卵巢发育（共4篇）
卵巢发育 篇1
虹鳟是世界主要的冷水性养殖鱼类,在我国已有50多年的养殖历史。近年来三倍体虹鳟受到养殖者青睐,与二倍体虹鳟相比,三倍体虹鳟具有生长快、肉质好、个体大、经济价值高等特点,具有很高的经济效益。但是三倍体虹鳟性腺发育不良,养殖过程中需要每年重新制种或者外购,使得苗种供给在一定程度上受限[1,2]。前期研究发现,三倍体雌性虹鳟在240 dpf(8月龄)左右卵巢发育停滞,卵原细胞发育异常,不能产生具有受精能力的卵子[3]。生长分化因子(growth differentiation factors,GDFs)和骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)是转化生长因子β(TGF-β)超家族的两个亚家族,在哺乳动物中,它们主要在卵巢中表达,通过自分泌和旁分泌两种方式调控早期卵泡的生长和分化,影响卵母细胞的发育并能控制排卵过程[4]。近年来,有关GDFs和BMPs在鱼类卵母细胞发育与成熟过程中的研究已取得一定进展,在欧洲海鲈(Dicentrarchus labrax)[5]、黄鳝(Monopterus albus)[6]、鳗鲡(Anguilla japonica)[7]、斑马鱼(Danio rerio)[8]、异育银鲫(Carassius auratusgibelio)[9]等鱼类的研究中,GDF9和BMP15具有调控卵母细胞发育的功能,其mRNA水平随着卵母细胞发育而逐渐降低。已有研究表明,GDF9、BMP4和BMP7在虹鳟卵巢发育和配子发生过程中起到重要作用,在卵泡成熟后的性腺体细胞中也被检测到[10]。
本研究以二倍体虹鳟为对照,利用光镜、电镜切片和TUNEL染色观察三倍体虹鳟卵巢中卵原细胞的发育情况,利用荧光定量PCR分析180 dpf(6月龄)至300 dpf(10月龄)时期二、三倍体虹鳟卵巢中的GDF9、BMP4和BMP7基因表达情况,探讨三倍体虹鳟卵巢中卵母细胞发育停滞后的最终去向,并分析其原因。
1 材料
试验中所有程序都严格遵守东北农业大学的动物保护和使用委员会的规定,并严格遵守动物福利。本次试验所用二、三倍体全雌虹鳟发眼卵(全雌三倍体虹鳟由全雌四倍体虹鳟与全雌二倍体虹鳟杂交而成)购于美国,置于水族箱中,孵化过程水温恒定为8℃,待鱼苗体重达50 g后饲养于养殖基地,养殖水温恒定为12℃。180 dpf(6月龄)起每30 d采集一次二、三倍体虹鳟的卵巢组织,共采集5次,采集的卵巢样本分三组:两组用p H值为7.2的磷酸缓冲液(PBS)清洗后,分别放入4%多聚甲醛和2.5%戊二醛中固定用于组织学观察;另外一组迅速放入液氮中暂存,然后转入超低温冰箱进行保存。
2 方法
2.1 组织学观察
2.1.1 光镜切片
将固定的卵巢组织从4%多聚甲醛中取出,从70%的乙醇开始进行梯度乙醇脱水,二甲苯透明,常规石蜡包埋与切片,切片厚度为5μm,H.E.染色,中性树胶封片,用Carl Zeiss显微镜观察,Motic Images plus 2.0系统拍照。
2.1.2 透射电镜切片
将固定的卵巢组织从2.5%戊二醛中取出,用锇酸再固定,Epon812包埋,在恒温培养箱中聚合,用Ultracut E型超薄切片机切片,经恒温培养后用醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色,用JEM-1200EX型电子显微镜观察拍照。
2.1.3 细胞凋亡的TUNEL法检测
将固定的卵巢组织从4%多聚甲醛中取出,进行脱水、透明、浸蜡、包埋,制作石蜡切片。脱蜡后采用末端脱氧核苷酸转移酶(Td T)介导的原位末端标记法(TUNEL)测定凋亡率,按照细胞凋亡检测试剂盒(罗氏公司)说明书进行,将10月龄三倍体虹鳟设为阴性对照组,采用PBS代替一抗,最后经脱水、透明、封片,在光镜下观察、拍照,细胞核呈棕黄色为凋亡细胞。
2.2 总RNA的提取及c DNA的合成
使用TRIzol试剂(购自Invitrogen公司)按照说明书进行总RNA的提取。琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性,紫外分光光度计检测RNA浓度与质量。使用Prime ScriptTM第一链c DNA合成试剂盒(购自Ta KaRa公司)进行c DNA的合成,并保存于-20℃。
2.3 Real-Time实时荧光定量PCR
