胚胎停止发育（精选4篇）
胚胎停止发育 篇1
胚胎停育是在孕早期胚胎尚未形成时停止发育, 给育龄妇女身心造成极大痛苦。影响胚胎发育的原因复杂, 除自身抗体、内分泌失调、染色体异常、支原体、衣原体感染等因素外, 微量元素水平异常是目前比较关注的与不良妊娠结局有关的原因。微量元素是指人体内含量少于体质量万分之一的元素, 它们含量虽微, 对人体却有重要作用。近年研究发现, 微量元素与生殖有密切关系, 孕期含量有明显变化, 提示微量元素可能与胚胎停止发育关系密切。为探讨微量元素水平与胚胎停止发育的关系, 笔者对胚胎停止发育妇女的血清微量元素进行了检测, 并与正常妊娠妇女进行对比分析, 现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选择妇科门诊及住院的胚胎停止发育的妊娠妇女50例为观察组, 年龄20~35岁, 孕6~12周。选择正常妊娠妇女50例为对照组, 年龄19~37岁, 孕6~12周。另选择未妊娠妇女50例为正常组, 年龄20~36岁。3组妇女均无发育异常及妇科肿瘤, 无自然流产史及内分泌疾病史。男女双方抗精子抗体均为阴性, 染色体检查核型正常。
1.2 诊断标准[1] B型超声表现为妊娠囊内胚芽或胎儿形态异常, 或妊娠囊平均直径>2cm或胎芽长度>0.6cm时, 无原始心血管搏动, 或表现为枯萎囊。
1.3 方法 3组患者均在清晨空腹采集静脉血5ml, 离心分离血清, 用1%硝酸银溶液稀释血清后在AA-6800型原子吸收分光光度仪上进行血清钙 (Ca) 、铁 (Fe) 、锌 (Zn) 、锂 (Li) 、铷 (Rb) 、磷 (P) 、铜 (Cu) 水平测定。
1.4 统计学方法 计量数据
2 结 果
观察组血清Ca、Fe、Zn、Li、Rb、P、Cu水平均明显低于对照组, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。对照组血清Ca、Fe、Zn、Li、Rb、P水平明显低于正常组, 而Cu水平高于正常组, 差异均有统计学意义 (P<0.05) 。见表1。
3 讨 论
矿物质对于胚胎发育有至关重要的作用。妊娠期是胚胎细胞分裂分化和生长旺盛时期, 而细胞分裂分化需要酶的参与, 无酶的存在, 细胞繁殖、生长发育、生化反应、能量转换、新陈代谢及基因表达等一系列生命活动就不能进行。而人体内的绝大多数酶, 则需要微量元素的参与和激活。另外, 微量元素的浓度直接影响下丘脑-垂体-性腺轴的激素分泌, 在生
注:与对照组比较, *P<0.05;与正常组比较, #P<0.05
殖内分泌系统各个环节均发挥作用。本结果显示, 观察组血清Ca、Ze、Zn、Li、Rb、P、Cu水平均明显低于对照组, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。说明胚胎停止发育妇女体内存在血清微量元素缺乏现象, 因此笔者推测缺乏微量元素, 可能会对胚胎的生长发育产生不良影响。
Ca有维持骨骼肌和心肌的收缩作用, 能引发细胞代谢活动, 维持神经兴奋性、镇定神经和合成神经递质, 参与血液的凝固过程, 还与细胞的有丝分裂、生殖细胞的激活有关, 使动物得以繁衍。P是构成骨骼、牙齿及软组织的重要成分, 也是许多维持生命物质如核酸、酶、磷蛋白等的重要成分。如果两者缺乏, 无疑会对胚胎细胞的分裂发育产生重要影响, 最终导致胎儿发育异常或胚胎停止发育。
Fe对孕期妇女有更重要的作用, 妇女怀孕后, 虽然对食物中的Fe吸收量增加, 并且无妊娠期9个月的经血丢失, 但仍不能弥补妊娠时的需Fe量, 因而缺铁及缺铁性贫血在孕期妇女中相当普遍。Barker小组发现:孕期低铁营养状况导致胎盘/胎儿比率升高, 并且是以后心血管疾病良好的预测指标。与之相似, 铁营养状况不良母鼠生育的幼鼠心脏重量增加, 并且使成年早期血压增高。本研究显示, 胚胎停育妇女血清中Fe含量明显低于正常妊娠妇女, 提示孕期Fe元素缺乏, 可能通过引起缺铁性贫血而影响胚胎发育。
