卵巢卵母细胞（精选7篇）
卵巢卵母细胞 篇1
随着现代胚胎工程技术的发展, 哺乳动物卵母细胞体外成熟、体外受精、胚胎冷冻保存、转基因、体细胞克隆等技术日趋完善, 卵母细胞的需求在迅速增加。传统的超数排卵技术所获得的成熟卵母细胞已不能满足研究和生产需求。卵巢卵母细胞的采集和体外成熟技术发展, 使人们可获得大量卵巢卵母细胞用于胚胎体外生产和研究, 但如何改进卵母细胞的采集方法, 提高卵母细胞的采集效率, 对获得更多的可用卵母细胞具有重要作用。本试验从屠宰场收集废弃的猪卵巢, 比较抽吸法和剖切法对屠宰猪卵巢卵母细胞采集数、采集时间, 以及对卵丘细胞完整程度的影响, 分析卵巢保存温度和保存时间分别对卵母细胞的成熟的差异。寻找一套有效的猪卵巢卵母细胞的采集方法, 为开展胚胎生物工程的深入研究提供优质、经济的猪卵母细胞奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验用猪卵巢
试验所用猪卵巢全部采自贵阳市花溪屠宰场, 母猪屠宰后30min内将两侧卵巢剪下, 除去特大卵泡与多余脂肪组织, 灭菌纱布擦干, 置于试验设计温度的灭菌生理盐水 (含双抗) 广口保温瓶内, 迅速送回实验室。随后用等温的生理盐水冲洗2～3次至无血水, 剪去卵巢上附带的输卵管系膜, 在超净工作台上灭菌纱布吸干卵巢表面水珠备用。
1.1.2 主要仪器设备
二氧化碳培养箱 (Forma 3111, 美国热电) 、实体显微镜 (Olympus) 、恒温水浴锅 (天津泰斯特仪器有限公司) 等。
1.1.3 试剂耗材
TCM-199, 氯霉素、青霉素、透明质酸酶、四孔培养皿均购自Sigma公司 (美国) , 其它试剂为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1
抽吸法和剖切法采集猪卵巢卵母细胞在采卵室内, 分别采用抽吸法和剖切法采集猪卵巢卵丘-卵母细胞复合体 (COCs) , 抽吸法用带有16G针头的5mL注射器抽吸卵巢表面2～8mm大小卵泡, 吸卵液为m PBS;剖切法是将清洗干净的卵巢置于内有5mL m PBS吸卵液的无菌培养皿中, 然后用灭菌手术刀片对卵巢表面所有卵泡 (2～6mm) 进行纵横方向切剖。参考文献介绍的方法进行收集、分级、记录, 分为A、B、C三级。
1.2.2 体外培养
将收集的A、B级COCs用于体外成熟培养, 培养液为TCM-199, 采用四孔微滴培养法, 每滴移入30～40枚卵母细胞, 在5%CO2、95%空气、饱和湿度、39℃下培养。
1.2.3 猪卵母细胞成熟鉴定
将培养38～42h的COCs放入含有0.1%透明质酸酶的成熟培养液中, 在CO2培养箱中孵育10min后用吸胚管轻轻吹打以脱去卵丘细胞。将裸卵在显微镜下观察卵母细胞是否已排出第一极体, 含有第一极体的判为成熟, 排出第一极体则为卵母细胞核成熟的标志。
1.2.4 不同保存时间对卵母细胞体外成熟的影响
采用抽吸法采集不同保存时间的猪卵巢COCs并用于体外成熟培养。保存时间设置为4个梯度 (1～1.5h、2～2.5h、4～4.5h、6～6.5h) , 将所获得的COCs用成熟培养液进行体外成熟培养, 培养方法见1.2.2。
1.2.5 卵巢保存温度对卵母细胞体外成熟的影响
将离体卵巢保存在不同温度的生理盐水中, 比较不同的保存温度对猪卵巢COCs体外成熟的影响, 温度设置为3个梯度 (36～38℃、26～28℃、16～18℃) , 采用抽吸法采集所获得的COCs进行体外成熟培养, 培养方法见1.2.2。
1.3 数据处理
所得数据以百分数t检验及平均数t检验进行统计学分析。
2 结果与分析
2.1 不同采集方法采集可用卵母细胞数
从屠宰场共采集猪卵巢158个, 共获得A、B、C级卵母细胞1078个, 其中可用来培养A、B级卵丘卵母细胞667个, 占总采卵数的61.87%, 平均采得可用卵母细胞数4.22枚/卵巢。用抽吸法采得卵母细胞数435个, 其中A、B级卵母细胞255, 平均2.66个/卵巢, 占该法获得卵母细胞的58.6%, C级卵母细胞180个, 占14.4%;而用剖切法得到卵母细胞643个, 其中A、B级卵母细胞数为412个, 平均6.64个/卵巢, 占该法获得的卵母细胞数的64.07%, C级卵母细胞数为231, 占35.93%, 可见这两种方法所得到的无论是卵母细胞数还是可用卵母细胞数差异极显著 (p<0.01) , 剖切法所得可用卵母细胞的比例高于抽吸法 (见表1) 。
2.2 不同采集方法对卵丘细胞完整程度的影响
在2种采集方法中, 剖切法获得的卵母细胞卵丘完整率高于抽吸法 (P<0.05) (见表2) , A、B二级卵母细胞的比例均显著高于抽吸法 (P<0.05) , 抽吸法所得的C级卵母细胞数要显著多于 (P<0.05) 剖切法。
注:同列肩标不同字母表示差异显著 (P<0.05)
2.3 卵巢保存时间对卵母细胞体外成熟的影响
一般而言卵巢保存时间越短越好, 最好是2h内将离体卵巢运回实验室, 但由于某些条件限制, 有时会超过2h。本试验采用抽吸法采集不同保存时间的卵巢卵母细胞并用于体外成熟培养。结果显示 (见表3) , 保存时间在1～1.5h时, 成熟率最高, 成熟率为57.6%;2～2.5h时, 成熟率为52.8%;4～4.5h时, 成熟率为48.2%;6～6.5h时, 成熟率最低, 为26.5%。
注:a、b之间差异显著 (P<0.05)
2.4 卵巢保存温度对卵母细胞体外成熟的影响
与其它哺乳动物相比, 猪卵子对温度特别敏感, 卵巢的回收温度较高或较低, 卵母细胞体外成熟培养的效果较差甚至退化, 较合适的温度是到达实验室维持在32～38℃, 当卵巢保存温度低于25℃, 猪卵母细胞将会受到冷休克的打击, 从而影响卵母细胞体外成熟的成熟率。本试验研究结果显示 (见表4) , 当保存温度在36～38℃时, 26～28℃时, 16～18℃时, 平均成熟率分别为:54.2%、47.6%、27.9%。保存温度36～38℃时与16～18℃时相比较差异极显著 (p<0.01) 。
注:a、b之间差异显著 (P<0.05)
3 讨论
3.1 两种采集方法对获得卵母细胞的数量的影响
卵母细胞的采集方法对获得卵母细胞的数量影响很大, 目前针对大多母畜卵巢COCs的采集多是采用抽吸法, 关于用不同方法获取COCs、对可用卵丘卵母细胞数量的比较研究, 在牛和羊尚有报道, 而猪报道不多。王启胜等 (2002) 用抽吸法从每头水牛卵巢中获得的卵母细胞数为4.57个/卵巢。卫恒习等 (2004) 研究发现用剖切法采集绵羊卵母细胞获得的卵均数、可用卵数均显著高于抽吸法。我们在的研究结果与他们的相似。
3.2 卵巢保存温度和时间对卵母细胞体外成熟的影响
关于卵巢在体外保存的温度和时间, 不同的学者有过不同的研究报道。卵巢保存时间的不同, 成熟率将随着卵巢离体时间的增加呈降低的趋势。文国艺等 (2000) 报道母猪卵巢离体时间的长短直接影响体外成熟率, 成熟率将随着卵巢离体时间的增加而降低的趋势。本试验表明, 卵巢离体时间在6h以内对卵巢卵母细胞的成熟率影响不大, 我们的结果与其相符。当卵巢的温度低于30℃时会对卵母细胞的成熟及之后的发育产生不利的影响。低于25℃时, 卵母细胞将会受到冷休克的打击, 影响体外成熟的成熟率。彭辉等 (2009) 研究发现, 牛卵巢从采集到送达实验室保存在30～39℃的灭菌生理盐水中可以获得较高的成熟率和囊胚发育率。本试验研究结果显示, 当保存温度在36～38℃时, 卵母细胞成熟率最高。
摘要：本试验利用抽吸法和剖切法两种采集方法采集猪卵巢卵母细胞, 对获得可用卵丘卵母细胞数和卵丘完整程度的影响进行比较研究, 并分析在卵巢收集时不同的保存温度、运输时间对卵母细胞体外成熟的影响。结果表明:剖切法采集细胞数目显著高于抽吸法 (P<0.01) ;A、B级卵母细胞的比例在剖切法中显著高于抽吸法 (P<0.05) ;抽吸法所采集的C级卵母细胞显著高于剖切法 (P<0.05) ;剖切法中卵母细胞卵丘完整率高于抽吸法 (P<0.05) ;离体卵巢保存的最佳温度为36℃～38℃;其保存时间为1～1.5h时成熟率57.6%与2～2.5h时成熟率52.8%相比无显著差异 (P>0.05) ;保存时间超过6h时卵母细胞的成熟率显著下降。
关键词：猪,卵巢卵母细胞,采集方法
参考文献
[1]陈晓宁, 等.不同收集方法对猪卵母细胞体外成热培养的影响[J].上海畜牧兽医通讯, 2003, (1) :24-25.
[2]Wang ZG.et al.Effects of oocyte collection techniques and maturation media on in vitro maturation and subse quentembryo development in Boer goat.Czech J.Anim.Sci., 52, 2007 (1) :21-25.
[3]王启胜, 等.水牛与黄牛卵母细胞的回收及体外成熟体外受精比较[J].中国畜牧杂志, 2002, 38 (5) :33-34.
[4]卫恒习, 等。提高绵羊卵母细胞发育能力的研究[J].黑龙江畜牧兽医, 2005, 5, 34-36.
[5]彭辉, 等.ITS、卵巢保存温度及所处性周期对黄牛卵母细胞和孤雌胚体外发育的影响[J].湖北农业科学, 2009, 48 (1) 128-131.