根据已经公布的虹鳟GDF9、BMP4和BMP7基因序列,应用Primer Premier 5.0软件设计实时荧光定量PCR引物(由华大基因公司合成),序列见表1。以β-actin为内参基因,分析各受体基因的相对表达水平。Real-Time实时荧光定量PCR反应体系(20μL):SYBR premix Ex Taq(购自Ta KaRa公司)10μL,5倍稀释的c DNA模板2μL,上、下游引物各0.4μL,dd H2O 7.2μL。PCR反应条件:95℃30 s;94℃5 s,60℃30 s,共40个循环。PCR反应结束后,对扩增产物进行熔解曲线分析,检测反应的特异性。采用2-△△Ct法分析各基因的相对表达量。
2.4 数据的处理与分析
试验数据采用SPSS 17.0进行统计处理,利用One-way方差分析进行差异显著性检验,分析后的结果均表示为“平均数±标准差”,P<0.05为差异显著。
3 结果
3.1 组织学观察结果
3.1.1 光镜切片观察结果
观察180~300 dpf时期二、三倍体虹鳟的性腺组织切片观察结果见287页彩图1。二倍体全雌虹鳟的卵巢发育正常,卵巢中以初级卵母细胞为主,卵母细胞体积增大,大多数为圆形,结构完整,核仁多个并移至核膜内侧(见287页彩图1A中箭头所示),而后外排,随着发育出现皮质泡(见287页彩图1B、1C箭头所示),卵母细胞由Ⅱ时相发育至Ⅲ时相。三倍体卵巢发育明显迟于二倍体,180 dpf时期卵巢中主要以卵原细胞为主,并且发生卵原细胞囊泡化现象,表现为数个卵原细胞外被一层膜结构包裹,形成卵原细胞簇(见287页彩图1D中箭头所示)。随着日龄增加卵原细胞簇数目减少,卵原细胞未发育成初级卵母细胞,并发生染色质固缩现象,疑似发生细胞凋亡(见287页彩图1E、1F中箭头所示)。
3.1.2 透射电镜切片观察结果
透射电镜下观察可见:与发育正常的二倍体相比,三倍体虹鳟性腺中的卵原细胞出现细胞膜空泡化、细胞质浓缩、染色质固缩(见图2A中箭头所示),以及卵原细胞膜内陷、染色质边聚(见图2B中箭头所示)等典型的细胞凋亡现象,并能观察到凋亡小体(见图2C中箭头所示)。
3.1.3 TUNEL染色观察结果
采用TUNEL法检测二、三倍体全雌虹鳟性腺细胞凋亡,结果见287页彩图3。二倍体卵巢阴性对照未出现阳性结果(见287页彩图3A)。180~300 dpf时期二倍体卵巢中的初级卵母细胞未见凋亡,卵母细胞呈蓝色(阴性),随着卵母细胞发育,个体逐渐增大,部分滤泡细胞和间质细胞发生凋亡,其细胞核呈黄褐色(阳性),为卵巢发育过程中自然凋亡(见287页彩图3B、3C、3D);180~300 dpf时期三倍体卵巢中的卵原细胞发生凋亡则为普遍现象,180 dpf卵原细胞簇内的卵原细胞簇内还存在部分未凋亡的卵原细胞,随着发育凋亡的加剧,卵原细胞簇数目减少,大部分卵原细胞均呈阳性,部分滤泡细胞和间质细胞也发生凋亡(见287页彩图3E、3F、3G)。
3.2 二、三倍体虹鳟GDF9、BMP4、BMP7基因在卵巢中的表达结果
提取的二、三倍体虹鳟5月龄的性腺组织RNA经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测,RNA完整性良好,反转录得到的c DNA经内参基因β-actin检测发现可以用于实时荧光定量PCR试验。
试验结果表明,随着卵巢发育,三倍体虹鳟卵巢中的GDF9、BMP4和BMP7基因表达水平均显著低于同时期二倍体(P<0.05),并大体呈不规则的下降趋势。但240 dpf时BMP4在三倍体虹鳟卵巢中的表达显著高于二倍体(P<0.05)。见图4。
4 讨论
注:*表示二、三倍体虹鳟比较差异显著(P<0.05)。
4.1 二、三倍体虹鳟性腺组织学观察结果
细胞凋亡是1972年由Kerr教授根据形态学特征首先提出的,是一种由基因控制的细胞自主性死亡方式,也是一种主动的、程序性的、细胞固有的生物学过程,是为更好地适应生存环境而主动争取的死亡过程,普遍存在于动植物中,又称细胞程序性死亡(programmed cell death,PCD)。细胞凋亡是最基本的生物现象,是机体生存和发育的基础,具有清除多余细胞、无用细胞、发育不正常的细胞和完成正常使命的衰老细胞等生物学意义[11]。光镜切片、透射电镜切片和TUNEL染色结果表明,在180 dpf至300 dpf时期,二倍体虹鳟卵巢中的卵母细胞并未发生凋亡,只有部分间质细胞因性腺发育而发生正常的凋亡现象[12]。