小鼠胚胎（精选9篇）
小鼠胚胎 篇1
摘要：探讨小鼠胚胎体外发育过程中,2种激素(孕马血清促性腺激素PMSG、人绒毛膜促性腺激素HCG)对早期胚胎发育的影响。取原核期胚胎培养于不同的培养体系中,确定适合胚胎发育的最佳体外培养体系;在胚胎培养液中加入不同浓度的激素,观察激素对体外发育的影响。试验发现含10%胎牛血清的人输卵管液培养液(HTF)是该试验条件下小鼠早期胚胎发育的最佳培养液;在该培养液中添加不同浓度和不同种类的激素后,各发育阶段胚胎的发育率与未添加激素的对照组相比均有所下降,但未发现浓度依赖性。由此可认为,高浓度的PMSG和HCG对体外培养的胚胎发育有抑制作用,可降低胚胎发育到各阶段的比例,尤其是显著降低了囊胚的发生率。
关键词：激素,小鼠胚胎,体外发育,影响
早期胚胎体外培养技术在发育生物学、胚胎移植、转基因动物等领域的研究工作中都有很重要的作用[1]。早期胚胎发育是一个复杂的过程,在此过程中,可受到各种激素的影响,激素通过不同途径来调控早期胚胎发育[2,3]。目前,在不孕治疗中经常使用到各种促排卵激素,在孕妇妊娠期间也经常使用一些激素类药物,有报道,使用不同剂量和不同种类的激素,可能影响到胚胎的质量[4,5,6,7]。另外,环境中也存在着多种激素的类似物,这些激素和激素类似物对胚胎发育的影响研究,目前还缺乏系统性,尤其是较高浓度的激素水平如何影响胚胎的发育、胚胎发育与激素的浓度之间是否存在着剂量依存性、同种激素对不同发育阶段的胚胎的影响等,这些都还不十分明了,很有必要进行深入的研究。本研究旨在以小鼠为试验动物模型,在基础胚胎发育培养液中分别加入不同种类和不同浓度的激素,以探讨其对鼠早期胚胎体外发育的影响机理。
1 材料与方法
1.1 试验试剂
孕马血清促性腺激素(PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(HCG)购自宁波第二激素厂,HTF培养液购于美国In-Vitro公司,透明质酸酶购自Vitrolife公司,BSA粉剂购自Bovoma X公司,FBS(胎牛血清)购自Gibco公司。胚胎操作液配制:CZB-HEPES(Na Cl为478.9mg/100m L,KCl为36.3mg/100m L,KH2PO4为15.9mg/100m L,Mg SO4为14.195mg/100m L,Na HCO3为210.0mg/100m L,C6H12O6为100.0mg/100m L,Ca Cl2·2H2O为25.0mg/100m L,乳酸钠(60%糖浆)为370mg/100m L,链霉素为50mg/100m L,青霉素为60mg/100m L,HEPES为238.0mg/100m L)。使用时,添加BSA粉剂4mg/m L,过滤除菌,使用前加温,用于体外胚胎的收集和清洗操作。
1.2 试验动物及处理
昆明品系性成熟小鼠,6~8周龄,购自浙江中医药大学动物实验中心,饲养于光照控制(10L∶14D)、恒温恒湿的饲养室,自由采食饮水。雌鼠于17∶30左右腹腔注射10IU孕马血清促性腺激素(PMSG),48h后腹腔注射10IU人绒毛膜促性腺激素(HCG),HCG注射后与正常雄鼠按1∶1比例合笼,次日清晨检查有无阴栓。有阴栓者于注射HCG后14~21h采用颈椎脱臼法处死小鼠。
1.3 胚胎收集
取出输卵管移入操作液,在体视显微镜下找到输卵管膨大部,划破输卵管膨大部使受精卵(云雾状)游离出来。用枪头吸出卵团,移入含透明质酸酶的液滴中反复吹打,镜下观察,当受精卵游离出来后,用移卵管(自制巴氏管)吸出来移入新液滴内清洗3次,备用。
1.4 试验分组与胚胎培养
1.4.1 检查通过2-细胞阻滞情况。
收集洗净的胚胎,选择形态较好的受精卵分为2组,分别置于HTF+10%FBS和HTF+4mg/m L BSA培养液小滴中。于37℃、5%CO2、95%空气、饱和湿度的培养箱中培养,24h后观察2-细胞发育情况并做好记录。
1.4.2 检查培养体系。
收集洗净的胚胎,选择形态较好的受精卵分为多组,分别置于HTF+10%FBS培养液小滴中。于37℃、5%CO2、95%空气、饱和湿度的培养箱中培养,每24h观察1次,并记录各发育阶段胚胎数目。
1.4.3 激素对胚胎发育的影响。
选择形态较好的受精卵分为多组,分别置于添加100、50、10IU/m L的HCG和100、50、10IU/m L PMSG的HTF+10%FBS培养液中。于37℃、5%CO2、95%空气、饱和湿度的培养箱中培养,每24h观察发育情况,并记录各发育阶段的胚胎个数。以不添加激素的HTF+10%FBS培养液作为对照组(CK)。
2 结果与分析
2.1 培养液中添加FBS和BSA检查培养系统突破2-细胞阻滞效果
在试验体系中,分别在HTF培养液中添加胎牛血清-FBS(10%)和牛血清白蛋白-BSA(4mg/m L),检查培养系统能否突破小鼠胚胎发育的2-细胞阻滞情况,结果发现:添加FBS和选购的BSA均可以使原核期胚胎突破2-细胞阻滞,而以添加血清效果较好,在以下的试验中将选择HTF添加血清作为基础培养液(见表1)。
2.2 培养体系检查
应用HTF+FBS培养原核期胚胎,可以平均获得2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑椹胚和囊胚的比例分别为80.3%、78.3%、76.0%、75.5%、68.5%,各发育阶段胚胎个数的具体数值见表2。
2.3 小鼠胚胎发育各阶段的显微摄影
培养后每间隔24h,在相差显微镜下观察胚胎的发育情况,并拍照,各发育阶段胚胎的形态如图1所示。各发育阶段胚胎发育正常,培养系统相对稳定。
注:A为2-细胞与4-细胞胚胎;B为8-细胞胚胎;C为桑椹胚和囊胚;D为囊胚;E为囊胚腔扩大;F为孵化的囊胚。
2.4 激素对小鼠原核胚胎体外发育的影响
不同浓度的激素对小鼠胚胎体外发育的影响结果见表3。由表3可知,添加激素后,各发育阶段胚胎的发育率与对照组相比均有所下降,原核期胚胎的2-细胞发生率与对照组相比有所下降,但未发现浓度依赖性;添加不同浓度的HCG使4-细胞胚胎及其后的各阶段胚胎发育下降尤为明显,并且未发现发育到囊胚阶段;添加不同浓度的PMSG,囊胚的发育率与对照组之间也存在着显著差异;添加HCG似乎可以降低胚胎异常分裂率,而添加PMSG似乎使异常分裂胚胎的比例升高,具体情况如何还需要深入的研究。
注:2-细胞发育率=2-细胞数/1-细胞胚胎数;4-细胞发育率=4-细胞数/2-细胞数;8-细胞发育率=8-细胞数/2-细胞数;桑椹胚发育率=桑椹胚数/2-细胞数;囊胚发育率=囊胚数/2-细胞数;异裂率=异裂数/1-细胞胚胎数。
3 结论与讨论
胚胎的早期发育过程中,很容易受到激素的影响,在辅助生殖实施过程中,往往需要使用激素进行超数排卵处理,激素对早期胚胎的发育影响研究可以为人类辅助生殖技术提高成功率提供一定的理论基础。近年来,随着动物胚胎工程的发展,试管动物、转基因动物和体细胞核移植动物已相继出现,而生产这些动物的一个关键步骤就是胚胎的体外培养,获得稳定的体外发育率是这些技术广泛推广的基础。
试验发现,应用HTF添加10%血清的培养系统可以很好地支持小鼠胚胎体外发育,使用的系统在多次试验检测过程中相对比较稳定,几次试验培养的原核期(1-细胞期)胚胎可以在体外发生分裂,并可以发育到囊胚阶段。
昆明品系小鼠早期胚胎体外培养中表现出严重2-细胞阻滞现象[8],应用模拟输卵管培养液添加血清和血清白蛋白的方式可以突破2-细胞阻滞,在本研究中进口血清突破2-细胞阻滞的效果要好于选购的BSA。这可能与血清中含有多种促进胚胎发育的细胞因子有关[9]。
PMSG和HCG这2种激素经常被用于动物的超数排卵。孕马血清促性腺激素(Pregnant mare serum gonadotropin,PMSG)具有体内的FSH和LH的作用,而人绒毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin,HCG)是模拟体内LH的作用,促进黄体发育,FSH和LH二者在体内促进卵泡发育、排卵和黄体发育。HCG由人胎盘和胞体滋养层细胞合成,现已可高度纯化,并可由基因重组生成。自1978年首例经体外受精胚胎植入创造的Louise Brown诞生后,近10余年来随着ART技术的进展,HCG的临床应用也日益广泛,但其在妊娠早期的功能迄今仍未完全明了。虽然HCG对维持黄体功能是必需的,在不孕症患者诱导排卵出现黄体功能障碍时,重复给予HCG能有效地支持黄体功能[10],但也有HCG溶解黄体的报道,试验表明在大鼠、小鼠、兔和羊于胚胎植入前和植入时,给予1次或多次HCG,会导致产生不同程度的胚胎死亡[11]。特别是最近用促性腺激素诱导排卵,在体内或体外受精治疗不孕症时,常继之出现缩短黄体期致胚胎植入失败、妊娠率降低等现象,其机理也还很少阐明。在程渭玉等[12]的研究中也表明HCG对胚胎的毒性,且存在时间、剂量依赖关系。试验添加不同浓度的HCG使4-细胞胚胎及其后的各阶段胚胎发育下降尤为明显,并且未发现发育到囊胚阶段的胚胎。
PMSG在母马妊娠38~40d时可以检测出,60d时达到高峰,而在120d时开始下降,170d时下降到检测不出的水平;HCG在非孕妇女处于较低水平,在胚胎发育早期也处于低水平,在妊娠第2周以后显著增加。近来也有学者研究认为胚胎体外发育与激素PMSG、HCG存在关联[13],其他激素也可能影响到胚胎的质量[14,15,16]。在辅助生殖和超数排卵过程中,需要使用高浓度的PMSG和HCG,在血中二者的浓度高于正常值。在培养体系中添加高浓度的PMSG和HCG,调查其对早期胚胎发育的影响,研究发现胚胎暴露在高浓度的PMSG和HCG降低了胚胎体外发育到各阶段的比例,尤其是明显降低了囊胚的发生率,而HCG对胚胎体外发育的影响似乎更大。由于所调查的样本还较小,其具体情况和具体机制等尚需要深入研究,下一步将扩大试验次数并深入研究多种激素的联合作用对胚胎体外早期发育的影响。