卵巢卵母细胞 篇2
在国内外有关猪卵母细胞体外成熟研究的基础上, 本研究选择若干培养系统、培养时间以及不同发育阶段卵泡卵母细胞为主要研究内容, 进一步探讨其对体外成熟 (极体排出和细胞活力等) 与体外受精影响, 为开展猪胚胎发育生物学和种质资源保存等研究提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 卵巢卵母细胞与卵丘细胞复合
体 (COCs) 的采集和猪卵泡液 (pFF) 制备
自本地屠宰场采集卵巢, 置于25~37℃生理盐水 (含抗生素) 的保温桶中, 3 h内返回实验室。卵巢用生理盐水冲洗3遍, 用干净的纱布拭干。采用10 mL注射器抽吸pFF, 汇集于37℃保温的试管中, 取试管下部滤液, 实体显微镜下分捡, 收集直径2~8mm, 包裹2~4层卵丘细胞的COCs。另取卵巢皮质组织, 于生理盐水中适度剪碎, 滤网过滤, 取滤液置实体显微镜下捡卵, 收集ф<2 mm的COCs。COCs暂时置DPBS中, 待IVM处理;捡卵后留下的pFF (分别为ф2~5mm、ф5~8 mm和ф2~8 mm卵泡类群) 经1 500 rpm/min离心15min, 取上清, 0.22μm滤膜过滤, -20℃冷冻保存, 备用。
1.2 不同COCs IVM系统
1.2.1 不同培养液种类:
成熟培养系统分别为两种, 即添加10%pFF (ф2~8mm) 、10%NCS、69μg/mLL-Cys、10U mLPMSG、10IU/mLHCG、1μg/mL17β-E2以及双抗 (青、链霉素) 各100 IU的改良TCM199培养液和改良NCSU23培养液 (其中以4mg/mLBSA代替10%NCS) 。IVM在35 mm培养皿内进行, 每皿布点5个50μL微滴, 覆盖矿物油, CO2培养箱中预平衡2 h以上待用。选取胞质均匀、包被三层或四层以上致密卵丘细胞的ф2~8 mmCOCs, 分别用TCM199和NCSU23基础培养液洗3遍, 转入相应的预平衡的成熟培养微滴系统中 (3~5枚/滴) , 在5%CO2, 饱和湿度, 39℃条件下培养44 h, 统计分析卵母细胞成熟培养效果。
1.2.2 添加不同pFF:
在改良TCM199培养液中分别添加10%ф2~4 mm、ф5~8mm和ф2~8 mm pFF, 以不添加pFF为对照, 按1.2.1条件条件进行ф2~8 mm卵泡COCs培养, 比较不同发育程度的卵泡pFF对IVM的影响。
1.2.3 添加不同外源激素:
分别选择添加17β-E2 (1μg/mL) 、PMSG (10IU/mL) +HCG (10 IU/mL) 和17β-E2+PMSG+HCG的改良TCM 199培养系统为处理组, 以不添加任何激素为对照组, 其它培养条件与1.2.1相同, 分析比较ф2~8mm卵泡卵母细胞IVM效果。
1.3 不同发育阶段COCs
COCs培养在四孔板上进行, 每孔TCM199成熟液500μL (含3.6 mg/mL丙酮酸钠、0.1%乳酸钠和10%NCS) , 上覆矿物油, 培养箱中预平衡2 h, 备用。分别收集的ф2 mm和ф2~8mm卵泡COCs移入预平衡的培养液内, 每孔<50枚, 培养板置CO2培养箱 (5%CO2的空气, 饱和湿度, 39℃) 内培养44 h, 期间间断取样, 检测卵泡COCs成熟发育状况。
1.4 不同IVM培养时间
选择约ф2~8mm卵泡卵母细胞为试验对象, 设置6个培养时间组, 每组3~4个重复, 培养条件与1.2.1相同, 培养32 h始间隔2 h采样, 观察卵丘细胞扩散状态, 尔后, 用0.1%透明质酸酶的DPBS处理约5 min, 除去卵母细胞周围的颗粒细胞, 实体显微镜下观察PbΙ排出情况。
1.5 体外受精
室温下将10 mL稀释精液 (当日采集的长白猪冷藏稀释精液, 购自句容动物改良站) 置台式离心机内, 1 500rpm/min, 离心5 min, 弃上清液, 精子沉淀加3 mLDPBS混匀沉淀, 重复离心2次。添加mTBM 2 mL, 混匀, 离心弃上清, 再添加2 mL获能液 (含100μg/mL肝素的mTBM) 混匀沉淀, 离心, 弃上清, 轻轻加入2 mL获能液, 离心管45°倾斜置37℃水浴中呈孵育40~60min, 使精子获能。将IVM后含有Pb1的成熟卵母细胞移入培养箱中预平衡过的mTBM液中洗3次, 然后移入CO2培养箱预平衡4 h (5%CO2, 饱和湿度, 39℃) 的mTBM微滴 (50μL) 中 (10枚/滴) , 最后, 取获能精液上清夜 (约1.0×106个精子/mL) 50μL, 加入CO2培养箱中含有卵母细胞的受精微滴中, 体外受精6~8 h。
1.6 胚胎体外短期培养 (IVC)
卵母细胞体外受精处理后, 先将受精卵移出受精液, 转入NCSU23 (含4mg/m LBSA) 基础培养液中洗涤3次, 然后移入培养箱内预平衡2 h以上的NCSU23培养液中培养 (5%CO2的空气, 饱和湿度, 39℃) 48 h。分别置倒置显微镜下观察和评价受精卵卵裂发育状态。
1.7 数据分析
试验数据采用SPSS11.0进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 不同培养液对卵母细胞IVM的影响
由表1可见, 采用改良TCM 199和NCSU23培养液对卵泡卵母细胞培养44h后卵丘细胞扩散率和第一极体 (Pb1) 排出率未显示统计学差异 (P>0.05) , 故认为该两种培养液系统皆为较理想的培养系统, 可有效地应用于猪有腔卵母细胞IVM。
2.2 pFF对卵母细胞IVM影响
实验结果表明 (见表2) , 与对照组相比较, 添加ф2~5 mm卵泡pFF对COCs卵丘细胞扩散率没有显著差异, 但Pb1排出显著降低;添加ф5~8 mm pFF显著提高了卵丘细胞扩散率和Pb1排出率;而添加2~8 mm (即ф2~5mm和ф5~8 mm混合pFF亦显示出明显地促进COCs成熟作用, 且与5~8 mm组差异不显著 (P>0.05) 。
2.3 外源激素对卵母细胞IVM的影响
表3中所列的数据显示, 与不添加任何外源激素相比较, 单独添加E2对卵丘细胞扩散率和Pb1排出率未表现明显影响;而添加PMSG+HCG或PMSG+HCG+E2的培养液则显著地提高了卵丘细胞扩散率和Pb1排出率 (P<0.05) 。
2.4 不同COCs卵母细胞IVM效果
重复实验表明, COCs经体外培养成熟44 h后, ≤ф2 mm和ф2~8 mm两种卵泡COCs平均卵丘扩散率分别达64.7%和81.4% (P<0.05) , 而Pb1排出率分别为11.8%和50% (P<0.01) , 两者在卵丘细胞扩散率和排出率两个衡量指标上均存在显著差异。这说明本实验中采用的IVM系统仅适合于发育后期 (ф2~8 mm) COCs的成熟培养, 而对发育早期小卵泡 (即≤ф2 mm) COCs的IVM效果较差。
2.5 不同培养时间对卵母细胞IVM的影响
实验中发现 (见表4) , 随着培养时间的适当延长, COCs周围的卵丘细胞呈现出逐渐扩散现象, 培养40 h时扩散率最高, 呈典型辐射状扩散状态, Pb1排出率亦达到最高水平;随着培养时间进一步延长, 卵丘细胞呈现逐步脱落现象, 扩散率亦不断降低, 虽然Pb1排出率降低速率较小, 但已排出的Pb1中退化和崩解的比例明显增加。由此认为, 对于ф2~8 mm COCs的IVM来讲, 在选择使用的改良TCM199培养系统中的最佳IVM时间为40 h左右。
%
注:同一列中标有不同字母的数据表示差异达到显著水平 (P<0.05) , 下同
%
注:大部分卵丘细胞呈不完全扩散, 未发现典型的辐射状扩散状态
注:同一列中标有不同字母的数据表示差异达到显著水平 (P>0.05)
2.6 体外受精卵裂率
多次重复实验表明, 卵母细胞体外成熟培养40 h后, 已排出PbΙ的成熟卵母细胞体外受精后2-细胞卵裂率为20.0%~36.0%, 平均达29.2%以上;4-细胞平均卵裂率达15.3%。本试验中652个卵巢采用抽吸法共采集可用卵母细胞4679枚, 平均每个卵巢可用卵母细胞为7.2枚;根据最初采集的可用卵母细胞数量推算, 每采集3枚卵母细胞可获得1枚2-4-细胞胚胎。
3 讨论
目前, 猪卵母细胞的体外成熟培养主要选择NCSU23和M199两种系统。NCSU23配方简单, 用作猪胚胎发育培养效果较好, 可使猪胚越过体外培养4-细胞阻滞;TCM 199培养液添加外源激素成分后可有效地促进卵母细胞成熟。从经济的角度考虑, 建议大量COCs培养时采用M199粉剂配制的成熟培养液。在人卵母细胞体外成熟培养中, 添加成分E2有利于胞质成熟[3]。但在牛卵母细胞体外成熟培养中, 最初培养时间阶段 (8 h前) 添加E2会引起卵子发育阻滞;而8 h后添加则增加核异常比例;但不影响胞质成熟[4]。本实验在猪卵母细胞卵母细胞体外成熟培养证明, 在含有PMSG和HCG的培养系统中添加E2对卵母细胞成熟发育未发现不良影响, 且添加E2后有利于卵丘细胞的充分扩散。据报道, pFF包含有多种因子, 能够促进卵丘细胞的扩散以及卵母细胞核成熟和受精能力[5], 其中含有的高浓度超氧歧化酶成分对培养中的卵母细胞有显著保护作用[6]。本实验亦取得相似的结果, 但不同发育阶段pFF添加效果有一定的差异。
一般情况下, 猪卵母细胞体外成熟培养需要30~48 h。本研究中, 32 h以后卵母细胞出现Pb1, 40 h成熟率最高, IVM 52 h时部分卵母细胞出现退化现象, 卵周隙明显增大, 超大或超小Pb1增多。目前, 进行动物卵泡COCs体外培养时许多学者往往以卵丘细胞扩散状态作为判断卵母细胞是否成熟的指标, 该指标在大多情况下是比较简单易行的, 可在程度上反映卵母细胞成熟状态。但是, 我们在实验过程中发现猪卵丘扩散度与Pb1的排出率在某些情况下并不一定吻合。因此, 认为应将卵丘细胞扩散和Pb1排出两者结合在一起作为衡量多数动物卵母细胞IVM成熟的指标, 特别是Pb1排出率指标更为重要。