Zn是多种酶和蛋白质的核心部分, 母体缺Zn可能引起一系列严重后果。Larissa等[2]研究发现如果脐带血锌降低, 会导致胎儿发育迟缓, 从而影响精神运动发育, 增加病死率。Zn缺乏影响了DNA聚合酶和RNA聚合酶活性及核酸蛋白质合成, 还干扰了前列腺素合成, 引起胎盘灌注减少。妊娠3个月缺Zn即可影响细胞增殖周期, 造成胚胎发育异常。有一假说认为[3], Zn代谢与畸形的发生关系密切, 任何能降低血锌的因素均可导致功能性锌营养不良, 如果发生在器官形成重要阶段, 就可能发生畸形。Kvist用人精子作体外实验总结出前列腺中Zn的功能之一是使精子具有核染色体去凝聚的能力, 在受精过程中起关键作用;Zn也通过超氧化物歧化酶清除自由基而抑制细胞膜发生脂质过氧化反应, 保证精子形态结构和功能正常。有研究表明孕妇补Zn对母婴均有益。但补充过量也可有相反效果, sinha用2种中毒剂量的Zn (500ppm和1000ppm) 喂养SD雌性大鼠, 6周后发现子宫、输卵管和卵巢的酸性磷酸酶和碱性磷酸酶均降低, 而这2种酶在排卵、顶体反应、孕卵种植和妊娠早期均起重要作用, 进一步研究证实高锌也可干扰性激素的合成, 甚至通过血睾屏障直接产生细胞毒作用, 损害睾丸和附属腺体的功能。本结果显示, 胚胎停育患者血锌水平低于正常妊娠妇女, 提示缺Zn可能通过影响各种酶及蛋白质的作用从而对胚胎产生不良影响。
Li是胚胎发育过程中重要的元素之一, 对胚胎发育有重要的影响。早在19世纪, Li被发现存在于人类的组织器官以及胎儿组织中。有研究报道, 在胚胎发育早期过程中, 胚胎组织中的Li浓度达到最大, 随后降低。Li缺乏对胚胎发育的影响可能为:Li缺乏会导致肾上腺功能紊乱和卵巢中卵泡囊肿等, 导致生殖功能障碍, Li可以替代Na、K、Mg、Ca, 也可促进多能干细胞分裂和分化。有研究报道低Li饮食的怀孕小鼠, 会导致下一代生长发育不良, 身长短小, 而且存活率降低。如果孕期缺Rb, 会对胎儿的发育有不利影响。有研究报道[4], 饲料Rb含量不足0.28mg/kg的山羊食物摄入量减少、生长减慢、自然流产率增加。缺Rb山羊流产率高于正常组, 而且宫内缺Rb影响幼仔出生前和出生后体质量[5]。本结果显示, 胚胎停育妇女血清中Rb和Li水平明显低于正常妊娠妇女, 说明血清Rb和Li缺乏可能与胚胎停止发育有关。
Cu参与人体多种酶合成, 是人体内一种特殊的催化剂参与各种生理活动和代谢过程。妊娠后, 微量元素发生了规律性变化。妊娠第4周血清Cu开始增加, 至18周达最高水平, 一直维持至分娩后第2周急速下降。缺Cu后组织中弹性蛋白含量降低, 增加了血管和组织的脆性, 易发生胎膜早破。Alvarez等[6]调查发现孕早期血铜升高, 而孕晚期血浆中几种微量元素比较稳定。Custodio等[7]对收集的66例孕晚期孕妇测定其血铅是降低的, 血铜是升高的。Ana等[3]研究认为血清低Cu均与反复流产、稽留流产、难免流产及自然流产关系密切。本结果显示, 观察组血铜含量明显降低, 与正常妊娠对照组相比差异有统计学意义 (P<0.05) , 说明血清低Cu与胚胎停止发育关系密切。
综上所述, 早孕妇女血清微量元素异常可能是胚胎停止发育的原因之一。妊娠期微量元素浓度对正常妊娠和胎儿发育极为重要。除食物外, 额外补充微量元素, 可防治妊娠并发症, 达到优生目的。
摘要：目的 探讨胚胎停止发育与微量元素水平的关系。方法 选择门诊及住院胚胎停止发育的妊娠妇女50例为观察组, 选择正常妊娠妇女50例为对照组, 另选择未妊娠妇女50例为正常组, 3组患者均在清晨空腹采集静脉血5ml, 进行血清钙 (Ca) 、铁 (Fe) 、锌 (Zn) 、锂 (Li) 、铷 (Rb) 、磷 (P) 、铜 (Cu) 水平测定。结果 观察组血清Ca、Fe、Zn、Li、Rb、P、Cu水平均明显低于对照组, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。对照组血清Ca、Fe、Zn、Li、Rb、P水平明显低于正常组, 而Cu水平高于正常组, 差异均有统计学意义 (P<0.05) 。结论 早孕妇女血清微量元素异常可能是胚胎停止发育的原因之一。妊娠期微量元素浓度对正常妊娠和胎儿发育极为重要。除食物外, 额外补充微量元素, 可防治妊娠并发症, 达到优生目的。