小鼠胚胎 篇2
2008-06-19 00:00 来源：丁香园
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知识总结
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1517 关键词： MEF小鼠 胚胎成纤维细胞
小鼠胚胎成纤维细胞的富集
1、给13-14天的孕鼠注射大约0.5ml阿佛丁。当鼠麻醉后，实施断颈法处死小鼠。
2、用70％乙醇擦拭腹部，把皮肤向后拉，暴露出腹膜。用消毒过的工具，剪开腹壁以暴露出子宫角。将子宫角移到10cm的皿里。用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。
3、用剪刀剪开每一测的胚囊,并将胚胎移到培养皿中。
4、用两副钟表镊子将胎盘和膜与胚胎分离开，分离后切除内脏（所有深色的东西）。将胚胎转移到(有盖)培养皿中，用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。
5、用带有弯钩的眼科剪将组织剪碎，当你剪的很累以致于不能再剪的时候，加入2ml胰蛋白酶/EDTA继续剪。再加入另外5ml胰蛋白酶/EDTA，并在37℃孵育大约20分钟。此时，返回至第一步，对下一只鼠进行操作。
6、执行1－4步，到将胚胎置于胰蛋白酶/EDTA中这一步。
7、吹打胰蛋白酶/EDTA中的胚胎，直到有很少的组织物残留。将皿放回培养箱再孵育10分钟。
8、用20ml培养基以终止胰蛋白酶/EDTA的消化，将皿中的物质转移至50ml锥形管中。
9、混匀管内的物质，加入到含有20ml培养基的T75培养瓶中。每个培养瓶中装大约3个胚胎。
10、将这些培养瓶放在培养箱中37℃培养过夜。
11、将胚胎置于PBS中，并重复第5步。
12、第二天更换培养基，以去除碎片和中毒的细胞及其分泌的物质。
13、当培养瓶中的细胞长到80-90%汇合时并仍处于指数生长期时，是冻存细胞的最佳时期。一般说来，这发生在准备胚胎的第二天。这可能或早或晚发生，所以请注意观察你的培养瓶。
注释：
我们已用CF－1品系的鼠制备了成纤维细胞。
培养基成分：
88％ DMEM 10％ FBS 1％ NEAA 1% 双抗
对于新建立的细胞系，要对样本进行支原体检测。
小鼠胚胎成纤维细胞的消化/传代
1、移去MEF培养基
2、用5ml不含钙镁离子的PBS洗涤细胞（以去除胰蛋白酶的抑制物）。
3、每个培养瓶里加入1.5ml的胰蛋白酶/EDTA（0.05%的胰蛋白酶），消化5min。
4、为了使细胞分散开，轻轻吹打细胞。
5、每加入1ml的胰蛋白酶/EDTA，加入至少1ml的MEF培养基以终止胰蛋白酶的消化。
6、将细胞悬液加入到15ml的锥形管中，吹打几次，使细胞分散为单个的。
7、在新的T75培养瓶中加入10mlMEF培养基。
8、将细胞悬液分装到新的T75培养瓶中，放在37℃培养箱中进行培养。
注释：
MEF培养基成分：
89% DMEM(Gibco # 12100-046)10% FBS(Gibco # 16000-044)1% NEAA(Gibco # 11140-050)MEF每传一代就会生长得更慢些。你第一次传代的比例可以是1:5，但是最后一次的传代（第4代或第5代）比例应该是1:2。
小鼠胚胎成纤维细胞的冻存
重悬培养基：
80% DMEM 20% FBS 1% NEAA 冻存培养基：
60％ DMEM 30％ FBS 20％ DMSO
1、用不含钙镁离子的PBS洗一次细胞。
2、加入胰蛋白酶/EDTA37℃消化大约5min。
3、将细胞吹打下来。
4、加入与胰蛋白酶/EDTA等体积的培养基以终止胰蛋白酶的消化。
5、吹散大块组织。如果还有大块组织存在，可将悬液加入到50ml的管中使其沉淀。
6、取上清液，将其分装到锥形管中，1000rpm离心5min。
7、每个冻存瓶中加入0.5ml（冻存液的一半体积）的重悬培养基重悬细胞。
8、逐滴加入等体积的（0.5ml/瓶）冻存培养基，混匀。现在DMSO的浓度是10％。
9、每个冻存瓶中加入1ml的细胞。
10、迅速将细胞转移到冻存的容器中，-70℃冻存过夜。（细胞不能长时间放置在室温而含有DMSO的情况下）
11、第二天将细胞放于液氮中长期保存。注释：
提前标注好冻存细胞的以下信息：
细胞系名称
传代的代数
冻存细胞的数目
日期
Initials 注明冻存/解冻形式
小鼠胚胎成纤维细胞的解冻/复苏
1、将冻存瓶从液氮中取出。
2、放在37℃水浴中快速解冻，being careful not to immerse the vial above the level of the cap.3、当仅还有一点冰晶残留时，用95％的乙醇消毒冻存瓶的外面，并将其置于hood中。（为什么用95％的乙醇消毒？hood是什么？）
4、轻轻地上下翻转细胞一次，将它们放入15ml锥形管中。
5、想管中逐滴加入10ml培养基。这一步操作不能少于两分钟。做快了对细胞将是一种打击，你将得到比其他方法具有更低生活能力的细胞。6、1000rpm离心5min。
7、将细胞重悬于10ml培养基中，然后放入T75培养瓶中。
8、放入37℃培养箱。
9、注明冻存/解冻的形式，以更新数据。
1、关于如何确底胚胎期12.5d~13d的小鼠？希望大家能够介绍一下自己所采用的方法，集思广益。我所采用的方法是选择同一天出生的三对小鼠，到成熟（8~10 w）后，分三周合笼，（每周合笼一对），然后待最早合笼的小鼠产崽后，再取另两个雌鼠的胚胎。不知道这样行不行，也没注意别人是怎样做的。另外问了几个外科的同学也没找到可以查出小鼠孕期的仪器。
2、关于提取MEF的比较好的protocol
3、关于MEF转染时起耐受性如何？这个我以后主要做这些，可能会积累一定的经验，但现在肯定有各位朋友已经从事或正在从事着方面的工作，希望能够分享经验。
4、关于其分泌细胞因子能力？我从一些文献上发现，MEF除了作为胚胎干细胞的饲养层以外，也是研究天然免疫的重要材料，如日本东京大学的AKIRA的实验室，大板大学的takashi fujita实验室就发了相当多的文章。从这些文献可以看出，MEF分泌细胞因子能力远远强于HEK293等工程细胞，相当于肝实质细胞，略低于几种免疫细胞。但较免疫细胞，我认为有其不可替代的优势：
（1）其并不是主要发挥免疫功能的细胞，只有在受到外界刺激时才会应答，分泌细胞因子，免疫细胞在不受刺激时也会为了维持稳态而不断产生细胞因子，即使有严格的control 组，但专门的免疫细胞即使是同一种细胞（DC，NK，T）但不同的细胞分泌细胞因子的能力也是参差不齐的。会造成control 相对不一致。
（2）另一方面，由于这些免疫细胞大部分都是悬浮的，不太容易转染，结果阳性率也会较低。（3）现在的分离MEF的方法很便宜，不复杂，而分离纯的免疫细胞（如NK，DC），需要MACS，FACS等，这对目前国内的实验室经费相对紧张的情况来说，不是很划算。因此除非是需要研究某一种免疫细胞，如果是为了研究天然免疫或者adaptive immune过程中某中基因，或者蛋白，或者某一信号通路等的作用，MEF 细胞不失为一种选择。
网友crepi 的观点：
1、我每次取的是16~18天的胚鼠 个人觉得无碍 我倒更喜欢大一点的胚胎 更好操作一点
2、我取的是皮肤 然后胰酶4度消化过夜 第二天终止消化 撕掉表皮 留下真皮 减碎 用的100目滤网过滤 这个胰酶消化的时间是个关键 时间长了 细胞容易死 时间少了，表皮不容易揭下来 我有此就是这样 消化了15个小时 结果接种下来的细胞不能贴壁 全死了
3、我用的培养液是DMEM+10%小牛血清 培养液也是关键 因为虽然都是成纤维细胞比较泼辣 但总归是原代 可能还是比较娇嫩 我前几天就是这样 后来发现是培养液出的问题 测的PH值都8.3了 细胞不死才怪 毕竟细胞耐酸不耐碱
4、原代培养的最大天敌还是污染
网友baichangming的观点：
MEF对培养基和血清的要求不高，一般的都行我用过高糖DMEM和D/F-12，生长情况都行，而且看不出什么差别。血清也是以前用几百块钱的国产标准胎牛血清也长得也不错，因为要养干细胞，所以现在换成进口Gibco胎牛的血清（两千多/500ml），感觉细胞的状态确实好了一些。我的血清浓度一般是16.66666%。
网友北羽迦楼的观点： 细胞没别的，就是很容易老化，一般我都是1:5~1:3传代，3代之后细胞就出现衰老了，我感觉年轻增殖能力强的MEF应该有着清晰的细胞轮廓，细胞立体效果不错，在相差显微镜下，细胞核清晰，细胞纤长，正在分裂或是刚刚分裂的细胞没有伸出伪足，但是同样有着更加明亮的轮廓，与细胞边缘相比，细胞呈深色（我觉得是透光效果不好）。一般在4×下观察最能看出细胞的状态，此时能看到细胞呈梭形或是三角形。细胞铺展很厉害，细胞的透光效果增加，说明开始衰老。衰老的MEF最好不要做feeder,但是也不是完全不好。但是要是做转染或是感染的话，出现衰老的MEF就不行了。所以一般就是3代以内做。
我们用的就是WiCell的protocal养，和前面那位战友发的差不多。只是我们用1mg/ml Collengase IV消化40min，用什么酶不重要，我觉得最重要的就是种盘后的换液。原代2小时不管还有多少米贴都不要，传代复苏后一小时就换。消化的时候也是要舍得，0.05%Trypsin-EDTA(GIBCO)，5min消化不下来的也统统不要。因为健康的MEF就是易消化易贴壁。老化以及混杂的其他细胞（神经、上皮）就没那么快了。
小鼠胚胎胸腺移植方法和实验研究 篇3
1材料与方法
1.1材料