本研究为了获得较多的COCs, 选择卵泡直径2~8 mm内的卵母细胞为主要培养对象。由于不同发育程度卵泡卵母细胞在IVM过程中很难达到同步, 这就需要将不同发育程度的卵母细胞分别培养以更好的达到同步成熟。
国内外有关研究成果表明, 猪体内成熟卵母细胞的体外受精卵裂率可达80%[7], 而IVM卵母细胞的IVF卵裂率一般只有30%~40%, 两者差异很大。要使获得更高的卵裂率, 还需要进一步的从选择培养材料以及培养液成分的改进等多方面因素综合考虑, 以完善整个系统。
本研究对影响猪卵母细胞IVM的主要因素进行了比较与分析, 初步建立了利用屠宰场废弃的猪卵巢为材料进行猪早期胚胎体外批量生产的基本方法。今后的研究重点将进一步改进和完善该项技术路线, 提高各技术环节效率, 并深入探讨体外受精卵裂胚的体外发育能力。该技术与胚胎保存和胚胎移植等相关技术结合起来, 可形成一整套猪胚胎体外生产与繁殖技术, 应用于养猪业科研与生产领域。
摘要：介绍了以屠宰场废弃的猪卵巢为材料, 通过系统技术途径得到猪早期胚胎的基本方法。新鲜的猪卵巢采集后, 25～35℃条件下保存, 在3h内进行卵泡卵母细胞与卵丘细胞复合体 (COCs) 采集与分级, 对COCs中卵母细胞体外成熟 (IVM) 、体外受精 (IVF) 及其受精卵体外发育 (IVD) 等关键技术环节进行了系统地探索, 重点探讨了不同发育阶段 (直径大小) 卵泡卵母细胞、不同培养系统与添加成分以及不同培养时间等关键因素对猪卵母细胞IVM的影响, 并对其IVF卵裂能力进行了比较与评价。实验结果表明, 采用mTCM199作为基础成熟培养系统液, 并添加ф5～8mm卵泡液 (pFF) 和雌二醇 (E2) , ф2～8mm卵巢卵泡COCs经IVM40h可得到较高的成熟率 (66.7%) 和IVF卵裂率 (29.2%) 。本研究初步建立了猪2-4-细胞早期胚胎的体外批量生产技术, 可望进一步改进和完善, 应用于养猪业科研与生产实践。
关键词：猪,卵母细胞,体外成熟,体外受精,卵裂率
参考文献
[1]Dorota Lechniak, et al.IVM media, oocyte diameter and donor genotype at RYR1locus in relation to the incidence of porcine diploid oocytesaftermaturationinvitro.Theriogenolo-gy.2005, 64:202～212
[2]张莉, 冯书堂.影响猪卵母细胞体外成熟的相关因素.中国农业科学, 2006, 39 (9) :1891-1896
[3]Tesaric J, Mendoza C.Nongenomic effect of17B-estradiol on maturing human oocytes:Relationship to oocyte development potential.J.Clin.endocrinol Metab.1995, 80:1438～1443
[4]Anna R.Bekervan Woudenberg, Helena T.A.van Tol, et al.Estradiol and Its Membrane-Impermeable Conjugate (Estradiol-Bovine Serum Albumin) During In Vitro Maturation of Bovine Oocytes:Effects on Nuclear and Cytoplasmic Maturation, Cytoskeleton, and Embryo Quality.Biol.Reprod.2004, 70:1465～1474
[5]Yoshiba, M., Ishizaki, Y., Kawagishi, H., Kojima, Y.Effects of pig fluid on maturation of pig oocytes in vitro and on their subsequent fertilizing and development capacity in vitro.J.Reprod.Fertil.1992, 95:172–177
[6]Tatemoto, H., Muto, N., Sunagawa, I., Shinjo, A., Nakada, A.Protection of porcine oocytes against cell damage caused by oxidative stress during in vitro maturation:role of superoxide dismutase activity in porcine follicular fluid.Biol.Reprod.2004, 71:1150～1157
玻璃化冷冻山羊卵母细胞效果研究 篇3
关键词：玻璃化冷冻,山羊,卵母细胞
卵母细胞冷冻保存不但可以使卵母细胞的供给不受时间和空间的限制,而且对品种资源保护、体外胚胎生产技术的商业化等也具有重要意义。自1985年W.F.Rall等[1]发明玻璃化冷冻方法并冷冻保存小鼠胚胎成功后,又有许多研究表明,玻璃化冷冻法在冷冻保存卵母细胞方面的效果优于传统冷冻方法,但目前玻璃化冷冻保存卵母细胞的存活率和发育能力仍然不能达到实际应用的水平。分析其原因,这与玻璃化冷冻方法含有较高浓度的抗冻保护剂有关。玻璃化冷冻液中的抗冻保护剂浓度高达6～8 mol/L,而传统冷冻方法的抗冻保护剂浓度则低于2 mol/L,说明玻璃化冷冻可以更有效地保护细胞在冷冻过程中冰晶形成所造成的物理性损伤。因此玻璃化冷冻法在冷冻保存卵母细胞方面的效果优于传统冷冻方法。由于玻璃化冷冻液中含有较高浓度的抗冻保护剂,其对细胞也具有较强的化学毒性,因此在一定程度上损伤了经玻璃化冷冻保存卵母细胞的存活率及发育能力。可见,研究开发低毒、高效的玻璃化冷冻液,将是提高玻璃化冷冻保存卵母细胞效果的有效途径之一。
目前,二甲其亚砜(DMSO)和乙二醇(EG)是配制玻璃化冷冻液最常用的2种渗透性抗冻保护剂。EG的优点是毒性低、渗透性高,但形成玻璃化态的能力较DMSO弱;虽然DMSO与EG相比形成玻璃态能力强[2],但其化学毒性较EG大,且渗透性相对较差[3]。如果将2种抗冻保护剂联合应用于配制玻璃化冷冻液,可显著降低各种抗冻保护剂的浓度,因此能够降低玻璃化冷冻液中抗冻保护剂的化学毒性,同时仍可以保证玻璃化冷冻液具有较好的形成玻璃化态的能力。
在采用含有高浓度抗冻保护剂的玻璃化冷冻液保存卵母细胞过程中,其毒性作用之一是增加了卵母细胞质内Ca2+游离浓度,孤雌激活卵母细胞[4,5]。有研究证实:玻璃化冷冻液中的Ca2+和DMSO、EG均可以使卵母细胞质内Ca2+浓度瞬时升高,并孤雌激活卵母细胞;但在不含Ca2+的玻璃化冷冻液中的EG并不引起显著性的Ca2+浓度增加;而无论玻璃化冷冻液中是否含Ca2+,DMSO都会引起细胞内Ca2+浓度增加[4,5]。据此推断,采用不含Ca2+的玻璃化冷冻液,并将DMSO在玻璃化冷冻液中的浓度控制在较低水平,将有助于提高玻璃化冷冻保存卵母细胞的效果。
因此,研究以山羊卵母细胞为材料,研究在不含Ca2+的玻璃化冷冻液中,不同浓度配比的DMSO和EG这二种抗冻保护剂对冷冻保存山羊体外成熟卵母细胞效果的影响,旨在探索适宜的玻璃化冷冻液配方,以提高卵母细胞冷冻保存后的存活率及发育能力。
1 材料
1.1 OPS管的制备
参照朱士恩等[6]的方法制备OPS管,用自制的小酒精灯明火加热0.25 mL的塑料管,变软后拉成OPS管。OPS管的内径为0.02～0.03 mm,管壁为0.02 mm,待冷却后用刀片将其切断,得到2支OPS管,细端长度为2～3 cm。
1.2 溶液的配制
FS液的配制:30%聚庶糖(Fico1170)+0.5 mol/L蔗糖+3.0 g/L牛血清白蛋白(BSA),溶液为无Ca2+的DPBS。预平衡液:以无Ca2+的DPBS为基础液,3种预平衡液的组成见表1。玻璃化冷冻液以FS液为基础液,3种玻璃化冷冻液组成见表1。0.5 mol/L解冻液:将0.5 mol/L的蔗糖溶于1 L无Ca2+的DPBS。0.25 mol/L解冻液:将0.25 mol/L的蔗糖溶于1 L无Ca2+的DPBS。
1.3 卵母细胞的采集及体外成熟培养
从河北省唐县定点屠宰场收集山羊卵巢,保存于30 ℃左右盛有生理盐水的保温瓶中,1～4 h内运回实验室。用生理盐水洗涤3次后,用刀片划破(切剖法)卵巢上直径为2～6 mm的卵泡,在放有采卵液的培养皿中洗刷几次,将卵丘卵母细胞复合体(COCs)冲洗下来,在实体显微镜下用口吸管挑选形态正常、胞质均匀、颗粒细胞不少于3层的COCs移入100 μL成熟培养液[M199液+100 μL/L 半脘氨酸+10 μg/mL卵泡刺激素(FSH)+10 μg/mL黄体生成素(LH)+1 μg/mL雌二醇(E2)+10%FCS]微滴中,微滴上覆盖矿物油,每个微滴放入20枚COCs,在38.5 ℃、5% CO2饱和湿度的CO2培养箱中成熟培养22 h。用口吸管吹打除去部分颗粒细胞,以卵母细胞周围保留2～3层颗粒细胞为宜。洗净后供冷冻试验用。
2 方法
将体外成熟培养22 h的山羊卵母细胞按3种方法进行处理:1)卵母细胞在玻璃化冷冻液中进行暴露处理,但不投入液氮中进行冷冻保存(毒性处理);2)卵母细胞利用玻璃化冷冻液进行冷冻保存(冷冻保存);3)卵母细胞既不进行毒性处理,又不进行冷冻保存(对照)。将经过处理的卵母细胞,分别进行体外受精及体外胚胎发育培养,统计相关指标。