关键词：胚胎停止发育,微量元素,妊娠并发症
参考文献
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胚胎停止发育 篇2
近年来研究发现正常妊娠的维持有赖于胰岛素样生长因子2(Insulin-like growth factor 2,IGF2)在胚胎中严格的遵循组织类型以及发育阶段表达[2,3]。笔者的前期研究也发现自然流产的绒毛组织中IGF2表达明显降低[4]。IGF2是一种母系印迹基因,这类基因的表达受DNA甲基化、组蛋白乙酰化、RNA干扰等多种方式调控。如今已有多项研究证明组蛋白乙酰化是影响遗传印迹的重要原因[5,6],组蛋白乙酰化修饰主要由组蛋白乙酰基转移酶(histoneacetyltransferases,HATs) 和组蛋白去乙酰基酶(histone deacetyltransferases,HDACs)作用完成,其中某些乙酰基转移酶有可能参与胚胎停止发育的病理过程。本研究比较早期胚胎停止发育及正常早孕人工流产患者绒毛组织中IGF2及相关因子组蛋白乙酰基转移酶 (general control of nucleotidesynthesis 5,GCN5)及p300/CREB结合蛋白(p300/CREB-bindingprotein,p300/CBP)的表达及其之间的相关性,从组蛋白乙酰化的角度进一步探索IGF2基因在胚停育绒毛中异常表达的原因,深化胚胎停止发育在表观遗传方面的病因学研究。
1 资料与方法
1.1 研究对象及分组
选择2012年7-9月就诊于中国医科大学附属盛京医院妇科门诊患者50例。其中胚胎停止发育29例为实验组,平均年龄(30.0±5.0)岁,平均孕周(8.3±1.3)周。实验组以停经日期确定孕周;B超检查符合胚胎停止发育诊断标准:妊娠囊不增长、变形,轮廓模糊,小于妊娠周数;胚芽枯萎缩小或无心管搏动,经1周后复查无改变[7],或妊娠6周后两次以上B超观察仅见妊娠囊,未见胚胎。无阴道出血及腹痛等先兆流产症状,此次妊娠前月经周期规律,末次月经准确,清宫时停经84 d以内,既往体健,无急性生殖器官感染,生殖器官畸形,无内分泌和肿瘤病史,孕期未服用过激素类药物,此次妊娠后孕妇血清TORCH病原体Ig M为阴性。胚胎发育正常者21例为对照组,平均年龄(28.0±5.0) 岁,平均孕周(8.1±0.9)周;对照组B超检查孕周与停经时间相符,胚胎存活,无先兆流产症状,无宫内节育器,由于非意愿怀孕而终止妊娠,其余条件与实验组相同。
本研究经中国医科大学盛京医院伦理委员会批准通过,所有患者签署知情同意书。
1.2 标本的采集与制备
将术中采集的新鲜绒毛及蜕膜组织用生理盐水漂洗后,经液氮速冻,立即放入 -80℃超低温冰箱内储存备用。收集全部样本后,解冻组织,常规脱水,石蜡包埋,连续切片,片厚4μm,每个样本切片10张备用,常规HE染色,观察绒毛及蜕膜形态。
1.3 免疫组织化学检测
1.3.1主要试剂IGF2、p300/CBP和GCN5兔抗人多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司(bs-0015R;bs-5130R;bs-1397R),免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司(SP-9001)。
1.3.2试验方法采用免疫组织化学染色SP法,参照免疫组化染色试剂盒说明并进行改良:切片常规脱蜡至水,滴加3%过氧化氢H2O2甲醇溶液室温放置10 min消除内源性过氧化物酶活性,枸橼酸盐缓冲液微波修复3次,每次间隔8~10 min,0.3% TritonX-100浸泡10 min增强细胞膜的通透性,10%山羊血清封闭15 min,一抗孵育4℃过夜。滴加生物素化二抗室温15 min,滴加辣根酶标记链酶卵白素室温15 min,滴加DAB显色液,镜下控制显色,蒸馏水终止显色。苏木素复染,常规脱水透明,封片。一抗工作液浓度 为IGF2 1∶500、GCN5 1∶500和p300/CBP 1∶500。阴性对照采用PBS代替一抗。
