人卵巢癌细胞株

2024-09-01

人卵巢癌细胞株（精选7篇）

人卵巢癌细胞株篇1

卵巢癌是一种常见的妇科恶性肿瘤,严重威胁着妇女生命[1]。临床上常用顺铂治疗卵巢癌,反应率可达70%~80%[2,3]。然而,大多数开始对顺铂敏感的卵巢癌患者服药不久后便出现了复发、耐药[4],严重限制了顺铂的应用。研究表明[5,6],自噬与癌症的发生、发展密切相关,调节自噬可以克服包括顺铂耐药的肿瘤的化疗耐药。最近研究表明[7],顺铂激活细胞自噬通路,这种作用可以抵消顺铂诱导的肿瘤细胞死亡。自噬激活导致肺癌对顺铂耐药已经得到证实[8,9],然而自噬在肿瘤治疗中的准确作用与组织类型和化疗药物类型有关[10,11],自噬与顺铂治疗卵巢癌及其对顺铂耐药的关系尚不明确,因此有必要针对卵巢癌寻找特殊的自噬调控方法。本实验拟考察顺铂对人卵巢癌细胞A2780及其顺铂耐药株A2780/DDP的自噬和凋亡作用,并借助自噬抑制剂研究细胞自噬与卵巢癌细胞对顺铂耐药的关系,为自噬作为克服顺铂耐药性的新靶点添加新的依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

实验所用人卵巢癌细胞顺铂敏感株A2780及顺铂耐药株A2780/DDP购于中科院上海细胞库。顺铂(10 mg,齐鲁制药厂);噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、巴弗洛霉素A1(Baf A1)、3-甲基腺嘌呤(3-MA)均购自Sigma公司;RPMI1640培养基购自Gibco公司;胎牛血清购自北京四季青生物科技有限责任公司。单克隆抗体(PARP、LC3)购自美国Cell Signaling公司;单克隆抗体β-actin、羊抗兔Ig G-HRP标记二抗购自武汉博士德生物工程有限公司。CO2培养箱(3110水套系列,美国,Thermo Scientific公司),多功能酶标仪(Infinite誖F500,瑞士,Tecan公司),垂直电泳系统(Powerpac通用,美国,Bio-Rad公司),电转膜系统(170-4070,美国,Bio-Rad公司),透射电子显微镜(JEM-1230,日本,日本电子株式会社),Odyssey红外成像系统(Odyssey誖CLx,美国,LI-COR公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组

人卵巢癌A2780细胞株和A2780/DDP细胞株均用含10%胎牛血清的RP-MI1640培养基在37℃、5%CO2恒温细胞培养箱中培养。为维持A2780/DDP细胞株的耐药性,细胞传代时采用含顺铂的培养基[顺铂浓度1μg/m L)培养。光学显微镜下观察细胞生长状况,每2~3天换液1次,待细胞贴壁70%~80%时,进行传代。设空白对照组(0μg/m L)和药物组[顺铂(5μg/m L),3-MA(1 mmol/L),3-MA(1 mmol/L)&顺铂(5μg/m L),Baf A1(2 nmol/L),Baf A1(2 nmol/L)&顺铂(5μg/m L)]。

1.2.2 MTT法检测顺铂作用下卵巢癌细胞的增殖率

取对数生长期细胞A2780和A2780/DDP分别接种于96孔板中(8×103/孔),次日待贴壁后加入不同浓度的顺铂培养液(0、1、2、4、8、16μg/m L)。作用48 h后,弃去上清液,每孔加入20μL MTT(5 mg/m L),37℃、5%CO2恒温细胞培养箱中继续培养4 h后弃上清液。每孔加入150μL DMSO,振摇10 min后将96孔板置于Infinite誖F500多功能酶标仪中于490 nm处测定各孔光密度值,并根据公式计算顺铂作用下的细胞相对增殖率:细胞相对增殖率=(OD加药组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)×100%。

1.2.3 透射电镜检测顺铂诱导的细胞自噬

JEM-1230透射电镜观测自噬小体形成是细胞发生自噬的金标准。取对数生长期的细胞A2780和A2780/DDP,常规消化离心,传代(细胞密度为1×107/瓶)。细胞贴壁后,弃去培养液,然后换为含5μg/m L顺铂的培养液,于37℃、5%CO2孵箱中培养,培养24 h后,常规消化,1500 r/min离心15 min,收集细胞沉淀,弃上清,加入2%戊二醛固定,0~4℃下固定过夜。送样检测。

1.2.4 Western blot法检测顺铂诱导的自噬蛋白与凋亡蛋白的表达

收集各组细胞,离心弃去上清液,加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液100μL,冰上裂解后于4℃,12 000 r/min离心20 min。配制不同浓度的BSA标准液绘制蛋白标准曲线,并对蛋白样品进行定量。采用12%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行蛋白分离,通过湿法转膜将蛋白转移至NC膜上,5%去脂奶粉室温封闭1 h,加入TBST润洗3次,加入一抗(LC3,PARP)4℃过夜后,TBST润洗3次后加入二抗(1︰20 000),室温下振摇孵育1 h,TBST润洗3次后,Odyssey誖CLx扫膜仪扫膜。以β-actin为内参,计算各蛋白的相对含量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析,计量资料数据多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 顺铂对人卵巢癌细胞A2780及其耐药株A2780/DDP增殖的作用

顺铂抑制人卵巢癌细胞A2780及其耐药株A2780/DDP增殖,且这种抑制作用具有浓度依赖性。根据Graph Pad Prism 5软件计算不同浓度顺铂(0~16μg/m L)作用人卵巢癌细胞(A2780和A2780/DDP)48 h的半数抑制浓度(IC50)。顺铂敏感细胞株A2780的IC50A2780=2.52μg/m L,顺铂耐药细胞株A2780/DDP的IC50 A2780/DDP=13.61μg/m L,故顺铂耐药细胞相对敏感细胞的耐药系数RI=IC50 A2780/DDP/IC50 A2780=5.4,提示A2780/DDP较A2780对顺铂不敏感。见图1。

2.2 顺铂诱导人卵巢癌细胞A2780及其耐药株A2780/DDP自噬

5μg/m L顺铂作用人卵巢癌细胞A2780及其耐药株A2780/DDP 24 h后,通过透射电镜观察分析,人卵巢癌细胞A2780及其耐药株A2780/DDP中均出现自噬小体,但是在耐药株A2780/DDP中的自噬小体数目明显多于敏感株A2780,且在空白对照中发现,顺铂耐药株A2780/DDP中的自噬小体数目远多于A2780空白对照中的自噬小体数目(图2A)。Western blot实验结果显示,顺铂作用细胞后,敏感株A2780和耐药株A2780/DDP中LC3-Ⅱ水平均升高,且相对敏感株A2780,耐药株A2780/DDP中LC3-Ⅱ呈现高表达(图2B)。进一步提示卵巢癌细胞的耐药可能与细胞自噬有关。

A:透射电镜检测自噬体生成,其中箭头表示细胞中的自噬小体;B:Western blot检测自噬蛋白LC3-Ⅱ的表达

2.3 自噬抑制剂对顺铂诱导自噬蛋白LC3-Ⅱ表达的影响

为明确顺铂对耐药株A2780/DDP中自噬的诱导作用,应用溶酶体抑制剂Baf A1,阻断自噬体和溶酶体的结合,通过Western blot法检测LC3-Ⅱ的水平,分析A2780/DDP中的自噬流。Western blot结果显示,Baf A1处理A2780/DDP后,经顺铂处理的较未经顺铂处理的A2780/DDP中LC3-Ⅱ表达明显增加(P<0.01)(图3A),提示顺铂可以诱导A2780/DDP中自噬体的形成。为进一步验证顺铂诱导的自噬是否可以被自噬抑制剂3-MA阻断,实验尝试顺铂(5μg/m L)作用人卵巢癌顺铂敏感细胞A2780 24 h,比较同时加入3-MA(1 mmol/L)或不加3-MA,细胞中LC3-Ⅱ水平的变化。Western blot结果显示,顺铂与3-MA同时作用卵巢癌细胞株后,细胞中LC3-Ⅱ水平大大降低(P<0.01)(图3B),提示3-MA可以抑制顺铂诱导的卵巢癌细胞中的自噬。