2.1 卵母细胞的玻璃化冷冻-解冻
调节室温至25 ℃,卵母细胞的玻璃化冷冻-解冻均在37 ℃的恒温板上完成。成熟培养22 h的卵母细胞用口吸管吹打除去部分颗粒细胞,在预平衡液中平衡30 s,移入玻璃化冷冻液中平衡25 s,将5～6枚卵母细胞吸入OPS管中,直接投入液氮中冷冻保存。解冻时,从液氮中取出OPS管后,将含有卵母细胞的部分直接浸入盛有0.5 mol/L解冻溶液的表面皿中,解冻后将卵母细胞用口吸管轻轻吹出,将回收的卵母细胞立即移入新鲜的解冻溶液中平衡3 min,移入0.25 mol/L解冻溶液中平衡2 min,脱出反抗冻保护剂后用成熟培养液洗3次,移入成熟液,于38.5 ℃、5% CO2饱和湿度的CO2培养箱中恢复培养2 h。在显微镜下观察统计各组卵母细胞的正常形态数。
2.2 体外受精
将成熟培养24 h的COCs用口吸管吹打除去部分颗粒细胞,在受精液(SOF 液+20%热灭活发性羊血清+5 U/mL肝素钠)中洗涤3次,移入30 μL的受精液微滴中,每个微滴放入约10枚卵母细胞。通过上游法制备体外受精(IVF)精子,方法是将解冻的500 μL冻精放入盛有2 mL预平衡受精液的底层,1 h后移出含有活精子的上层液约800 μL,并测定精子密度。每个受精滴中加入精子的密度为1×106/mL。精子和卵母细胞在CO2培养箱中培养24 h。
2 3 胚胎发育
体外受精24 h后,将假定受精卵从受精液移入发育液,用口吸管吹打除去颗粒细胞,在发育液中洗涤3次,移入30 μL发育液微滴中(预先在培养箱中平衡4 h),每个微滴放入15～20枚受精卵,置于含有混合气(5% CO2、5% O2、90% N2)、38.5 ℃饱和湿度的CO2培养箱中进行体外发育培养,每48 h半量换液1次。受精当天计为第0天,第48小时观察卵裂数,第120小时观察桑葚胚数,第192小时观察囊胚数。
2.4 地衣红(Orcein)染色液法测定卵母细胞核相
将卵母细胞/受精卵从培养液中取出,用PBS液洗3次,放在载玻片上,排成一条直线,盖上盖玻片,不要将卵母细胞/受精卵压碎,在4 ℃固定液中固定48 h,再用Orcein染色液染色9 min,用脱色液脱去染色液,用指甲油封片。在相差显微镜下观察卵母细胞核相,判定卵母细胞是否被孤雌激活。
2.5 统计分析
采用SPSS 11.5中的配对样本t检验对试验数据进行统计分析,P<0.05表示差异显著。
3 结果与分析
3.1 卵母细胞暴露在不同玻璃化冷冻液中对其正常形态数和孤雌激活数的影响(结果见表2)
注:同列数据肩标字母相同表示差异不显著(P>0.05),括号内数据均为百分率(%)。
由表2可知:在玻璃化冷冻液1,2,3中暴露后,卵母细胞的形态正常率分别为97.1%、97.3%、97.3%,与对照组的形态正常率(100%)相比差异不显著(P>0.05),说明卵母细胞仅在玻璃化冷冻液1,2,3中暴露处理不会对其形态造成损伤。在玻璃化冷冻液1,2,3中暴露后,卵母细胞的孤雌激活率分别为1.0%、2.7%、3.5%,与对照组孤雌激活率(0)相比差异不显著(P>0.05),说明玻璃化冷冻液1,2,3的化学成分对卵母细胞没有造成明显的毒害作用。可见,玻璃化冷冻液1,2,3对卵母细胞不具有明显的化学毒性。
3.2 卵母细胞暴露在不同玻璃化冷冻液中对其体外受精及胚胎发育能力的影响(结果见表3)
注:同列数据肩标字母相同表示差异不显著(P>0.05),字母不同表示差异显著(P<0.05),括号内数据均为百分率(%)。
由表3可知:采用玻璃化冷冻液1,2,3保存卵母细胞,卵裂率及囊胚率均显著低于对照组(P<0.05),说明玻璃化冷冻保存卵母细胞均会在一定程度上损伤其受精及胚胎发育能力。对玻璃化冷冻液1,2,3冷冻保存山羊卵母细胞的效果进行比较,玻璃化冷冻液2冷冻保存卵母细胞的囊胚率(13.8%)显著高于玻璃化冷冻液1(5.7%)和玻璃化冷冻液3(5.1%)(P<0.05),说明玻璃化冷冻液2冷冻保存山羊卵母细胞的效果优于玻璃化冷冻液1,3。
4 讨论与小结
山羊卵母细胞在玻璃化冷冻液1,2,3中进行暴露处理,卵母细胞并未表现出异常孤雌激活现象,原因之一是玻璃化冷冻液中不含Ca2+。Ca2+作为卵母细胞激活的中间调节物,其在细胞内瞬时升高是引起第2次减数分裂中期(MⅡ期)卵母细胞被孤雌激活的重要原因[7],卵母细胞在含Ca2+玻璃化冷冻液暴露过程中,容易导致胞质内Ca2+浓度瞬时升高,从而引起卵母细胞孤雌激活。这与田树军等[8]发现,含Ca2+的玻璃化冷冻液对体外成熟绵羊卵母细胞的孤雌激活具有增强作用的结果一致。S.Succu等[9]采用以Ca2+为基础液配制的玻璃化冷冻液冷冻保存绵羊卵母细胞,孤雌激活率高达54.5%。 引起卵母细胞孤雌激活的另一原因可能是玻璃化冷冻液中含有较高浓度的DMSO。以往的研究发现:DMSO可以引起多种细胞内Ca2+浓度的瞬时升高[10]。M.G.Larman等[4]发现,小鼠MⅡ期卵母细胞暴露于以DMSO和EG作为抗冻保护剂的玻璃液中可能引起细胞内Ca2+浓度升高,并且无论冷冻液中是否含Ca2+,DMSO都会引起细胞内Ca2+浓度升高,而不含Ca2+的玻璃化冷冻液中EG并不引起显著性的Ca2+浓度增加。田树军等[11]研究发现:玻璃化冷冻液中的DMSO对体外成熟绵羊卵母细胞具有孤雌激活作用的研究结论支持了这一观点,并进一步证实卵母细胞被孤雌激活后引起卵母细胞皮质层部分皮质颗粒提前释放到卵周隙,导致透明带变硬,从而降低精子穿透卵子的能力。通常玻璃化冷冻液中DMSO所占体积浓度在15%以上,试验中玻璃化冷冻液中DMSO体积浓度分别降低,为5%、2.5%、0,然而试验组卵母细胞的受精率仍然低于对照组,说明含有低浓度DMSO抗冻保护剂的玻璃化冷冻液依然对山羊卵母细胞的体外受精能力具有一定程度的损伤。但这种损伤是由玻璃化冷冻液中抗冻保护剂的化学毒性所致,还是冷冻过程所造成的物理性损伤,还有待于进一步研究。
尽管采用玻璃化冷冻液1,2,3保存山羊卵母细胞,囊胚率与对照组相比显著降低,但玻璃化冷冻液2冷冻保存山羊卵母细胞的囊胚率达到13.8%,显著高于玻璃化冷冻液1(5.7%)和玻璃化冷冻液3(5.1%),说明玻璃化冷冻液2更适合于山羊卵母细胞的冷冻保存。研究的效果好于S.Succu等[9]采用玻璃化冷冻液保存绵羊卵母细胞囊胚率为0的结果,以及田树军等[8]采用玻璃化冷冻液保存绵羊卵细胞囊胚率为7.1%的结果。
综上所述,玻璃化冷冻液2(27.5%EG+5%DMSO) 不产生引起山羊卵母细胞被孤雌激活的化学毒性作用,用玻璃化冷冻液2冷冻保存山羊卵母细胞可获得较为理想的胚胎发育效果。
参考文献
[1]RALL W F,FAHY G M.Ice-free cryopreservation of mouse em-bryos at-196 degrees C by vitrification[J].Nature,1985,313:573-575.
[2]FAHY G M,MACFARLANE D R,ANGELL C A,et al.Vitrifica-tion as an approach to cryopreservation[J].Cryobiology,1984,21:407-477.
[3]ALI J,SHELTON J N.Design of vitrification solutions for the cryo-preservation of embryos[J].J Reprod Fertil,1993,99:471-477.
[4]LARMAN M G,SHEEHAN C B,GARDNER D K.Calcium-freevitrification reduces cryoprotecatant-induced zona pellucida hard-ening and increases fertilization rates in mouse oocytes[J].Repro-duction,2006,131:53-61.
[5]田树军.绵羊卵母细胞玻璃化冷冻保存及胚胎体外生产技术研究[D].北京:中国农业大学,2006.
[6]朱士恩,曾申明,吴通义,等.OPS法玻璃化冷冻牛卵母细胞的研究[J].中国农业科学,2002(6):700-704.
[7]DE LAFUENTE R,KING W A.Developmental consequences of kar-yokinesis without cytokinesis during the first mitotic cell cycle of bo-vine parthenotes[J].Biol Reprod,1998,58(4):952-962.
[8]田树军,闫长亮,杨慧欣,等.绵羊体外成熟卵母细胞OPS法玻璃化冷冻保存试验[J].中国畜牧杂志,2007,43(13):9-12.
[9]SUCCU S,LEONI G,BERLINGUER F,et al.Vitrification devicesaffect developmental competence and biochemical properties of IVMovine oocytes(abstract)[J].Reprod Fertil Dev,2005,18:163.
[10]MORLEY P,WHITFIELD J F.The differentiation inducer,dimethylsulfoxide,transiently increases the intracellular calcium ion concen-tration in various cell types[J].J Cellular Physiology,1993,156:219-225.