而发育异常的三倍体虹鳟卵原细胞最终去向是发生了凋亡。在180 dpf时,三倍体虹鳟卵巢中的卵原细胞簇数目较多,其中仍有部分未发生凋亡,随着性腺发育,卵原细胞簇数目减少,绝大部分卵原细胞发生凋亡,几乎观察不到发育正常的卵母细胞。之前对于三倍体在生长过程中较二倍体显示出明显的生长优势,一直被认为是奇数染色体组会导致减数分裂的失败和性腺发育的失败,在二倍体鱼类中用来促进性腺发育的能量在三倍体鱼类中被用来生长[13]。结合以上观点,笔者认为三倍体虹鳟卵巢中卵原细胞凋亡为其后性腺的重组或重新分化奠定了物质基础,发育不正常的卵原细胞通过细胞凋亡的途径,使机体获得更强的生存能力和更优良的生长特性。
4.2 二、三倍体虹鳟GDF9、BMP4、BMP7基因在卵巢中的表达
对鱼类的研究表明,GDF9在异育银鲫卵细胞的发育过程中具有重要作用,尤其是参与调控卵母细胞的早期发育[9]。在60 dpf和100 dpf时均检测出GDF9和BMP7在虹鳟卵巢中的表达,GDF9、BMP4、BMP7在不同发育阶段的虹鳟卵母细胞中均有表达,在Ⅰ时期卵母细胞中表达量最高,随着发育在卵母细胞中的表达量逐渐降低[14]。本研究也发现,180 dpf至300 dpf期间,二倍体虹鳟卵巢中GDF9和BMP7基因随着月龄的增加呈上升趋势,在10月龄达到最高,可见GDF9、BMP4和BMP7在鱼类卵巢发育过程中的作用。
三倍体虹鳟卵巢中GDF9、BMP4和BMP7基因的表达量显著低于卵巢发育正常的二倍体虹鳟,整体呈不规则下降趋势。羊GDF9和BMP15基因表达异常会导致母羊产仔数目减少。人类多种卵巢疾病,如卵巢早衰(POF)、卵巢功能缺陷(POI)、多囊卵巢综合征(PCOS)都与GDF9和BMP15(GDF-9B)的突变和表达异常有关[15]。GDF9基因敲除的小鼠缺乏生育能力,卵泡发育停留在初级卵泡阶段,即使有GDF9的同系物BMP15的表达也不能弥补GDF9的缺失[16]。因此,笔者认为随着卵巢发育,三倍体虹鳟GDF9、BMP4和BMP7的表达量过低,可能不足以维持卵原细胞的正常发育,最终导致卵原细胞发生凋亡。
240 dpf时三倍体虹鳟卵巢中的BMP4表达量突然升高,并高于同时期二倍体虹鳟的表达量,随后表达水平恢复至显著低于二倍体,结合TUNEL染色结果可知,240 dpf三倍体虹鳟卵巢中卵母细胞凋亡程度加剧。有研究表明,BMP4已经被证实不仅能够促进大鼠原始卵泡的发育,还能作为存活因子抑制细胞凋亡[17]。因此可以推测BMP4在虹鳟中的功能可能与在鼠中的相似,不仅可以调节卵母细胞的发育,还能抑制卵原细胞的凋亡。
5 结论
1)三倍体虹鳟中发育不正常的卵原细胞最终去向为发生细胞凋亡。2)三倍体虹鳟中性腺发育相关因子GDF9、BMP4和BMP7的低表达可能诱导卵原细胞发生凋亡,且BMP4可能同时具备抑制卵原细胞凋亡的功能。
摘要：为了研究三倍体雌性虹鳟在生长过程中出现的性腺发育停滞、卵原细胞发育异常的原因,试验采集180300 dpf时期二倍体和三倍体虹鳟的性腺组织,利用光镜、电镜切片和TUNEL染色进行组织与细胞学对比研究,利用实时荧光定量PCR分析对卵巢发育和配子发生过程发育具有调节作用的生长分化因子9(GDF9)、骨形态发生蛋白4(BMP4)和骨形态发生蛋白7(BMP7)在二、三倍体相同时期的表达差异。结果表明:180300 dpf虹鳟三倍体卵巢中的卵原细胞发生凋亡,除240 dpf三倍体虹鳟BMP4表达量显著高于二倍体外,三倍体虹鳟中GDF9、BMP4和BMP7表达量显著低于同时期二倍体。说明三倍体虹鳟卵原细胞发育异常,最终发生凋亡,可能与GDF9、BMP4和BMP7的低表达有关,BMP4在调节卵母细胞发育的同时可能有抑制细胞凋亡的作用。
关键词：虹鳟三倍体,卵原细胞,细胞凋亡,GDF9,BMP4,BMP7
密斯特黄彩鲶卵巢发育的研究 篇2
关键词：密斯特黄彩鲶,卵巢发育,繁殖力,性腺指数
密斯特黄彩鲶(图1-1),其背部体色金黄色,腹部白色,在广州观赏鱼市场上被美名为“黄金招财猫”,深受市民欢迎。养殖和试验测定发现,密斯特黄彩鲶生长快,病害少,营养价值高,是一种具有良好养殖前景的名优品种。目前,有关密斯特黄彩鲶的研究报道很少[1,2,3,4],关于密斯特黄彩鲶的性腺发育尚未有报道。研究以密斯特黄彩鲶的卵巢发育为内容展开,旨在为人工繁殖提供基础生物学资料。
1 材料与方法