实验动物组:供体BALB/c妊娠14d(E14d)小鼠10只,不限雄雌,单次钴(60Co)全身均匀5Gy强度辐射(剂量率为:0.8Gy/min),去除供体胸腺内T淋巴细胞。受体BALB/c老龄(16月龄)小鼠10只,体重24~27g。对照动物组:BALB/c老龄(16月龄)小鼠10只,体重24~27g。
1.2方法
(1)麻醉方法:1%戊巴比妥钠60mg/kg体重腹腔内注射。(2)建立胸腺移植模型:供体BALB/c手术:将供体BALB/c妊娠14d(E14d)小鼠胎盘分离出,无菌取胎鼠,断头,体视镜下摘取胎鼠胸腺小叶于培养液中,待用。(3)受体BALB/c手术:BALB/c老龄(16月龄)小鼠无菌麻醉、消毒后,取腰背左侧中纵行切口,显露左侧肾脏,肾被膜处制孔,在体视镜下将胸腺小叶植入16月老龄小鼠肾被膜下。无菌缝合结扎逐层结扎封闭腹腔。术后连续5d给予环孢素A 10mg/kg体重静脉注射,安置在SPF级饲养室内,分笼单独饲养4~6周后取移植胸腺标本,在光镜下观察胸腺组织结构变化。
1.3统计学方法
采用SPSS17.0软件统计分析,实验数据采用±s表示,组间比较采用t检验,组内比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),P<0.05差异具有显著意义。
2结果
受体BALB/c老龄(16月龄)小鼠10只全部存活,供体胎鼠胎胸腺移植于左侧肾脏肾被膜下,术后4周,打开腹腔,光镜下观察移植胸腺无明显缩小,胸腺组织结构基本正常,未见明显排斥现象。术后5周,观察移植胸腺组织在肾脏被膜下继续发育,呈半球形,颜色瓷白,表面可见数条细小的血管。
移植的老龄小鼠T淋巴细胞的恢复效果,流式细胞分析老龄移植小鼠相比同龄对照,CD4+细胞百分含量分别为:14.07±4.13,10.95±6.63,差异不显著;CD8+细胞百分含量分别为:25.12±13.53,12.96±11.64,差异显著;CD4+/CD8+比值分别为:0.59±0.56,0.82±0.27,差异不显著。
注:*表示差异显著(P<0.05)。
3讨论
胸腺移植的方法有很多,胸腺细胞及胸腺移植被国内外许多学者建模和应用治疗多种疾病:Hong[1]和Dupuy[2]等人通过移植胸腺细胞,恢复淋巴细胞功能,治疗免疫缺陷病;通过移植胸腺上皮细胞,改善免疫功能低下的人体。Danner[3]等人通过胸腺组织块移植治疗爱滋病患者,Ortak[4]等人通过将带血管的胸腺移植来重建移植胸腺的血液供应,目前国内已建立相应的动物模型,Lambrigts[5]等人的胸腺与其他脏器联合移植。在国内,徐春岳等[6]将大鼠胚胎胸腺与后肾原基联合移植至无胸腺裸小鼠,探讨了联合移植能否重建受体细胞免疫功能。付继成等[7,8]将正常胚胎小鼠胸腺移植于2月龄的雄性BXSB小鼠体内治疗红斑狼疮和改善BXSB雄性小鼠肾功能。徐高四等[9]也探讨了胚胎胸腺组织移植对系统性红斑狼疮(SLE)模型鼠的治疗效果。胡正等[10]将冻融处理或新鲜的人胚胎胸腺移植入小鼠肾被膜下1~3mm处,良好地支持人胸腺发育。在国外,Zhu X等[11]利用胚胎胸腺移植,恢复血运,免疫重建、恢复功能。
目前国内尚未见小鼠胚胎胸腺移植动物模型建立的报道。与国外动物模型相比,我们采用的移植物为胎胸腺小叶,可充分发挥胎胸腺功能、利于最大限度地发挥移植胎胸腺的功能。我们胸腺移植受体部位是肾被膜下,该部位局部血液供给较丰富,手术简单,便于手术观察移植物的变化等优点,朱世滨等[12]也观察了肾包膜下胰岛移植对移植物存活情况。我们在进行手术时,采用妊娠14d(E14d)胎鼠胸腺,胚胎胸腺组织对于受体而言,抗原性低,而适合用来移植,移植后容易形成免疫耐受,有利于在同种异体或异种受者中存活,杨崇贤等[13]曾用胚胸腺组织浆液注射治疗慢性病毒性肝炎。胎鼠胸腺内T淋巴细胞钴剔除技术,张涛等[14]曾探讨过(60)Co照射小鼠免疫功能的影响,这样大大缩短了移植胸腺恢复血运时间,对老龄小鼠恢复免疫起重要作用,建立了较为成功的胎胸腺移植动物模型。
摘要：目的:探讨T细胞剔除的同种胎胸腺在老龄小鼠肾被膜下血运重建、免疫功能和外周血T细胞池重建恢复。方法:对10只胸腺老化萎缩的BALB/c老龄(16月龄)小鼠施行胚胎胸腺移植,供体为BALB/c小鼠妊娠14d(E14d)的胎鼠,将胎鼠胸腺小叶移植于受体BALB/c老龄(16月龄)小鼠肾被膜下,无菌缝合结扎逐层结扎封闭腹腔。术后连续5d给予环孢素A10mg/kg体重静脉注射。结果:受体BALB/c老龄(16月龄)小鼠10只全部存活,无排斥反应,移植后移植胸腺恢复血运,重建免疫、恢复免疫功能。结论:老龄小鼠胸腺组织在肾被膜下移植3周后血运重建良好,术后6周恢复发挥对新生T淋巴细胞选择发育功能。
小鼠胚胎 篇4
目的:观察小鼠胚胎胃发育过程中上皮细胞凋亡及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、P53的`表达.方法:E11d～E15d胎鼠连续切片,体视学法测量胃上皮凋亡小体密度(DAB);免疫组化SABC法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、P53的表达.结果:①胃DAB峰值为E14d～E15d.②Bcl-2表达峰值为E11～13d;Bax表达峰值在E14d,P53表达峰值在E11～13d.结论:Bel-2可能具有抑制胃上皮细胞凋亡的作用;Bax可能具有促进细胞凋亡的作用;P53可能与胃上皮细胞凋亡调控的关系不密切.
作 者：林雪梅 李均 汪维伟 作者单位：林雪梅,汪维伟(重庆医科大学基础医学院组织与胚胎学教研室,重庆,400016)
李均(重庆市急救中心,重庆,400014)
小鼠胚胎 篇5
1 材料与方法
1.1 材料
清洁级昆明系小白鼠 (雌性4～5 周龄, 体重18～20 g;雄性10～12 周龄, 体重25～30 g) , 购自北京协和医院;胎牛血清 (FCS ) , 杭州四季青公司生产;链霉蛋白酶 (pronase or protease) 、胚胎缓冲液 (M2液) 、石蜡油, Sigma公司生产;孕马血清促性腺激素 (PMSG) 、人绒毛膜促性腺激素 (HCG) , 宁波第二激素厂生产;青霉素、链霉素, 天津华孚高新生物技术公司生产;倒置显微镜 (Nikon ECLIPSE TS100) , 日本Nikon公司生产。
1.2 方法
1.2.1 培养液的配制
胚胎体外培养液 (CZB液) , 按 Chatot C L等[5]的配方配制。 表皮生长因子用胚胎体外培养液稀释成0.01, 0.10, 1.00, 10.00 ng/ mL 4种不同浓度。
1.2.2 小鼠超排卵
小鼠在控光 ( 6:00～ 20:00光照 , 20:00～ 6:00黑暗) 条件下饲养, 先腹腔注射孕马血清促性腺激素 8 IU, 48 h后再腹腔注射人绒毛膜促性腺激素 10 IU。注射人绒毛膜促性腺激素后立即与雄鼠1∶1合笼, 次日 8:00检查阴道栓。
1.2.3 胚胎的收集、去透明带及培养
于注射人绒毛膜促性腺激素后的 17～18 h 内采取颈部脱臼法处死见栓雌鼠, 无菌取出输卵管并去除其上附着的脂肪, 迅速置于预热的胚胎缓冲液中, 用异物针撕开输卵管膨大部释放出原核胚团, 移入含0.1%透明质酸酶的PBS中, 除去卵丘细胞并用胚胎缓冲液清洗3次;将去除卵丘细胞的原核胚移入含 0.5% 链霉蛋白酶的PBS液中, 待原核胚卵间隙增大、透明带膨胀变软时立即移入到10% 胎牛血清的胚胎缓冲液中, 反复清洗几次, 使透明带脱落;无透明带的原核胚采用微滴单卵培养法 (micro-drops single culture method, MDS) 按常规方法制作30 μL的胚胎体外培养液液滴, 每个微滴放1枚原核胚, 在37.5 ℃、5%CO2、饱和湿度条件下进行培养, 每24 h半量换液并观察、记录胚胎的发育情况。
1.2.4 囊胚细胞的计数
将发育至囊胚期的胚胎进行回收, 在含有Hoechst 33342的PBS液中染色10 min, 然后将囊胚移至加有100%甘油的载玻片上, 覆盖盖玻片并轻轻挤压, 使细胞平铺, 在荧光显微镜下进行囊胚细胞计数。
1.3 数据分析
每组试验均重复5次, 试验数据应用统计软件SPSS11.0 进行方差分析。
2 结果
2.1 不同浓度的表皮生长因子对各期胚胎体外发育的影响 (见表1)
注: 同列数据肩标字母完全不同表示差异显著 (P<0.05) 。
从表1可以看出:在无血清培养液中, 添加0.10 ng/mL 表皮生长因子处理组的2细胞胚胎发育率 (85.9%) 与对照组 (84.1%) 无显著差异 (P>0.05) , 添加0.01, 10.00 ng/mL 的表皮生长因子对无透明带小鼠胚胎体外各期的发育率均有显著提高 (P<0.05) 。其中添加0.01 ng/mL表皮生长因子处理组的无透明带胚胎体外发育率最好, 其2细胞胚胎发育率、4细胞胚胎发育率和囊胚发育率分别为88.0%、37.9%和30.1%。表皮生长因子浓度大于0.10 ng/mL时会对无透明带小鼠各期胚胎的体外发育率有一定的抑制作用。培养得到的无透明带2细胞胚胎、无透明带4细胞胚胎和无透明带囊胚见图1～3。
2.2 无透明带原核胚用不同浓度的表皮生长因子培养得到的囊胚回收率和囊胚细胞计数
在无血清胚胎体外培养液中添加不同浓度的表皮生长因子用于体外培养无透明带原核胚胎, 得到的囊胚回收率和囊胚细胞计数结果见表2。由表2可见:添加0.01, 0.10 ng/mL 表皮生长因子的2个处理组囊胚回收率较高, 分别为89.0%和86.0%, 与其他几个处理组相比均差异显著 (P<0.05) ;从囊胚细胞计数来看, 0.01 ng/mL 表皮生长因子处理组的囊胚细胞数显著高于其他几个处理组 (P<0.05) , 囊胚细胞数为69枚。
综合表1和表2的结果, 比较不同浓度的表皮生长因子对无透明带小鼠胚胎体外发育的情况, 可以得出结论:在无血清培养液中添加0.01 ng/mL 表皮生长因子能明显提高无透明带小鼠胚胎体外培养各期的发育率。
