro随黄芪注射液浓度的增加而呈剂量依赖性降低, 细胞泡沫化程度也随着药物浓度的升高而降低 (P<0.01) , 且在药物浓度一定的情况下, 细胞中TC/Pro比值随黄芪注射液处理时间的延长而呈时间依赖性降低 (P<0.01) 。 以上结果表明, 黄芪注射液一定程度上减轻巨噬细胞的泡沫化程度, 推测可能与其抑制巨噬细胞上SR-B1受体功能从而抑制细胞对胆固醇摄取, 或是通过增强巨噬细胞上ABCA1转运体的功能而促进了细胞内胆固醇的外流有关。本研究结果为健脾益气法能够升高HDL-C和调节RCT的假说提供了部分证据, 后续研究将进一步从分子水平和受体水平对黄芪抗AS和抑制细胞泡沫化的机制进行探讨, 为研发调节RCT的中药新药和防治冠心病提供线索。

摘要：目的观察黄芪注射液是否对人外周血单核细胞源性泡沫细胞内胆固醇外流产生作用和影响, 从机体胆固醇逆转运 (RCT) 的角度探讨黄芪的调脂机制和抗动脉粥样硬化的作用。方法采用密度梯度离心法和塑料吸附法从人外周血中分离出单核细胞, 以50nmol/L佛波酯 (PMA) 刺激48h使之转化为巨噬细胞。细胞分为对照组与实验组, 以黄芪注射液干预后分别测定细胞内总胆固醇 (TC) 、游离胆固醇 (FC) 与蛋白 (Pro) 含量的变化, 观察黄芪注射液对细胞内TC/Pro比影响的量效关系和时效关系。结果成功建立人单核细胞源性泡沫细胞模型。经不同浓度黄芪注射液作用后, 细胞中TC/Pro随黄芪注射液浓度的增加而呈剂量依赖性降低, 细胞泡沫化程度也随着药物浓度的升高而降低 (P<0.01) , 且在药物浓度一定的情况下, 细胞中TC/Pro随黄芪注射液处理时间的延长而呈时间依赖性降低 (P<0.01) 。结论黄芪注射液通过降低细胞内TC含量, 一定程度上减轻巨噬细胞的泡沫化程度, 推测可能与其抑制巨噬细胞上SR-B1受体功能从而抑制细胞对胆固醇摄取, 或是通过增强巨噬细胞上ABCA1转运体的功能而促进了细胞内胆固醇的外流有关, 或者是两者共同作用的结果。

人单核细胞 篇5

时间： 年 月 日上午09：30-10：10 地点：儿科病房

床号15床

姓名

主持者： 主治医师，记录者： 主治医师 参加人员：医师及全体实习生。学习内容：传染性单核细胞增多症

实习同学汇报病史：略。

一、总结病史汇报情况：基本病史情况汇报清楚，对重点体查未详细提及。

二、查体肝脾触诊：单手、双手、钩指触诊。

触诊肝脏时描述的内容：大小、质地、边缘和表面状态、压痛、搏动、肝区摩擦感等。

小儿正常肝脾脏触诊范围：

正常肝上界：在右锁骨中线第5肋间（婴儿在第4肋间），腋中线在第7肋间，肩胛线在第9肋间。一般1-2岁时，可在右锁骨中线肋缘下触及<2cm，3岁以上绝大部分不能触及。

正常新生儿脾脏可在左肋下1-2cm，5-6个月的婴幼儿偶可触及，1岁以后脾脏不应摸到。正常脾脏浊音界在左腋中线的第9-11肋间，质地柔软。

轻中重分度：轻度：右锁骨中线肋缘下3cm以内；中度：肋缘下3cm以上至脐；重度：肝超过脐水平；极重度：肝脏大多已入骨盆，并横过中线。

三、传单概念：EB病毒所致急性感染性疾病，主要侵犯儿童及青少年，以“发热、咽峡炎、肝脾及淋巴结肿大”为主要表现，外周血中淋巴细胞增多并出现异型淋巴细胞为特征。

四、流行病学：全年均有发病，以秋末春初为多，病后可获得持久免疫力，第二次发病罕见。患者和EBV携带者为传染源。病毒主要在唾液腺及唾液中，口口传播是重要途径。6岁以下大多轻型或隐性感染，15岁以上症状典型。

婴幼儿典型病例很少，主要是不能对EB病毒产生充分的免疫反应。

五、病理及发病机制：

1）EBV属疱疹病毒科Y亚科中唯一能引起人类感染的淋巴滤泡病毒。是线性双链DNA病毒，EBV特点是：亲淋巴细胞性和亲上皮细胞性。

主要侵入B淋巴细胞（B淋巴细胞表面有C3a受体，与EBV受体相同）。回顾免疫学相关知识：

单核-吞噬细胞系统（MPS）：包括血液中的单核细胞（MO）和组织中的吞噬细胞，具有抗感染、抗肿瘤、参与免疫应答和免疫调节作用。抗原呈递细胞（APC）：1）单核-吞噬细胞系统（MPS）2）树突状细胞（DC）2）B细胞；

淋巴细胞：根据细胞功能和膜表面标志的不同分为：1）T淋巴细胞（介导细胞免疫）2）B淋巴细胞（介导体液免疫）3）自然杀伤细胞（NK细胞）； T细胞根据CD分子分类：CD3表达于所有成熟T细胞的表面；

CD4+T细胞和CD8+T细胞；

根据功能分类：1）辅助性T细胞（Th）2）细胞毒性T细胞（Tc）：具有细胞毒作用，可特异性杀伤靶细胞；3）调节性T细胞（Tr）

适应性免疫应答：感染早期，病原体未完全清除，巨噬细胞将加工处理后的抗原异物传递给T、B细胞，诱导T、B细胞活化、增殖、分化、发挥特异性的免疫应答。

识别：T、B细胞对抗原的识别；T、B细胞与抗原结合后即开始活化； 活化阶段：T细胞表达的TCR（T细胞表面表达的抗原识别受体）只能识别小分子抗原肽，对大分子蛋白质性抗原必须经抗原提呈细胞（APC）处理，降解为小分子多肽，并与APC细胞的主要组织相容性复合体（MHC）分子相结合后，转运至APC的表面，才能被TCR识别，产生活化的第一信号；

效应阶段：B细胞分化为浆细胞，分泌抗体，执行体液免疫功能；T细胞转化为效应T细胞，其效应是杀伤抗原靶细胞：如病毒感染细胞、肿瘤细胞；

2）EBV进入口腔后首先在口咽部淋巴组织中B淋巴细胞增殖（淋巴结：T淋巴细胞约占淋巴结内淋巴细胞总数的75%，B细胞约占25%。脾脏：B淋巴细胞约占脾脏中淋巴细胞的60%，T细胞约占40%。），继而入血，出现病毒血症，累及周身淋巴系统。因B细胞表面有EBV受体，故EBV主要感染B细胞，B细胞多克隆活化，受感染B淋巴细胞表面抗原改变，继而引起T淋巴细胞的强烈免疫应答转化为细胞毒效应细胞而直接破坏感染EBV的B细胞。大量的异型淋巴细胞就是这种具杀伤力的的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）。