1.3.3结果判定IGF2的阳性表达部位在细胞浆,GCN5和p300/CBP表达阳性部位在胞核,部分呈核- 浆型,呈棕黄色颗粒状。
采用双盲法进行阳性表达水平评分,以综合计分法进行半定量分析:1每张切片在400倍镜下随机选取5个视野,计数阳性细胞总数的百分比并计分:0分 = 没有阳性细胞;1分 = 阳性细胞 <10%;2分 = 阳性细胞占10%~29%;3分 = 阳性细胞占30%~60%;4分 = 阳性细胞占 >60%;2根据细胞的着色强度进行强度计分:0分 = 无着色,与阴性对照一致;1分 = 浅黄色;2分 = 棕黄色;3分 = 棕褐色;3阳性细胞百分比记分和强度记分相乘,两者乘积作为每张切片的平均染色强度。0~2分记为(-),3~4分记为 (+),5~8分记为 (++),9~12分记为(+++)。(++)、(+++)为高表达。
1.4 统计学处理
运用SPSS 19.0软件对数据进行统计学处理,采用χ2检验进行统计学处理。在处理时,将(+)、(++)、(+++)均视为阳性。(++)、(+++)为高表达。P<0.05为差异有统计学意义。应用染色强度计分对三项指标进行两者间相关性分析,Pearson相关系数>0.5或 <-0.5认为两者间存在显著正 / 负相关。
2 结果
2.1 IGF2 表达情况
IGF2在21例正常早孕绒毛组织中阳性率为90.48%,高表达率71.43%;在29例胚胎停止发育绒毛组织中阳性表达率为55.17%,高表达率仅为17.24%。见表1和图1、2。统计表明正常早孕绒毛与胚胎停止发育绒毛相比IGF2的表达差异有统计学意义(P =0.001)。
A:×100;B:×400
A:×100;B:×400
2.2 GCN5 表达情况
GCN5在21例正常早孕绒毛组织中阳性率为90.48%,高表达率80.95%;在29例胚胎停止发育绒毛组织中 阳性表达 率为65.52% , 高表达率 为24.14%。见表2和图3、4。统计表明正常早孕绒毛与胚胎停止发育绒毛相比GCN5的表达差异有统计学意义(P =0.002)。
2.3 p300/CBP 表达情况
p300/CBP在21例正常早孕绒毛组织中阳性率为80.95%,高表达率57.14%;在29例胚胎停止发育绒毛组织中阳性表达率为48.28%,高表达率为10.34%。见表3和图5、6。统计表明正常早孕绒毛与胚胎停止发育绒毛相比GCN5的表达差异有统计学意义(P =0.003)。
2.4 胚停育组织中 IGF2 与 GCN5、p300/CBP 表达两两间的相关性
根据IGF2、GCN5和p300/CBP三种指标的染色强度计分进行两者之间的相关性分析,IGF2与GCN5、p300/CBP之间的Pearson相关系数分别为0.622(P <0.00)、0.563(P <0.00),都显示了显著的正相关性,即GCN5与p300/CBP均跟随IGF2表达的上调呈现上调趋势。GCN5与p300/CBP之间也呈现了显著正相关(Pearson相关系数为0.563,P <0.00)。
3 讨论
IGF2是一种在胚胎发育中起重要作用的促有丝分裂肽,它在大多数胚胎组织中合成、分泌,调节细胞的生长和分化,参与许多生理、病理过程的调节[8]。IGF2的主要生理作用包括:促多细胞器官生长;激素样作用;促进血管形成;影响糖代谢;促进软骨内成骨;抑制细胞凋亡等。IGF2基因是一个重要的印迹基因,IGF2时间或空间上的异常表达对于胚胎常常是致畸甚至致死性的。巨大舌 - 脐膨出综合征(Beckwith-Wiedemann syndrome,BWS)和罗素综合征(Russell-Silver syndrome,RSS)[9,10],都是IGF2印迹状态异常导致先天畸形的例子。LEE等[3]在动物模型观察到IGF2低水平表达会造成胎鼠宫内发育迟缓,甚至导致胚胎停止发育。笔者的前期工作和其他学者的一些研究表明IGF2基因的甲基化调节异常与早期胚停育的发生有关[11,12,13]。本研究结果再次证实在胚停育的绒毛组织中存在IGF2蛋白的表达降低。可能由于胚胎早期时期,绒毛组织中的IGF2异常表达降低,胚胎失去其发育的营养支持,最终枯萎。