试验鱼于2008年8月—2009年7月采自广州市白云区嘉禾水产研究所,共计42尾。对新鲜标本测量体长(L,精确到0.01 cm)和体重(Wa,精确到0.01 g),解剖取性腺并称重(Wa,精确到0.01 g),计算性腺成熟系数GSI=100%(Wb/Wa)。选择其中性成熟的雌鱼卵巢,称取1.0 g卵巢组织,至含福尔马林(5%)的大培养皿中计数。个体绝对繁殖力(F)=1.0 g卵巢的卵粒数×Wb,个体相对体重繁殖力(Fw)=F/Wa。运用石蜡切片观察性腺发育情况,性腺分期主要依据刘筠[5]和楼允东[6]的分期标准。
2 结果
2.1 卵巢的外部形态结构
密斯特黄彩鲶成熟的卵巢呈囊袋状(图1-2),位于体腔的腹中线、膘上方的左右两侧,为“V”字型结构。“V”字顶端有一较短的输卵总管,连接泄殖孔,与外界相通。依据卵巢的体积、色泽、卵子的成熟与否等标准,将卵巢发育的过程分为Ⅵ期:
I期卵巢:卵巢条带状,细长,肉色,紧贴于体腔背面。
II期卵巢:卵巢多呈扁带状,有不少细血管分布于组织中,经过成熟产卵之后退化到II期的卵巢上的血管更加发达明显,肉眼尚看不清卵粒。
III期卵巢:卵巢体积增大,肉眼可以看清卵粒,但卵粒不能从卵巢隔膜上分离剥落下来,卵母细胞开始沉积卵黄,但也有比较早的卵母细胞。这一时期的特点是卵母细胞直径不断扩大,卵质中尚无完全充满卵黄,卵膜变厚,同时有油球出现。
IV期卵巢:整个卵巢很大,占据腹腔的大部分,卵巢呈黄色,结缔组织和血管发达。卵巢膜富有弹性。卵粒内充满卵黄,大而饱满。
V期卵巢:性腺完全成熟,卵巢松软,卵已排于卵巢腔中,轻压亲鱼腹部,有成熟卵流出。成熟的卵是透明的。
VI期卵巢:卵巢体积变小,组织松,血管暗淡。
2.2 卵巢的组织学结构
卵巢表面的被膜由两层构成,外膜为腹膜,内层是结缔组织的白膜(图1-3)。由白膜向卵巢内部伸进许多结缔组织纤维、毛细血管和生殖上皮组织的板层结构,它们是产卵的地方,为产卵板。
密斯特黄彩鲶卵子的发生经过了增殖、生长和成熟三个时期。随着季节的变化和周期的运转,在卵巢的组织发育的过程中,可以观察到处在不同发育阶段的卵巢和卵母细胞:
第I时相:I时相的卵母细胞呈原始分化状态,以卵原细胞为主,嗜碱性,细胞多为圆形,直径21.26～30.17μm。
第II时相:II时相的卵母细胞正处于初级卵母细胞小生长期(图1-3)。嗜碱性。早期细胞多呈多角的圆形,卵径48.96～50.42μm,中央大核仁消失,形成15个左右的大小不等的核仁,分散在核中。中期,卵径96.28～110.12μm,核仁在45个以上,单层滤泡细胞明显。晚期,卵径149.18～156.73μm,卵母细胞体积进一步增大,胞质嗜碱性大大减弱,卵母细胞的一段有明显的卵黄核,深蓝色。
第III时相:III时相的卵母细胞则已进入大生长期,为中期的初级卵母细胞,卵径212.34～270.72μm,在质膜的外面有两层滤泡膜,外层较厚,内层较薄,细胞有一大的核。细胞质为弱嗜碱性,在发育的较早阶段,在卵质的外缘先出现一层小的液泡,其数目和体积随着卵母细胞的生长而增加(图1-4)。在液泡之间逐渐出现卵黄颗粒,核仁分布于核膜的边缘,少数分散在核中央。
第IV时相:此时已是发育晚期的初级卵母细胞,体积增大。早期滤泡细胞仍为两层,核位于细胞中央,卵黄泡密集于围核区,卵黄颗粒逐渐充满细胞质,卵径为308.44～423.78μm,细胞质边缘的颗粒带消失(图1-4)。后期卵黄颗粒几乎充满核外空间,只有核的周围及靠近卵膜的边缘有较多的细胞质,嗜碱性(图1-5)。核向动物极移动,核质均匀,卵黄泡消失,放射带变薄。在这个时期,细胞核由卵原细胞的原核状态过度到成熟分裂状态。
第V时相:这是由初级卵母细胞经过成熟分裂向次级卵母细胞过度的阶段。卵径为472.32～522.48μm,卵径细胞质中充满粗大的卵黄颗粒(图1-6),它们在成熟的过程中逐渐相互融合成块状,外围的卵壳膜源于滤泡细胞,但无明显的结构(图1-7)。细胞核膜完全溶解,核质和动物极细胞质融合。在卵质的边缘仍有液泡,可以观察到辐射膜(图1-8)。
第VI时相:此时卵粒逐渐退化,并被吸收。卵巢中除被吸收的卵母细胞和空滤泡外,有较为丰富的结缔组织和不同发育时相的卵母细胞(图1-9)。
2.3 繁殖力
体长为16.81～19.24 cm的密斯特黄彩鲶的个体绝对繁殖力2 232～3 846粒,平均3 042±36粒;个体相对体重繁殖力25.0～40.6粒/g,平均(33.0±8.3)粒/g。繁殖力随体重和体长的增加而增加。