A:Baf A1(2 nmol/L);B:3-MA(1 mmol/L);**P<0.01

2.4 自噬抑制剂对顺铂诱导A2780和A2780/DDP中凋亡蛋白Cleaved-PARP表达的影响及3-MA和顺铂对A2780/DDP增殖的影响

顺铂诱导人卵巢癌细胞敏感株A2780凋亡,3-MA同时作用时,其对耐药株A2780/DDP的凋亡诱导能力明显增加,同时使A2780/DDP对顺铂敏感性增加。Western blot检测结果显示,顺铂可以诱导人卵巢癌顺铂敏感株A2780中Cleaved-PARP水平升高,但对其耐药株A2780/DDP作用时影响不大(图4A)。然而,当3-MA与顺铂同时作用人卵巢癌细胞时(图4B),耐药株A2780/DDP中的Cleaved-PARP表达水平显著升高(P<0.01),同时耐药株细胞增殖力受到顺铂明显抑制(图5)。提示自噬抑制剂3-MA可以促进顺铂诱导人卵巢癌细胞凋亡,且增加顺铂耐药株对顺铂的敏感性。

A:顺铂(5μg/m L)作用24 h;B:3-MA(1 mmol/L)&顺铂(5μg/m L)作用24 h;**P<0.01

3 讨论

顺铂及其铂类抗肿瘤药物是治疗卵巢癌的一线化疗药物,但是大多数卵巢癌患者最终都会出现顺铂耐药而导致肿瘤复发,因此解决顺铂的耐药问题是临床治疗卵巢癌的关键点。最近几十年的研究中,自噬在卵巢癌中的作用引起越来越多的关注[12,13]。自噬不仅在肿瘤的发生、发展中起着关键作用,在肿瘤的药物治疗中也发挥着关键作用[14,15]。Liu等[16]研究表明自噬激活剂(雷帕霉素联合三氧化二砷)可以抑制卵巢癌细胞增殖;有研究发现,抑制自噬可以增加卵巢癌细胞的敏感性[17,18]。

本研究结果显示,顺铂作用卵巢癌细胞后,顺铂敏感株及耐药株中自噬体增加,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ水平升高,为进一步证实LC3-Ⅱ升高的同时伴随顺铂诱导人卵巢癌细胞A2780,A2780/DDP发生自噬的过程,实验分别使用溶酶体抑制剂Baf A1和自噬抑制剂3-MA抑制顺铂耐药株A2780/DDP中自噬体和溶酶体融合形成自噬溶酶体或抑制自噬体的形成。结果显示Baf A1与顺铂同时作用时,卵巢癌细胞株中自噬体的堆积程度加大,即顺铂可以诱导卵巢癌细胞A2780及其耐药株A2780/DDP发生自噬,同时这种作用可以被3-MA阻断。

大量文献表明自噬可以促进肿瘤生长[19,20],本实验中发现,A2780/DDP中自噬体明显增多,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ表达水平较顺铂敏感株A2780显著升高。但是顺铂对其诱导凋亡能力较弱,表现为顺铂单独作用A2780/DDP时,凋亡蛋白PARP几乎不裂解,PARP是细胞凋亡核心成员半胱天冬酶(caspase)的切割底物,在细胞凋亡中发挥着重要作用。当自噬抑制剂3-MA阻断顺铂诱导自噬后,顺铂诱导A2780/DDP凋亡的能力显著提高,且A2780/DDP对顺铂的敏感性增加。因此,顺铂作用A2780/DDP时,自噬与凋亡是两种相互拮抗的通路,同时调节着卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。其中自噬是促进卵巢癌细胞耐药的因素,而且可以削弱顺铂对卵巢癌耐药细胞的杀伤力。

卵巢癌的顺铂耐药性是临床亟待解决的问题,体外实验结果表明抑制细胞自噬可以增加卵巢癌顺铂耐药株A2780/DDP对顺铂的敏感性。因此,以细胞自噬作为治疗卵巢癌复发与耐药的靶点可以为克服卵巢癌顺铂耐药带来新的希望。

摘要：目的探讨细胞自噬与人卵巢癌细胞对顺铂耐药的关系。方法以不同浓度的顺铂(0、1、2、4、8、16μg/mL)分别作用人卵巢癌细胞A2780及其顺铂耐药株A2780/DDP 48h,采用MTT法检测卵巢癌细胞的增殖率,透射电镜检测顺铂诱导细胞自噬体的形成,Western blot法测定自噬和凋亡相关蛋白。结果与A2780对照比较,A2780/DDP增殖率明显升高(P<0.01);顺铂可以诱导A2780及A2780/DDP中自噬体的形成,且A2780和A2780/DDP中LC3-Ⅱ水平均升高,这种作用可以被自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)阻断;顺铂可以诱导A2780中凋亡相关蛋白Cleaved-PARP水平升高,但作用A2780/DDP时影响不大,当3-MA与顺铂同时作用人卵巢癌细胞时,A2780/DDP中的Cleaved-PARP表达水平显著升高(P<0.01)。结论卵巢癌细胞的耐药可能与顺铂诱导卵巢癌细胞自噬有关,自噬抑制剂3-MA可以抑制顺铂诱导的细胞自噬,同时促进顺铂诱导人卵巢癌细胞凋亡,且增加顺铂耐药株对顺铂的敏感性。

关键词：顺铂,耐药,卵巢癌,增殖,细胞自噬,凋亡

人卵巢癌细胞株篇2

1 资料与方法

1.1 研究对象

人卵巢癌细胞株SKOV3由斯隆-凯特林癌病中心(Memorial Sloan Kettering Cancer Center)建株,本室传代保存。

1.2 样本的采集和处理

1.2.1 细胞培养

在含有10%胎牛血清 (FBS)的RPMI-1640培养基中(内含2 mmol/L谷氨酰胺、青霉素100 U/ml、链霉素100 μg/ml)培养, 37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养备用。

1.2.2 选择对数生长期细胞实验

将SKOV3细胞株分为对照组、TPA组。分别以TPA 0.003、0.006、0.012、0.024、0.048 μg/ml的药物作用于细胞。对照组为未加药的SKOV3细胞株。培养时间段分别为6、12、18、24、48、72小时,收获细胞。

1.2.3 DNA提取

①各组细胞处理:将培养基倒掉,细胞用PBS液洗涤2～3次,加入1 ml Trizol,静置5～10分钟;②每1 ml Trizol加入200 μl氯仿,剧烈震摇15秒,室温下静置5分钟;③将细胞转移至1.5 ml离心管中,4℃,12000 r/min离心10分钟;④样品加氯仿分层后,移去上层水相,用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。每使用1 ml Trizol加0.3 ml无水乙醇混匀,室温放置3分钟,2℃～8℃不超过2000 r/min离心5分钟;⑤移去上清,用含10%乙醇的0.1 mol柠檬酸钠洗涤DNA沉淀。每用1 ml Trizol加入1 ml柠檬酸钠,室温放置30分钟,2℃～8℃ 2000 r/min离心5分钟,弃上清,重复1次;⑥用75%乙醇再洗1遍DNA沉淀,每用1 ml Trizol加入1.5～2 ml 75%乙醇,室温放置10～20分钟,2℃～8℃ 2000 r/min离心5分钟, 弃上清;⑦室温放置晾干DNA 5分钟,用8 mmol NaOH溶解DNA。

1.2.4 聚合酶链反应实验(PCR)

①ND1、ND4、ND5、Cytb、CoⅡ每条基因引物分别按照以下反应液配制:引物(15 pmol/μl) 0.5 μl;上游引物(15 pmol/μl) 0.5 μl;10 mmol 核苷酸混合物 1.5 μl;缓冲液1.5 μl;DNA聚合酶 0.3 μl;水 9.7 μl;总量 14 μl。②分装到5组PCR管中,每管加14 μl;③每管中分别加入不同样品的cDNA模板 1 μl;④将15 μl体系的混合液,放入PCR仪中;⑤反应及退火程序:95℃ 5分钟,95℃ 30秒,60℃ 30秒,72℃ 30秒,运行35周期,72℃ 7分钟,20℃终止反应。