组蛋白乙酰化和DNA甲基化同样都是重要的表观遗传学调节形式。组蛋白乙酰化在早期发育中的作用越来越受到重视[14,15]。组蛋白乙酰化主要受HATs和HDACs两大类酶调节。HATs的主要功能是对染色质核心组蛋白氨基端的赖氨酸残基进行乙酰化修饰,从而使染色质结构疏松,提高基因的转录活性[16]。
GCN5是第一个被发现的组蛋白乙酰基转移酶,它广泛存在于众多物种里,主要修饰核小体组蛋白及游离组蛋白H3及H4。p300则是一种辅助激活因子兼HAT,它与CBP(CREB-binding protein)在结构和功能上高度同源,经常作为一个整体—p300/CBP发挥作用[17]。p300在多器官及细胞中均有表达,修饰H2A、H2B、H3及H4四种组蛋白[18]。
GCN5及p300/CBP作为组蛋白乙酰基转移酶,通过调节基因组印迹,在胚胎发育、肿瘤发生等重要生理、病理过程中发挥重要作用。XU等[19]发现,敲除GCN5的小鼠胚胎发育严重受阻,并有大部分胚胎死亡。SHIKAMA的研究表明敲除p300的鼠胚大都在孕中期死亡,而p300乙酰基转移酶活性域单等位基因沉默的鼠胚,则呈现多器官(主要是心脏、小肠和肺)的复杂畸形,大部分胚胎死亡,一部分在出生时或生后几小时因呼吸衰竭死亡。GCN5及p300对早期胚胎形成有重要协同调节作用,其异常表达对早期胚胎具有致死性[20]。
鲈鲤胚胎发育研究 篇3
1 材料与方法
1.1 亲鱼来源及催产
2013年5月19日, 于云南省鹤庆县龙开口鱼类增殖站捕捞经驯化养殖的鲈鲤亲本, 并挑选成熟程度较好、体质健壮、体表无伤的亲本, 通过鱼用高效催产合剂进行人工催产。然后, 放入直径为3 m的圆形池内, 水深1.2 m, 并用流水刺激亲鱼, 待达到效应时间后, 每间隔1 h检查1次是否有产卵迹象。♀∶♂=1∶2, 雌鱼均重1 350 g, 雄鱼均重1 056 g。
1.2 人工受精及孵化
2013年5月21日, 17:20发现有产卵迹象, 17:30进行干法人工授精, 获卵3 400粒。用清水脱粘后放入尤先科孵化器中进行孵化。孵化过程为全流水恒温 (19±1) ℃孵化。
1.3 胚胎发育观察
受精卵发育48 h内, 每1 h取样1次, 以后每2 h取样1次。每次观察不少于30粒胚胎正常发育的受精卵, 以60%以上达到某个时期记为该时期的起始时间, 从前一阶段发育到下一阶段的起始时间为时间间隔, 期间进行重复观察验证。用Nikon双目体视解剖镜观察鱼卵胚胎发育情况, 用NIS-Elements软件测定数据, 用尼康DS-Fil高分辨率摄像头将图像放大10倍反应到电脑屏幕, 通过比例尺 (20∶1) 用直尺测量 (精确到0.1 mm) 。用Excel进行数据统计分析。
2 结果与分析
2.1 卵的特性
发育成熟的卵呈卵圆形, 为金黄色, 沉性, 卵黄均匀分布, 卵径为1.8 mm。
2.2 胚胎发育阶段
孵化水温为 (19±1) ℃的条件下, 鲈鲤受精卵经101 h 40min孵化出膜, 积温为1 901.0℃。参考国内学者的研究[7], 将鲈鲤的胚胎发育分为受精卵、胚盘、卵裂、囊胚、原肠胚、器官形成6个阶段32个时期, 各期发育时期、发育时间、水温和积温见表1, 各发育时期所对应胚胎见图1。
2.2.1 受精卵阶段。
鲈鲤受精卵表面富有光泽, 受精后开始发粘, 此时用清水轻轻冲洗, 用鸡毛轻轻搅动, 可脱去黏性, 卵粒逐渐吸水膨胀, 卵周隙扩大, 颜色变淡, 卵膜呈透明状, 卵径达到2.5 mm (图1-1) 。
2.2.2 胚盘阶段。
受精后1 h 25 min, 原生质不断向动物极集中, 逐渐隆起形成类似盘状结构, 此时即为胚盘期 (图1-2) 。胚盘的形成为后续的卵裂奠定了基础。
2.2.3 卵裂阶段。
受精卵卵裂方式为盘状卵裂, 随着胚盘逐渐增大, 胚盘表面出现分裂沟, 将胚盘分为左右对称的2个部分, 经过1 h 20 min, 胚盘分裂为2个大小相等的分裂球, 为2细胞期 (图1-3) 。分裂球再次经裂, 分裂沟与第1次垂直, 形成4个大小相等的分裂球 (图1-4) 。此后, 分裂球呈几何级数增加, 分别继续发育至8细胞、16细胞、32细胞、64细胞等 (图1-5、1-6、1-7、1-8) 。受精后13 h 15 min, 分裂球越来越小, 形成多细胞胚体, 桑椹状, 此期为桑椹胚期 (图1-9) 。