受感染的B细胞两种命运：1）增殖性感染（细胞溶解性感染）：因溶解感染而释放出病毒颗粒，繁殖出EBV进而感染周边上皮细胞与B淋巴细胞，将感染扩大。这种感染方式主要见于EBV感染性疾病如：传单。2）非增殖性感染：包括：潜伏性感染和恶性转化两个阶段：静止的记忆B淋巴细胞被认为是EBV持续存在的场所，在一定的条件和某些诱导因素作用下，潜伏的EBV基因组可被激活而转化为增殖性感染。这种感染方式主要见于慢性活动性EBV感染和EBV相关性恶性肿瘤性疾病，如：Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌、平滑肌瘤、淋巴瘤、胃癌等。

3）除T、B细胞交互作用，还有免疫复合物沉积及病毒对细胞的直接损害等免疫病理因素。毒T淋巴细胞除了杀伤受感染B淋巴细胞，还侵犯组织器官产生一系列临床表现。

4）淋巴细胞良性增生是本病基本病理特征。（淋巴细胞及单核-巨噬细胞高度增生，胸腺依赖副皮质区的T细胞增生最为显著，肝脾、肾、骨髓、中枢神经系统均可受累，主要为异常的多形性淋巴细胞侵润）

六、临床表现：潜伏期：5-15天，大多10天，青年期达30天。

1.发热，大多是出现发热，体温在38.5-40度之间，无固定热型，中毒症状多不明显； 2.咽峡炎：咽部、扁桃体、悬雍垂充血肿胀伴有咽痛；

3.淋巴结肿大，均有，病程第一周出现，浅表淋巴结普遍受累，以颈部最为常见，腋下、腹股沟次之，很少超3cm，中等硬度，无黏连及明显压痛，常在热退后数周才消退。热退后数周消退，如果合并肠系膜淋巴结肿大，可出现腹痛。

4.肝脾肿大：20%-60% 肝大，肝功能异常（谷丙转氨酶升高，部分患者有轻度黄疸），脾轻度肿大，伴疼痛及压痛。

5.皮疹：约10%患者出现在病程1-2周出现多形性皮疹，以丘疹及斑丘疹常见，多见于躯干部位，1周内消退。消退后不脱屑，也不留色素。本病病程2-3周。

七、并发症：重症可并发神经系统疾病；急性期可发生心包炎，心肌炎。少部分咽部合并细菌感染。

八、实验室检查：

1.血常规：早期（发病1周内）白细胞总数正常或偏低，1周后白细胞总数逐渐升高，一般为10-20×10^9/L，单个核细胞增多为主，占60%以上。异型淋巴细胞增多10%以上或其绝对值超过1.0×10^9/L时具有诊断意义。血小板计数常减少，可能与病毒直接损伤和免疫复合物作用有关。

2.血清学检查： 1）EBV特异性抗体检测：衣壳抗原（VCA）IgM阳性提示新近感染标志，多在4-8周后消失。早期抗原（EA）IgG 是近期感染或EBV复制活跃标志。

2）嗜异凝集试验：起病1-2周，血清中出现一种IgM型嗜异性抗体，能凝集绵阳或马红细胞，效价高于1：64经豚鼠肾吸收后仍阳性，具有诊断意义。

3）EBV-DNA检测：血清中存在高浓度EBV-DNA，提示病毒血症。

九、诊断：根据流行病史、典型临床表现（发热，咽峡炎，肝脾淋巴结肿大）、外周血异型淋巴细胞>10%，EB病毒特异性抗体阳性。

十、鉴别诊断：与其他病毒（巨细胞包涵体病毒、腺病毒、肺炎支原体、甲肝病毒、风疹病毒、疱疹性咽炎）所致淋巴细胞及单核细胞增多（又名：类传染单核细胞增多症，占5%-10%）鉴别。

传单综合征：有1）临床表现：发热、咽峡炎、淋巴结肿大、肝脾大、皮疹、肝功能受损。2）外周血异型淋巴细胞增多10%以上或其绝对值超过1.0×10^9/L。且EB病毒感染证据阴性（即嗜异凝集试验阴性或嗜异凝集试验阳性而豚鼠肾吸附后试验转为阴性或抗EB病毒抗体阴性），应诊断为传单综合征。

十一、治疗：自限性疾病，大多预后良好，一般不需特殊治疗。主要对症治疗，如肝炎症状安病毒性肝炎对症治疗；脾大卧床休息，2-3周避免与腹部接触。抗细菌治疗仅用于咽或扁桃体继发链球菌感染时，忌用氨苄西林或阿莫西林，以免引起皮疹加重病情。

抗病毒治疗：1）阻碍DNA多聚酶合成的药物：阿昔洛韦800mg/kg.d，分4次，连用5天。更昔洛韦10mg/kg.d，分2次静滴，2）细胞因子：a-干扰素具有抗病毒作用及抗肿瘤活性，且可促进B细胞分化，增强杀伤细胞和NK细胞的活性，有助于恢复患儿的免疫功能，清除EBV及EBV感染细胞。

重型患者发生咽喉严重病变或水肿者，有神经系统并发症及心肌炎、溶血性贫血、血小板减少性紫癜等并发症是，应用短程肾上腺皮质激素可明显减轻症状，强的松1mg/kg.d，第二周逐渐减量而停用。中毒症状明显是，丙球 400mg/k.d，每日一次，连用4-5天。

十二、预防：正研制EB疫苗，尚用于EBV感染的相关的儿童恶性淋巴瘤和鼻咽癌的免疫预防。

十三、总结：通过这次对传染性单核细胞增多症的教学查房可以加深实习生对传染性单核细胞增多症的认识，加强诊断与治疗的认识。最后感谢家属与患儿的 配合！

人单核细胞 篇6

【摘要】单核细胞增生李斯特氏菌在病原学上作为一种人畜共患和食源性疾病的致病菌已得到世界范围普遍的公认。近年来，如何分离和鉴定食品中单核细胞增生李斯特氏菌已成为研究热点。本文结合近十年的各种该病菌的快速检测方法作了系统综述，介绍了针对该病菌的快速检测方法， 如显色培养基快速检测方法、酶联免疫试验检测方法、结合单克隆抗体技术的免疫学检测方法、反转录-PCR检测方法、生物芯片，以期对食品中单核细胞增生李斯特菌的检测起到帮助和指导作用。

【关键词】单核增生细胞李斯特氏菌；检测方法

【中图分类号】R741.32 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2015）03-0234-02

基金项目： 2014年地方高校国家级大学生创新创业训练计划资助项目（编号：201410313027）；2014年江苏省高等学校大学生创新创业训练计划重点项目（编号：201410313027Z）；