1.2.5 水平琼脂糖凝胶电泳法(2%琼脂糖凝胶电泳)检测PCR产物

①溶解琼脂糖,配制成2%的琼脂糖溶液,加入5 μg/ml的EB溶液3 μl后摇匀。②制成厚度5～8 mm的琼脂糖胶板,放入电泳槽后加入电泳缓冲液高出胶板2～3 mm。③将样品缓冲液和上样缓冲液按5∶1的比例混匀后加样。④150伏恒压电泳 30分钟后取出胶板。⑤利用紫外线透射分析仪进行观察,并用数码相机照像。

1.2.6 引物序列

mtDNA引物序列及扩增片段,ND1-F:TCAAATTCCTCCCTGTACG;ND1-R:GGCTACTGCTCGCAGTG。CoⅡ-F:AGAAAAACCATTTCATAACTTTGTC;CoⅡ-R:CTTAAAAGGTTAATGCTAAGTTAGC。ND4-F:GATAATCATATTTACCAAATGCC;ND4-R:GAAGGGGTAGGCTATGTGTT。ND5-F:CAGCTATCCATTGGTCTTAG;ND5-R:AGGCGTTTGTGTATGATATGTTTGCG。Cytb-F:ACCATCGTTGTATTTCAACTAC;Cytb-R:GTTTACAAGACTGGTGTATTAG。

1.2.7 mtDNA序列分析

应用 ABI 3100型DNA自动测序仪和BIGDYE KIT对所有标本进行ND1、 CoⅡ、ND4、ND5、Cytb基因测序分析。登录美国国立生物信息网(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi),将测序结果与NCBI、GENE、BANK 的 mtDNA剑桥序列进行相似性比较,各PCR产物测序结果与其相似性均达到95%以上。将每份标本的mtDNA突变统计出来,取其平均值。

1.3 统计学处理

应用SPSS 16.0统计分析软件进行t检验及数据处理, P<0.01为差异有高度统计学意义。

2 结果

2.1 ND1、CoⅡ、ND4、 ND5、Cytb基因扩增产物图

电泳检测均显示单一清晰条带,有特异性扩增片段,见图1。

2.2 mtDNA 突变热点

在mtDNA突变的测试中,我们发现多个基因突变。本试验结果表明,mtDNA的突变热点依次是CoⅡ基因、ND5基因、Cytb基因和ND4基因,见表1。

2.3 mtDNA突变类型

本研究发现TPA诱导后的人卵巢癌细胞株SKOV3细胞发生的高频率mtDNA基因突变中,其突变主要集中表现为A→T,T→A,G→A,T→C,A→G,C→T,其中C→T是最为多见。见表2。

3 讨论

本研究提取人卵巢癌细胞株SKOV3细胞DNA,进行mtDNA突变的分析,比较各组细胞之间mtDNA突变率和突变类型的差异。在mtDNA突变的测试中,我们发现多个基因突变。试验结果表明,TPA诱导后的人卵巢癌细胞株SKOV3细胞mtDNA的突变热点依次是CoⅡ基因、ND5基因、Cytb基因和ND4基因。ND1基因突变点明显低于其他4条测试基因,仅在337位点有一缺失。所测标本中,mtDNA核酸片段中均未发现大片段缺失现象。推测其原因,可能是人卵巢癌细胞株SKOV3细胞的增生活跃使细胞在短时间内进行了反复的多代传递,致使发生片段缺失,突变的mtDNA分子通过mtDNA复制的非随机分离机制而被有效清除。插入突变多于缺失突变,与Eimon等[3]提出的缺失不容易积累理论相符。Zhu等[4]发现D环突变是编码区的7倍,且多为C→T突变,这种突变将降低该区域的C含量,而导致mtDNA复制失控。大量变异位点出现在复制、转录区域后,必将导致线粒体复制转录的异常,致使氧化呼吸链中断,能量供给不足。李红霞等[5]研究发现,在妇科恶性肿瘤中存在mtDNA编码区的高频率变异,卵巢癌mtDNA突变率为70.6%,提示mtDNA编码区变异与妇科恶性肿瘤的形成有密切关系, mtDNA变异可能是妇科恶性肿瘤形成中的一个早期现象,并持续存在于癌症演变的全过程。mtDNA突变与细胞凋亡基因表达亦具有一定的相关性,其与bcl-2表达呈正相关,而与Bax及caspase基因表达呈负相关。

本实验通过TPA诱导人卵巢癌细胞株SKOV3 mtDNA突变的研究,发现人卵巢癌细胞株SKOV3 mtDNA编码区的CoⅡ、Cytb 、ND4、 ND5是一个具有高度多态性和突变性的区域,它与卵巢癌的发生、发展有重要关系。经TPA诱导后的人卵巢癌细胞株SKOV3细胞,其mtDNA突变主要集中表现为A→T,T→A,G→A,T→C,A→G,C→T,其中C→T是突变的热点。各组细胞不同基因组的突变率中以ND5、ND4、 CoⅡ及Cytb 4条基因的突变率差异有高度统计学意义(P<0.01)。有文献报道突变最常发生于NADH脱氢酶亚单位4基因和D环区[6],与本结果有相同之处。Cytb基因的突变可能会对线粒体的氧化过程产生显著的影响[7]。而A→T,T→A,G→A,T→C,A→G,C→T等点突变可能会导致蛋白质中相应位置的氨基酸改变,从而影响基因的功能,最终导致某些疾病的发生。这种突变的后果在于突变位置对蛋白质功能影响的程度,具体基因突变与氨基酸改变之间的关系还有待深入研究。

参考文献

[1]Anderson S,Bankier AT,Barrell BG,et al.Sequence and organiza-tion of the human mitochondrial genome[J].Nature,1981,29(6):457-465.

[2]敖琳,曹佳,黄明辉,等.佛波酯对BALB/c3T3细胞转化早期基因表达的影响[J].中华预防医学杂志,2005,39(2):99-102.

[3]Eimon PM,Chung SS,Lee CM,et al.Age-associated mitochondrial DNA delettions in mouse skeletal muscle:comparison of defferent re-gions of the mitochondrial genome[J].Dev Genent,1996,18(2):107-113.

[4]Zhu W,Qin W,Bradley P,et al.Mitochondrial DNA mutations in breast cancer tissue and in matched nipple aspirate fluid[J].Carcino-genesis,2005,26(l):145-152.

[5]李红霞,钟声,李春海,等.妇科肿瘤组织中线粒体DNA基因突变的研究[J].中华妇产科杂志,2003,38(5):290-293.

[6]Jannifer SC.Peng H1Mitochondrial defects in cancer[J].Mol Cancer,2002,1(1):9-28.

人卵巢癌细胞株篇3

1 材料与方法

1.1 药品、试剂和仪器桦褐孔菌醇提取见参考文献[5],由河南大学药学院赵芬琴博士提取并鉴定。使用前用二甲基亚砜(DMSO)溶解(DMSO浓度<0.01%)。人卵巢癌SKOV3细胞株由吉林医药学院实验中心主任徐也博士赠送。IMEM培养基和胰蛋白酶为Gibco公司产品,无支原体胎牛血清为杭州四季青公司产品,MTT为美国Sigma公司产品。倒置生物显微镜(麦克奥迪AE31);Bio-Rad 550酶标仪(Bio-Rad)。

1.2 体外细胞培养人卵巢癌SKOV3细胞株在5%CO237℃的条件下,含有10%胎牛血清的IMEM培养基中常规培养。每次实验取对数生长期细胞,细胞密度为5×104/ml,接种于96孔板或100 ml中进行实验。

1.3 MTT法测定细胞增殖抑制率人卵巢癌SKOV3细胞株随机分在桦褐孔菌醇剂量浓度为25 μg/ml、50 μg/ml和100 μg/ml的3组中,每个组设6个平行样本,同时设立阴性对照组(不加药),分别在培养48小时后收集细胞,并倒置显微镜观察细胞的变化。采用MTT快速比色法,在酶标仪上测定570 nm处的吸光度值(A),按照公式计算药物抑制率,同时获得50%抑制浓度(IC50)。药物抑制率(%)=(对照组A值-实验组A值)/对照组A值×100%。A值为570 nm实验波长下测定的每孔光吸收值。