2.2.4囊胚阶段。
受精后17 h 30 min, 细胞团隆起明显, 细胞间的间隙已经变得十分模糊, 形成的囊胚层高举在卵黄上, 此时为囊胚早期 (图1-10) 。受精后21 h 10min, 囊胚层的高度降低, 此时已不能分清细胞间隙, 细胞层向下扩散, 进入到囊胚中期 (图1-11) 。受精后24 h 30 min, 囊胚细胞向边缘扩散, 紧紧贴着卵黄, 并渐渐向卵黄部分下包约1/3, 此时进入囊胚晚期 (图1-12) 。
2.2.5 原肠胚阶段。
受精后28 h, 胚盘向植物极下包, 约占整个胚胎的1/2, 胚环出现, 此期为原肠早期 (图1-13) 。受精后33 h 50 min, 胚层继续下包至2/3处, 并且伴随着胚盾的出现, 此时进入原肠中期 (图1-14) , 统计其受精率高达99.38%。受精后38 h, 胚层下包至3/4处, 进入原肠晚期 (图1-15) 。
2.2.6神经胚阶段。
受精后40 h 34 min, 胚层下包至4/5处, 露出卵黄栓, 胚体多为侧卧状态 (图1-16) , 此期为神经胚期。受精后43 h, 胚孔关闭, 胚体延长脊索初显呈柱状, 胚体的雏形形成 (图1-17) , 此为胚孔封闭期。
2.2.7 器官形成阶段。
受精后45 h, 胚体中部出现1~3对肌节, 脑区略微隆起, 胚孔仍可见, 即为肌节出现期 (图1-18) 。受精后47 h, 肌节增至4~6对, 眼基出现, 呈长扁圆形, 下缘隐约可见, 且不很平整, 胚体包围卵黄约4/5, 此为眼基出现期 (图1-19) 。受精后49 h, 肌节增至7~8对, 围抱卵黄的胚体约5/6, 眼基稍微扩大呈椭圆形, 为眼囊期 (图1-20) 。受精后53 h 30 min, 眼囊前方隐约可见嗅板, 肌节为14对, 脊索清晰, 为嗅板期 (图1-21) 。受精后58 h 10 min, 尾端略突出, 脑区微微隆起, 肌节增至16~18对, 为尾芽期 (图1-22) 。受精后62 h 50 min, 听囊明显 (图1-23) 。受精后65 h 10 min, 尾部出现尾泡, 此时进入尾泡期 (图1-24) 。受精后67 h 10 min, 肌节19~23对卵黄囊的自由边缘内凹, 胚体进一步拉长, 肌肉收缩微弱无节奏, 作缓慢的颤动式收缩状, 为肌肉效应期 (图1-25) , 此时尾泡已经消失。受精后68 h 50 min, 体节为25~26对, 胚体尾芽进一步伸长, 包绕着整个卵黄的3/4, 眼囊内出现圆形晶体, 此时进入眼晶体形成期 (图1-26) 。受精后76 h 10 min, 肌节33~35对, 胚体和卵黄拉得更长, 胚体可摆动, 头部与卵黄连接处出现心脏原基 (图1-27) 。受精后77 h 30 min, 肌节36~37对在眼囊后方的听囊中出现一对透光性较差的黑点, 此时进入耳石期 (图1-28) 。受精后85 h15 min, 卵黄囊前上方, 头腹部, 管状心脏出现, 开始微弱的心跳, 此时进入心动期 (图1-29) 。受精后89 h 40 min, 胚体包绕着整个卵黄的5/6, 色素开始在视网膜形成, 致使视杯清晰可见, 此为色素出现期 (图1-30) 。受精后94 h 6 min, 围心腔增大, 心脏跳动加剧, 胚体可以包绕整个卵黄囊1周, 且摆动较快, 卵膜明显变得更薄、更透明, 已经为出膜做好了准备 (图1-31) 。受精后101 h 40 min, 胚体尾部不断地拍击卵膜, 将卵膜击破, 尾部随即伸出卵膜外, 伴随着尾部的不停摆动, 鱼苗由尾至头逐渐脱离卵膜, 鱼苗孵出 (图1-32) 。
初孵仔鱼全身透明、淡黄色;卵黄囊较大, 未见血管分布;前端呈卵圆形, 后端呈棒状, 整个仔鱼卧在卵黄囊上;围心腔位于卵黄囊的前端, 心跳明显;眼睛后侧左右耳囊内一对耳石清晰可见;胸鳍、鳃均未出现。初孵仔鱼侧卧于水底, 尚无平游能力。
3 结论与讨论
3.1 鲈鲤受精卵的特点
鲈鲤成熟卵为金黄色, 与同亚科的中华倒刺鲃[8]相同, 与两者的地理分布相似有关。卵色与受精卵所吸附的水底卵石、泥沙的颜色相似, 是自然进化中的一种保护性适应[9]。