单核细胞增生李斯特氏菌是一种短小的革兰氏阳性无芽孢杆菌[1]，它能引起人畜的李氏菌的病，该病发病率较低，但致死率高达 20%～30%[2]，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。单核细胞增生李斯特氏菌广泛存在于自然界中，食品中存在的单核细胞增生李斯特氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，因此，在食品卫生微生物检验中，必须加以重视。本文拟对单核细胞增生李斯特氏菌的检测方法及其当前存在的问题等作系统介绍，以期为进一步深入研究提供参考。

1快速检测方法

1.1 显色培养基快速检测方法

显色或荧光鉴别培养基的基本原理是针对李斯特氏菌的β-D-葡萄糖苷酶和毒力因子PI-PLC酶，设计相应的底物，加入到常规选择性培养基中，利用酶对底物的分解，产生荧光或显色物质，使其菌落形态或颜色不同于其他李斯特氏菌和非李斯特氏菌，从而实现对李斯特氏菌快速定性鉴定和菌落数目快速定量。张淑红等[3]检测了显色培养基的特异性和灵敏度。实验证明此种检测方法具有较高灵敏度、特异性和选择性，是非常有价值的分离平板。

1.2 免疫学检测方法

1.2.1 酶联免疫试验检测方法（ELISA）

早期起初人们采用简单直接的细胞计数法进行检测，运用细胞计量术对牛奶中的单核细胞增生李斯特氏菌进行检测。但是由于病原微生物的含量很低，仅通过细胞计数的方法检测灵敏度无法达到。之后，基于抗原抗体的ELISA技术被广泛应用于食品检测中，用酶联荧光的方法检测食品中的单核细胞增生李斯特氏菌。ELISA的方法虽然灵敏度较细胞计数方法有很大的提高，但是由于ELISA检测的结果容易受多种因素影响，并且容易出现假阳性的结果，所以不能满足检测的要求。

1.2.2 结合单克隆抗体技术的免疫学检测方法

针对和学习前人的科学成果，人们在ELISA的基础上结合单克隆抗体技术建立了一种快速检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法[4]。建立了以高度特异的针对单核细胞增生李斯特菌和无害单增生李斯特氏菌的共同表位的单抗构建的快速酶免疫检测方法以及以抗单核细胞增生李斯特氏菌的特异单抗为试剂所建立的快速检测方法[5]。国内焦新安等制备了针对单核细胞增生李斯特菌的特异性单抗并研制了检测该菌的ELISA检测试剂盒，推动了单核细胞增生李斯特氏菌检测方法的发展。

1.3 分子生物学检测方法

1.3.1 反转录-PCR检测方法

在PCR反应中，死细胞的存在使得DNA扩增数要大大降低，从而造成实验结果的假阳性，分辨活细胞和死细胞对避免假阳性至关重要。反转录-PCR把mRNA反转录成cDNA，然后通过特异引物扩增目标cDNA进行PCR，因其具有高度敏感性，被应用于检测具有活性的单核细胞增生李斯特氏菌。采用反转录-PCR的检测结果与一般PCR的检测结果无显著差异，但其反转录-PCR却有效地检测到单核细胞增生李斯特氏菌活菌。李晓红等[6]利用反转录-PCR方法对出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌进行检测，结果通过传统检测方法确证，符合率达到100%，灵敏度高。

1.4 生物芯片

生物芯片是近年来在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术，它主要通过微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、DNA以及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测，使样品检测、分析过程连续化、集成化、微型化。生物芯片能够在短时间内分析大量的生物分子，使人们快速准确地获取样品中的生物信息，它为食源性疾病快速检测提供了良好的发展空间。王刚等正用含有小牛血清BSA（减少对其它菌的非特异性吸收）的SiO2包被的蛋白芯片对C11EG抗体（单核细胞增生李斯特氏菌一种IgG抗体）进行研究[7]。目前，应用于食品中致病菌检测的生物芯片技术还在研究中，但我们相信建立、应用生物芯片技术将成为食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测方法的一个发展方向。

2. 展望

单核细胞增生李斯特氏菌是WHO关注的食源性致病菌之一，也是我国食品污染物监测网中检测的重要食源性致病菌之一。随着多学科的交叉，食源性致病菌的检测一方面向综合的方向发展，即集多种检测技术于一体的多功能、全自动化大型检测仪器不断出现；另一方面，针对单个菌种和菌属的新型培养基、免疫试剂盒和分子试剂盒也会不断推向市场。无论是从哪个角度，未来检测的方向都是向着敏感性高、特异性强、检测时间短的检测方法的方向发展。相信随着对李斯特氏菌的全方位深入了解和认识，更方便快捷的检测工具会不断出现。

参考文献

[1] 吴清平， 李善志， 张菊梅， 等. 单核细胞增生李斯特菌检测技术研究进展[J]. 中国卫生检验杂志， 2005， 15（7）： 888-890.

[2] 沈晓盛， 郑国兴， 李庆， 等. 食品中单核细胞增生李斯特菌的危害及其检测[J]. 食品与发酵工业， 2004， 30（8）： 87-91.

[3] 張淑红， 吴清平， 张菊梅. 显色培养基在单核细胞增生李斯特菌快速检测中的应用研究[J]. 中国卫生检验杂志， 2007， 17（1）： 43-45.

[4] 梁锐萍， 黄素珍， 胡慧强. 单核细胞增生性李斯特氏菌及其检验[J]. 动物科学与动物医学， 2004， 21（11）： 47-49.

[5] 焦新安， 刘秀梵. 李斯特氏菌快速检测研究进展[J]. 肉品卫生， 1996， 11（1）： 28-31.

[6] 李晓红， 蒋琴娣， 吴仲梁， 等. 利用反转录-PCR方法快速检测食品中单增李斯特菌[J]. 检验检疫科学， 2003， 13（6）： 20-22.