1.4 细胞凋亡检测将无菌的盖玻片置于六孔板中,每孔1片。取对数生长期细胞以消化液(0.25%胰蛋白酶+0.03%EDTA)2 ml消化细胞,用含10%胎牛血清的IMEM细胞培养液配成单个细胞悬液,将SKOV3单细胞悬液接种于培养板中,待细胞贴壁后弃掉培养基,每孔加培养液2 ml,次日,各孔加入桦褐孔菌醇1 ml使其终浓度为50 μg/ml,对照组加等体积培养液;桦褐孔菌醇与细胞作用48小时后,在倒置显微镜下观察记录后,按常规做HE染色,光镜下观察。

1.5 Ki-67蛋白检测细胞爬片用4℃冷丙酮固定10分钟,PBS洗涤,预冷的0.1% Triton-X 100处理,PBS洗涤。其余步骤按试剂盒操作说明进行,一抗为鼠抗人Ki-67单克隆抗体,阴性对照用PBS代替。结果判断:以细胞核出现棕黄色颗粒为Ki-67阳性。高倍镜下每张细胞爬片随机选取10个不同部位计数阳性细胞数和总细胞数,并以阳性细胞百分率进行比较,取其平均值。

1.6 统计学处理采用 SPSS 14.0统计软件,数据以均数±标准差表示,行t检验,P<0.05为差异有统计学意义。0.05)。

2 结果

2.1 MTT法检测桦褐孔菌醇对人卵巢癌SKOV3细胞株的生长抑制作用

培养48小时后,桦褐孔菌醇在25～100 μg/ml范围内对人卵巢癌SKOV3细胞株均有抑制增殖作用,桦褐孔菌醇浓度为25 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml的抑制率分别为(17.16±4.71)%、(35.16±4.26)%和(57.83±3.48)%,随着药物浓度的增加,增殖抑制效果越明显,表现出量-效关系,与对照组(0)比较,差异均有统计学意义(t=8.931;t=20.210;t=40.613,P<0.05)。IC50 为78.86 μg/ml。

2.2 人卵巢癌SKOV3细胞株的凋亡形态学观察

2.2.1 倒置显微镜观察

对照组细胞生长旺盛,呈上皮样贴壁生长,细胞间紧密连接。桦褐孔菌醇组肿瘤细胞体积变小、细胞变圆,细胞膜完整,染色质凝聚,细胞折光能力降低,细胞间连接疏松,贴壁能力明显减弱,吹打易离壁漂浮,生长明显受抑制。

2.2.2 HE染色光镜观察

对照组肿瘤细胞生长旺盛,呈不规则形,核分裂像多见。桦褐孔菌醇组肿瘤细胞胞质浓缩,体积缩小,呈圆形或不规则形,核染色质浓缩或染色质块形成,有的细胞膜起泡形成凋亡小体。见图1。

2.3 免疫细胞化学法检测人卵巢癌SKOV3细胞株Ki-67蛋白表达

桦褐孔菌醇作用于SKOV3细胞48小时后,Ki-67阳性表达率随药物浓度的增高而降低,见图2,桦褐孔菌醇浓度为25 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml的阳性表达率分别为(64.67±3.98)%、(43.83±3.06)%和(34.00±2.61)%,与对照组(92.83±3.06)%比较,差异均有统计学意义(t=14.222;t=28.297;t=36.451,P<0.05)。

3 讨论

桦褐孔菌醇具有多种生物活性,如诱导细胞凋亡,抑制炎症反应等,而在动物实验中也发现桦褐孔菌醇对裸鼠移植瘤有较好的抗肿瘤作用[1]。MTT法常用于肿瘤细胞抗肿瘤药物敏感性检测。前期工作已经证明,桦褐孔菌醇对A549细胞具有良好的抗肿瘤细胞增殖作用[3]。本研究采用桦褐孔菌醇刺激卵巢癌SKOV3细胞,结果表明,25 μg/ml桦褐孔菌醇作用48小时后就能抑制卵巢癌SKOV3细胞的生长,在25～100 μg/ml范围内,随着药物浓度的增加,细胞增殖抑制率也相应增加,其IC50为78.86 μg/ml,这为进一步研究桦褐孔菌醇用于卵巢癌的化疗提供了可能性。Ki-67抗原为人增殖期细胞特异性核蛋白,其抗体可识别细胞周期中G1后期、S期、G2期及M期的细胞核及染色体,是较可靠地全面反映细胞群体增殖水平的指标[6]。本研究结果显示,桦褐孔菌醇在25 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml浓度下,作用于SKOV3细胞48小时后,Ki-67阳性表达率下降,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05),并表现出浓度依赖性,提示桦褐孔菌醇具有抗卵巢癌癌细胞增殖的作用,我们推测桦褐孔菌醇可能是抑制了肿瘤细胞生长和(或)诱导细胞凋亡及坏死的结果。由于形态学观察是判断细胞凋亡发生的可靠方法之一。本实验应用倒置显微镜、HE染色光学显微镜,均发现经桦褐孔菌醇作用后的人卵巢癌SKOV3细胞出现凋亡形态学改变。然而,桦褐孔菌醇如何通过阻止细胞周期进程并诱导细胞凋亡的抗肿瘤作用至今还不清楚,因此对桦褐孔菌醇的诱导肿瘤细胞凋亡的分子生物学机制及对细胞周期的影响需要进一步深入研究。

参考文献

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[5]赵芬琴,朴惠善.桦褐孔菌抗突变活性成分研究[J].中草药,2006,37(12):1777-1780.

人卵巢癌细胞株篇4

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

Hoechst 33258、溴化噻唑蓝四唑 (MTT) 为Sigma公司产品, DNA Ladder试剂盒, Bcl-2、Bax抗体购自武汉博士德公司, 其余均为国产分析纯。

超净工作台, CO2细胞培养箱, 普通及荧光倒置显微镜, Elx-800型酶标仪和凝胶成像分析系统, DYY-III型电泳仪, 电泳和电转系统等。

1.2 药品及细胞株

OM为本校药学系提供 (纯度达90%以上) ;用新鲜DMEM培养基溶解, 0.22μm微孔滤膜过滤除菌, 现配现用。

人卵巢癌HO-8910细胞培养在含体积分数为10%灭活新生牛血清的DMEM培养基中, 置37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱内培养, 取对数生长期细胞进行实验。

1.3 MTT法测定肿瘤细胞生长抑制率

根据《黄培堂细胞培养指南》:取对数生长期细胞用含血清培养液稀释成1×104/L, 接种于96孔培养板中, 每组平行6孔, 每孔200μL, 细胞贴壁时向每孔加入OM使其终浓度分别为0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2mg/m L, 设空白对照组, 培养24、48和72 h后, 每孔加入新配制5 g/L MTT 10μL, 继续培养4 h后, 弃上清, 加入200μL DMSO, 振荡10 min至蓝紫色颗粒完全溶解后, 于酶标仪570 nm波长测定吸光度值。细胞生长抑制率 (IR) 按公式IR= (1-用药孔平均吸光度值/对照孔平均吸光度值) ×100%来计算。实验重复3次。

1.4 Hoechst 33258荧光染色法观察细胞凋亡

取对数生长期的细胞调整细胞浓度为105个/m L, 接种于24孔板, 每孔400μL, 继续培养至细胞贴壁后加入终浓度为0.25、0.5和1 mg/ml的OM, 设正常培养的细胞为对照组, 每组三个复孔, 继续培养48 h。4%多聚甲醛固定后, 每孔加入1 m L 5μg/m L Hoechst 33258, 室温孵育5 min, 在荧光倒置显微镜下观察细胞核形态学的变化 (激发波长380 nm) , 每孔随机取5个视野, 拍照。实验重复3次。