2.4 卵巢性腺指数的周年变化
试验测得密斯特黄彩鲶卵巢发育的性腺指数(gonadosomatic index,GSI)周年变化(图2)。一年中,密斯特黄彩鲶的卵巢GSI有2个峰值,分别出现6月和9月,其中后一阶段的峰值低于前1个,这可能是因为密斯特黄彩鲶虽然一年中可以产2次卵,但主要还是集中在5～6月份,这一时期孵化的鱼苗,无论气候条件还是水文条件,都有利鱼苗的生存和生长。
3 讨论
3.1 密斯特黄彩鲶的卵巢结构
真骨鱼大多数卵巢有卵巢腔和输卵管,成熟的卵子先突破包围在它周围的滤泡膜而跌入卵巢腔内,然后经输卵管从泄殖孔排出体外[6,7]。但有些鱼类如鲑科鱼类,既无卵巢腔,也无输卵管,成熟的卵子先跌入体腔,然后从这里经泄殖孔排出体外[6]。在观察密斯特黄彩鲶卵巢发育的切片中,虽然没有看到明显的卵巢腔,其产卵板也不明显,但解剖得到的IV期、V卵巢,其被膜完整,体腔中也没有发现游离的卵子,这表明密斯特黄彩鲶排出的成熟卵仍保存在囊状的卵巢中,由此判断密斯特黄彩鲶具有卵巢腔,但可能腔的容积很小。
3.2 密斯特黄彩鲶的产卵类型
根据卵母细胞在卵巢中的发育情况,可将鱼类生殖的产卵类型分为3种,即完全同步型、分批同步型和分批非同步型[8]。四大家鱼则属于典型的同步产卵类型,卵母细胞发育基本同步,一年只产1次卵[8,9]。方静等[10]对齐口裂腹鱼的卵巢进行研究认为齐口裂腹鱼属分批同步型产卵类型的冷水性鱼类。董玉兰等[11]对泰山螭霖鱼的研究则认为泰山螭霖鱼的产卵属于分批产卵类型。在密斯特黄彩鲶各个时期的卵巢切片中,都发现有其他时相的卵母细胞,如:在第II期卵巢中,发现有第III、IV时相的卵母细胞。在第IV期卵巢中,有一定数量的第IV、V时相的卵母细胞。在第VI期卵巢中,即产卵后开始萎缩及已经萎缩了的滤泡附近可以看到很多正在成熟或已经成熟的第III、IV、V时相的卵母细胞。因此,密斯特黄彩鲶属于分批非同步产卵类型的鱼类。
3.3 密斯特黄彩鲶的繁殖性能与种质保护
个体生殖力作为种群生殖力的重要指标,主要是由种的遗传性决定的,同时也受环境子的影响。个体相对生殖力可以用来比较不同种或不同种群、不同大小鱼的繁殖力,它体现了鱼的繁殖策略。
卵巢发育 篇3
1 材料和方法
1.1 动物
2007年10—12月份在大足黑山羊保种场选择营养良好、体态匀称、健康的经产未孕大足黑山羊20只, 年龄3～5岁, 体重25～40 kg。试验羊按免疫程序注射疫苗, 试验前驱虫, 每日给料3次, 中午精料、早晚2次喂青草, 自由采食, 饮水清洁、充足, 圈舍每周定期消毒1次, 试验羊连续观察20 d后开始试验。
1.2 方法
1.2.1 B 超探察方法
选用HS-2000便携式兽用B超 (频率为7.5 MHz、线阵探头) 进行直肠探察。山羊站立保定, 清除直肠内粪便, 用混有润滑剂的温水灌肠, 探头上涂偶合剂, 缓慢将探头伸入直肠并打开B 超, 在直肠内寻找膀胱, 然后以膀胱为基准, 左右上下旋转移动探头寻找子宫、卵巢, 找到后固定图像, 用电子刻度尺进行测量和计数。
1.2.2 B 超探察内容
通过外阴部和生理活动观察, 结合公羊试情法和B超探察卵泡发育情况, 确定大足黑山羊发情周期、发情持续期和排卵时间。以大足黑山羊发情开始记为0小时, 分别在0, 12, 24, 36, 48, 60, 72小时用 B超观察羊只卵巢卵泡变化, 从第4天开始每天观察1次, 直到下一次发情, 连续观察2个发情周期, 每次分别记录左、右卵巢募集卵泡、优势卵泡和排卵卵泡的直径、数量及卵巢大小。
1.3 统计学分析
每天用B超探察左、右卵巢各3次, 用SPSS14.0软件分别统计发情周期左、右卵巢募集卵泡、优势卵泡、排卵卵泡的个数、直径和卵巢大小, 以undefined表示, 以配对t检验和独立t检验分析左、右卵巢卵泡个数和直径的差异。
2 结果
2.1 卵泡的超声图像特征 (见图1)
A.募集卵泡;B.优势化卵泡;C.排卵卵泡。
B超探察卵巢时, 卵泡充满了液体, 它能吸收超声波使其在B超显示器上表现为黑色 (无回声) , 而卵泡壁图像为亮区 (强回声) , 卵泡壁和卵巢的界线分明。根据卵泡大小、数量、出现时间和形状, 将卵泡分为募集卵泡、优势卵泡和排卵卵泡。图1A表示募集卵泡, 直径为2～4 mm, 卵泡数量较多, 形状不太规则;图1B表示优势卵泡, 数量显著减少 (卵泡闭锁) , 直径增长快, 一般大于6 mm;图1C表示排卵卵泡, 直径大于6 mm, 形状近似圆形, 卵泡壁变薄。