成人传染性单核细胞增多症1例 篇7

患者男性, 18岁, 因发现颈部肿块10d, 咽痛7d, 加重伴发热3d入院。患者于入院前10d无意中发现颈部肿块, 无特殊不适症状, 7d前出现咽痛, 吞咽时明显加重, 3d前出现发热, 体温最高达38.6℃, 当地医院予抗炎药物治疗后上述症状缓解不明显, 出现耳痛、闷塞感, 就诊于我院, 查血常规:WBC20×109/L, N80%, L10%;颈部彩超:双侧颈部多发肿大淋巴结。以“急性化脓性扁桃体炎, 颈部多发性淋巴结肿大”收入院。查体:T38.7℃双侧颈部可触及多个肿大淋巴结, 最大约4cm×2cm×1cm, 两耳廓无畸形, 外耳道干燥, 鼓膜边缘及松弛部充血明显, 未见穿孔, 咽后壁充血明显, 双侧软腭及腭舌弓轻度充血, 双侧扁桃体Ⅱ°肿大, 充血明显, 附着脓苔, 不易拭去, 悬雍垂居中。余查体未见明显异常。入院时诊断: (1) 急性化脓性扁桃体炎; (2) 颈部多发性淋巴结肿大; (3) 急性中耳炎。经抗炎、激素等对症治疗2d, 患者体温下降, 诉偶有憋气、咽部阻塞感, 查喉部未见异常, 淋巴结肿大明显, 锁骨上可触及肿大淋巴结。肝功、心肌酶:GPT213U/L, LDH378U/L, AST544U/L。腹部彩超:脾稍大, 复查血浑规:WBC17.17×109/L, N12.9%, L67.4%。入院后3d, 患者临床症状明显减轻, 颈部淋巴结肿大较入院时无明显变化。查异型淋巴细胞>20%;嗜异性凝集试验:1:64 (+) 。修正诊断为传染性单核细胞增多症, 查甲、丙、丁、戊型肝炎抗体 (-) , 巨细胞病毒抗体 (-) 。经抗病毒、保肝、降酶等对症治疗, 患者临床症状消失, 扁桃体查体无充血、脓苔, 淋巴结明显减小, 痊愈出院。

2讨论

人单核细胞 篇8

关键词：牙龈卟啉单胞菌,血管内皮细胞,单核细胞,黏附

牙周炎是成人牙齿早失最主要的原因。牙龈卟啉单胞菌 (Porphyromonas gingivalis, Pg) 的感染与其发病关系密切, 是牙周炎的最主要致病菌之一[1]。

心血管疾病 (cardiovascular disease, CVD) 已成为威胁人类健康的主要杀手。动脉粥样硬化 (atherosclerosis, AS) 作为CVD的共同病理基础, 一直是人们研究CVD发病机制的突破口[2]。血管内皮细胞 (vascular endothelial cells) 黏附功能紊乱导致其与单核细胞发生聚集黏附是AS病变早期的关键性事件之一。尽管AS的许多传统危险因素业已明确, 然而并不能完全解释其发病情况, 应进一步寻找潜在危险因素[3]。

近年来有越来越多的证据表明牙周炎除了造成牙齿的松动脱落, 还是CVD的危险因素之一[4,5], 但具体生物学机制了解甚少。现已明确牙周炎时Pg可入血并侵入到血管壁中直接参与AS的发生发展[6,7,8,9,10,11]。那么Pg感染后是否对VEC与单核细胞的黏附产生影响则尚不清楚。本文通过建立Pg感染人脐静脉内皮细胞 (human umbilical vein endothelial cells, HUVEC) 的体外模型, 研究Pg感染HUVEC后对其与THP-1单核细胞黏附的影响, 为探讨Pg在牙周炎与CVD相关性中可能的生物学作用和机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

脑心浸液 (brain heart infusion, BHI) 培养基 (Bio Merieux, 美国) ;胎牛血清 (Gbico, 美国) ;高糖DMEM培养基和RPMI 1640培养基 (Hyclone, 美国) ;虎红 (Sigma, 美国) ;其他试剂均为国产或进口分析纯。

1.2 主要仪器

超净工作台 (苏州安泰) , 细胞培养瓶和细胞培养板、Crystal Spec比浊仪 (BD, 美国) , 细胞培养箱 (Sanyo, 日本) , 厌氧培养箱 (义乌冷冻机总厂) , HTS7000 Plus多孔板高效分析仪 (PE, 美国) 。

1.3 细菌培养

Pg381和Pg33277菌株由四川大学口腔疾病研究国家重点实验室提供。将脱脂牛奶中冻存的以上菌株接种于BHI血琼脂平板 (含5 ml/100 ml脱纤维羊血、1 mg/100 ml维生素K1和1 mg/100 ml氯化血红素) 于37℃、80%N2、10%H2、10%CO2的专性厌氧条件下复苏和培养。取对数生长期的细菌接种于新鲜BHI液体培养基中培养48 h, 离心 (1 500 g, 5 min) , PBS洗涤2次后以DMEM培养基重新悬浮, Crystal Spec比浊仪调整菌悬液浓度。

1.4 细胞培养

HUVEC细胞株EA.hy926和人单核细胞株THP-1均由四川大学生物治疗国家重点实验室提供。EA.hy926于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中在37℃、5%CO2细胞培养箱中常规培养。THP-1于含10%FBS的RPMI 1640培养基中在37℃、5%CO2细胞培养箱中常规培养。

1.5 虎红染色法直接观察Pg对HUVEC与单核细胞黏附的影响

取生长旺盛的HUVEC制备细胞悬液 (2×108个/L) 按0.1 ml接种于96孔板, 待细胞汇合后以PBS洗涤2次, 分为实验组和对照组, 实验组分别加入浓度为2×1010CFU/L的Pg381和Pg33277菌悬液0.1 ml, 对照组加入空白细胞培养基0.1 ml, 孵育1.5 h后弃上清, PBS洗脱未黏附的细菌, 加入空白细胞培养基继续培养4.5 h和22.5 h, 当总的培养时间分别达到6 h和24 h时, 弃上清, 再次分为加THP-1细胞组与加空白RPMI 1640培养基组:加THP-1细胞组每孔加入THP-1细胞悬液0.2 ml (1×109个/L) , 孵育40 min后轻轻吸弃未黏附的细胞, 并用PBS洗涤3次, 每孔加入0.25%虎红溶液0.1 ml, 室温放置5 min, 吸弃游离虎红, 再以PBS洗涤3次后每孔加入50%乙醇溶液0.2ml, 室温放置1 h使单核细胞所吸收的虎红染料充分释放, 多孔板高效分析仪测定各孔A570nm值, 各实验组单核细胞黏附量相对值=A实验组- (A空白对照加THP-1组-A空白对照未加THP-1组) -A实验组未加THP-1组。实验采用复孔设计, 重复3次。

1.6 统计学分析

应用SPSS 13.0软件完成统计学处理。所有数据均代表3次实验的结果, 以±s表示。多个样本的比较采用单因素方差分析, P<0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞的培养

EA.hy926细胞每3~4 d传代1次, 细胞生长状态好, 可见突起、伪足, 呈铺路石样分布 (图1A) 。单核细胞呈圆球形悬浮状生长 (图1B) 。

2.2 Pg感染后HUVEC与单核细胞黏附的影响

6 h时Pg381感染组的THP-1细胞黏附量相对值为0.210±0.025, 高于Pg33277感染组 (0.078±0.024, P<0.05) 和空白对照组 (0.062±0.022, P<0.05) , Pg33277侵入组较阴性对照组略高, 但差异无统计学意义 (P=0.183) ;24 h时Pg381感染组、Pg33277感染组和空白对照组的THP-1细胞黏附量相对值分别为0.075±0.017、0.073±0.017和0.062±0.022, 3组间无显著差异 (P=0.309) 。表明Pg381侵入HUVEC后显著地增强其黏附功能, 促进其与THP-1细胞的黏附, 但Pg33277此作用则不明显 (图2) 。