注: 同列数据肩标字母不同表示差异显著 (P<0.05) 。
3 讨论
以往的研究表明, 哺乳动物胚胎去掉透明带后仍然可以发育[6,7], 这种方法最早是由Peura T T等[2]建立并用于牛的胚胎细胞核移植。近年来, 该方法又用在病毒作为载体转染无透明带胚胎进行转基因动物的生产研究上。为了更好地完善胚胎细胞核移植技术和转基因动物生产技术, 建立一种标准化、简便、有效的小鼠无透明带胚胎体外培养体系是非常重要的。
表皮生长因子是血清和卵泡液中都存在的生长因子, 无血清培养液中加入表皮生长因子能促进牛胚胎的发育, 增加蛋白质的合成和囊胚的孵化, 但不增加囊胚中的细胞数量。也有研究发现表皮生长因子也能增加细胞数量[8]。Wiley L M等[9]用RT-PCR和Southern-blotting方法证实小鼠原核胚存在表皮生长因子受体。Paria B C等[10]采用125I-表皮生长因子放射自显影方法发现小鼠8-细胞至囊胚各期胚胎也存在表皮生长因子受体。这就提示表皮生长因子可通过表皮生长因子受体对小鼠胚胎各期胚胎的发育起一定的调节作用。
试验于无血清胚胎体外培养液中添加不同浓度的表皮生长因子, 采用微滴单卵培养法对不同浓度的表皮生长因子对无透明带小鼠胚胎发育的影响效果进行了观察, 结果发现, 在无血清胚胎体外培养液中添加0.01 ng/mL 表皮生长因子可显著提高无透明带小鼠胚胎体外各期的发育率。 表皮生长因子对各期胚胎发育的影响与上述胚胎表皮生长因子受体机制有关, 一定浓度的表皮生长因子会对无透明带胚胎体外各期的发育有促进作用, 但浓度过高反而会抑制其发育。添加0.01 ng/mL 表皮生长因子同时可以增加囊胚回收率, 经囊胚细胞计数, 其囊胚细胞数均比其他处理组显著增高。该结果与白照岱等[4] 的试验结果基本相符。因本试验已用链霉蛋白酶将小鼠原核胚胎的透明带消化掉, 所以其添加量比较少, 可能与去掉胚胎透明带后胚胎的表皮生长因子受体作用机制有关。
综上所述, 在无血清胚胎体外培养液中添加0.01 ng/mL表皮生长因子可以提高无透明带小鼠胚胎体外各期的发育率, 从而有效地改善了无透明带小鼠胚胎体外发育的质量。
摘要：为了观察不同浓度的表皮生长因子对无透明带小鼠胚胎体外发育的影响, 试验将小鼠原核期胚胎用链霉蛋白酶去除透明带后, 分别置于含有不同浓度的表皮生长因子无血清胚胎体外培养液中培养, 观察各期胚胎的发育情况。结果表明:除0.01 ng/mL表皮生长因子添加组胚胎的2细胞发育率和囊胚回收率与添加0.1 ng/mL表皮生长因子处理组差异不显著外 (P>0.05) , 其体外胚胎各期的发育率、囊胚回收率和囊胚细胞数与其他处理组比较均差异显著 (P<0.05) 。说明一定浓度的表皮生长因子可以提高无透明带小鼠胚胎体外培养各期的发育率, 但是高浓度的表皮生长因子对无透明带小鼠胚胎的体外发育有一定的抑制作用。
关键词：表皮生长因子,小鼠,无透明带胚胎
参考文献
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[2]PEURA TT, LANE MW, LEWIS I M, et al.The effect of recipientoocyte volume on nuclear transfer in cattle[J].Molecular Reproduc-tion and Development, 1998, 50:185-191.
[3]YANG B K, YANG X, FOOTE R H.The effects of growth factorson development of (IVM/IVF) bovine embryos[J].Therigenology, 1993, 39:342.
[4]白照岱, 刘凯, 邴鲁军.表皮生长因子对小鼠早期胚胎体外发育影响的研究[J].山东大学学报, 2004, 42 (2) :150-152.
[5]CHATOT C L, ZIOMEK C A, BAVISTER B D, et al.An improvedculture medium support development of random-bred 1-cellmouse embryos in vitro[J].J Repord Fert, 1989, 86 (2) :679-688.
[6]MODLINSKY J A.The role of zona pellucida in them development ofmouse eggs in vitro[J].J Embryol Exp Morphol, 1970, 23:539-551.
[7]TROUNSON A O, MOORE N.The survival and development ofsheep eggs following complete or partial removal of the zona pelluci-da[J].J Reprod Fertil, 1974, 41:97-108.
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[9]WILEY L M, WUJ X, HARARI I, et al.Epidernal growth factorreceptor mRNA and protein increase after the four-cell preimplant-ation stage in murin development[J].Dev Biol, 1992, 149:247-260.
小鼠胚胎 篇6
1 材料和方法
1.1 实验动物
清洁级健康性成熟的昆明种小鼠,雌鼠体重为20~35 g,雄鼠体重为35~40 g,均购自南华大学动物实验中心,置于专用饲养房喂养,温度22℃,湿度60%~70%,动物自由饮水进食。
1.2 主要试剂和仪器
苯(国产分析纯),Ham's F12培养基、噻唑蓝和台盼蓝(Sigma公司),胰蛋白酶(Difco),胎牛血清(浙江三利公司),DMSO(北京鼎国公司)。二氧化碳培养箱(5400型NAPCO公司),酶标仪(ELX800型,BIO-TEK公司),解剖显微镜(MOT-IC),倒置显微镜(CK40,OLYMPUS)。
1.3 方法
1.3.1 中脑细胞和肢芽细胞的制备
按照文献方法[6,7]稍加改良。处死孕12 d小鼠,分离胚胎,选择53~56体节的胚胎,移入含50%胎牛血清的无钙镁的PBS液中,切取中脑和前肢芽,用无钙镁的PBS液清洗3次后剪碎,0.125%胰蛋白酶37℃水浴消化10~15 min,Ham's F12全培养基(Ham's F12、20%胎牛血清、L-谷氨酰胺548.6 mg/L、青链霉素各100 I-U/m L)终止消化,200目细胞筛过滤,胎盘蓝计数细胞存活率在90%以上,调整悬液细胞密度分别为5×106个/m L(中脑细胞)和2×107个/m L(肢芽细胞)。
1.3.2细胞分化实验
按每孔20μL细胞悬液加入24孔培养板,二氧化碳培养箱中孵育2.5 h后,每孔加入2 m L含不同浓度苯(0、1.5、15、150和1 500μmol/L)的Ham's F12全培养基培养5d,弃培养液,2.5%戊二醛固定,PBS漂洗;肢芽细胞培养板加入0.5%阿利兴蓝染液37℃过夜,中脑细胞培养板加Mayer's苏木素液染色3、4 min。蒸馏水漂洗后风干,倒置显微镜下盲法计数每孔中的全部软骨细胞集落数和神经细胞集落数。每一剂量组设4个复孔,重复2次。
1.3.3 细胞增殖实验
按每孔10μL细胞悬液加入96孔培养板,二氧化碳培养箱中孵育2.5 h后,每孔再加入200μL含不同浓度苯的Ham's F12全培养基培养5 d,弃培养液,每孔加入新鲜配制的MTT液(5 mg/m L)20μL,37℃孵育4 h,弃尽培养液,每孔加入DMSO 100μL,振摇10~15 min,待细胞中蓝紫色结晶充分溶解后,于酶标仪上570 nm处测定OD值。细胞增殖抑制率=(1-试验孔OD值/对照孔OD均值)×100%,并计算ID50。每一剂量组设4个复孔,重复2次。
1.4 统计分析
计量指标以表示,计数指标以百分率表示。用SPSS 13.0软件建立数据库,用单因素方差分析,多重比较采用LSD法;以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 苯对小鼠胚胎肢芽细胞分化和增殖的影响
随着苯染毒浓度的增加,胚胎肢芽细胞分化为软骨细胞的集落数逐渐减少,肢芽细胞增殖受到抑制,两者均呈现较强的剂量-效应关系,见表1和图1。苯对肢芽细胞分化、增殖的半数抑制浓度(即dID50和pID50)分别为89.93μmol/L和396.77μmol/L。
2.2 苯对小鼠胚胎中脑细胞分化和增殖的影响
培养5 d后,对照组单个中脑细胞形成明显的细胞集落,集落间神经突起丰富,并连接成网络状,苏木素染色成特异的深紫色;苯染毒各组较对照组集落形成减少、体积小、集落细胞间突起数量减少等,具有较明显的剂量-效应关系,见表2、图2,苯对中脑细胞的dID50=116.29μmol/L,pID50=831.46μmol/L。
3 讨论
胚胎肢芽细胞微团培养采用正在分化的肢芽细胞,经高密度培养,分散的细胞可组织成分离的细胞团并增殖,最终分化为软骨细胞的集落,细胞分化抑制剂能使微团培养中的细胞集落数明显减少,已知大多数致畸物都是细胞分化抑制剂,故可根据微团培养中的细胞集落数的变化,判断化学物的致畸性[6]。