淡水鱼沉性卵卵径大多为1.0~1.5 mm[10], 鲈鲤成熟卵卵径为1.8 mm, 而宽口光唇鱼[11]、半刺厚唇鱼[12]卵径分别为:1.50~2.10、1.74~1.97 mm, 鲈鲤与之相似。但比光倒刺鲃卵径[13] (2.2~2.4 mm) 要小, 这与鱼类胚胎发育具有种的特异性、主要受遗传因素的影响有关[10]。
鲈鲤卵为弱黏性, 其黏性不可自行消失, 需人为脱黏。这与异齿裂腹鱼[14]、中华倒刺鲃[8]等鲃亚科其他鱼类的黏性自行消失不同。这跟其孵化期较长且需要牢固地粘附在水底卵石及泥沙上面有关。
3.2 鲈鲤胚胎发育与温度的关系
温度是胚胎发育过程中的重要影响因素, 在水温 (19±1) ℃, 其胚胎发育时间为101 h 43 min, 而一般鲤科鱼类的胚胎发育要快的多, 如草鱼在水温为24~26℃下, 胚胎发育所需时间为25 h 30 min[15], 即使同亚科的中华倒刺鲃, 在水温为19~22℃的条件下, 胚胎发育的时间为43 h 40 min[11]。这是因为在适当的温度范围内, 受精卵的发育速率与水温成正相关[10]。据报道[16], 鱼类的胚胎发育快慢除与水温高低关系密切外, 一般卵径大的胚胎发育较慢, 鲈鲤的卵径为1.8 mm, 在鲤科鱼类中属于较大的一种, 鲈鲤胚胎发育较慢, 可能与此有关。低温使得鲈鲤仔鱼延缓孵出, 外加其卵径较大, 这也有助于幼鱼的成活率提高。
胚胎停止发育 篇4
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试雌金鱼购自湖南柳吉现代农业科技有限公司;雄性鲤鱼来自湖南农业大学水产教学基地。
1.2 试验方法
1.2.1 人工催产。
在繁殖季节, 选取已经达到性成熟的雌金鱼和雄性鲤鱼注射HCG与LHRH-A1合剂进行催熟, 约10 h采集精液。催产药物注射时间与量根据当时水温、亲本成熟度、方便操作等诸多因素来确定, 鲤鱼注射1次, 用量为金鱼亲本的1/2。
1.2.2 精子灭活。
人工挤出鲤鱼精子, 立刻加Hanks液, 精子∶Hanks液=1∶4, 然后充分摇匀, 在培养皿上铺成1 mm左右的液层, 放距紫外线20 cm处垫有冰板的摇床处理15 min左右, 显微镜下定期检查精子活性。当90%精子失去活性时停止紫外线照射, 收集失活精子, 储存在冰块中备用。
1.2.3 雌核发育。
受精:捞取发情金鱼亲本, 挤出成熟卵粒, 快速加入失活精子, 用消毒的干鸡毛搅拌, 进行人工干法假授精。热休克:用21℃水尽量冲散卵粒, 均匀粘附在直径20 cm的玻璃培养皿内, 恒温5 min, 然后逐步进入40℃水体, 放置3min, 再逐步回到21℃, 放置3 min, 其后放置室内孵化。胚胎发育观察:孵化水温和室内维持在 (21±2) ℃, 孵化用水充分曝气, 每隔2 h换水1次, 定期剔除死卵, 定期用显微镜观察与摄像记录胚胎发育过程, 并统计受精、孵化等情况。
2 结果与分析
当水温为21℃时, 受精卵经过60 min开始细胞分裂, 18 h 48 min进入原肠期, 29 h 40 min后进入神经胚期, 40 h40 min后进入眼基期, 45 h 30 min进入眼囊期, 49 h 10 min进入肌肉效应期, 55 h 23 min进入心脏原期。
2.1 胚胎发育过程
2.1.1 卵裂。
卵受精后, 卵膜吸水膨胀开始出现第1次分裂, 卵裂速度较快, 2 h内完成16细胞期分裂, 胚盘开始形成多层, 卵裂球越来越小, 规则地排列在配盘表面, 逐渐向胚盘外表推移, 并集中在胚盘处形成较为明显的隆起, 4 h后形成多细胞期 (图1a~d) 。
2.1.2 囊胚期。
受精6 h后, 胚胎细胞界限开始模糊不清, 胚盘在卵黄上呈高峰状, 出现早期囊胚, 进入高囊胚期 (图1e) ;9.8 h后, 细胞界限消失, 囊胚细胞开始向下方扩展, 面积不断扩大, 囊胚降低, 囊胚细胞逐步平展于卵黄膜上, 胚盘为弓形, 形成低囊期 (图1f) 。
2.1.3 原肠胚期。