3讨论

尽管CVD的许多传统危险因素, 如高胆固醇血症、高血压和肥胖等业已明确, 但这只能解释50%~75%的CVD发病原因, 仍有25%~50%CVD的发病原因不明[3]。近年来, 越来越多的证据表明牙周炎与CVD密切相关, 是其独立危险因素之一。本课题组[4]、Nesse等[5]经过大样本的追踪调查, 在校正了各种偏倚后发现牙周炎患者冠心病的发病率显著升高, 牙周炎与冠心病之间呈现中等强度的相关。这一结论也得到了众多临床干预研究的证实[12,13,14]。

目前研究已提示, 牙周炎时原本定植于人类口腔的Pg可通过牙周袋软组织壁溃疡面入血而直接侵入血管壁, 参与AS的发生发展。Marcelino[6]、Figuero[7]、Toyofuku[8]和Nakano等[9]在CVD患者的AS斑块中检出Pg DNA, 检出率从26%到100%不等。Li[10]和Pereira[11]证实Pg感染均可加速AS动物模型-Apo E基因敲除小鼠主动脉的AS病变发展, 且在其主动脉AS斑块内均有Pg DNA检出。在另外的前瞻性研究中还发现循环血液中Pg抗体水平与未来发生CVD的风险呈正相关[15]。此外本人前期研究已证实, Pg具有较强黏附和侵入HUVEC的能力[16]。

CVD的共同病理基础-AS的发病机制极其复杂, 现已证明循环血液中的单核细胞黏附聚集于VEC表面, 并迁入动脉内膜下吞噬脂质而成为泡沫细胞, 最终导致AS的形成。其中, 血管内皮细胞黏附功能的紊乱导致单核细胞与其发生黏附在AS早期病变中发挥重要作用, 有众多黏附分子参与介导VEC与单核细胞的黏附[3]。此前Hirose[17]研究发现Pg381菌毛蛋白促进HUVEC与人单核细胞株U937的黏附, 较空白对照组增加约3倍。然而目前对于Pg感染血管内皮细胞后对其黏附功能是否产生影响则仍不甚清楚。

本文采用了虎红染色法进行研究。虎红染色法是Gamble根据白细胞对虎红染料的吸收特性而建立的一种用于定量测定内皮细胞与单核细胞黏附的方法[18]。由于虎红可被单核细胞吸收, 且不受其活化与否的影响, 而VEC对虎红的吸收则很少。用虎红溶液与单核细胞孵育一定时间后用乙醇溶液将单核细胞所吸收的虎红释放出来, 通过测定溶液的A值, 即可间接反映所黏附单核细胞的数量。

本研究发现Pg381与HUVEC共孵育6 h后, 能够显著增强HUVEC与单核细胞的黏附, 较空白对照组增加了约2.4倍, 而Pg33277的作用则很微弱。镜下观察也进一步证实:Pg381感染组较空白对照组的THP-1细胞黏附明显增加, 而Pg33277感染组则与空白对照组类似。

本研究还发现, 不同的Pg菌株诱导HUVEC黏附功能变化的能力不同, Pg381较Pg33277显著促进HUVEC与单核细胞的黏附。虽然本人的前期研究已证实Pg33277可以侵入HUVEC, 然而并未对HUVEC的黏附功能产生影响。提示Pg感染上调血管内皮细胞黏附功能的能力与Pg的菌株和毒力有关。Gibson[19]的研究也得出类似的结论:通过口腔将Pg菌毛缺陷株DPG接种于apo E基因敲除小鼠, 发现DPG能侵入小鼠主动脉壁, 但其主动脉AS病变程度与空白对照组间无差异。

隐匿性传染性单核细胞增多症一例 篇9

资料:患者男, 71岁。在就诊前两天因进食油腻食物后出现右上腹疼痛不适, 为持续性胀痛。并伴发向右肩胛部放射, 偶有恶心、呕吐, 呕吐物为胃内容物、量少。在个体诊所给予输液治疗 (用药及剂量不详) , 疗效不佳。来我院就诊, 经B超检查提示:“胆囊炎伴结石”。于2011年12月6日以“胆囊炎伴结石”入院。体检:体温37C。血压140/90mm Hg。心率88/min。皮肤巩膜无黄染苍白, 浅表淋巴结无肿大, 自述高血压史30余年。备行胆囊切除术, 于当日查血常规:WBC42.8×109/L, 淋巴细胞0.754, 中间细胞0.019, 中性粒细胞0.227, RBC:4.0×1012/L, Hb:134g/L, PLT:111×109/L。12月8日复查血常规:白细胞36.3×109/L淋巴细胞0.72, 中间细胞0.036, 中性粒细胞0.244, 红细胞3.76×1012/L, 血红蛋白124g/L, 血小板110×109/L。外周血涂片:中性粒细胞0.22。淋巴细胞0.73。单核细胞0.05, 未见幼淋巴细胞。另一份送武威市人民医院血液科的骨髓涂片结果为:淋巴细胞0.57, 异淋0.055。经对胆囊对症消失治疗一周后, 再无不适。于12月13日出院。经定期随访获悉:12月18日在其他医院查血常规:白细胞3 3.5×1 09/L, 淋巴细胞0.683, 嗜异性凝集实验阴性, EBV抗体阳性。12月29日血常规结果:白细胞30.7×109L, 淋巴细胞0.625, 其它无变化。2012年1月22日再次查血常规, 白细胞22.3×109/L, 淋巴细胞0.477, 其它无变化。以后在2012年2月14日、6月15日、9月28日共查三次血常规, 所有指标均正常, 身体无任何不适。

讨论:传染性单核细胞增多症是EB病毒感染机体后, 病毒在淋巴组织内复制而导致淋巴细胞大量增殖, 使多部位淋巴结肿大, 临床表现多样化, 属自限性疾病, 好发于儿童及青少年, 35岁以上患者少见。该患者综合临床症状、体征、血常规、骨髓涂片、EBV抗体检查结果以及10个月的跟踪随访, 可排除血液系统疾病, 并确诊为传染性单核细胞增多症。但该病例有以下特征: (1) 患者年龄大, 属实罕见。 (2) 无发热、类似感冒、全身不适等症状。 (3) 多次多部位触摸浅表淋巴结始终不肿大。 (4) 淋巴细胞比例增高持续时间长, 达两个多月。 (5) 异型淋巴细胞小于10%。见于以上特征, 我们认为是隐匿性的感染, 其原因可能与患者年龄大, 对该病毒感染后的反应能力差相关, 出现与常见的传染性单核细胞增多症有许多不同之处。提示此类病例应与慢性淋巴细胞白血病的前期和其他病毒感染诱导的淋巴细胞增高相鉴别。