2.2 大足黑山羊的发情周期和发情持续期 (见图2)
如图2所示, 20只大足黑山羊发情周期最长23 d, 最短20 d, 发情周期主要集中在21 d (占60.0%) , 20只羊发情周期平均为 (20.9±0.8) d。发情持续期最长48 h, 最短18 h, 发情持续期平均为 (32.7±6.8) h, 发情后排卵时间为 (28.5±3.1 ) h。
2.3 发情周期募集卵泡数及卵泡直径 (见图3, 4)
注:字母不相同表示差异显著 (P<0.05) 。
大足黑山羊左卵巢募集的卵泡数平均为 (9.0±1.0) 枚, 右卵巢平均募集卵泡数为 (7.9±1.1) 枚。左卵巢募集卵泡直径平均为 (3.6±0.6) mm, 右卵巢募集卵泡平均直径为 (3.6±0.5) mm。左卵巢募集的卵泡数显著多于右卵巢募集的卵泡数 (P<0.05, n=20) , 但左卵巢募集卵泡直径与右卵巢募集卵泡直径无显著差异 (P>0.05, n1=177, n2=158) 。
2.4 发情周期优势卵泡
大足黑山羊左卵巢优势卵泡数平均为 (4.5±1.1) 枚, 右卵巢 (3.7±0.9) 枚。左卵巢优势卵泡直径平均为 (7.3±0.9) mm, 右卵巢卵泡平均直径为 (6.7±1.7) mm。左卵巢优势卵泡数极显著多于右卵巢 (P<0.01, n=20) , 但左、右卵巢优势卵泡直径无显著差异 (P>0.05, n1=91, n2=75) 。
2.5 发情周期排卵卵泡
大足黑山羊左卵巢排卵数平均为 (1.5±0.7) 枚, 右卵巢为 (1.2±0.4) 枚。左卵巢排卵直径平均为 (6.4±1.7) mm, 右卵巢为 (6.6±1.1) mm。左、右卵巢排卵数差异显著 (P<0.05, n=20) , 但左、右卵巢排卵卵泡直径无显著差异 (P>0.05, n1=30, n2=25) 。
2.6 大足黑山羊左、右卵巢大小
大足黑山羊左卵巢大小为 (24.9×14.5) mm, 右卵巢为 (23.5×14.1) mm。左卵巢比右卵巢稍大, 但差异不显著 (P>0.05, n=84) 。
3 讨论
动物品种是影响左、右卵巢卵泡发育的重要因素。沼泽型水牛左卵巢排卵机率为77.8%, 猪左侧卵巢排卵机率为55%～60%, 马左侧卵巢排卵机率为55%, 但萨能山羊右侧卵巢排卵机能较强, 为55%～57%, 大足黑山羊左卵巢募集卵泡、优势卵泡和排卵卵泡数目多于右侧卵巢, 与沼泽型水牛、猪、马的情况相同, 但与萨能山羊有一定差异。据报道, 沼泽型水牛排卵优势卵泡出现在左卵巢的机率占77.8%[2], 而娟珊牛右侧卵巢的排卵机率为55%～60%[3], 这种差异也说明了左、右卵巢卵泡发育差异与品种有关。关于大足黑山羊左、右卵巢排卵机率差异的具体原因, 初步分析可能是由于卵巢大小不同所引起, 大足黑山羊左卵巢 (24.9×14.5) mm比右卵巢 (23.5×14.1) mm稍大;另一种可能原因是左、右卵巢离腹主动脉距离不同, 影响了血液供应, 使左右卵巢得到的营养不同, 引起卵巢大小不同。
另外, 山羊每次排卵数目依品种和胎次不同而有差异, 胎次较多者排卵数也较多, 3～5胎的排卵率最高, 以后逐渐下降。排卵率与营养也有很大关系。
试验证实大足黑山羊发情周期为 (20.9±0.8) d, 发情后排卵时间为 (28.5±3.1) h, 发情持续期平均为 (32.7±6.8 ) h, 这对大足黑山羊发情后配种具有指导作用。山羊卵子排出后运动到输卵管需要6 h左右, 精子从阴道运动到输卵管需要12 h左右, 可见大足黑山羊发情最佳配种时间是在发情后18～24 h。掌握大足黑山羊最佳配种时间对提高配种受胎率有重要意义。
参考文献
[1]MEDAN MS, WATANABE G, SASAKI K, et al.Ovarian dynam-ics and their associations with peripheral concentrations of gonadotro-pins, ovarian steroids, and inhibin during the estrous cycle in goats[J].Biol Reprod Biology of Reproduction, 2003, 69 (1) :57-63.