1.5 细胞DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳

将对数生长期细胞经OM处理后, 收集细胞2×106/L, 按DNA Ladder试剂盒方法提取DNA。取DNA样品液10μL加入2μL的6×上样缓冲液, 加于1%的琼脂糖凝胶板样品孔内, 通入直流电, 5V/cm, 电泳2 h后于凝胶扫描分析系统观察并拍照。实验重复3次。

1.6 Western blot法

将对数生长期细胞经0.25、0.5、1 mg/ml OM作用48 h处理后, 收集细胞2×106/L, 裂解细胞收集蛋白, 经SDS-PAGE分离后, 转到硝酸纤维素膜上, 以5%脱脂牛奶室温封闭1 h后, 加入1:500单抗反应1h, 再加入1:1000辣根过氧化物酶标记的Bcl-2和Bax二抗孵育1h, 应用ECL Western Blot检测系统测定Bcl-2和Bax表达情况。实验重复3次。

1.7 统计方法

采用SPSS11.5统计软件进行数据处理, 两组间比较采用t检验, 多组间比较采用单因素方差分析, 多组均数间两两比较采用Dunnett's t检验, P<0.05表示差别有统计学意义。

2 结果

2.1 OM对HO-8910细胞增殖的抑制作用

细胞生长抑制率随着OM作用浓度的增大和作用时间的延长逐渐增大 (图1) 。24 h、48 h、72 h的IC50值分别是 (0.8004±0.1232) mg/m L、 (0.3825±0.0611) mg/m L、 (0.1922±0.0384) mg/m L。48 h、72 h的IC50值与24 h的IC50值相比差异有显著统计学意义 (P<0.01) (表1) 。

**:同24h的IC50比较, P<0.01;n=5。

2.2 肿瘤细胞形态学变化

荧光显微镜下, 0.5mg/m L OM作用48 h后, 细胞核发生浓缩、碎裂或溶解成大小不等, 似多边形、圆形或碎片状的凋亡小体 (图2-B) 。凋亡细胞的数量随着作用时间的延长而逐渐增多 (图2-C, D, E) 。对照组细胞呈均匀蓝色荧光, 细胞膜完整, 细胞核呈规则的椭圆形 (图2-A) 。

经OM作用48 h后A:正常染色HO-8910细胞 (×400) ;B:0.5mg/ml (×400) ;C:0.25 mg/ml (×100) ;D:0.50 mg/ml (×100) ;E:1mg/ml (×100)

2.3 DNA琼脂糖凝胶电泳

对照组细胞在上样孔附近形成一条大分子条带 (图3, lane B) 。0.5mg/ml OM作用24 h, 仅见一条高亮带 (图3, lane C) ;0.5mg/m L OM作用48、72 h后, 可见凋亡细胞典型的DNA ladder (图3, lane D、E) 。

2.4 蛋白表达

随着药物浓度的增加, 抗凋亡蛋白Bcl-2表达量逐渐降低, 促凋亡蛋白Bax表达量增加 (图4) 。

Lane A:DNA Marker, Lane B:control, Lane C:24 h, Lane D:48h, Lane E:72 h。n=3。

1:control, 2:0.25 mg/ml, 3:0.50 mg/ml, 4:1mg/ml, 5:2 mg/ml;同control组比较, *:P<0.05, **:P<0.01;n=3。

3 讨论

恶性肿瘤是目前危害人类健康最严重的一类疾病。我国最严重的肿瘤为鼻咽癌、肺癌、肝癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌等。因此, 寻找高效低毒的抗肿瘤药物是当前肿瘤研究的重要方向。中草药抗肿瘤是目前肿瘤研究的热点。OM对多种肿瘤细胞具有直接的杀伤作用, 其抗肿瘤作用机制包括诱导肿瘤细胞凋亡、诱导细胞分化等, 但确切的抗肿瘤作用机制仍不明确[4,5]。

侯华新[4]等报道, 氧化苦参碱能显著抑制人卵巢癌SKOV3细胞增殖, 呈浓度依赖性, 通过琼脂糖凝胶电泳可见典型的凋亡DNA片段的梯形条带。流式细胞仪的检测推断氧化苦参碱可能通过将肿瘤细胞周期阻滞在G0/G1期, 抑制其增殖。但氧化苦参碱对人卵巢癌HO-8910细胞增殖抑制作用的分子机制尚未见报道。

本研究通过MTT法发现OM在一定浓度和一定时间范围内, OM对HO-8910细胞生长有显著的抑制作用, 呈时间和浓度依赖性。与侯华新[4]等报道的结果一致。

根据MTT的结果, 计算OM作用24 h、48 h和72 h的IC50值, 结合文献, 我们选择0.25 mg/ml、0.5 mg/ml、1 mg/ml三个浓度作用48h。运用Hoechst33258染色和DNA琼脂糖凝胶电泳法对凋亡细胞形态学特征和生化特征进行检测, 可观察到典型的凋亡小体和DNA ladder。

目前研究证实, 细胞凋亡过程受到很多基因的调控, 如p53、caspase家族、Bcl-2家族等。其中, Bcl-2家族是目前研究最广泛的一类细胞凋亡调控因子[7], 根据结构和功能分为两大类:前凋亡蛋白 (pro-apoptosis protein, 又称凋亡蛋白) 和抗凋亡蛋白 (anti-apoptosis protein) 。抗凋亡蛋白的代表有Bcl-2, 主要分布于线粒体外膜、内质网和核膜, 与肿瘤的发生有密切相关。凋亡蛋白代表有Bax, 主要分布在线粒体外膜上。Bax过表达不仅可使细胞发生自发凋亡, 而且也可以促进其他因素诱导的细胞凋亡[7]。Bcl-2和Bax二者互为拮抗因子, 如二者表达量平衡则细胞生存期正常;当Bcl-2表达量较高时, 形成异源二聚体Bcl-2/Bax, 抑制细胞凋亡;当Bax表达量较高时, 形2和Bax在调控肿瘤细胞凋亡上起着重要作用的典型基因。

蛋白表达的结果显示:Bcl-2表达随OM浓度增大逐渐减少, 而Bax表达逐渐增加, Bcl-2/Bax比例下降, Bax表达占主导。此时形成同源二聚体Bax/Bax, 下调Bcl-2表达, 使细胞对凋亡信号的反应增强, 诱导细胞凋亡。

综上所述, OM能诱导人肝癌HO-8910细胞凋亡。OM通过促进Bax表达, 抑制Bcl-2表达, 使人肝癌HO-8910细胞发生凋亡。肿瘤细胞凋亡的调控是由多个基因参与的复杂过程, OM诱导的人肝癌HO-8910细胞发生凋亡也肯定是一个多途径参与的过程, 还有待进一步的深入研究。

摘要：目的探讨氧化苦参碱 (Oxymatrine, OM) 在体外诱导人卵巢癌HO-8910细胞的凋亡作用及其可能的机制。方法以不同浓度的OM作用于人卵巢癌HO-8910细胞, 应用MTT法检测细胞生长情况;荧光染色观察细胞核的形态学改变;琼脂糖凝胶电泳分析细胞DNA变化;Western blot检测细胞Bcl-2和Bax的蛋白表达情况。结果 OM能显著抑制HO-8910细胞的增殖作用, 具有浓度和时间依赖性。荧光染色后可观察到典型的凋亡小体。细胞DNA电泳后呈现出凋亡细胞典型的DNA ladder。Bcl-2蛋白表达量逐渐降低, Bax蛋白表达量逐渐增加, 呈明显的浓度依赖性。结论 OM能诱导体外培养的人肝癌HO-8910细胞凋亡。Bcl-2表达增多, Bax表达减少是OM诱导HO-8910细胞凋亡的可能机制之一。

关键词：氧化苦参碱,卵巢癌,HO-8910细胞,细胞凋亡,Bcl-2,Bax

参考文献

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人卵巢癌细胞株篇5

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂

人卵巢癌A2780细胞系购自武汉典型培养物保存中心,阴离子聚合物聚甲基丙烯酸羟乙基酯(poly HEMA)试剂、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、白藜芦醇购自美国Sigma公司,DMEM培养液、胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司,Annexin V-PI试剂盒购自南京凯基生物有限公司,抗人survivin单克隆抗体、抗人γ-tubulin单克隆抗体购自美国Abcam公司。