脑脊液单核细胞P38表达及意义 篇10

1 资料与方法

1.1 一般资料

把研究对象分为癫痫组和对照组, 癫痫组我院门诊就诊的癫痫患者, 参照国际抗癫痫联盟癫痫分类及命名委员会修改方案诊断标准[2]分类。共测查癫痫患者30例, 其中男20例, 女10例, 年龄15~65岁, 平均年龄 (35.5±6.1) 岁;起病年龄6~35岁。平均起病年龄 (21.9±9.7) 岁;对照组:与癫痫组患者各个情况均相匹配且无其他神经精神史的健康志愿者15名。

1.2 脑脊液收集

收集初发病历30志愿患者, 初发癫痫后1 h、24 h、7 d、30 d、90 d、180 d分别收集5 m L脑脊液, 勿污染及混入血液等。过液氮后转入-80℃超低温冰箱保存。

1.3 Western印迹检测P38蛋白表达

用蛋白提取试剂盒 (南京凯基公司) 提取总蛋白, 定量试剂盒 (BCA法) 测定蛋白浓度。依次加入5×上样缓冲液煮沸、上样、电泳、转膜、封闭, 滴加兔抗P38 (比例1:100) , 滴加生物素标记的二抗 (比例1:800) , 4℃摇晃3 h, PBST洗膜10 min×3次后行ECL发光5 min, 应用胶片曝光, 结果扫入凝胶成像系统 (bandscan软件分析系统) 进行灰度分析。

1.4 统计学方法

结果采用SPSS13.0统计软件进行统计学处理, 认知功能测验成绩用±s表示, 组间比较采用独立样本检验。利用多元线性回归分析多个自变量对于正态分布的变量的相关性。P<0.01为差异具有统计学意义。P38分子生物学实验数据采用单因素因素方差分析, 组间比较用LSD-t检验。

2 结果

Westernn blot印迹检测结果:各个试验组脑脊液单核细胞中P38蛋白均有表达, 表达有明显差异性 (P<0.01) 。癫痫组在癫痫初期 (30 d) 明显高于对照组, 后期 (60d) 明显低于对照组。癫痫组内组内比较, 蛋白灰度校对值癫痫发作7 d时明显高于1 h、24 h、7 d、30 d、90 d、180 d组, 180 d组最低 (P<0.01) 。

注:组内比较P<0.001

3 讨论

癫痫是神经科常见的一种慢性病。反复的癫痫发作给患者的身心健康造成严重损害, 脑功能受损尤为受到密切关注, 表现在认知功能障碍等方面[3]。已有研究表明癫痫患者认知功能较正常人明显下降。而影响认知功能是多因素综合作用的结果, 起病年龄、发作类型、受教育程度、用药情况、发作频次密切相关, 且起病年龄、发作频次及受教育程度最为显著。药物不规律使用可以导致耐药或癫痫本身不能控制, 长期规律用药, 其药物本身对患者认知功能也是一种重要的损害。在癫痫患者中, 大部分患者的认知功能损害是缓慢进行的, 最后可发展为不可逆的认知功能障碍。

突触素P38存在于所有神经终末的突触囊泡膜上及脑脊液单核细胞内, 单核细胞中P38被分泌至脑脊液从而进入循环, 与突触可塑性密切相关, 与突出重构及调节长时程增强密切相关[4]。本研究显示, P38在癫痫发病早期, 呈逐渐升高, 30 d前均高于正常健康对照组, 30 d为最高。多次癫痫发作所, 异常放电激活MAPK激活系统, 使P38表达逐渐增加, 促进癫痫发作所引起脑生理生化损伤的修复及促进新的突触形成, 及突触重建修复, 维持认知功能功能, 后由于P38调节长时程增强及突触可塑性, 启动损伤保护过程。所以认知功能与对照组无明显变化。而长期的癫痫发作, 引起脑部自我功能的失调和破坏, 打破这种平衡, 认知功能即会下降, 微观上P38也可引起多种基因的表达, 引起认知功能神经元的调亡, 即认知功能受损[5]。

综上所述, 本研究表明癫痫患者认知功能受损, 而P38脑脊液单核细胞中的蛋白变化随着认知功能变化而变化, 是有关认知功能的重要因子, 但机制复杂, 尚不明确, 有待进一步探索。

摘要：目的 检测脑脊液P38的表达, 探讨其意义。方法 30例癫痫首次发作患者发作后1 h, 24 h, 7 d, 30 d, 90 d, 180 d脑脊液及外伤后复查脑脊液正常者脑脊液为对照组, 用Western bolt检测脑脊液单核细胞P38蛋白表达变化。结果 脑脊液中P38表达在各个时间段表达与对照组相比明显变化 (P<0.05) 。结论 P38与癫痫患者认知功能变化密切相关, 是认知功能维持的重要因子。

关键词：癫痫,认知功能,P38,脑脊液

参考文献

[1]谷鸣, 钱元桂.61例癫痫患者认知功能及其影响因素分析[J].安徽医药, 2009, 13 (3) :290-292.

[2]Proposal for revised clinical and electroencephalographic classification of epileptic seizures.From the Commission on Classification and Terminology of the International League Against Epilepsy[J].Epilepsia.1981, 22 (4) :489-501.

[3]Noe KH, Locke DE, Sirven JI.Treatment of depression in patients with epilepsy[J].Curr Treat Options Neurol.2011, 13 (4) :371-379.

[4]Bonora A, Benuzzi F, Monti G, et al.Recognition of emotions from faces and voices in medial temporal lobe epilepsy[J].Epilepsy Behav.2011, 20 (4) :648-654.

人单核细胞 篇11

关键词 单核细胞趋化蛋白1 牙髓炎 免疫组化

资料与方法

检测标本来自长春市口腔医院2004年3～9月口腔内科门诊患者，急、慢性牙髓炎各20例，健康牙髓20例（烤瓷牙需要拔髓者），患者年龄18～50岁,所有患者2个月内无服用免疫抑制剂及抗菌药物史,均未做过牙髓治疗。

标本处理：标本用10%中性福尔马林浸泡，常规脱水，石蜡包埋，制备4～5μm厚切片，分别作HE染色和免疫组化染色。HE染色结果作为病理学分组标准，进一步区分各组标本。

主要试剂、仪器：MCP-1单克隆抗体（TBD公司），SABC显色试剂盒（武汉博士德公司），S-P超敏试剂盒（迈新生物）。

免疫组化染色步骤：石蜡切片常规脱蜡水化，PBS冲洗3分钟×3次，高温加热修复抗原（加热至95℃关火，室温放置自然冷却，蒸馏水冲洗3次，PBS浸泡5分钟）；PBS冲洗3分钟×3次；滴加过氧化酶阻断溶液（试剂A）室温下孵育15分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性；PBS冲洗3分钟×3次；滴加正常非免疫动物血清（试剂B），室温下孵育10分钟；除去血清，滴加第一抗体（稀释浓度1∶[KG-*2]50），4℃过夜。PBS冲洗3分钟×3次；滴加生物素标记的第二抗体（试剂C），室温孵育10分钟，PBS冲洗3分钟×3次；滴加链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液（试剂D），室温孵育10分钟，PBS冲洗3分钟×3次；DAB显色，自来水冲洗，苏木素复染，梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。阴性对照采用PBS代替一抗,其余步骤相同。