12 d龄小鼠胚胎肢芽细胞经体外高密度培养后,按一定时间和空间关系有序的分化增殖成为软骨细胞集落[6]。本研究结果显示,苯在低浓度时即在不导致细胞大量死亡的剂量下,可使软骨细胞集落形成减少,细胞的增殖分化抑制率增加,并呈明显的剂量-效应关系,表明苯可对胚胎肢芽细胞的增殖、分化产生特异性的抑制作用。细胞增殖分化的分子基础是亲代全套遗传基因的选择性激活、转录、翻译,在基因表达过程中,这些环节受到内外环境的影响而发生变化。当内外环境变化超过细胞生理耐受阈值时即可导致其整体调控失常,出现细胞的异常分化并最终导致胚胎的组织器官发育异常。由于大多数细胞分化抑制剂也是致畸物[6]。因此,苯可判断为致畸物,其致畸机制很可能是苯干扰了细胞增殖期的DNA合成,导致细胞的功能受到破坏,但有待从分子水平上进一步深入探讨。
12 d龄小鼠胚胎中脑细胞其神经母细胞正处在分化阶段,经高密度培养后,相同类的细胞可通过细胞间的识别、粘着及细胞的运动而聚集在一起,并最终形成集落,具有神经细胞的特征,最终分化为神经细胞[7]。中脑细胞微团培养系原代细胞培养,它要比多次传代的细胞系,在其结构功能等各方面更接近于体内神经细胞的正常发育状态,亦与人类早期脑发育过程相似[7]。因此,可根据微团培养中的细胞数的变化来判断化合物的脑发育毒性。本研究表明:苯在一定的浓度下,对微团培养的中脑神经细胞增殖和分化均具有明显的抑制作用,并呈现明显的剂量-效应关系,其细胞分化半数抑制浓度低于细胞增殖半数抑制浓度,分别为116.29 mg/L和831.46μmol/L。提示苯的分化毒性作用不是由于细胞毒性作用引起的,根据文献[7]的评价标准,苯应该是神经细胞分化的特异抑制剂,可影响神经元的正常分化,从而影响脑发育,导致神经系统功能下降,但其在分子水平上的作用机制仍有待进一步阐明。
摘要：目的探讨苯对胚胎肢芽、中脑细胞分化和增殖的影响及对肢芽器官发育的影响。方法分离12d龄小鼠胚胎肢芽和中脑细胞进行微团培养,观察肢芽和中脑细胞的分化与增殖;结果随着苯染毒浓度的增加,胚胎肢芽细胞分化为软骨细胞的集落数逐渐减少,中脑细胞形成神经集落数减少、体积小,集落细胞间突起数量减少,肢芽细胞和中脑细胞增殖率下降,均具有较明显的剂量-效应关系;苯对肢芽细胞的半数分化抑制浓度(dID50)和半数增殖抑制浓度(pID50)分别为89.93μmol/L和396.77μmol/L,对中脑细胞的dID50和pID50分别为116.29μmol/L和831.46μmol/L,对细胞分化的抑制作用大于对增殖的抑制作用。结论苯对胚胎中脑及肢芽细胞的分化和增殖有特异性抑制作用,可能对胚胎骨和脑具有发育毒性。
关键词：苯,微团培养,胚胎,细胞,分化和增殖
参考文献
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小鼠胚胎 篇7
1 材料与方法
1.1 材料
酵母双杂交系统BD克隆质粒pGBKT7;AD克隆质粒pGADT7;BD质粒阳性对照pGBKT7-P53;AD质粒阳性对照pGADT7-SV40;酵母菌株AH109、Y187、酵母提取物、酵母蛋白胨、人工合成营养缺陷型培养基(synthetic dropout minimal base,SD)SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade、X-a-半乳糖苷酶(X-a-gal)及Advantage 2 PCR试剂盒均购自Clontech公司;小鼠胚胎干细胞c DNA文库为德国哥廷根大学W ENGEL教授惠赠;大肠杆菌感受态细胞Ecoli DH5α、T4连接酶及pGEMT-easy试剂盒购自Promega公司;所需限制性内切酶、LA TaqDNA聚合酶购自Ta KaRa公司;Trp、Leu、His及Ade 4种氨基酸及酸化玻璃珠购自Sigma公司;小量质粒抽提试剂盒购自Qiagen公司。
1.2 诱饵质粒p GBKT7-PIASx的构建、毒性及自激活活性分析
根据小鼠PIASx基因序列设计上、下游引物,经PCR扩增后将其亚克隆入pGEMT-easy载体内,经序列测定确认正确无误后,用EcoR I和BamH I双酶切后,插入到同样双酶切的pGBKT7载体上,转化大肠杆菌DH5α,利用酶切方法筛选阳性克隆;构建好的诱饵质粒按照常规的方法转化入酵母菌株AH109及Y187中,经过夜培养,观察其对酵母细胞是否有毒;同时将诱饵质粒pGBKT7-PIASx和pGBKT7共转化酵母细胞AH109及Y187,分别铺板于营养缺失培养基SD/-Trp、SD/-His/-Trp、SD/-Ade/-Trp 3种培养板上,30℃培养3～5 d,分析诱饵载体是否有自激活活性。
1.3 酵母细胞交配法筛选小鼠胚胎干细胞cDNA文库
应用酵母交配法进行c DNA文库的筛选,具体方法如下:将转化有诱饵质粒pGBKT7-PIASx的酵母细胞Y187过夜培养细胞5 m L(细胞数大于1×109个/m L)、1 m L室温融化后的小鼠胚胎干细胞c DNA文库加入2 L含有45 m L 2×YPDA/Kan培养液的锥形瓶中,30℃震荡培养20～24 h,转速为30～50 r/min。将交配后的酵母细胞1 000 g离心10min,用10 m L 0.5×YPDA/Kan重悬细胞,将重悬的细胞铺板于营养缺失型的培养基SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade,30℃培养5～8 d,直至克隆出现。
1.4 阳性克隆的表型验证
挑取酵母交配法筛选出的阳性克隆,采用划线法将其划至营养缺失型培养基SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal上,30℃培养3～5 d,该实验批内及批间均重复3次。
1.5 对经过验证的阳性克隆进行PCR扩增、测序及生物信息学分析
采用通用引物对筛选出的阳性克隆进行酵母细胞PCR扩增,通用引物序列为5'-PCR引物:5'-TTC CACCCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG-3';3'-PCR引物:5'-GTATCGATGCCCACCCTCTAGAG-GCCGAGGCGGCCGACA-3'。采用Advantage 2 PCR试剂盒,PCR反应条件为:94℃3 min,94℃30 s,68℃3 min,共30个循环,68℃3 min,琼脂糖凝胶电泳鉴定,并进行PCR产物测序,将测序结果用生物信息学软件进行分析,观察插入片段是否含有正确的开放阅读框架,经过对比分析其在NCBI中是否能找到其同源序列。
1.6 对阳性克隆进行质粒回收
将酸化玻璃珠与Qiagen小量质粒抽提试剂盒联合应用进行酵母细胞中质粒的提取回收,具体方法如下:将阳性克隆30℃培养过夜,取酵母细胞沉淀用酸化玻璃珠进行酵母细胞破碎,即涡旋10 min,然后按照Qiagen小量质粒抽提试剂盒说明书进行质粒提取,提取完质粒DNA后,用常规方法将其转化入感受态大肠杆菌Ecoli DH5α中,铺板于含氨苄青霉素的LB培养基上。挑取大肠杆菌单克隆摇菌过夜,然后再进行质粒提取,琼脂糖凝胶电泳,以便对提取的质粒进行质量鉴定。
1.7 对阳性克隆进行自激活活性分析
采用醋酸锂转化法,将阳性克隆的质粒和空载质粒PGBKT7共同转化入酵母细胞AH109中,将转化后的酵母细胞铺到营养缺失的培养基SD/-Leu/-Trp上,30℃培养3～5 d,挑取5～10个克隆混合后,划线到营养缺失型培养基SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal上,30℃培养3～5 d,观察共转化的酵母细胞是否能激活报告基因。
1.8 直接酵母双杂交对阳性克隆进行酵母中相互作用验证
采用醋酸锂转化法,将阳性克隆的质粒分别与诱饵质粒pGBKT7-PIASx共同转化入酵母细胞AH109中,将转化后的酵母细胞铺到营养缺失的培养基SD/-Leu/-Trp上,30℃培养3～5 d,挑取5～10个克隆混合后,划线到营养缺失型培养基SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal上,30℃培养3～5 d,观察两者在酵母中是否能相互作用。
2 结果
2.1 诱饵质粒p GBKT7-PIASx的构建、毒性及自激活活性分析
利用上游引物F及下游引物R成功扩增出PIASx基因片段,经T-A克隆连接到PGEM-T easy载体中,经过DNA测序证实序列完全正确,再将插入片段酶切后,插入到用相同酶切的pGBKT7载体中,经酶切及测序进行鉴定,结果证实pGBKT7-PIASx构建正确。
将pGBKT7-PIASx分别转化至AH109及Y187中,挑取单克隆在SD/-Trp液体培养基中培养过夜,次日晨测OD600均大于1.5,说明诱饵蛋白PIASx对酵母菌株AH109及Y187没有毒性。
将转化pGBKT7-PIASx后的AH109及Y187分别铺板与3种类型的营养缺失培养基SD/-Trp、SD/-His/-Trp、SD/-Ade/-Trp中培养3～5 d后发现,2种类型的酵母均仅在SD/-Trp上生长,其他2种营养缺陷培养基中不能长出任何克隆,说明诱饵蛋白PIASx没有自激活活性,可以用于下一步的筛选。
2.2 筛选文库结果
应用酵母交配法进行小鼠胚胎干细胞c DNA的筛选,在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培养基上共得到54个克隆,挑取所得到的阳性克隆培养在SD/-Trp/-Leu/X-α-gal上连续划线培养3次,然后把得到的蓝色克隆划线培养在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal上,最终得到28个阳性克隆。
2.3 分析比对阳性克隆