1.2 细胞培养

正常贴壁细胞培养体系:A2780细胞培养于含10%FBS的DMEM培养液中,置于37℃、5% CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养。悬浮培养(即失巢培养)模型:参照文献[1]构建细胞悬浮培养模型,以此模拟细胞失巢样生长。当细胞达到对数生长期后,用相应浓度的RES处理细胞。

1.3 MTT比色法检测细胞活性

选用悬浮单个细胞作为实验组细胞,实验组经10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L、80 μmol/L、100 μmol/L RES分别处理6小时、12小时和24小时,同时以悬浮培养相应时间细胞作为对照组,以无细胞培养组作为调零组,记录计算细胞增殖抑制率:(对照组OD值-对照调零组OD值)-(实验组OD值-实验调零组OD值)/(对照组OD值-对照调零组OD值)× 100%。

1.4 流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测细胞凋亡

收集经正常贴壁培养24小时(对照组)、悬浮培养24小时(悬浮培养组)以及经30 μmol/L RES处理24小时悬浮培养A2780细胞(RES处理组)。根据使用说明进行实验,经磷脂酰丝氨酸蛋白 V-FITC/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)双染后进行检测。在双变量流式细胞仪的散点图上,Q1象限表示坏死细胞;Q2象限表示晚期凋亡细胞;Q3象限表示活细胞;Q4象限表示早期凋亡细胞。计算凋亡细胞百分率:凋亡细胞百分率=(Q2+Q4)%。

1.5 免疫印迹实验

收集经正常贴壁培养24小时、悬浮培养24小时以及经30 μmol/L RES处理24小时的悬浮培养A2780细胞,提取蛋白后,利用Western blot检测3组细胞的survivin蛋白水平,并以γ-tubulin作为内参,应用Image Jimage 处理软件进行半定量分析,以内参为参考标准计算出目的条带标准化后的光密度值,并以此判断蛋白的表达水平。

1.6 统计学方法

应用统计学软件SPSS 13.0作统计学分析,数据以均数±标准差表示,组间比较采用独立样本t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 A2780细胞的抗失巢凋亡特性

利用FCM检测悬浮培养组培养24小时的A2780细胞凋亡率为(3.19±1.63)%,与在正常贴壁对照组培养模型中培养24小时的细胞凋亡率(3.51±1.33)%相比较,两组间差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

(①与对照组比较,P>0.05;②与悬浮培养组比较,P<0.01)

2.2 RES抑制悬浮培养模型中A2780细胞增殖

分别以10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L、80 μmol/L、100 μmol/L的RES作用于悬浮培养的A2780细胞6小时,12小时和24小时。利用MTT测定细胞活性表明, RES能明显抑制细胞在悬浮培养模型中的增殖,其细胞增殖抑制作用呈时间、剂量依赖性。24小时RES的半数抑制浓度(IC50)为27.0 μmol/L。见图2。

2.3 RES诱导悬浮培养模型中A2780细胞调亡

以30 μmol/L的RES作用于悬浮培养的A2780细胞24小时,利用FCM检测其调亡率,并与悬浮培养24小时的细胞相比,发现RES处理组的细胞凋亡率(58.71±6.78)%明显高于悬浮培养组(3.19±1.63)%,差异有统计学意义(P<0.01)。

2.4 细胞内survivin蛋白表达水平

收集正常贴壁培养24小时 A2780细胞、悬浮培养24小时 A2780细胞以及经30 μmol/L RES处理24小时的悬浮培养A2780细胞,并利用Western blot技术检测细胞内survivin蛋白的表达,发现悬浮培养组细胞survivin蛋白水平明显高于正常贴壁培养组细胞,而RES能显著降低细胞survivin的蛋白表达水平。survivin蛋白表达水平由高到低依次为:悬浮培养组、对照组、RES处理组,3组细胞的survivin蛋白水平比较,差异有统计学意义(P<0.01)。见图3。

(①与对照组和RES处理组比较,P<0.01)

3 讨论

失巢凋亡是指细胞脱离细胞黏附基质, 失去细胞间连接而发生的一种特殊程序化细胞死亡的形式。恶性肿瘤转移是多阶段的级联过程,肿瘤细胞进入脉管系统[血管和(或)淋巴管]存活,并到达远处器官,是转移的早期重要事件,而细胞抗失巢凋亡能力则是该事件的先决条件[2,3,5,6,7]。已经有研究证实,多种肿瘤细胞具有抗失巢凋亡的特性,同样,在本研究中利用悬浮培养模型体外模拟失巢培养,也证实人卵巢癌A2780细胞具有抗失巢凋亡的特性,其在体外失巢培养模型中仍能保持与正常贴壁培养模型中相等的细胞活性。

RES作为一种潜在的抗肿瘤药物,已经在体外证实能杀灭多种肿瘤细胞,并抑制肿瘤细胞转移,然而,RES在卵巢癌中研究,特别是对卵巢癌失巢凋亡影响的研究才刚刚起步,知之甚少。在本实验中,通过研究RES对失巢培养模型中人卵巢癌A2780细胞增殖以及凋亡的影响,发现RES能有效抑制细胞在失巢状态下的增殖活性、促进凋亡,说明RES能有效地逆转卵巢癌细胞抗失巢凋亡特性。此发现无疑为卵巢癌的治疗提供了新的契机。

为了进一步研究RES促进A2780细胞失巢凋亡的有关机制,本实验选取在卵巢癌中高度表达并证实与卵巢癌转移相关的survivin蛋白作为研究对象。研究发现,当细胞从正常贴壁培养模型进入失巢培养模型时,survivin蛋白的表达水平明显提高,而RES在诱导细胞失巢凋亡的同时能显著抑制survivin的蛋白表达。上述发现不难说明survivin在A2780细胞抗失巢凋亡过程中的正性作用,RES通过下调其表达促进细胞失巢凋亡。

综上所述,本实验发现人卵巢癌A2780细胞具有抗失巢凋亡的特性,而RES能逆转此特性,阐明了survivin蛋白参与了细胞的上述过程,为RES用于卵巢癌的治疗提供了一个可行的方案。以上研究结果提供有关RES对人卵巢癌细胞失巢凋亡的影响以及机制的新信息,为卵巢癌的治疗提供新思路和靶点。

摘要：目的:初步探讨人卵巢癌A2780细胞抗失巢凋亡的特性及白藜芦醇(RES)对人卵巢癌A2780细胞失巢凋亡的作用及相关机制。方法:利用悬浮培养模型体外模拟人卵巢癌A2780细胞失巢培养,流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡;利用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖,免疫印迹实验(Western blot)检测生存素(survivin)蛋白表达的情况。结果:悬浮培养A2780细胞凋亡率与正常贴壁培养细胞凋亡率相比[(3.19±1.63)%vs(3.51±1.33)%],差异无统计学意义(P>0.05);而悬浮培养组细胞survivin蛋白表达明显增高。RES处理后呈时间、剂量依赖性抑制悬浮培养A2780细胞增殖。RES处理组细胞凋亡率(58.71±6.78)%明显高于悬浮培养组细胞凋亡率(3.19±1.63)%(P<0.01),且RES处理组细胞survivin蛋白水平明显下降。结论:人卵巢癌A2780细胞具有抗失巢凋亡的特性。RES能诱导人卵巢癌A2780细胞失巢凋亡,其效应与survivin蛋白表达下调有关。

关键词：白藜芦醇,卵巢癌,抗失巢凋亡,生存素

参考文献

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人卵巢癌细胞株篇6

关键词：胎盘间充质干细胞,卵巢早衰,分子机制

卵巢早衰已成为妇科疾病不孕不育的常见因素, 目前对于卵巢早衰的机理并不是很清楚, 因此也没有根治的方法[1]。胎盘间充质干细胞是从胎盘组织中分离培养出来的, 取材广泛, 对供者无不利影响, 无伦理问题, 且细胞增殖、分化能力较强, 有报道对卵泡的生长有促进作用[2], 本文重点从分子机制方向研究人胎盘间充质干细胞治疗卵巢早衰的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