结果

免疫染色结果显示，在健康牙髓组织中未见明显的MCP-1表达阳性细胞，在急慢性牙髓组织中MCP-1有不同程度的阳性表达，阳性染色细胞数量不均，阳性染色程度不一致，阳性表达为分布于细胞浆呈棕黄色的颗粒状物。表达MCP-1的细胞主要是单核/巨噬细胞和血管内皮细胞,中性粒细胞，成纤维细胞。在慢性炎症牙髓组织中还可观察到新生的毛细血管上有MCP-1表达阳性细胞。急、慢性组阳性表达无统计学差异。

讨论

MCP-1在炎症性疾病中的作用：大量的炎性疾病中都发现了MCP-1的存在,与单核/巨噬细胞免疫作用有关的疾病大多有MCP-1的参与。

首先，MCP-1对单核/巨噬细胞具有激活和趋化的双重作用。实验证明MCP-1促使嗜碱性粒细胞释放组胺的速度相当快，能在1小时内达到最高水平。MCP-1在炎症反应时与单核/巨噬细胞、淋巴细胞、嗜碱性粒细胞的激活有关联，在免疫应答中起重要作用，具有促炎的作用。

其次，由于MCP-1的缺失可以导致IL-4、IL-5、IL-10分泌受抑制，从而导致Th2型免疫反应受抑制，MCP-1在Th2型细胞因子的定位方面具有重要作用，促进巨噬细胞选择性激活途径的抗炎过程，是Th2型免疫应答必不可少的重要因素［1］。而正是Th1细胞向Th2细胞的不断转化导致巨噬细胞选择性激活，抑制经典激活的巨噬细胞的抗原提呈作用和促炎因子的分泌，并通过分泌血管生成因子和成纤维因子促进组织的愈合，从而避免炎症反应过度对组织造成的损害。这证明MCP-1还有抗炎的作用。

MCP-1在炎症牙髓中表达的意义：在本实验中观察到，急、慢性牙髓炎症组织中存在MCP-1阳性表达，正常牙髓组织中没有表达，这证明MCP-1作为一种诱导性表达趋化因子，在牙髓炎中存在的内毒素、细菌释放的各种酶、代谢产物、炎症介质及其他损伤因子的刺激和诱导下上调表达，参与了牙髓炎症反应。由于 MCP-1对单核/巨噬细胞的强烈趋化作用，MCP-1在炎症牙髓中的表达为炎症区单核/巨噬细胞的存在提供了机制性解释，同时趋化的单核/巨噬细胞再度表达MCP-1能够再趋化和激活更多的单核/巨噬细胞到炎症部位，在炎症反应中起到一种级联放大的作用。实验中观察到，慢性牙髓炎组织中MCP-1的表达比急性组略有增高，同时慢性组的单核/巨噬细胞数量也比急性组高，这说明MCP-1是单核/巨噬细胞持续趋化的主要动力。

在慢性炎症组织中观察到，除一些炎症细胞表达MCP-1外，血管内皮细胞和成纤维细胞也表达MCP-1，并且在新生的毛细血管上有MCP-1阳性表达，这说明MCP-1参与了慢性炎症的恢复过程。MCP-1在血管内皮细胞中的表达，提示MCP-1有助于单核细胞穿越血管内皮细胞，到达炎症部位。MCP-1可以调节单核细胞表面特异性黏附分子CD11c、CD11b的表达，激活血管内皮细胞黏附分子的表达，导致单核细胞与内皮细胞紧密接触，最终穿透血管壁进入组织到炎症部位。

在部分炎症组织中，我们观察到中性粒细胞有阳性表达，这与以往报道不同。Johnston B［2］等在观察小鼠慢性脉管炎模型时也发现，在由MCP-1引起的募集的白细胞中，不是单核细胞而是中性粒细胞占大多数。流式细胞分析显示，CC趋化因子受体CCR1、CCR2在小鼠慢性诱导脉管炎炎症部位聚集的中性粒细胞上有异常表达。Raffaella［3］等也有类似的发现。这些实验都从不同的角度提示，在炎症的具体条件下，趋化因子受体的表达可能发生调整，而趋化因子（包括MCP-1）主要通过与相应的受体高亲和结合发挥生物学功效。因此对趋化因子受体的进一步研究将有助于进一步解释炎症条件下各趋化因子的“行为”，也可以为临床治疗提供新的思路。

目前，在各種炎性疾病的治疗领域针对MCP-1的治疗方法越来越多，其中肌肉注射含有MCP-1拮抗剂7ND基因的质粒抑制动脉粥样斑块的形成，正处于临床应用阶段，试验证明是安全的，有望成为比药物治疗更有效的治疗方法。可以预见，通过对给药方式、给药途径的改进，针对MCP-1的治疗将为恢复牙髓炎症提供新的途径。

参考文献

1 WimNo?l Infection Stage-Dependent Modulation of Macrophage Activation in Trypanosoma congolense-Resistant and -Susceptible MiceInfect Immun，2002，70(11)：6180-6187.

2 Brent Johnston.Chronic inflammation upregulates chemokine receptors and induces neutrophil migration to monocyte chemoattractant protein-1.J Clin Invest，1999，103(9)：1269-1276.

人单核细胞 篇12

1 资料与方法

1.1 一般资料

2009年1月—2010年6月我院共收治IM患儿63例, 其中男39例, 女24例, 男∶女为1.6∶1;发病年龄:9个月~1岁5例 (8%) , 1岁~3岁10例 (16%) , 3岁~7岁36例 (57%) , >7岁12例 (19%) , 年龄最小9个月, 最大10岁。

1.2 诊断标准

具备典型的临床表现:发热、咽痛、肝脾及淋巴结肿大, 外周血异型淋巴细胞>10%, EBV特异性抗体Ig M、Ig G检测阳性, 血嗜异凝集反应阳性[2]。

1.3 临床表现

本病临床表现多样。本组63例中发热57例 (90.4%) , 热程2 d~13 d;体温最高达40.6℃, 热型不规则。有咽峡炎60例 (95%) , 表现为咽部充血, 扁桃体Ⅰ~Ⅱ度肿大, 有疱疹12例, 出血点者5例, 扁桃体上可见灰白色分泌物者32例。63例 (100%) 颈部淋巴结肿大, 表现为单个或成串淋巴结肿大, 局部不红, 直径1.0 cm~3.0 cm, 47例在颌下或腹股沟可及肿大淋巴结。肝脾肿大30例 (47%) , 肝大小在右肋下2 cm~4.5 cm, 质软至质中等, 无1例发生黄疸;脾肿大在腋前线上肋下刚触及至肋下5.0 cm, 质软至质中等;1例腹部膨隆, 移动性浊音阳性。皮疹18例 (29%) , 婴幼儿多见, 皮疹多为红色斑丘疹, 分布于全身, 疹间皮肤正常, 不搔抓;1例类似猩红热样皮疹, 皮疹多发在发病2 d~4 d, 均在1周内消退。眼睑水肿7例 (11%) 。合并肺炎14例 (22%) , 心肌损害32例 (50.8%) , 腹泻16例 (25%) 。1例就诊太晚合并弥散性血管内凝血 (D IC) 死亡。