将28个阳性克隆进行测序分析,在GenBank数据库中进行序列分析,其中10个克隆与已知基因的部分序列完全同源(100%),其他的18个克隆中部分为已知的假阳性rRNA,部分没有开放阅读框,因此均为假阳性结果。将10个阳性克隆进行质粒回收,仅得到其中的7个克隆质粒,代表了6种蛋白。对这7个克隆进行自激活活性分析,结果发现7个克隆均没有自激活活性。进一步对7个克隆进行直接酵母双杂交实验,结果证实其在酵母中均可以与PIASx相互作用(见附表及附图)。
3 讨论
酵母双杂交技术是一种用于筛选蛋白质相互作用的常用方法,其最大的缺陷是假阳性较多。因此,对于酵母双杂交结果的分析,最关键的是要鉴别真假阳性克隆。通过文库的筛选,笔者得到了54个阳性克隆,应用划线筛选法,经过组内重复实验及组间重复实验,去除了26个假阳性克隆。进一步通过测序分析,笔者发现有部分阳性克隆没有真正地开放阅读框架,部分克隆为最常见的假阳性rRNA,在这个分析过程后,得到了10个阳性克隆。由于从酵母细胞中回收质粒有别于细菌中的质粒回收,在这个步骤中,尽管重复了3遍以上仍然丢失了3种克隆,最终获得了7种阳性克隆。这些克隆中的捕获蛋白还必须进行自激活活性分析,经过自激活活性分析,结果并未发现有自激活活性的克隆。经过上述假阳性结果的排除,笔者得到了7个真性阳性克隆,为验证其在酵母中是否与PIASx相互作用,笔者又采用直接的酵母双杂交来验证这些克隆是否与PIASx相互作用,结果发现这7个克隆无一例外地都能与PIASx相互作用。因此,笔者的研究一共发现了7个在酵母中能够与PIASx相互作用的蛋白,其中有2个克隆编码同一种蛋白,因此代表了6种与PIASx相互作用的蛋白。
Huwe1(HECT,UBA and WWE domain contain ing 1,Huwe1)基因是HECT E3连接酶家族的成员之一[6],HECT结构域位于蛋白的羧基端,其中含有1个半胱氨酸的激活位点,从而形成1个泛素硫酯键中间体。在肺脏、乳腺及结直肠癌中该基因呈高表达。该基因的突变可导致3种无关联的伴X染色体的智力低下综合征[7]。研究表明,该基因可通过多种途径使其靶蛋白发生泛素化修饰来达到调控作用:使靶蛋白发生泛素化修饰进而被蛋白酶体降解;通过催化MCL1的多聚泛素化及降解来调控细胞凋亡;通过介导DNA聚合酶β赖氨酸-41、赖氨酸-61及赖氨酸81的单泛素化来发挥碱基的切除修复功能;同时还可以介导肿瘤抑制因子P53、核心组蛋白H1、H2A、H2B、H3及H4的泛素化修饰,进而调控细胞凋亡;通过催化MYCN的多聚泛素化修饰及降解来调节神经元的分化和增生[8,9]。
Ubr3(ubiquitin protein ligase E3 component nrecognin 3,Ubr3)是N-末端规则E3连接酶家族成员之一。该蛋白质的羧基端包含有一个约70个氨基酸残基的保守性的UBR盒子结构域,该结构域是其连接酶活性所必须的。Ubr3与其同源基因Ubr1和Ubr2一样,可以与E2-泛素化连接酶HR6A和HR6B相结合,但是与Ubr1和Ubr2不同的是,它不能结合到已知的N末端规则通路的底物上[10,11]。
Psmb 3(proteasome subunit,beta type,3)是20S蛋白酶体的β亚基之一。20 S蛋白酶体是26 S蛋白酶复合体的催化中心,它由4个环状结构组成,2个外圈各由7个α亚基组成,2个内圈则各有7个β亚基。20 S蛋白酶体与19 S复合物结合后可激活依赖ATP的泛素化蛋白质的降解[12]。
泛素蛋白酶体通路是目前已知的所有真核生物体内具有高度选择性的最为重要的蛋白质降解通路,被降解的蛋白底物经过泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3的作用与多聚泛素结合,从而提呈给26 S蛋白酶复合体降解。该通路通过蛋白酶体选择性降解细胞内泛素化的蛋白质,不但能够破坏损伤陈旧的蛋白质,而且能够参与调节细胞的多种重要生命过程,精确降解细胞内各种目的靶蛋白,进而参与基因转录、细胞周期调节,以及受体胞吞、抗原呈递等各种细胞生理过程。在笔者发现的6种PIASx相互作用蛋白中,Huwe1和Ubr3为2种不同类型的E3连接酶,而Psmb3则为26 S蛋白酶体的一个组成部分,而目前对PIASx蛋白作用的研究显示,PIASx是一种SUMO化E3连接酶,它可以介导多种蛋白质的SUMO化修饰[13,14],诸结果表明,在胚胎干细胞中PIASx可能与这3种蛋白质一起参与了泛素蛋白酶体通路介导的蛋白质降解,但其在泛素蛋白酶体通路中的作用机制还有待于进一步的研究。
总之,该研究成功地从小鼠胚胎干细胞c DNA文库中筛选出了与PIASx相互作用的蛋白6种,为揭示PIASx在小鼠胚胎干细胞中的作用机制奠定了基础。
摘要：目的 应用酵母双杂交系统,从小鼠胚胎干细胞cDNA文库中筛选与PIASx(protein inhibitor ofactivated STAT x,PIASx)相互作用的蛋白。通过对其相互作用蛋白的筛选和研究,探讨PIASx在干细胞分化中的作用机制。方法 以pGBKT7-PIASx为诱饵质粒,从小鼠胚胎干细胞cDNA文库中筛选出与PIASx相互作用的阳性克隆,对验证后的阳性克隆进行测序及生物信息学分析,进一步采用直接酵母双杂交进行相互作用验证。结果 经过筛选、测序、同源性分析及直接酵母双杂交验证,发现了6种与PIASx相互作用的蛋白。结论 应用酵母双杂交系统,共筛选得到了6种不同的基因,其编码蛋白与PIASx相互作用,可能与小鼠胚胎干细胞的增殖与分化相关。对PIASx相互作用蛋白的筛选有助于揭示PIASx在胚胎干细胞中的作用机制。
小鼠胚胎 篇8
1 材料
CO2培养箱(型号为3121),Thermo Forma公司生产;洁净工作台(型号为SW-CJ-1FD),苏州佳德净化科技公司生产;冰箱(型号为BCD-290W),Haier公司生产;冷冻离心机(型号为Certrifuge 5430),Eppendorf公司生产;倒置荧光显微镜(型号为TI-DH 606790),Nikon公司生产。m LIF(批号为LIF2010),Millipore公司生产;丝裂霉素-C(批号为BML-GR311),ENZO Life Sciences公司生产;高糖DMEM(批号为AAJ207791),Hyclone公司生产;胎牛血清(FBS,批号为10099-141)、Knockout DMEM/F-12(批号为12660-012)、Neurobasal Medium(批号为21103-049)、N-2 Supplement(批号为17052-048)、B-27 Supplement(批号为17504-044)、血清替代物SR(批号为10828-028)、β-巯基乙醇(批号为50325-1)、L-谷氨酰胺(批号为1572285)、非必需氨基酸(批号为1567906),均购自Gibco公司。
2 方法
2.1 主要培养基的配制
小鼠胎儿成纤维细胞培养基:高糖DMEM+10%FBS;基础培养基:Knockout DMEM/F12+N-2+Neurobasal+B-27+20%SR;小鼠ES细胞培养基:基础培养基+CHIR99021(3μmol/L)+PD0325901(1μmol/L)+m LIF(10 ng/m L)+β-巯基乙醇+L-谷氨酰胺+非必需氨基酸。
2.2 饲养层的制备
从液氮罐取出冷冻保存的小鼠胎儿成纤维细胞(MEF),直接投入37℃水浴锅中快速解冻;将复苏的MEF悬液转移至15 m L离心管,缓慢加入4 m L培养基,1 200 r/min离心3 min;弃去上清液,加入培养基重悬细胞,接种于直径为60 mm培养皿中,于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中进行培养。待细胞汇合度达到90%以上,加丝裂霉素-C(10~20μg/m L)处理细胞2~4 h,将细胞接种入经明胶处理的直径为60 mm培养皿中,备用。
2.3 小鼠ES细胞的复苏和传代培养
将小鼠ES细胞解冻复苏后,接种入饲养层铺底的培养皿中,使用ES细胞培养基培养3~5 d细胞克隆即可达到90%汇合度。此时,可对小鼠ES细胞进行传代培养:弃去培养皿中旧的培养液,用PBS清洗细胞3次,使用0.25%胰蛋白酶1 m L消化2~3 min;加入含10%FBS的DMEM培养基2 m L中和,将小鼠ES细胞吹散均匀,1 200 r/min离心3 min;弃去上清液,加入ES细胞培养基重悬细胞,接种于经饲养层铺底的培养皿中。
2.4 小鼠ES细胞碱性磷酸酶染色(AP染色)
按照碱性磷酸酶染色试剂盒(Stemgent AP Staining KitⅡ)说明书对小鼠ES细胞进行染色,用PBS洗3次后,加4%多聚甲醛固定5 min,室温避光染色5~15 min后终止反应,PBS漂洗3次,显微镜下观察,产生红色或者紫色为碱性磷酸酶阳性。
2.5 小鼠ES细胞总RNA的提取及RT-PCR检测
RNA的提取采用TRIzol裂解法:小鼠ES细胞传代培养3 d后用胰酶消化悬浮,收集细胞并用PBS清洗2次,然后加入1 m L TRIzol裂解液,充分混匀并静置5 min,使得核蛋白完全解离;向上述裂解液中加入200μL的氯仿,盖紧离心管盖,剧烈震荡15 s并静置2~3 min;然后于4℃、12 000 r/min离心15 min;小心吸取上层水相至一个新的离心管中,加入等体积的异丙醇,颠倒混匀后室温放置5 min;之后再于4℃、12 000 r/min离心10 min;小心弃去上清液,加入1 m L用DEPC水配制的75%乙醇,充分洗涤管盖和管壁,并轻弹管底使得沉淀悬浮,之后再于4℃、7 500 r/min离心10 min;弃去上清液并将乙醇吹干,加入30~100μL RNase free water(DEPC水),待完全溶解后,取少量进行完整性及纯度检测,其余用于反转录或放于-80℃冰箱保存。