为正常足月剖宫产胎盘, 属对实验均知情同意并签署“知情同意书”。产妇的条件为:年龄为25~30岁, 且满足艾滋病、乙肝病毒、丙肝病毒、梅毒、支原体HBSAg、HCV检测均为阴性。雌性C57的卵巢早衰模式小鼠 (6~8周) 购自天津赛尔生物技术有限公司。

1.2 方法

人胎盘间充质干细胞的分离培养与鉴[3]:件下取足月剖宫产胎儿的胎盘, 剥除羊膜, 剪取胎儿侧胎盘组织, 用胶原酶II 37℃消化45 min。然后过细胞筛网, 收集各组细胞悬液, 于室温以1 000 r/min离心5 min, 弃上清。用PBS重悬细胞, 加入60 g/L羟乙基淀粉 (体积比为4﹕1) 充分混匀, 室温静置45 min, 小心吸取上清, 1 000 r/min离心5 min, 弃上清, PBS洗涤2次。以完全培养基重悬, 制成单细胞悬液, 台盼蓝染色计数活细胞数。按8X108/L的密度接种于T-25培养瓶中, 置于37℃、0.05%的C02培养箱中, 用含体积分数为10%的胎牛血清的DMEM/F12进行培养。7d后首次全量换液, 弃去未贴壁细胞, 每3天换液1次。细胞达80%汇合后, 用2.5 g/L胰酶消化, 按1﹕2的比例传代, 继续扩增培养。使用0.25%胰酶消化, 将细胞悬液转入15 m L离心管中并以1 000 r/min离心3 min。第1管为空白对照, 用于调节流式细胞仪的电压, 第2管加入同型对照抗体 (PE-MOUSE Ig G1/FITC-MOUSE Ig G1/APC-Mouse Ig G1κ) 10μL, 其余管中加入相应流式抗体10μL, 混匀, 4℃避光孵育30 min, 磷酸盐缓冲液洗涤2次, 分成每管1×106细胞, 各管中加入相应流式抗体, 避光孵育30 min, 洗涤1次后离心弃上清, 加入500μL磷酸盐缓冲液重悬, 上机 (流式细胞仪FACSAria, BD公司) 检测。

对照组:注射生理盐水;实验组:注射人胎盘间充质干细胞, 连续注射10天。10天后取卵巢, 提取RNA, 反转录后进行荧光定量PCR。Gapdh, Zcchc11, Angpt 1, Cxcr4种引物委托上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计学处理, 计量资料以“±s”表示, 采用t检验的方法进行比较, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 流式细胞仪鉴定结果

分离得到的人胎盘间充质干细胞, CD29、CD44和CD90均为高表达均在98%以上, CD45、HLA-DR均呈阴性表达, 见图1。

2.2 荧光定量PCR检测分析结果

与对照组相比, 观察组的Zcchc11和Angpt1基因的表达上升, Cxcr4基因表达下降, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。如图2。

3 讨论

胎盘间充质干细胞可能通过旁分泌的细胞因子的作用来改善卵巢功能。胎盘间充质干细胞分泌一些细胞因子, 比如胎盘生长因子 (PGF) , 转化生长因子-β (TGF-β) , 表皮生长因子 (EGF) , 血管内皮细胞生长因子 (VEGF) , 成纤维细胞生长因子-2 (FGF-2) , 血管生成素-1 (Angpt-1) 等。

Angpt1的表达水平可能与排卵前卵泡生长和血管形成有关。Angpt1是干细胞分泌的因子, 分泌血管形成相关细胞因子的使卵巢的循环系统功能得以改善[4]。CXCR4, 有较强的淋巴细胞趋化活性, 在维持卵泡处在非激活状态起到重要作用。处于非激活状态的CXCR4可能诱导原始卵泡生长成为成熟卵泡[5]。Zcchc11与micro RNA调节相关。可以刺激颗粒细胞增殖抑制凋亡, 促进窦状卵泡的形成[6]。因此, Angpt1的表达上升表明胎盘间充质干细胞有分化为血管内皮细胞的治疗潜能。CXCR4基因的表达下降, 表明胎盘间充质干细胞可以促进原始卵泡发育为成熟卵泡。Zcchc11基因表达上调, 表明胎盘干细胞可以减少POF介导的细胞凋亡。

综上所述, 人胎盘间充质干细胞可以调节卵巢生长相关基因的表达, 对治疗卵巢早衰有重要作用。

参考文献

[1]Wolbank S, Peterbauer A, Fahrner M, et al.Dose-dependent immunomodulatory effect of human stem cells from amniotic membrane:a comparison with human mesenchymal stem cells from adipose tissue.Tissue Eng.2007;13 (6) :1173-1183.

[2]Markov v, Kusumi K, Tadesse MQ, et a1.1dentification of cord blood-dedved mesenchymal stem/stroma I cell populations with di Stinct growth kinetics.differentiation potentials and geneexpression profiles.Stem Cells Dev.2007;16 (1) :53-73.

[3]刘丽, 黎渊明, 刘琴.三种胎盘间充质干细胞的分离培养及生物学特性对比研究[J].中国热带医学, 2012, 12 (12) :1528-1529.

[4]I Makhoul, VK Todorova, ER Siegel.Germline Genetic Variants in TEK, ANGPT1, ANGPT2, MMP9, FGF2 and VEGFA Are Associated with Pathologic Complete Response to Bevacizumab in Breast Cancer Patients.PLo S One.2017 Jan 3;12 (1) :e0168550.

[5]王红英, 王景苗.si RNA靶向沉默CXCR4基因对人卵巢癌SW626细胞增殖、迁移及侵袭的影响[J].现代妇产科进展, 2012, 21 (11) :48-51.

人卵巢癌细胞株篇7

卵巢癌是妇科常见恶性肿瘤,在女性生殖系统恶性肿瘤中发病率居第3位,死亡率却居首位[1]。尽管有手术及术后化疗等多种治疗方法,但长期化疗对骨髓抑制明显、耐药及停药后高复发率等问题,其5年生存率仅为20%～30%[2],使化疗也受到限制。因此,寻找既能控制癌细胞增殖、诱导分化及促进凋亡,又能尽量减少骨髓抑制的治疗方法,对于改善患者的生存质量有重要意义。

近年来,通过运用维生素及其衍生物抑制肿瘤细胞增殖,促进细胞凋亡,诱导肿瘤细胞进一步分化日益受到重视。但诱导分化疗法往往需要较大剂量,进而可能引起毒副作用。为了克服这些毒副作用,可通过联合用药提高对靶细胞的作用,这无疑为提高诱导分化疗效提供了新思路。

本研究以1,25-二羟维生素D3和全反式维甲酸对人卵巢癌细胞株HO 8910分别进行单独或联合用药,通过检测细胞生长抑制率、细胞周期及细胞凋亡,同时采用RT-PCR检测VDR及RARαmRNA表达情况,研究和探讨1,25-二羟维生素D3和全反式维甲酸抑制肿瘤细胞增殖的分子机制,以及二者联合用药能否产生一定的协同作用,为肿瘤的诱导分化提供新的途径。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1细胞株

人卵巢癌细胞株HO 8910(人卵巢上皮细胞样腺癌)购自南京凯基生物科技发展有限公司。

1.1.2主要药品

1,25(OH)2D3、ATRA、四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自Sigma公司。EASYspin组织/细胞RNA快速提取试剂盒购自北京博迈德科技发展有限公司。BioRT逆转录扩增(RT-PCR)试剂盒购自杭州博日科技有限公司。

1,25(OH)2D3以无水乙醇配制成10-5mol/L的贮存液,ATRA以无水乙醇配制成10-2mol/L的贮存液,-20℃避光保存。

1.1.3 PCR引物

据VDR的cDNA序列设计合成VDR引物,RARα引物参考文献[3],另设计β-微球蛋白(β-actin)引物作为内参照,以上引物均由上海生工生物技术有限公司合成,见表1。

1.2方法

1.2.1细胞培养及实验分组

卵巢癌细胞HO 8910在含100U/mL青霉素、链霉素,10%胎牛血清的RPMI—1640完全培养基中,于37℃、湿度100%、5%CO2条件下培养,细胞换液为2～3d,取对数生长期细胞进行实验。实验组分为10-8mol/L 1,25(OH)2D3组、10-6mol/LATRA组和二者联合用药组,对照组加等体积无水乙醇。