受精18.67h后, 胚层进一步向植物极扩张, 约占整个胚胎的1/3 (图1g) ;受精20.17 h后, 胚盘下包卵黄1/2 (图1h) , 由于细胞的集中和内卷后造成一环带形的胚胎和一新月形的缺口, 这就是背唇, 也即原肠期形成的开始。21.33 h后, 胚盘下包3/5, 背唇处又内卷及增生的细胞向中央伸展集中形成球胚盾, 前段头部隆起明显, 形成原肠晚期胚胎 (图1i) 。原肠期统计受精率为56.54%。
2.1.4 神经胚期。
受精39 h后, 胚层细胞继续下包4/5, 受精35 h后, 囊胚层完全包围卵黄, 胚孔闭合, 胚体形成, 呈弧形, 胚盾中线形成神经索, 脑部逐渐膨大, 出现2个收缩部分, 脑分为前、中、后3个部分, 胚体上神经沟两侧可见5~6对短柱状体节, 达到胚孔封闭期 (图1k) 。
2.1.5 器官形成期。
受精45 h后, 胚体前方两侧出现椭圆形突起的眼泡原基, 出现体节, 并随着时间的推迟, 体节越来越明显, 受精52 h后出现眼点, 配体后部肌肉可以轻微扭动, 可见神经索。受精60 h后, 个别胚体心脏开始微弱跳动。
2.1.6孵化期。
受精75~90 h后, 胚体活动明显减弱, 然后胚体尾部出现剧烈扭动, 甚至翻滚整个胚体, 借助尾部摆动的力量冲破卵膜, 从卵膜破裂到胚体完全脱落需要8~10 h。刚脱膜而出的鱼苗, 腹部带有一椭圆形卵黄膜, 2~3 d后消失, 鱼苗能平游。
2.2 胚胎发育成活情况
对雌核发育的金鱼胚胎发育到囊胚期的成活率、孵化率以及正常鱼苗的比率进行统计, 结果见表1。平均受精率为65.16%;平均孵化率为50.28%;诱导率15.80%, 正品率为
注:a为受精卵;b为2细胞期;c为4细胞期;d为8细胞期;e为64细胞期;f为囊胚期;g为原肠早期;h为原肠期;i为原肠晚期;j为神经胚期;k为胚孔封闭期。
67.90%。
3 讨论
3.1 鲤鱼精子作为诱导源的可行性
热休克是一种常用的染色体加倍处理方法, 用于雌核发育研究的不多, 并且不同鱼类和不同染色体加倍处理阶段, 热休克起始时间、所需强度、温度等均有所不同, 孵化率和成活率较低[4,5]。本研究表明, 遗传失活的鲤鱼精子能有效启动金鱼雌核发育, 采用热休克处理染色体加倍, 较其他学者研究结果来看, 可能达到较高的受精率和孵化率, 表明此方法进行金鱼雌核发育是有效可行的。
3.2 雌核发育技术在金鱼选种中的优势
雌核发育主要是通过人工染色体加倍处理, 使雌核单体发育成为有正常生活力的个体[6]。染色体加倍可在不同发育阶段处理进行, 受精受阻后阻止卵子的第2次成熟分裂, 或卵子的第1次有丝分裂而使染色体加倍, 不同染色体加倍处理, 雌核发育后代基因纯度不同, 实践中多采用第1次有丝分裂过程中染色体加倍处理[7]。
试验过程中, 胚胎发育时间同其他学者研究上有所差异, 笔者认为可能是以下原因:一是孵化水温和室温差异, 导致胚胎发育速度有所改变。胚胎在培养皿发育过程, 水温易受到环境影响, 故孵化水温较难控制。二是雌核胚胎发育多放在室内进行, 环境光照对其影响较大。三是不同品种鱼类, 其胚胎发育时间会有所差异。
鲤鱼属鲤科, 鲤亚科, 鲤属, 染色体数目2N=100, 金鱼染色数目为2N=100, 两者关系较近, 外部形态较大, 理论上早杂交个体不存活。在该研究中, 用未曾遗传失活的鲤鱼精子与金鱼人工授精, 有杂交个体产生, 体色黑, 外部形态与鲤鱼相似, 其杂交出现成活个体的机理仍有待进一步研究。
摘要：开展了金鱼人工雌核发育的胚胎发育过程研究, 用紫外线灭活的鲤鱼精子激活金鱼卵子, 采用热休克处理卵子使其染色体加倍, 获得雌核发育的二倍体金鱼苗。将假受精的金鱼卵放入室温 (21±2) ℃室内塑料盒里孵化, 10 min后卵膜吸水膨胀, 60 min后开始卵裂, 8 h后出现囊胚期, 29 h后出现原肠胚期, 39 h后出现神经胚期, 56.8 h后器官开始形成, 3 d后孵化出小苗, 受精率为65.16%;平均孵化率为50.28%;诱导率15.80%, 正品率为67.90%。
关键词：金鱼,人工雌核发育,鲤鱼,胚胎发育
参考文献
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