1.4 实验室检查

血常规:白细胞3.4×109/L~20.1×109/L, 其中<4.0×109/L 6例, 4.0×109/L~10.0×109/L 15例, >10×109/L 42例。血涂片细胞学检查:淋巴细胞0.42~0.84, 异型淋巴细胞均>0.10, 最高达0.65.血红蛋白<110 g/L 12例, 血小板<100×109/L 7例。C反应蛋白增高28例, 多为轻度增高, 最高达57 m g/L.红细胞沉降率增高32例, 最高达51 m m/1h.凝血五项检查8例, 2例异常。

1.5 血清学检查

63例患儿有56例用酶联免疫吸附法测EBV衣壳抗原抗体Ig M, 其中36例阳性 (70%) 。嗜异性抗体 (玻片凝集法) 检测16例, 阳性3例。

1.6 肝功能检查

肝功能异常23例, 丙氨酸转氨酶41~451 U/L、天冬氨酸转氨酶41~447 U/L, 总胆红素增高 (22~33.4μm ol/L) 19例, 白蛋白降低2例, 总胆汁酸增高 (11~46.32μm ol/L) 12例。心肌酶检查:异常28例, 乳酸脱氢酶352~698 U/L, 肌酸激酶259~3 172 U/L, 肌酸激酶同工酶26~136 U/L, α-羟丁酸脱氢酶210~531 U/L.30例受检者肾功能正常, 63例行尿常规检查, 无蛋白尿、血尿。血脂测定30例, 2例甘油三酯增高, 分别为3.1 m m ol/L和3.3 m m ol/L.

1.7 骨髓象检查

检查5例, 均为感染性骨髓象, 其中1例骨髓内异型淋巴细胞0.54.

1.8 影像学检查

胸部X线检查52例, 肺炎改变14例。B超检查35例, 5例可见胆囊壁呈双环状, 提示胆囊壁增厚。5例胸腔积液, 多为单侧, 6例腹水。

1.9 治疗方法

所有患者均给予阿昔洛韦或更昔洛韦10 m g/ (kg·d) , q 12 h静脉滴注。病情较重, 合并脏器损害者加用干扰素30万~100万U/d肌注, 共3 d~5 d, 或丙种球蛋白400 m g/ (kg·d) 静脉滴注, 连用3 d~5 d.合并细菌感染者加用抗生素, 合并肝脏、心肌损害, 予保肝、营养心肌治疗。

2 结果

1例患儿因就诊太晚, 入院时已出现出血, 合并D IC死亡, 其余病例均临床治愈。

3 讨论

传染性单核细胞增多症是由EB病毒感染引起的全身感染性疾病, 可累及全身多个系统, 包括肝、脾、淋巴结、心脏、肺、肾脏, 但以网状内皮系统为主。临床表现多变, 病情轻重不一, 可出现典型的IM或其他复杂的临床表现。病程常具有自限性, 预后良好。但儿童期还有两种较为严重的EBV感染性疾病, 即EBV相关嗜血淋巴组织细胞增生症 (Epstein-Barrvirus-related hem ophagocytic lym phohistiocytosis syndrom e, EBV-H LH) 、慢性活动性EBV感染 (chronic active Epstein-Barr virus infection, CA EBV) , 此两种疾病预后不良[3], 需引起临床医生的高度重视。EBV感染与社会经济状况密切相关, 发达国家IM多见于青少年, 发展中国家IM发病高峰在2岁~6岁, 本组患儿1岁~7岁发病46例, 占73%, 3岁~7岁36例, 占57%, 这可能与该年龄段儿童免疫功能较低, 在家庭、幼儿园、学校中通过唾液飞沫更易感染有关。

IM首发症状不一, 对不典型病例很容易误诊、漏诊。发热、扁桃体有白色分泌物, 易误诊为化脓性扁桃体炎;仅有颈淋巴结肿大易诊为淋巴结炎;发热、咽红、皮疹者易误诊为病毒感染。通常EB病毒感染后3 d才出现异型淋巴细胞, 第1周逐渐增多。因此, 对疑似IM的患儿必须反复多次检查外周血异型淋巴细胞, 不能单靠一次检查而否定诊断。值得注意的是异型淋巴细胞在其他病毒感染及肺炎支原体感染也可增高, 需结合临床综合分析。

本组病例中肝脏损害23例, 主要以肝酶增高为主, 部分患儿总胆汁酸、总胆红素增高, 白蛋白降低。因此, 肝功能异常也是本病的重要表现。经保肝、降酶治疗, 10 d~14 d恢复正常, 这可能与肝脏病理改变较轻, 仅表现为肝门区渗出, 大量单核细胞浸润, 胆管轻度肿胀, 而少有肝实质坏死有关。本组患儿5例出现胆囊壁水肿增厚, 可能系肝功能损害后门静脉周围淋巴结肿胀, 淋巴回流障碍或EB病毒直接侵犯胆囊壁所致[4]。

本组患儿有外周血两系同时减少者3例, 甘油三酯增高2例, 5例可见胆囊壁呈双环状、壁厚。5例胸腔积液, 6例腹水, 提示要警惕EBV-H LH、CA EBV的存在。要重视对重症患者的治疗。

机体免疫系统对EB病毒感染的控制作用, 主要通过细胞免疫来实现, B淋巴细胞是EB病毒原发感染的靶细胞, 当B淋巴细胞受到EB病毒攻击后发生抗原性改变, 引起T细胞的强烈免疫应答而转化为细胞毒性T细胞 (主要是CD8+T细胞、Tc细胞) , Tc细胞在免疫病理损伤形成中起着非常重要的作用。它一方面杀伤感染EB病毒的B细胞, 另一方面侵犯许多组织器官而产生一系列临床表现。故在临床上应用免疫调节剂干扰素, 对清除EB病毒及EB病毒感染的细胞, 免疫球蛋白中和细胞外病毒, 加快疾病恢复具有一定作用。

本组患儿除1例就诊太晚, 合并D IC死亡外, 其余患儿经综合治疗均临床治愈, 但要警惕EBV-H LH、CA EBV的存在。

参考文献

[1]肖智辉, 文飞球.病毒相关性肿瘤疾病[J].中国小儿急救医学, 2010, 17 (2) :113.

[2]沈晓明, 王卫平.儿科学[M].第7版.北京:人民卫生出版社, 2007:198.

[3]申昆玲.加强儿童EB病毒感染疾病的相关研究[J].中国实用儿科杂志, 2010, 25 (8) :577.