1.2.2 MTT比色法测定细胞生长抑制率

取对数生长期细胞,制备成单细胞悬液,以2～3×10-4mL的密度接种于96孔板,每孔200μL,细胞贴壁后,实验组分别加入1,25(OH)2D3,ATRA,以及二者联合用药,对照组加等体积无水乙醇,每组设6个平行孔(n=6),孵育24h,48h,72h后,每孔加入20μLMTT,再孵育4h,吸弃上清液,每孔加入150μLDMSO,震荡摇匀,酶标仪492nm处测定吸光度值(A492),计算细胞生长抑制率(IR)=(A对照-A实验)/A对照×100%。

1.2.3流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡

细胞准备及实验分组同上,各组细胞培养72h后,收集5×106个细胞,PBS洗涤,缓慢加入3mL70%预冷乙醇,4℃固定过夜。细胞经PI染液染色后,用流式细胞仪(美国BD公司)测定细胞的周期分布及细胞凋亡,ModFit软件分析。

1.2.4细胞总RNA提取

细胞准备及实验分组同上,各组细胞培养72h后,收集5×106个细胞,PBS洗涤2次,0.25%胰酶消化,置EP管中,1 000r/min离心5min,按照细胞RNA快速提取试剂盒说明提取细胞总RNA,以30μLDEPC水溶解沉淀,所提取的总RNA经琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性,-80℃保存。

1.2.5逆转录cDNA合成

取上述总RNA 3μL进行逆转录(10μL体系),按照逆转录扩增试剂盒说明加入各反应液,按以下条件进行逆转录反应:42℃,45min;95℃,5min;4℃,5min,于-20℃保存。

1.2.6 PCR检测VDR及RARαmRNA表达

取2.5μL逆转录产物进行PCR扩增(25μL体系),按照PCR扩增试剂盒说明依次加入各反应液,按以下条件进行PCR反应:94℃预变性5min,94℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸45s,共35个循环,最后再72℃延伸8min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定,图像分析处理系统拍照并进行PCR半定量分析。

1.3统计学分析

采用SPSS13.0软件进行分析,实验数据用均数±标准差(x±S)表示,组间比较采用方差分析,以P<0.05为差异有显著性标准。

2结果

2.1 1,25(OH)2D3和ATRA对卵巢癌细胞增殖的影响

由图1可知,1,25(OH)2D3和ATRA或二者联合用药对HO 8910细胞生长均有不同程度的抑制作用(P<0.05),各实验组对癌细胞的抑制率均低于29%。诱导72h后细胞生长的抑制率显著,各实验组对卵巢癌细胞的抑制随作用时间的延长而增加,且呈明显的时间依赖关系。实验组与对照组之间差异有显著性,其中联合用药组抑制率明显高于单独用药组(P<0.05)。

2.2 1,25(OH)2D3和ATRA对卵巢癌细胞周期的影响

1,25(OH)2D3和ATRA对细胞株HO8910作用后细胞周期分布见图2,1,25(OH)2D3和ATRA作用72 h后,G1 期细胞分别为(81.36±0.83)%、(83.56±0.30)%,较对照组(73.43±0.85)%明显增多(P<0.05),其中联合用药组G1 期细胞(88.58±2.06)%明显高于单独用药组(P<0.05),提示1,25(OH)2D3和ATRA可引起HO8910细胞细胞周期时相改变,发生G1期阻滞。

2.31,25(OH)2D3和ATRA对卵巢癌细胞凋亡的影响G 1期细胞分别为(81.330)%,较对照组(73.43±.05),其中联合用药组G 1

HO8910细胞经1,25(OH)2D3和ATRA单独或联合诱导72 h后,流式细胞术显示均出现细胞凋亡,见图3。凋亡细胞比例分别为1,25(OH)2D3组(12.76±0.47)%,ATRA组(15.61±0.25)%,较对照组(4.82±0.69)%差异有显著性(P<0.05),其中联合用药组凋亡细胞占(23.68±0.36)%明显高于单独用药组(P<0.05),提示1,25(OH)2D3和ATRA可诱导HO8910细胞产生细胞凋亡。

2.4卵巢癌细胞VDR、RARα mRNA的表达变化

RT-PCR结果显示,如图4、图5所见, 1,25(OH)2D3和ATRA单独或联合对卵巢癌细胞HO8910作用后, VDR和RARα mRNA表达上调,各实验组较对照组差异有显著性(P<0.05),其中联合用药组VDR和RARα mRNA的表达明显高于单独用药组(P<0.05)。

1—对照组,2—100bp DNA Marker, 3—10-8mol/L 1,25(OH)2D3组,4—联合用药组

1—10-6mol/L ATRA组,2—联合用药组, 3—100bp DNA Marker,4—对照组

3讨论

1,25(OH)2D3是维生素D3的活性形式,其作用方式是通过特异维生素D受体介导的。近年来发现,1,25(OH)2D3除了能调节钙磷代谢外,对细胞的增殖和分化、免疫功能亦有明显的调节作用,并主要表现在抑制肿瘤细胞的周期进展[4]。全反式维甲酸(al1-trans retinoic acid,ATRA)是维甲酸类化合物的活性形式.也具有抑制细胞生长、促进细胞分化等多种生物学功能,它通过特异性维甲酸受体(retinoic acid receptor,RAR)发挥其生物学功能。

新近观点认为VDR和RAR同源,同属类固醇激素核受体超家族(steroid nuclear receptor superfamily),是配体依赖的核转录因子,通过形成VDR/RAR或VDR/RXR(维甲酸X受体)异型二聚体,作用于靶基因启动区中的特异DNA序列,从而增强了调节分化的活性[5,6],因此1,25(OH)2D3和ATRA两者联合使用时可能产生一定的协同作用。Muto等[5]证实,1,25(OH)2D3和ATRA在对急性早幼粒白血病UF-1细胞的诱导分化中有协同作用。Manferdini[7]等发现ATRA能够明显增加白细胞的VDR的数量和活性,促进VDR调控基因转录。表明这两种药物联用可能有协同作用。

本研究发现1,25(OH)2D3和ATRA对卵巢癌HO8910细胞生长均有一定的抑制作用,当二者联合使用时,抑制率明显提高。流式细胞术显示,1,25(OH)2D3和ATRA单独或联合用药后,卵巢癌HO8910 G1期细胞明显增多,细胞周期阻滞于G1期;同时可以引起细胞凋亡,以联合用药组更为明显。 RT-PCR结果发现VDR和RARα mRNA在HO8910细胞中基础含量很低,经过诱导二者的表达上调,联合用药组更为显著。提示1,25(OH)2D3和ATRA在抑制HO8910细胞生长,引起细胞周期改变,诱导细胞凋亡中能够发挥一定的协同作用。

Li等[8]发现1,25(OH)2D3通过降低CDK2-cyclin E复合物的活性及S期激酶相关蛋白2(S-phase kinase associated protein 2,SKP2)的表达,上调CDK抑制因子p21WAFl/CIP1和p27 KIP1蛋白的表达,诱导肿瘤细胞停滞于G1期,阻止其进入S期,从而调节肿瘤细胞的增殖和分化[9]。研究发现,p21WAFl/CIP1基因启动子中含有维生素D反应元件 (vitamin D response elements,VDRE)[10]和维甲酸反应元件(retinoic acid response elements,RARE)[11],因此1,25(OH)2D3和ATRA能够通过VDR、RAR、RXR参与p21WAFl/CIP1基因转录的调控,增强p21WAFl/CIP1蛋白的表达,诱导肿瘤细胞发生G1期细胞周期阻滞。Gartel等[12]研究证实,在p21WAFl/CIP1基因上游的调控区内存在者多种转录因子的结合序列,如p53、VDR、RAR等。提示1,25(OH)2D3和ATRA通过VDR、RAR直接参与靶基因的调控[10,13],增强p21WAFl/CIP1蛋白的表达,诱导肿瘤细胞发生G1期细胞周期阻滞。