RT-PCR:试验采用北京全式金生物公司的Trans Script first-strand c DNA synthesis试剂盒将提取的RNA反转录合成c DNA。反应体系(20μL):总RNA 2μg,Random Primer(0.1μg/μL)1μL,2×TS Reaction Mix 10μL,Enzyme Mix 1μL,用RNase free water补足20μL。轻轻混匀并短暂离心,之后放于PCR仪,25℃孵育10 min,42℃反转录30 min,85℃5 s使反转录酶失活,4℃终止。反转录获得的c DNA用RT-PCR进行检测。PCR反应体系为:2×PCR-Mix 10μL,c DNA≤100 ng,引物5 nmol/L,加无菌水补足20μL。检测所用引物(见表1)用Oligo7软件设计并在NCBI上对其特异性进行分析,于生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
2.6 小鼠ES细胞的免疫荧光检测
将小鼠ES细胞接种到四孔板培养3 d后,弃去培养基,加PBS洗3次,再加入4%多聚甲醛室温固定30 min;用阻断液(含100 mmol/L甘氨酸和0.3%BSA的PBS)洗3次,然后加入1%Tritonx-100室温透化15 min;之后加入5%牛血清白蛋白(BSA)室温封闭2 h;用TBP(Tritonx-BSA-PBS)洗3次,加一抗4℃孵育过夜;隔天进行室温复温20 min,用TBP洗3次,加二抗室温孵育1 h;用TBP洗3次,然后置于荧光显微镜下观察。
2.7 畸胎瘤的制作和石蜡切片鉴定
将MES消化成单细胞悬液,1 200 r/min离心5 min,每个60 mm平皿培养的细胞加入600μL分化培养基重悬,迅速注射到具有免疫缺陷的裸鼠(13~15 g)皮下(注射部位为后肢内侧或颈部皮下),每次注射细胞不少于1.0×109个,每只裸鼠注射悬液剂量不超过1 m L,可以分4个部位注射,在注射后6~10周形成畸胎瘤。
使用颈椎脱臼方法处死裸鼠,剪开畸胎瘤所在部位的皮肤,剥离出畸胎瘤,然后将畸胎瘤固定于4%多聚甲醛固定液中,其间每隔1 h晃动固定液以使其充分固定。之后经过梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、修块、剪成6μm切片,再展片、贴片、烘干,最后进行H.E.染色、镜检、拍照分析。
3 结果
3.1 小鼠ES细胞形态特征
小鼠ES细胞具有干细胞典型的形态特征,细胞核大,胞质胞浆较少,体外培养时细胞排列紧密,呈集落状生长,克隆呈突起圆顶状,边缘遮光性强,与周围的饲养层细胞界限分明(见281页彩图1a、1b)。
3.2 小鼠ES细胞AP染色结果
小鼠ES细胞克隆呈现红色,边缘饲养层细胞未着色作为阴性对照,说明小鼠ES细胞克隆呈AP染色阳性(见281页彩图1c)。
3.3 小鼠ES细胞RT-PCR结果
小鼠ES细胞克隆表达OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、CDH1、DNMT3B、DAPP4、REX1等相关多能基因(见图2)。
3.4 小鼠ES细胞免疫荧光检测结果
免疫荧光检测结果表明,小鼠ES细胞表达多能性相关蛋白OCT4、SOX2、NANOG、E-Cadherin、TRA-1-60和表面特异性抗原SSEA-1(见281页彩图3)。
3.5 小鼠ES细胞体外分化能力
小鼠ES细胞克隆悬浮培养7 d后,可形成拟胚体(见282页彩图4a)。拟胚体继续贴壁培养后,自发分化为不同类型的细胞(见282页彩图4b)。对其进行免疫荧光试验,检测到内、中、外3个胚层的标志基因的表达:SOX17(内胚层),β-tubulin(外胚层),SMA(中胚层),见282页彩图4c、d、e。
3.6 小鼠ES细胞体内分化能力
小鼠ES细胞注射到裸鼠皮下6~10周可形成畸胎瘤(见282页彩图5a、5b),取畸胎瘤进行石蜡切片分析,结果表明,来源于小鼠ES细胞的畸胎瘤具有3个胚层特有的组织结构,如外胚层的鳞状上皮组织(见282页彩图5e)、内胚层的肠上皮组织(见282页彩图5c、5d)、中胚层的骨组织(见282页彩图5f)。
4 分析与讨论
小鼠ES细胞在体外培养时易出现分化,要维持它的多潜能水平就要诱导激活相关信号途径。近几年的研究表明,添加小分子化合物(PD0325901和CHIR99021)以及LIF的培养体系(2i/LIF)不仅可以应用在已经证明可以进行多能干细胞建系的物种上,如小鼠和人[4],而且也可以使用在传统培养体系长期无法获得稳定多能干细胞系的品系或者物种上获得稳定传代的Nave ES细胞系,如大鼠或其他品系小鼠[5]。该2i/LIF培养基的主要作用原理是通过使用PD0325901作用于多能干细胞阻断ERK的磷酸化,从而维持多能干细胞的多能状态[6]。同时培养基中的另一个组分CHIR99021抑制GSK3或APC等信号通路中成分的活性间接激活Wnt信号通路,从而促进多能干细胞的自我更新;因此2i/LIF培养基能够在维持干细胞多能性的同时促进其增殖。有研究表明,人ES细胞形态以及生物学特性更类似于小鼠primed epiblast stem cells,而且这类小鼠多能干细胞已经被证明不具有完全多能性。为了获得类似于小鼠Nave ES细胞的人Nave ES细胞,2013年,O.Gafni等[7]利用2i/LIF添加其他小分子化合物培养人ES细胞,随后发现克隆形态由平铺的单层细胞转变成为小鼠Nave ES克隆形状,将转化后的细胞注射到小鼠胚胎中能形成异种嵌合体重构胚胎,证明小分子化合物能够促进多能干细胞从Primed到Nave状态的转变。D.Harris等[8]研究表明,2i/LIF培养基具有促进牛成纤维细胞重编程为多能干细胞的潜力,也证实了其在牛多能干细胞分离培养以及建系上的潜力,虽然培养在2i/LIF培养基的牛i PSC增殖缓慢,但是这已经为我们提供了一个筛选合适促进增殖因子的平台。
传统的小鼠ES细胞培养基中通常添加FBS和LIF[9],而血清中可能含有诱导小鼠ES细胞分化的因子。因此,本研究使用的培养基中不含血清,而是使用血清替代物,使得该培养基的成分更明确。对在此培养条件下获得的小鼠ES细胞进行鉴定,该细胞呈AP阳性,表达多能性相关蛋白OCT4、SOX2、NANOG、TRA-1-60、E-cadherin和表面特异性抗原SSEA-1,且具有体内外分化成3个胚层组织的能力,初步证明该小鼠ES细胞具有完全多能性。结果说明该培养基更适合小鼠ES细胞的生长以及多能性的维持。
该研究成功为本实验室建立了ES细胞的无血清、化学成分确定的培养体系。同时,也说明了小分子化合物能够有效地促进小鼠多能干细胞的自我更新,为应用小分子化合物到大家畜多能干细胞的建系和相关研究提供了理论基础。
注:第1列为Hoechst染色图片;第2列为免疫荧光检测图片;第3列为Hoechst染色与免疫荧光检测的重叠图片。
注:c、d、e第1列为Hoechst染色图片;第2列为免疫荧光检测图片;第3列为Hoechst染色与免疫荧光检测的重叠图片。
参考文献
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小鼠胚胎 篇9
微小RNA(microRNA,miRNA)是一类长度为21～25个核苷酸单链RNA分子,在转录后水平调控mRNA的表达,对发育、细胞增殖、凋亡及肿瘤发生等多种生理和病理过程起重要作用[1]。生物体内miRNA合成过程如下:RNA polII作用下miRNA基因转录、微处理器对pri-miRNA加工生成premiRNA、Exportin 5介导pre-miRNA转运、Dicer酶介导pre-miRNA剪切及miRNA链成熟;其中前两个过程是在细胞核中完成,最后两个过程是在细胞质中完成[2]。Dicer 1和DGCR 8基因是动物体miRNA生物合成过程两个关键基因,Dicer 1主要在细胞质介导从70ntpre-miRNA到22nt成熟miRNA剪切过程;DGCR 8主要在细胞核中与Drosha组成微处理器复合体,可能对pri-miRNA在微处理器复合体中的定向有帮助,从而有利于Drosha在特定位点的切割[3]。本研究采用一步法RT-PCR的方法鉴定miRNA合成相关基因Dicer 1和DGCR 8在着床前胚胎发育过程中的表达,探讨miRNA及其生物合成相关基因对胚胎发育的作用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
昆白系健康小白鼠,雌雄兼用,购自第四军医大学实验动物中心,饲养于唐都医院妇产科动物房,光照、黑暗各12h;严格控制温、湿度,自由摄食昆白系6周雌鼠(22～25g)购回后饲养一周供实验用,昆白系8-9周龄成年雄鼠购回后,单笼单放饲养3-4d后交配用。
1.1.2 细胞系、细菌及PCR引物
3T3细胞系为小鼠成纤维细胞,培养于10%FCSDMEM,第四军医大学骨科研究所惠赠;JM 109感受态细菌购自华美公司。引物根据Genbank小鼠Dicer 1、DGCR 8和β-actin基因mRNA序列采用Primer 5软件设计,Invitrogen公司合成,序列见表1。
1.2 方法
1.2.1 采用小鼠3T3细胞进行PCR反应参数的优化及引物验证
用含10%胎牛血清的DMEM培养3T3细胞,Trizol试剂提取细胞TotalRNA。紫外分光光度计检测RNA纯度和浓度,-70℃保存待用。采用SuperScriptIIReverseTranscriptase(Invitrogen公司)进行反转录,TotalRNA模板2-2.5μg反应体系为20μL;取RT产物2μL、上下游引物各1μL、PCR反应总体积50μL,扩增相应片段。预期Dicer 1基因扩增产物大小为334bp,DGCR 8基因扩增产物大小为420bp。2%琼脂糖凝胶电泳切胶回收相同大小的片段,用ClontechGelextractorKit纯化,与PGEM Teasyvector(Promega公司)连接,电穿孔法转化JM 109感受态细菌,涂AMP平板,培养过夜。博大质粒DNA小量提取试剂盒提取质粒,EcoRI单酶切鉴定筛选阳性克隆,命名为Dicer-T、DGCR 8-T送生工生物技术公司测序。