卵母细胞成熟中钙离子的研究概况 篇4
1 钙振荡
几乎所有的生理活动都受Ca2+的调控。钙离子在生命的开始就触发受精过程, 控制细胞发育和分化成为特定类型的细胞, 然后调节细胞的各种生理活动, 最后参与细胞凋亡过程。
迄今为止研究的所有动物卵母细胞在受精时, 都有一个共同的现象, 即胞质游离Ca2+浓度从静息状态的40~100 nmol/L升高至600~1 000 nmol/L水平, 并以波的形式从精卵结合点向卵子的其他部位扩展。在哺乳动物受精诱导的Ca2+浓度变化表现为有规律的跃升, 即Ca2+波动或振荡, 而非哺乳类受精诱导的卵内游离Ca2+浓度仅表现单一升高。Carroll和Swann在l992年王晓丽, 辛立江, 成俊萍, 潘红平, 石德顺*
(广西大学动物科学技术学院, 广西南宁530005)
首次报道在小鼠卵母细胞体外自发成熟过程中存在自发的Ca2+波动, 周期约1~3 min, 持续1~2 h。同时, 发现另一种对thimerosal敏感的钙离子波, 它们均可导致GVBD前卵母细胞内Ca2+波动的产生。Li等在小鼠卵母细胞成熟分裂过程中观察到另外一种Ca2+的波动, 其周期约10 min, 持续1 h, 这种形式的Ca2+波动与GVBD的发生相关联, 不发生GVBD的卵母细胞不出现这种形式的Ca2+波动。许多研究证实, 哺乳动物精子获能和顶体反应过程中伴随着Ca2+内流, 使细胞内游离Ca2+呈现多次有规律的脉冲升高, Ca2+在精子获能和顶体反应过程中起着主导作用。且有大量报道在卵激活时存在Ca2+的波动。邓满齐等证实乙醇、电刺激等多种激活方法都会引起胞质Ca2+升高。Vitullo等通过人工激活卵母细胞可使胞质Ca2+重新分布, 呈现脉冲升高。
目前认为引起钙振荡的机制有两种:一是认为钙库排空后对IP3和Ryanodine的敏感性立即降低, 使排空的钙库对外来的连续刺激产生一个不应期。与此同时钙库排空后开启质膜上的Ca2+通道使胞外Ca2+内流。胞外Ca2+内流后, 使排空的钙库再次充盈并恢复对IP3和Ryanodine的敏感性, 从而引起第二次Ca2+释放。这种周而复始的过程导致胞质Ca2+浓度有规律地波动。此外, 还有人认为, 当外界的信号与钙蛋白结合的受体或结合酪蛋白激酶的受体作用, 使细胞内磷酯酶C (PLC) 水解4, 5-二磷酸磷酯酰肌醇 (PIP2) 产生IP3, IP3与细胞内Ca2+库的受体结合, 激动贮存的Ca2+的释放或引起外Ca2+的流入。当细胞内游离Ca2+的水平超过一定阈值细胞内钙库又吸收胞质中的Ca2+, 引起细胞内Ca2+的波动。但是胞质Ca2+波动的机制目前仍处于假说阶段, 有许多问题还没有解决。
2 钙离子的检测方法
细胞内的钙以三种方式存在: (1) 牢固地结合在细胞结构成分或大分子上。 (2) 以离子形式自由状态存在于细胞中, 即细胞内游离钙。 (3) 与高容量低亲和的钙结合蛋白松弛的结合而存于质网、线粒体等胞内钙库中, 当信号传来时能将钙释放入胞浆中成为游离钙。最初人们一直难以找到好的方法测定钙浓度, 这主要是由于细胞内游离钙浓度很低;且没有合适的探针既可导入细胞和Ca2+很好地结合又不损伤细胞。第一次测定活细胞钙浓度是60年代用水母发光蛋白测定巨肌肉细胞中的钙浓度。70年代出现了两类方法:双偶氮吸光染料法和钙选择性微电极法。1982年出现了荧光法;随后, 荧光染料不断更新, 各种方法不断增多。这的确为我们提供了方便, 但倘若选择方法不恰当, 将影响实验的准确性;因此在研究时选择合适的测定方法显得尤为重要。目前常见的检测方法有:Ca2+活化的发光蛋白法、偶氮染料法、钙离子选择性微电极测定法、放射示踪法、核磁共振法 (NMR) 、荧光标记法。
3 卵母细胞成熟分裂过程中Ca2+的研究现状
哺乳动物卵母细胞成熟和卵受精过程是Ca2+依赖的, 且在卵的激活方面起着主导作用。自从1992年Carroll和Swarm首次报道在小鼠卵母细胞体外成熟分裂过程中存在自发的Ca2+波动后, 许多研究者对其进行了大量的实验研究。研究表明, 钙与卵母细胞GVBD的关系的解释具有争论性。Tombes发现小鼠卵母细胞GVBD的发生不依赖细胞内钙的变化。王晨光, 邓满齐通过研究也得到相同的结论, 认为GVBD的发生是不依赖于Ca2+变化的事件。而Li等在小鼠卵母细胞成熟分裂过程中观察到的Ca2+波动与GVBD的发生相关联, 不发生GVBD的卵母细胞不出现这种形式的Ca2+波动。Carroll等用heparin拮抗IP3均导致牛和猪卵母细胞的GVBD的抑制, 认为卵母细胞发生GVBD是依赖Ca2+的。另外, 外钙与卵母细胞GVBD发生之间的关系, 许多学者仍持有不同意见。有研究报道小鼠的卵母细胞在无Ca2+的培养基中培养2 h, 就几乎不能存活, 除非卵母细胞先在含Ca2+的培养基中培养中培养2 h, 使成熟分裂恢复, 说明小鼠卵母细胞只有外钙存在时才可发生GVBD。通过使用钙离子通道阻断剂-rerapamil和钙离子载体A23187等手段来研究细胞外钙的作用发现, 有些种类的卵母细胞在缺Ca2+的培养基中, 对减数分裂的恢复没有明显的影响。但实验都是在添加血清的条件下进行的, 也许血清中所含的少量Ca2+足以使减数分裂恢复。对细胞外钙作用的相互矛盾的报道, 可能是实验方法造成的误差, 或是不同种类卵母细胞对Ca2+的敏感性不同所造成的。王晨光, 邓满齐等用BAPH/AM鳌合小鼠细胞内的钙离子会使染色体的向极运动不能发生, 抑制排出第一极体。李明文等在小鼠GVBD后的发育过程中, 通过焦地酸钾原位定位法得到, 此时在纺锤体两极区域有较多的Ca2+分布, 可能与染色体的向极运动有关。
越来越多的研究表明, 无论是受精还是人工刺激, 细胞内游离Ca2+浓度升高是卵激活的初始信号。据报道, 仓鼠GV期卵受精诱导的Ca2+波动振幅仅为成熟卵的1/20, 但对于小鼠GV期卵受精诱导Ca2+波动则报道不一。邓满齐等对小鼠卵母细胞不同发育时期受精诱导Ca2+波的研究发现, MI期及MII期卵受精诱导Ca2+波动的振幅明显高于GV期卵, 且认为Ca2+波的产生源于钙库Ca2+的释放, 可兴奋性的不同可能与钙库Ca2+释放的敏感性有关。另外, 人工激活刺激亦能诱导卵母细胞产生受精样Ca2+变化。邓满齐, 范必勤等证实, 乙醇、钙离子载体A23187、电刺激等多种激活方法都会引起胞质Ca2+升高, 且用乙醇刺激MII期卵母细胞可诱导胞质游离Ca2+浓度多次升高;单次电刺激仅可诱导Ca2+浓度单次升高;多次电刺激则诱导Ca2+浓度多次升高, 并与之形成一一对应关系。这与兔上的实验结果一致。刘红林等通过向小鼠卵内注入Ca2+而引起卵激活, 说明Ca2+浓度升高在卵母细胞激活中有重要作用。
卵巢卵母细胞 篇5
在生殖系统细胞培养方面,基础培养液主要用M199培养液或DMEM培养液。DMEM培养基 (Dulbcco's Modifed Eagle Medium)含L-谷氨酰胺,不含碳酸氢铵、丙酮酸钠,2~8℃保存。DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基,DMEM细胞培养基是在MEM培养基的基础上研制的。与MEM比较增加了各种成分用量,同时又分为高糖型(低于4 500 g/L)和低糖型(低于1 000 g/L)。高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长,适于生长较快、附着较困难肿瘤细胞等。 这种培养基的特点:①氨基酸含量为依格尔培养基的2倍,且含有非必需氨基酸,如甘氨酸等; ②维生素含量为依格尔培养基的4倍; ③含有糖酵解途径中的重要物质——丙酮酸;④含有微量的铁离子。该类培养基广泛应用于疫苗生产和各种初代病毒宿主细胞的细胞培养及单一细胞培养;如:A9、3T6、BALB/3T3、COS-1、COS-3、COS-7、L6、WEHI-3b等细胞系的培养。
M199培养液含Earle’s salts 和 Hank’s salts。 Media 199可促使鸡胚成纤维细胞在无血清条件下生长。与配入血清可用于各种细胞的培养。Earle’s salts组成碳酸盐缓冲液,可维持在CO2培养箱中的pH值,在大气环境下会使培养液pH值迅速上升。Hank’s salts的盐溶液用于均衡大气,在CO2培养箱中使用会使培养液pH值迅速下降。
1 卵母细胞体外培养液成分
目前, 卵母细胞成熟液大部分采用稳定性较好的TCM199 作为基础培养液。在牛上, TCM199 添加10 %血清、促性腺激素和雌激素,卵母细胞成熟率可达到90 %;在猪上,卵母细胞成熟液除用TCM199 外,NCSU223 也被较多使用,但成熟率差别不大。由于在使用TCM199 时需加入成分比较复杂的血清,这使得在研究中难以明确找出影响卵母细胞成熟的因素及其程度。许多学者通过研究,寻找一些成分明确的培养液。研究结果表明,合成培养液(如SOFM、KSOM) 中用BSA 或PVA 及氨基酸代替血清,作为成熟培养液,可使卵母细胞成熟,并能进行受精后的发育( Eckert 等,1995)。用复合输卵管合成液(cSOFMaa) 培养成熟的牛卵母细胞发育到囊胚的能力与TCM199 + NCS培养成熟的卵母细胞相同(Wat son 等,1999) 。