[2]韦英明, 刘瑞鑫, 周虚, 等.沼泽型水牛发情周期卵泡发育波的发育动态观察[J].中国畜牧杂志, 2006, 42 (19) :21-23.
卵巢发育 篇4
关键词：斑节对虾,卵巢,肝胰腺,氨基酸组成
斑节对虾 (Penaeus monodon) 是世界重要的养殖对虾品种之一, 国内外有许多关于斑节对虾的研究报道[1,2,3,4]。中国南方早在20世纪80年代末就开展斑节对虾的人工育苗[5]和养殖研究[6]工作。斑节对虾亲虾在性腺发育期间, 卵巢质量能在1周内增加4~8倍[7,8], 显然, 这个过程进行了很活跃的营养代谢, 发生了大量的营养积累。因此, 研究亲虾在性腺发育期间肝胰腺、性腺等的生化组成及其变化很有必要。
有关斑节对虾蛋白质、氨基酸的研究报道很多, 如斑节对虾亲虾肌肉和成熟卵巢的氨基酸组成[1];斑节对虾不同生长阶段肌肉氨基酸组成[9];斑节对虾对精氨酸 (Arg) 、蛋氨酸 (Met) 、苯丙氨酸 (Phe) 、色氨酸 (Trp) 的需求量[10]等。斑节对虾在卵巢发育过程中, 卵巢和肝胰腺的脂肪酸组成研究已有报道[2], 但未见有关氨基酸组成的报道。笔者收集了海南岛南部海域的野生斑节对虾, 测定了卵巢发育不同阶段的全虾、肝胰腺和卵巢的氨基酸组成, 为斑节对虾亲虾人工培育技术的优化及其人工饵料研制提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料
2011年10月至12月, 从海南省陵水、三亚和乐东附近海区的渔获物中选购活体斑节对虾雌虾, 根据黄建华等[11,12]的卵巢发育分期方法, 把Ⅰ期和Ⅵ期作为卵巢发育初级阶段, Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期作为中级阶段, Ⅴ期作为高级阶段。3个阶段的雌虾各选购45尾, 充氧包装, 运回实验室。测量头胸甲长、体长和体质量, 每阶段样品解剖30尾, 分离出肝胰腺和卵巢, 分别称取质量并记录 (精确到0.01 g) , 同阶段肝胰腺和卵巢样品用研钵分别混合捣碎, 同阶段全虾样品分别用绞肉机混合绞碎。样品放在75℃烘箱中烘干至恒质量, 塑料袋密封包装, 置干燥箱中备用。
1.2 方法
烘烤去水分后的样品用盐酸水解测定17种氨基酸, 用甲氧酸水解法测定色氨酸, 处理后在日产835-50型氨基酸自动分析仪上分析, 每个样品分析3次。分析条件为离子交换柱2.6 mm×150mm, 交换柱型号No.2619, 柱温53℃, 泵流速0.225 m L·min-1, 泵压力90 kg·cm-2, 进样体积50m L, 分析时间72 min。
1.3 计算公式
1.4 数据处理
采用Excel 2003软件对数据进行统计分析并作图, 数值用平均数±标准误差 (±SD) 表示, 并进行Duncan's多重比较, P<0.05表示差异显著。
2 结果
2.1 肝胰腺指数与性腺指数
野生斑节对虾卵巢发育的初级、中级和高级阶段, HSI有差异但不显著 (P>0.05) ;GSI差异显著 (P<0.05) , 中级阶段为初级阶段的2倍, 高级阶段约为初级阶段的6倍。表明卵巢在发育过程中发生了大量的营养积累, 卵巢质量不断增加, Ⅴ期达到最大值 (图1) 。
The results with different letters are significantly different from each other (P<0.05) .