1.2.2 建立小鼠超排、交配及胚胎采集系统
挑选发情前期雌鼠于下午16:30腹腔注射PMSG(7.5IU/只),注射PMSG 48h腹腔注射HCG(7.5IU/只)并于当晚将雌、雄鼠1∶1合笼交配,次晨看阴栓。于交配后0.5d、1.5d、2.5d、3.5d和4.5d分别收集卵母细胞、2细胞、8细胞、桑椹胚及囊胚胚胎[4]。胚胎收集操作过程简述如下:未见栓雌鼠脱臼处死取出双侧输卵管,置于0.01mol/L PBS缓冲液中,挑取输卵管壶腹部卵母细胞团,0.3%透明质酸酶脱颗粒细胞,挑选质量好的卵母细胞1—10枚,移入25μL 2×ReactionMix溶液,13000g离心1min。见阴栓孕鼠脱臼处死后取出输卵管或输卵管及子宫置于0.01mol/LPBS缓冲液中,从输卵管伞端向子宫腔方向用PBS缓冲液冲洗,并迅速将囊胚、桑椹配、8细胞、及2细胞胚胎各1—10枚,移入25μL 2×ReactionMix溶液中,13 000g离心1min。
1.2.3 一步法RT-PCR检测着床前胚胎Dicer 1和DGCR 8表达
离心后向上述25μL 2×Reaction Mix溶液(SuperScriptIIIOne-StepRT-PCR System withPlatinum R★TaqDNA Polymerase,Invitrogen公司)中加入1μL(100μmol/L)基因特异性反转录引物(下游引物),70℃处理5min后置于冰上;然后依次加入1μL(100μmol/L)上游引物、21μL H2O和2μL SuperScriptIIIRT/Platinum TaqMix进行RT-PCR扩增,反应总体积为50μL。反转录参数为:40℃5min、45℃45min和50℃15min。PCR反应循环参数为:94℃预变性5min一个循环,之后94℃变性1min、60℃退火1min、72℃延伸1min,共完成40个循环;72℃延伸10min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳,紫外透射仪下观察扩增条带。
2 结果
2.1 PCR反应参数的优化及引物验证
以3T3细胞totalRNA为模板,采用随机引物进行反转录,β-actin、Dicer 1和DGCR 8特异性引物分别进行PCR扩增(β-actin为内参照),电泳结果见图1,分别扩增出约550bp、334bp和420bp条带,与预期结果相符,且无明显的非特异性扩增,表明所设计的引物特异性较高。
产物琼脂糖凝胶电泳M—100bpDNA Ladder;Lane 1—β-actin;Lane 2—DGCR 8;Lane 3—Dicer 1
将上述RT-PCR产物,经纯化后克隆入PGEM T easy载体,挑取克隆,质粒用EcoR I单酶切鉴定。结果表明Dicer-T和DGCR 8-T各有两个阳性克隆,分别切出约300bp和400bp条带,结果见图2,与预期片段大小相符。
M—100bpDNA ladder;Lane 1&2—Dicer 1;Lane 3&4—DGCR 8
将Dicer 1-T和DGCR 8-T各2个阳性克隆送测序。DGCR 8-T 2个克隆序列结果一致,将序列输入Blast分析同源性,结果表明获得序列与DiGeorge syndromecriticalregiongene 8(DGCR 8)基因(NM022720.5)高度同源。Dicer-T 2个克隆序列结果一致,将序列输入Blast分析同源性,结果表明获得序列与HomosapiensDicer1,Dcr-1homolog(Drosophila)(Dicer 1)基因(NM 177438.1)高度同源。
2.2 一步法RT-PCR检测着床前胚胎Dicer 1和DGCR 8表达
分别用1枚和10枚新鲜获取卵母细胞直接裂解后,用Dicer 1和DGCR 8特异性引物分别进行RT-PCR扩增;PCR产物电泳结果如图3,结果表明两对引物分别扩增出约334bp和420bp条带,与预期片段大小相符,但一枚胚胎的扩增效率明显低于10枚胚胎。结果表明可以采用一步法RT-PCR检测小鼠着床前胚胎中Dicer 1和DGCR 8基因的表达;应根据不同发育阶段单个胚胎RNA量高低,调整实验用胚胎数量(10枚以内)。
A—Dicer 1基因;B—DGCR 8基因;M—100bpDNA ladder;Lane 1～3依次为阴性对照、1个卵母细胞和10个卵母细胞
根据上述结果,获取新鲜不同发育阶段着床前胚胎各1—10枚,同法检测着床前各个发育阶段胚胎中Dicer 1和DGCR 8基因的表达,电泳结果见图4;结果表明在着床前胚胎发育的各阶段均表达miRNA生物合成相关基因Dicer 1和DGCR 8。
A—Dicer 1基因;B—DGCR 8基因;M—100bpDNA ladder;Lane 1～5依次为阴性对照、受精后1.5、2.5、3.5和4.5d胚胎
3 讨论
生物体发育过程从受精开始,受精进一步激活卵母细胞并启动胚胎的早期发育,哺乳动物从受精至植入这一发育阶段(即着床前阶段)的基因表达与调控是生命科学研究前沿和热点问题。近年大量研究表明,miRNA及其生物合成相关基因Dicer 1等对着床后胚胎发育、中枢神经系统发育及胚胎干细胞分化等过程起重要调控作用[3,5,6,7,8]。因此,鉴定miRNA合成相关基因Dicer 1和DGCR 8在着床前胚胎的表达,对进一步研究miRNA在着床前胚胎发育中作用具有重要意义。
小鼠是研究哺乳动物胚胎发育常用模型,但是小鼠着床前胚胎操作困难、复杂且技术难度大,尤其是要获取微克级TotalRNA需要的胚胎数量巨大几乎无法实现,这是研究着床前胚胎基因表达调控的一个瓶颈。针对着床前胚胎实验样品量有限的难题,我们设想采用将胚胎直接裂解后进行RT-PCR的方法研究基因表达。该方法优点在于省略了RNA提取和纯化过程,减少了此过程可能造成RNA损失和降解,同时大大降低实验需要的胚胎数量;其缺点是不能消除反应体系中基因组DNA的污染。为了解决基因组DNA影响实验结果问题,实验对引物特异性要求比较高,而且在设计引物时要考虑跨内含子;为解决上述问题我们采用小鼠3T3细胞系对PCR反应条件进行优化,同时对设计引物进行验证,证明引物的特异性高设计合理;并通过采用一步法RT-PCR成功鉴定了小鼠卵母细胞、受精后1.5d(2细胞)、2.5d(8细胞)、3.5d(桑椹胚)和4.5d(囊胚)胚胎中Dicer 1和DGCR 8基因的表达。根据我们体会,采用这一研究方法,首先在研究设计上应考虑全面;其次需要熟练掌握胚胎操作过程,操作迅速并采用新鲜胚胎是实验成功的关键。该方法不仅大大减少了实验需要的胚胎数量,同时减少了大量采集胚胎过程中温度和pH值等外界环境对胚胎质量影响而引起RNA降解问题;在大大减少实验样品需求量同时,也避免了大规模收集、贮存小鼠胚胎过程中掺杂的多种因素对实验结果的影响。
Dicer 1和DGCR 8基因是miRNA生物合成过程中在细胞核和细胞质中不可缺少的两个基因,我们的研究表明在着床前胚胎发育各个阶段均表达Dicer 1和DGCR 8基因,它们是着床前胚胎miRNA生成的重要因子。关于这两个基因在胚胎发育中的作用,目前有大量的文献报道应用基因敲除和RNA干涉技术降调解Dicer 1研究miRNA的功能,结果发现敲除小鼠Dicer 1基因,会导致早期胚胎死亡[9];从敲除Dicer 1基因的胚体中分离出的胚胎干细胞,在生成成熟miRNA时有缺陷,同时这些细胞增殖率降低并在分化中显示严重的缺陷[10]。这些研究提示Dicer敲除或降调节后,胚胎或胚胎干细胞在发育和分化方面出现异常,由此推测miRNA在胚胎发育和分化中起重要作用。但是,由于Dicer不仅是miRNA生物合成的关键基因,也是RNA干扰中小干扰RNA(siRNA)生成的关键因子;因此,敲除和降调节Dicer所产生的效应尚不能完全证实是miRNA的作用。Landthaler等[11]采用RNAi降调节DGCR 8基因,发现一系列成熟miRNA和pre-miR-NA的下降而pri-miRNA增加;并进一步证明DGCR8降调节可以使miRNA靶标mRNA水平增加。这些研究表明,DGCR 8是miRNA生物合成的关键和特异的因子,其作用较Dicer单一是研究miRNA功能的一个更好靶点。但是,目前尚没有关于DGCR 8基因在胚胎发育和干细胞分化中的作用的文献报道;我们在小鼠着床前胚胎中发现了有Dicer 1和DGCR 8基因的表达,为进一步建立DGCR 8基因降调解的小鼠模型,研究着床前胚胎发育中miRNA功能奠定了基础。我们建立的这种研究着床前胚胎中mRNA基因表达的方法,有可能用于对miRNA表达的研究,从而为下一步进行小鼠着床前胚胎中miRNA表达和功能研究奠定了良好的基础。
摘要：研究了miRNA生成相关基因Dicer 1和DGCR 8在小鼠着床前胚胎各发育阶段的表达,探讨其对着床前胚胎发育的作用。建立小鼠超排、交配系统,采集着床前胚胎;采用一步法RT-PCR方法鉴定着床前胚胎Dicer 1和DGCR 8表达。结果显示:小鼠卵母细胞及受精后1.5d、2.5d、3.5d和4.5d着床前胚胎均表达Dicer 1和DGCR 8基因。这是着床前胚胎miRNA生成物的重要基因,miRNA及其生物合成相关基因可能对着床前胚胎发育起重要作用。
关键词：miRNA,着床前胚胎,发育
参考文献
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