1.1 激素
目前,绝大多数研究者在卵母细胞的体外成熟培养中,都添加促性腺激素或类固醇激素或两者的混合物,但它们对卵母细胞成熟、受精和早期发育的作用及作用机理尚未完全了解清楚。在猪的卵母细胞体外成熟液中加PMSG培养,成熟率为67.7 %,而不加的仅为17.8 %,可见生殖激素对促进卵母细胞成熟有明显作用(秦鹏春等,1995)。大量研究结果表明,FSH 可使卵丘细胞扩散达100 %,并且卵丘细胞的扩散程度随着FSH 浓度的增加而提高(Choi 等,2001)。0.05IU ree2hFSH添加到COCGs 的培养液中,导致卵母细胞胚泡破裂,COCGs 直径增加(Van 等,1996) ,2 ×10 - 3 IU/ mL FSH能够刺激腔前卵泡的生长及腔的形成,并且抑制颗粒细胞的凋亡(Mao 等,2002)。在无FSH 的培养中卵母细胞成熟率显著降低,且退化量达36%(Bottcher等,1991)。但也有学者认为,在含有血清的成熟液中添加FSH ,既没有提高卵母细胞形成第一极体的比例,也没有显著影响体外受精和核移植后的发育( Keefer 等,1993)。Brackett (1989)研究结果表明,卵母细胞体外成熟培养基中加入LH能促进卵母细胞发育,并有利于随后的体外受精和体外培养,而Fukui 等(1989)则认为LH无这一作用。江金益等(1989)添加人绒毛膜促性腺激素、促卵泡素,奶牛卵母细胞成熟率为83.5 % ,效果都很明显。类固醇激素对哺乳动物的作用仍有争论,在卵泡培养过程中,类固醇合成的抑制剂对卵母细胞成熟后的受精和发育能力有不良影响。Singh 等(1993)报道猪卵母细胞体外成熟在雌二醇和FSH 存在时,胚泡损伤率下降。
1.2 血清
血清中含有蛋白质、维生素、脂肪、激素、氨基酸等营养物质和多肽类生长因子,可防止透明带硬化和促进受精的发生。因此,体外成熟卵母细胞的大多数试验均添加一定浓度的血清,能有效提高卵母细胞的体外成熟率。试验结果表明,对于牛卵母细胞的体外成熟,发情牛血清和犊牛血清均优于BSA。已有研究结果表明,血清中可能存在不利于胚胎发育的成分,造成胎儿体重过大、流产等综合症,且血清质量和产地等的影响,使试验结果有大的误差。鉴于由血清培养产生的种种问题,人们在卵母细胞体外成熟液中常添加血清替代物,如:牛血清白蛋白、聚乙烯醇、氨基酸和非离子型表面活性剂Twin 280等。
1.3 生长因子和细胞因子
在基础培养基中添加各种生长因子和细胞因子,如胰岛素、EGF 、IGF21 、白血病抑制因子、转化生长因子、重组牛生长激素(rbGH)等,对卵母细胞的生长、成熟起重要调节作用。EGF是一种卵泡卵母细胞成熟的诱导剂,能促进卵母细胞的体外成熟。I m 等(1995)发现,30 μg/L 的EGF有利于牛卵泡卵母细胞的体外成熟,使达到第2 次减数分裂中期的卵母细胞达97%。
1.4 卵泡液
卵泡液是卵母细胞体外发育的介质,含有大量来自血清的生长因子和卵母细胞及卵泡细胞的分泌因子。卵泡液所含的这些因子在体内随体内分泌状态的变化而变化,用于体外培养时会表现出对卵母细胞成熟的促进和抑制两种相反的作用。卵泡液的促进作用主要表现在提高卵母细胞质成熟的质量,增加胚胎的发育能力。控制卵泡液在培养液中添加的浓度,可以清除其对核成熟的抑制作用(石德顺等,1994)。另据报道,成熟的抑制作用与所采卵泡的大小有关,来自小卵泡(<3 mm)和中卵泡(3~8 mm)的卵泡液抑制卵母细胞核成熟,大卵泡(>8 mm)对核成熟没有抑制作用[1]。
1.5 抗氧化物质和维生素
卵母细胞体外成熟过程中,特别在20%氧气的气相环境中,产生许多对卵母细胞成熟和胚胎发育有害的ROS ,它能导致线粒体功能障碍,损害DNA 、RNA 和蛋白质,抑制精卵结合,是引起细胞死亡的一个重要原因,谷胱甘肽(GSH)能清除不利于细胞发育的过氧化物,细胞本身能合成GSH ,且不同的发育时期,细胞内GSH含量不同,这在小鼠、仓鼠、牛和猪已得到证实。外源性GSH、半胱胺、β2巯基乙醇、半胱胺酸和胱胺酸等已在不同物种的成熟体系中被添加。在低氧(5% 或7%氧气)条件下,卵母细胞体外成熟液中是否需要添加抗氧化物质,还有待进一步研究。Bormann等(2003)在山羊卵母细胞的体外成熟液中添加维生素,促进胚胎的发育,研究结果证明,维生素是卵母细胞培养液中一种重要成分[2]。
王国华等(2007)采用无血清培养液,其成熟液OM的基础成份为:9.5 g/L M199(Gibico)+10 mmol/L Hepes+1 mmol/L 丙酮酸钠+25 mmol/L 谷氨酰胺+0.075 U/mL 尿促性腺激素(HMG)(Sereno) +1 μg/mL 17β雌二醇(17β-E2) 。根据实验设计在OM 液中添加不同物质配成0.3% BSA(m/V)、1% PVA(m/V)、1% ITS(V/V) 和5% FBS(V/V)( Gibco)。培养液的pH 控制在7.2~7.4,用前置于CO2 培养箱中预先平衡2 h[3]。
2 颗粒细胞体外培养液成分
颗粒细胞培养采集的牦牛卵巢用PBS反复冲洗几次后,用注射器从2~6 mm的卵泡中抽吸卵泡液。取0.5 mL卵泡液加入灭菌离心管,再加入2 mL/ L透明质酸酶1 mL,摇匀,于38.5℃置5 min,然后加入3 mL BO液,立即离心5min (1 500 r/ min),弃去上清液;再加入约3 mL M199 + 200 mL/ L FBS培养液,离心5 min (1 500 r/min),弃去上清液;给沉淀( 颗粒细胞) 加入适量的M199 + 200 mL/ LFBS ,将其浓度稀释成0.5 ×107 个/ mL 。吸取10μL颗粒细胞悬液,注入已在CO2 培养箱平衡2 h的成熟培养液滴内(50 μL/滴)或培养孔内,待颗粒细胞扩散后,吸弃大块的凝聚物。最后将颗粒细胞液滴放入培养箱培养,备用(颗粒细胞的最终浓度约为106 个/mL)[4]。王妍等(2007)采用D/F12 培养基+ 100 U/ mL青霉素+ 100 μg/mL链霉素+ 0.5 μg/ mL两性霉素2B +体积分数10 % FBS[5]。
3 输卵管上皮细胞体外培养液成分
输卵管上皮细胞体外培养液成分组成为:M 199+8%血清+HEPPES+NaHCO3+牛磺酸+丙酮酸钠+乳酸钠[6]。王益兵等(2007)采用的是DMEM/F12[7]。
4 子宫内膜细胞体外培养液成分
子宫内膜细胞体外培养液成分组成为:DMEM、10%胎牛血清、HEPES缓冲液、两性霉素B、青霉素、链霉素等[8]。李幼飞等(2007)采用20%胎牛血清的DMEM培养液[9]。
5 滋养层细胞体外培养液成分
李珍等(2005)的滋养层细胞体外培养液成分组成为:含100 mL/L胎牛血清的DMEM。蒋立艳等(2007)采用DMEM/F12[10]。其中,F12为Ham’s F12 nutrient medium。是动物细胞培养基,成分复杂,含有多种微量元素,最初设计用于克隆二倍体的中国地鼠卵巢细胞。起初是作为一种无血清配方设计的,现在常补加血清用于支持各种正常的和转化细胞的增殖。F12常和DMEM以1∶1结合,称为DME/F12培养基(DME/F12medium),作为开发无血清配方的基础,以利用F12含有较丰富的成分和DMEM含有较高浓度的营养成分的优点。综上所述,各培养液总的来说有如下特点:①DMEM、M199使用最多的基础培养液;②比较而言,卵母细胞的培养液成分最复杂,在基础培养液中还需加入许多其他成分;③无血清培养液,有利于对培养过程中的影响因素的研究,故将会是以后研究的重点所在。
参考文献
[1]蒋立艳,李真,成娅,等.早孕绒毛细胞滋养层细胞分离培养的实验研究[J].第三军医大学学报,2004,26(14):1248-1251.
[2]熊成,苏雷.哺乳动物卵母细胞体外成熟培养的研究进展[J].中国畜牧兽医,2007,34(1):71-74.
[3]王国华,刘凤军,权富生.等.山羊卵母细胞无血清体外成熟培养[J].农业生物技术学报,2007,15(3):424-428.
[4]郭宪,阎萍,许保增,等.牦牛输卵管上皮细胞和卵泡颗粒细胞的培养[J].动物医学进展,2007,28(8):29-32.
[5]王妍,赵晓娥,杨培先,等.小鼠卵巢颗粒细胞的体外培养[J].西北农林科技大学学报(自然科学版),2007,35(8):11-14.
[6]季高峰,董红丽,武建中,等.水牛输卵管上皮细胞的培养[J].黑龙江动物繁殖,2005,13(4):10-11.
[7]王益兵,宋宇轩,朱广琴.等.黄牛输卵管上皮细胞的体外分离与培养[J].西北农业学报,2007,16(4):39-41.
[8]秦海燕,王晶磊,陈加祥.子宫内膜细胞培养方法的研究[J].实用临床医学,2007,8(10):133-135.
[9]李幼飞,李力,俞丽丽.早孕绒毛滋养层细胞体外培养方法的改良[J].重庆医学,2007,36(14):1389-1390.