2.2 全虾氨基酸
随着卵巢的发育, 野生斑节对虾全虾氨基酸总量逐渐增加, 但差异不显著 (P>0.05) 。必需氨基酸总量略呈“V”型变化趋势, 差异不显著 (P>0.05) 。3个阶段样品中, 谷氨酸 (Glu) 含量均最高, 占氨基酸总量的15%;其次是门冬氨酸 (Asp) , 占9.5%;含量最少的是胱氨酸 (Cys) , 占氨基酸总量的0.5% (表1) 。牛磺酸 (Tau) 含量以中级阶段为最高, 高级阶段次之, 初级阶段最低 (表1) , 各阶段Tau含量差异显著 (P<0.05) 。表明卵巢发育中级阶段Tau代谢活跃。
2.3 肝胰腺与卵巢的氨基酸
在初级、中级和高级3个发育阶段的野生斑节对虾肝胰腺及卵巢中, 肝胰腺和卵巢氨基酸总量呈倒“V”型, 差异不显著 (P>0.05) (表2) ;肝胰腺中的必需氨基酸总量也略呈倒“V”型, 卵巢的必需氨基酸总量呈增加的趋势, 但各阶段之间差异不显著 (P>0.05) (表2) 。中级阶段卵巢有5种氨基酸处于峰值, 分别是天门冬氨酸 (Asp) 、谷氨酸 (Glu) 、脯氨酸 (Pro) 、酪氨酸 (Tyr) 和赖氨酸 (Lys) (表2) 。
mg·g-1
注:同行数据中不同上标字母者差异显著 (P<0.05) ;*.必需氨基酸;后表同此Note:Values in same row with different superscript letters are significantly different from each other (P<0.05) ;*.essential amino acid;The same case in the following table.
3 讨论
3.1 性腺发育过程的采样
亲虾的卵巢发育是一个连续过程, 大多学者根据卵巢发育形态、组织学观察或化学成分分析分为6期[2,11,12,13], 这些分期方法较细但工作量大且费时, 笔者通过简单的肉眼判断将卵巢发育分为初级阶段 (对光看不到性腺, 即Ⅰ和Ⅵ期) 、中级阶段 (对光看清性腺, 即Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期) 和高级阶段 (对光性腺极度膨大, 即Ⅴ期) , 测定的GSI差异极显著。因此, 笔者认为此研究采用该分期方法简便可行。
3.2 卵巢发育中全虾的氨基酸和Tau质量分数
该试验中, 斑节对虾全虾样品质量分数最高是Glu, 约占总氨基酸的15%;最低为Cys, 约占0.5%。与斑节对虾成虾肌肉中w (Glu) 最高 (约14%) 、w (Cys) 最低 (约0.6%) [14]的结果相似。全虾氨基酸总量和必需氨基酸总量略有差异, 但不显著。卵巢发育过程中肝胰腺和卵巢氨基酸代谢活跃, 这可能是全虾氨基酸略有差异的主要原因。但是, w (Tau) 差异显著 (P<0.05) , 中级阶段最高, 初级阶段最低。Tau是一种含硫的非蛋白结构氨基酸, 影响动物的繁殖性能[15], 对脂肪代谢发挥重要的生理作用[16], 能显著提高雄性大鼠血清睾丸酮水平[17], 明显提高鸡蛋质量[18], 促进黄鸡性腺组织发育[19], 对鱼类繁殖成功同样起到促进作用[20]。尚未见Tau对对虾繁殖性能的研究报道, 原因可能是还没有适宜亲虾的配合饲料。对虾是无脊椎动物, 比前述实验动物低等, 其卵巢发育表现在卵黄积累, Tau可能加速卵黄积累, 导致性腺成熟, 但其作用机理有待进一步研究。
mg·g-1
3.3 卵巢发育中肝胰腺和卵巢氨基酸质量分数
该试验中肝胰腺氨基酸总量和必需氨基酸总量随着卵巢发育而逐渐上升, 至临产 (Ⅴ期) 时下降。中国对虾 (P.chinensis) 亲虾肝胰腺的消化酶活性随卵巢发育逐渐上升, 至临产卵时 (V期) 活性下降[13];消化酶是一种蛋白质, 由氨基酸构成, 可以理解为中国对虾氨基酸总量随性腺发育而逐渐上升。一些鱼类也有类似的现象[21,22];斑节对虾卵巢发育期间需要消化更多食物才能快速积累营养, 氨基酸水平上升可能是消化酶活性增加所致。摘除眼柄是促使对虾卵巢发育的典型方法, 但摘除眼柄后中华绒螯蟹 (Eriocheir sinensis) 肝脏氨基酸略有下降[23], 摘除眼柄无助于诱导中华绒螯蟹卵巢的成熟[24]。这从肝胰腺氨基酸变化可以得到旁证。
该试验中随着卵巢发育, 野生斑节对虾卵巢的氨基酸总量逐渐上升, 临产时 (Ⅴ期) 下降, 而必需氨基酸总量逐渐上升。哈氏仿对虾 (Parapenaeopsis hardwickii) 卵巢发育时蛋白质发生了积累[25];成熟凡纳滨对虾 (P.vannamei) 卵巢蛋白质含量增加[26];随着性腺发育, 野生和养殖褐牙鲆 (Paralichthys olivaceus) 亲鱼卵巢中氨基酸含量也发生类似的变化[19]。对虾卵巢发育需要积累大量卵黄蛋白, 即氨基酸水平会上升。但临产 (Ⅴ期) 时卵巢氨基酸水平会下降, 其原因有待深入研究。