卵巢卵母细胞 篇6
关键词：兔,卵母细胞,体外成熟,保存温度,运输时间,季节
随着体外受精技术和胚胎移植技术在生产应用中的快速发展以及体细胞核移植和转基因等胚胎工程技术的深入开展,如何稳定地获得高质量的成熟卵母细胞已经成为该领域中一个极其重要的问题。目前,主要依靠超数排卵后用手术的方法从输卵管获得成熟的卵母细胞。但是单纯依靠超数排卵技术获得卵母细胞需要使用激素,不但费用昂贵,试验过程中还需要大量的人力和物力,而且获得的卵母细胞数量有限。而采集屠宰场废弃的兔卵巢,回收其卵母细胞用于体外成熟培养,获得可以用于体外受精、单精子注射和转基因克隆的成熟卵子,这种方法成本低、取材方便,能满足大批量生产体外胚胎的需求,但卵巢的收集和运输往往需要较长的时间,同时屠宰大多数都在夜间进行,给后续的工作带来诸多不便。如果能够建立良好的卵巢保存体系,使其在一定时间内的储存不对卵母细胞的体外成熟和成熟后的发育能力造成不利影响,就能为相应的研究工作和生产应用带来极大的便利。针对以上存在的问题,本研究就兔卵巢运输时的保存温度、运输时间等因素对卵母细胞体外成熟及发育的影响及体细胞核移植技术的实际应用进行了初步研究,旨在获得更多高质量的卵母细胞,为体外受精、转基因、体细胞核移植等胚胎工程技术的研究奠定基础。
1 材料
试验所用试剂除TCM-199购自Gibco公司外,其余均购自Sigma公司。
洗卵液和胚胎培养液(CM):TCM-199+5 mmol/L HEPES+26.2 mmol/L NaHCO3+3%发情牛血清(OCS)。
卵母细胞(COC)体外成熟培养液(M):TCM-199+5%(OCS)+0.2 μg/mL促卵泡素(FSH)+20 ng/mL上皮细胞生长因子(EGF)+5 μg/mL促黄体素(LH)+3.5 μg/mL催乳素(PRL)。
所有培养液均添加60 mg/L青霉素和100 mg/L链霉素,用1 mol/L NaOH溶液将pH值调至7.4,并用孔径为0.22 μm的微孔滤膜过滤消毒。
2 方法
2.1 兔卵巢的收集
试验所用兔卵巢均来自南宁市淡村市场当日清晨屠宰的母兔。在不同季节,母兔宰杀后,将兔卵巢取出分别置于含有K+、Ca2+、Mg2+的20～30 ℃、31～35 ℃、36～40 ℃的生理盐水的保温瓶内,分别在>3 h、≥3～≤4 h、>4 h送到实验室。
2.2 卵母细胞的收集
剪去卵巢周围多余的系膜、脂肪、输卵管等,先用加有双抗的生理盐水反复清洗卵巢,放入75%乙醇中浸泡30 s;再用PBS洗3次,置于装有经过平衡的CCM液的玻璃皿中,用1 mL注射器的针头将卵巢表面的可见卵泡刺破,使卵母细胞流出,迅速在实体显微镜下捡卵。
2.3 卵母细胞的分级选择及体外成熟
卵母细胞的类型通常是以形态学进行分类的:A类为由致密的卵丘细胞层完全包裹的卵子;B类为卵丘细胞层不完全包裹的卵子;C类为完全裸露的卵子,亦称为裸卵。在实体显微镜下,用玻璃吸管选择色泽均匀、大小均一并有完整或部分致密卵丘细胞的卵母细胞,即A、B级卵母细胞,弃去空泡化、色泽不均的卵母细胞及裸卵,然后用洗卵液将选出的卵母细胞清洗2次后,根据试验设计分组放入装有成熟培养液的玻璃平皿中,在38.5 ℃、5%CO2和最大饱和湿度的培养箱中培养22～24 h。
2.4 卵母细胞的体外成熟鉴定
主要通过卵母细胞形态观察来判断成熟情况,正常成熟的卵母细胞胞质均匀,没有空泡,其周围的卵丘细胞发生扩散,呈放射状排列。先将卵母细胞放入0.1%的透明质酸酶中,用玻璃吸管轻轻反复吹打,使周围颗粒细胞脱落,之后将卵母细胞放入洗卵液洗3次,最后在实体显微镜下观察统计。判断标准:胞质完整、均匀,且能观察到第一极体排出的为成熟卵母细胞。
2.5 数据的统计分析
每个试验至少重复3次,所得试验数据均用卡方(χ2)分析,P< 0.05判定差异显著。
3 结果
3.1 不同保存温度对兔卵母细胞体外成熟培养效果的影响(见表1)
注:同列数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)。
从表1可以看出,温度对卵母细胞体外成熟的影响很大,25～30 ℃保存的兔卵巢中的卵母细胞成熟率可达61.09%,显著高于温度为31～35 ℃和36～40 ℃两组(26.30%和15.79%,P<0.05)。
3.2 不同运输时间对兔卵母细胞体外成熟培养的影响(见表2)
注:同列数据肩标字母不同表示差异显著(P<0.05),字母相同表示差异不显著(P>0.05)。
由表2可知,兔卵母细胞成熟率随运输时间的增加而降低,但<3 h和≥3～≤4运回实验室时,卵母细胞体外成熟率差异不显著(P>0.05),分别为64.24%和59.64%;但当运输时间>4 h时,成熟率降低到50.23%,与另两组差异显著(P<0.05)。
3.3 不同季节对兔卵母细胞体外成熟的影响(见表3)
从表3可以看出,春、秋、冬3个季节进行兔卵母细胞体外成熟的效果较好,成熟率分别为64.26%、58.37%、64.86%,显著高于夏季32.65%(P<0.05),但3组间差异不显著(P>0.05),春、冬2个季节稍好于秋季。
注:同列数据肩标字母不同表示差异显著(P<0.05),相同表示差异不显著(P>0.05)。
4 讨论
4.1 卵巢运输时不同保存温度对兔卵母细胞体外成熟的影响
兔宰杀后,在最短的时间内采集卵巢,回收卵母细胞效果最好。但实际上,屠宰场与实验室之间有一定的距离,需要长距离运送,这就存在着卵巢质量受运输温度和时间影响的问题。目前,一般都是保存在含抗生素的生理盐水中,但保存的温度各异。从本试验结果看,兔卵巢运输时保存温度为25～30 ℃时卵母细胞的成熟率显著高于保存在31～35 ℃和 36～40 ℃,保存温度为31～35 ℃的卵母细胞成熟率显著高于36～40 ℃。当温度大于36 ℃时,大部分卵母细胞变形,死卵增多,胞质多数不均匀。Naoi H等[1]研究发现,猫卵巢的储存温度过高会损害卵母细胞减数分裂的能力。从理论上讲,保存温度越接近动物体温越好,即在36～37 ℃的生理盐水中保存卵巢时卵母细胞的成熟应该是最好的,但是从试验数据上看,结果并不是这样的,这可能是因为温度接近动物体温,卵巢代谢活动旺盛,卵母细胞中的物质发生降解造成有害物质积累,另外卵巢在离体的环境中缺乏充足的营养物质供应,使卵母细胞的质量下降较快,当采用和体温相同或更高温度的生理盐水保存卵巢时,卵子受到热应激而影响其成熟后的质量。不同动物卵子对温度的耐受性不同,兔卵母细胞对温度较为敏感,温度过高很容易造成细胞的老化甚至死亡。库尔班·土拉克[2]在研究卵巢运输保存温度对野生梅花鹿卵母细胞体外成熟的影响时发现:梅花鹿卵巢在20～25 ℃保存时,卵母细胞成熟率为77%,且无变形卵子出现;而在10～15 ℃保存时,卵母细胞成熟率为45%,变形率为18%。有学者发现,牛卵巢在37 ℃保存的卵裂率与20 ℃保存相比显著下降;在10 ℃保存30 min就会出现变形卵子。罗光彬等[3]也证实黄牛卵巢保存温度达到36 ℃以上时,卵母细胞的成熟率开始下降。刘青春[4]认为,高温会导致卵巢的新陈代谢加快,卵母细胞可能会过早成熟,而同时产生的大量废物无法及时运出,从而产生毒害作用,致使体外培养时卵母细胞的发育受到不良影响,成熟率下降,降低保存温度可能会避免这些影响,但温度过低也会产生不良影响。因此,在实际运用中,不能因追求在卵巢运回实验室时温度接近体温而一味地提高保存卵巢的初始生理盐水温度,温度下降幅度过大也不利于卵母细胞的成熟。因此,在本研究条件下,卵巢保存温度以25～30 ℃为宜。
4.2 卵巢运输时不同运输时间对兔卵母细胞体外成熟的影响
研究表明,采集到的兔卵巢一般应在4 h内运回实验室,时间太长对卵巢有很大损伤,从而影响卵母细胞的成熟率。本试验也得出了一致的结论,兔卵巢运输时间为4 h以内时,卵母细胞成熟率没有显著差异,而当运输时间大于4 h时,卵母细胞的成熟率显著降低。Wongsrikeao P等[5]研究发现,猪卵巢保存6～12 h,卵巢保存液会产生比卵母细胞多的酸性物质,从而使卵母细胞的pH值下降,导致卵母细胞DNA片段化,不利于卵母细胞的发育。母猪卵巢离体时间的长短直接影响卵母细胞体外成熟及胚胎卵裂率,成熟率和卵裂率均随卵巢离体时间的增加而呈降低趋势。Naoi H等[1]的研究结果表明,为保持卵母细胞的后续发育潜能,猫卵巢在室温下保存不宜超过6 h。Blondin P等[6]的试验结果表明,牛卵巢长时间(7～8 h)保存,会减少卵母细胞体外受精后胚胎的卵裂率和囊胚的形成。进一步的研究表明,卵巢中部分蛋白的变性和DNA的降解对马[7]和猫[8]卵母细胞的发育潜能造成影响。李东伟[9]在研究黄牛的卵母细胞运输时间时认为,卵巢在离体的情况下,卵巢内由于代谢所产生的有毒物以及氧气的供给不足会影响卵母细胞的体外成熟率,运输时间越短越有利于卵母细胞体外成熟培养的成功。何良军等[10]在研究绵羊的卵母细胞成熟时指出,运输时间过长会导致很多卵母细胞老化,生理活动功能降低,虽然对成熟率的影响不大,但会大大降低其体外受精的效果。本试验的结果与以上报道的结果相一致。
4.3 不同季节对兔卵母细胞体外成熟的影响
试验结果表明,季节对于兔卵母细胞体外成熟率有一定影响。春、秋、冬3个季节的卵母细胞成熟率显著高于夏季。分析其原因可能是由于不同季节的水质有差异。另外,虽然兔为四季发情动物,但对于本地区来说,夏天的气温较高,高温会影响母兔的生理机能和繁殖机能,使母兔的发情率大大降低,而在春、秋、冬3个季节兔更易发情。发情季节有大量的卵泡生长,体内的FSH、LH等较高,采集到的卵母细胞经体内激素作用,卵母细胞内产生了更多的激素受体,在体外培养更易成熟。孙桂金[11]在研究中也发现,虽然在发情季节与乏情季节,绵羊卵母细胞在采集数量上差异不显著,但发情季节的卵母细胞成熟率显著高于乏情季节(74.2%、57.3%,P<0.05)。
师如意等[12]在研究中发现,卵母细胞的成熟潜力与季节密切相关,并认为动物在繁殖季节或气候适宜的季节获取的卵母细胞成熟能力较强。因此,在进行兔体细胞克隆等胚胎操作试验时,条件允许的话,可以避开夏天采卵,以防由于卵母细胞成熟质量的降低而影响其发育。
5 结论
总的来说,兔卵巢的保存温度、运输时间和采卵季节对兔卵母细胞的体外成熟培养有很大的影响。兔卵巢保存于25～30 ℃生理盐水中,在4 h内运回实验室为宜;春、秋、冬3个季节经废弃卵巢采集的卵母细胞体外成熟培养质量较好。
参考文献
[1]NAOI H,OTOI T,SHIMAMURA T.Demvelopmental competence ofcat oocytes from ovaries stored at various temperature for 24 h[J].JReprod Dev,2007,53(2):271-277.
[2]库尔班.土拉克.卵巢运输保存温度和时间对野生梅花鹿卵母细胞体外成熟的影响[J].新疆农业大学学报,2008,31(6):63-66.
[3]罗光彬,蔡春花.卵巢保存温度、激素及体外培养时间对延边黄牛卵母细胞体外成熟的影响[J].中国畜牧兽医,2004,6(31):25-26.
[4]刘青春.不同卵巢运输温度和培养方法对卵母细胞体外成熟的影响[J].畜牧兽医杂志,2008,4(27):16-17.
[5]WONGSRIKEAO P,OTOI T,KARJA N,et al.Effect of ovary storagetime and temperature on DNA fragmentation and development of pro-cine oocytes[J].J Reprod Dev,2005,51(1):87-97.
[6]BLONDIN P,COENEN K,GUILBAULT L A,et al.In vitro produc-tion of bovine embryos:developmental competence is acquired beforematuration[J].Theriogenology1,997,47(5):1061-1075.
[7]PEDERSEN H G,WATSON E D,TELFER E.Effect of ovary hold-ing temperature and time on equine granulosa cell apoptosis,oocytechromatin configuration and cumulus morphology[J].Theriogenolo-gy,20046,2(314):468-480.
[8]WOLFE B A,WILDT D E.Development to blastocysts of domesticcat oocytes in vitro matured and fertilized after prolonged cold storage[J].J Reprod Fertil,19961,06(1):135-141.
[9]李东伟.黄牛卵母细胞体外成熟影响因素的研究[D].合肥:安徽农业大学,2002.
[10]何良军,彭莉.绵羊卵母细胞最优运输温度和体外成熟时间的研究[J].塔里木大学学报,2005,17(4):5-7.
[11]孙桂金.绵羊卵母细胞体外成熟、体外受精和胚胎体外培养的研究[D].泰安:山东农业大学,2002.
卵巢卵母细胞 篇7
关键词：东北细毛羊,羔羊,体重,超排激素
幼畜体外胚胎移植技术是根据幼龄母畜卵巢对生殖激素反应敏感, 采用外源促性腺激素处理后生产的卵母细胞数量远高于成年母畜的生理特点, 并与卵母细胞成熟、体外受精和受精卵体外培养技术相结合, 体外生产胚胎并移植后获得大量后代的一种技术。在生产中幼畜的超数排卵受较多因素影响[1~4], 其中关于体重对超排的影响在国内研究较少。本试验探究了不同体重及超排激素和剂量不同对幼羔卵泡发育和体外成熟的影响, 以期为羔羊超数排卵方案的制定及生产实践提供良好的技术和理论支撑。
1 材料与方法
1.1 试验动物
试验动物为发育整齐、体况良好且膘情正常, 经疫病检测合格。4~8周龄未断奶的东北细毛羊母羔, 以母乳喂养为主并适量补饲优质草粉。
1.2 试验设计
1.2.1 不同体重东北细毛羊羔羊卵泡发育及卵母细胞回收数量比较
试验对4~8周龄东北细毛羊羔羊采用相同超排方案, 手术方法收集卵母细胞, 根据体重划分为4.0~5.0 kg、5.0~7.0 kg、7.0~9.0 kg、9.0~11.0 kg, 共计4组。分别统计各组采集的卵泡发育状况和回收卵母细胞比率, 并分析回收比率与羔羊体重的关系。
1.2.2 不同激素和剂量对母羔卵泡发育及体外成熟效果影响
将46只4~8周龄的东北细毛羊母羔分为4组, 具体方法见表1。
每两针间隔为12 h, 注射部位:早针为颈部、晚针为后腿部, 对比卵泡发育、回收卵数量及成熟效果。
1.3 试验方法
1.3.1 羔羊手术方法
最后一针结束后6~10 h手术。术前羔羊禁食24 h, 限量饮水, 环境及手术器械灭菌。供体羊采用前低后高的姿势仰卧保定于自制保定架上, 与地面呈斜角, 肌肉注射速眠新, 麻醉剂量为0.01 m L/kg。进入麻醉后, 打开腹腔, 术者将左手食指及中指由切口伸入腹腔将卵巢轻轻引出体外并摘除卵巢, 然后缝合切口, 常规消毒, 术后解麻药剂量为0.02 m L/kg。
1.3.2 卵母细胞的收集和筛选
无菌条件下用m PBS液润洗12#针头的10 m L灭菌注射器, 然后抽取1.5~2.5 m L m PBS液, 用针头刺入卵泡抽取卵巢表面卵泡液和卵母细胞 (卵泡直径为2~6 mm) , 每抽吸3~5个卵泡后, 将注射器内液体慢慢注入培养皿中, 饱和湿度CO2培养箱精致10 min, 吸弃上清液, 在基础培养液内洗涤3次后于恒温板上检卵。后对卵巢采用纵切法剖开, 除去皮质外的其它组织, 用手术刀以1mm间距切割皮质部分, 在含冲卵液的培养皿内冲洗和静置3次, 沉淀培养皿冲卵液, 从中检出卵丘细胞-卵母细胞复合体。选取A、B级COCs体外培养。
1.3.3 体外成熟培养
颗粒细胞单层的制备从直径为2~4 mm的卵泡中吸取颗粒细胞, 在无Ca2+和Mg2+的Hank's液中反复吹吸、洗涤、离心 (1 500 r/10 min) , 将颗粒细胞置于含15%发情山羊血清的TCM199中, 其最终的颗粒细胞密度为3×106~8×106个/m L。将上述颗粒细胞液置于灭菌的塑料培养皿中, 在38.5℃, 5%CO2, 95%空气、饱和湿度的条件下培养12 h, 形成颗粒细胞单层。培养方法为常规微滴法, 培养24~26 h后吸取裸卵镜检, 以第一极体释放作为卵母细胞成熟判定指标。
2 试验结果
2.1 不同体重东北细毛羊羔羊卵泡发育及卵母细胞回收数量比较
用相同超排方法对4~8周龄的东北细毛羊母羔进行超排, 并观察记录双侧卵巢卵泡个数, 活体吸卵后镜检, 镜检结果见表2。
注:同肩列字母不同表示差异显著 (p<0.05) , **与*表示两者差异极显著 (p<0.01) , 未标字母表示差异不显著 (p>0.05) 。
2.2 不同激素和剂量对母羔卵泡发育及体外成熟效果影响
超数排卵后摘除卵巢, 采用切割法回收卵母细胞。对比卵泡发育、回收卵数量及成熟效果, 结果见表3。
注:同肩列字母不同表示差异显著 (p<0.05) , **与*表示两者差异极显著 (p<0.01) , 未标字母表示差异不显著 (p>0.05) 。
根据表3得出, 收获卵母细胞后, 羔羊卵泡发育数量和收获卵丘细胞的A、B级卵平均数量为:58.4±22.1、97.8±24.1、71.9±14.8、103.4±146枚和45.8±11.5、63.7±18.2、53.8±6.4、62.4±21.6枚, 卵巢表面卵泡发育个数最高为IV组 (103.4±46) , 与未进行PMSG处理的I组差异显著 (103.4±46VS58.4±22.1, p<0.05) 。回收卵数量和可用卵母细胞各组之间差异不显著。卵母细胞体外成熟数量方面II组显著高于I组 (38.2±2.4VS24.1±3.5, p<0.05) , 而卵母细胞的体外成熟率, III组64.8±6.8%与IV组41.2±11.4%差异显著 (p<0.05) 。结果表明, 超排处理最后加注PMSG能够增加卵母细胞发育数量。而首针注射PMSG能够提高体外成熟率。东北细毛羊个体对激素产生反应有较大的差异, 但在回收数量上无显著差异。
3 讨论
幼龄羔羊不存在成年羊体内的卵泡优势化现象[5], 且较成年母羊对激素更加敏感, 卵泡很少发生闭锁, 这为幼龄羔羊超排提供了理论基础。对幼龄母羔羊体重与超数排卵关系之间的研究, 可以为其超排前个体的合理利用及幼羔育种方案的计划实施提供充分的理论依据。对于幼羔与成年母羊超排的效果一直存在着很大的争议[6~8], 这可能与供体母羊的年龄、超排季节、超排方案和体重等因素相关。如果羔羊体重较轻, 且超排方案不合理, 势必影响试验结果。
不同体重的幼羔超排后结果:从发育卵泡比较, 4~5 kg组平均为124.6±45.1枚, 显著高于7~9 kg组 (p<0.05) 。5~7 kg组羔羊只均可用体外培养的卵为53.9±12.8枚, 显著高于9~11 kg组的37.4±8.9枚 (p<0.05) , 试验表明体重在4~5 kg的母羔对超排激素反应最敏感, 而5~9 kg体重阶段的卵母细胞的可利用率最高。体重较轻的羔羊超排效果高于较重者可能是由于发育状况所致, 发育较好的羔羊卵巢发育日趋成熟, 对激素敏感性逐渐降低, 而体重较轻的羔羊则保持着高度的敏感性, 但卵泡发育程度不及较重者。
运用四组不同的激素和剂量的超排方案处理母羔, 结果显示:IV组方案 (国产激素) 超排反应最好, 发育卵泡显著高于无PMSG的I组 (p<0.05) 。而II组 (加拿大FSH+PMSG组) 只均获得体外成熟的卵母细胞数量最多, 显著高于I组 (p<0.05) 。统计培养的卵母细胞体外成熟率, III组 (PMSG+加拿大产FSH) 64.8±6.8%, 明显高于IV组 (国产FSH+PMSG) 41.2±11.4%, (p<0.05) 。试验表明:在首针注射PMSG能够提高体外成熟率, 超排处理最后加注PMSG能够增加卵母细胞发育数量。综合试验结果表明, 使用加拿大产FSH优于国产激素。
参考文献
[1]Morton K M, Catt S L, Maxwell W M C, et al.Effects of lamb age, hormone stimultion and response to hormone stimultion on the yield and in vitro developmental competence of prepubertal lamb oocytes[J].Reproduction, Fertility and Development, 2005, 17 (6) :593~601.
[2]Schiewe M C, Fitz T A, Brown J L, etal.Relationship of oestrus synchronization method, circulting hormones, luteinizing hormone and prostaglandin F-2αreceptors and luteal progesterone concentration to premature luteal regression in superovulted sheep[J].Journal of reproduction and fertility, 1991, 93 (1) :19~30.
[3]Magarey G M, Rodger J C, Buist J M, et al.Effects of repeated superovultion and surgical oocyte collection on ovarian response and natural breeding ability of the tammar wallaby (Macropus eugenii) [J].Reproduction, 2003, 125 (5) :701~707.
[4]Cognie Y, Baril G, poulin N, et al.Current status of embryo technologies in sheep and goat[J].Theriogenology, 2003, 59 (1) :171~188.
[5]SEEKALLU S V, TOOSI B M, DUGGAVATHI R, etal.Ovarian antral folliculr dynamics in sheep revisited:Comparison among estrous cycles with three or four folliculr waves[J].Theriogenology, 2010, 73 (5) :670~680.
[6]于勇, 钟旭, 王芬露, 等.不同月龄绵羔羊卵泡发育的比较研究[J].中国畜牧杂志.2012, (09) :22~26.
[7]Gandolfi F, Brevini T A L, Cillo F, et al.Cellulr and moleculr mechanisms regulting oocyte quality and the relevance for farm animal reproductive efficiency[J].Rev Sci Technol, 2005, 24 (1) :413~423.