小鼠试验（共6篇）
小鼠试验 篇1
软组织损伤是由各种急性外伤或慢性劳损以及风寒湿邪侵袭等原因造成机体的皮肤、皮下浅深筋膜、肌肉、肌腱、腱鞘、韧带、关节囊、滑膜囊、椎间盘、周围神经血管等组织的病理损害,临床主要表现为疼痛、肿胀、畸形、功能障碍等[1]。赛犬和赛马的运动损伤是影响其经济价值的重要疾病。中国传统医学根据中医学理论,对急性软组织损伤治疗积累了丰富的经验。
ZD制剂来源于临床效果良好的验方,根据局部作用外用药起效较快的特点,制成软膏剂型。它是利用中药毒副作用小的优点研制出的一种非甾体类抗炎新型药物。本方剂由12味中药材组成,包括川椒、没药、红花、当归、透骨草等,具有抗炎镇痛、活血化瘀等功效,对治疗软组织损伤有很好的效果。其中川椒等主要起到温中止痛、杀虫止痒和解热等作用,没药主治胸腹瘀痛、跌打损伤、痈肿疮疡、目赤肿痛,有活血止痛、消肿生肌等功效[2]。没药配伍红花,其中没药活血止痛,红花祛瘀通经。二者合用,有活血、祛瘀、通经、止痛的功效,经常用于治疗血瘀所致的疼痛和跌打损伤的瘀滞疼痛[3]。当归具有补血、活血、调经止痛、抗炎的作用,能显著抑制毛细血管通透性增高[4]。方剂中加入了透皮剂,这是因为皮肤作为天然的屏障决定着外用药物的渗透速率,而动物皮肤普遍比较厚,因此提高透皮率是外用给药的关键[5]。本试验对ZD制剂的毒性作用进行初步研究,为临床的安全应用提供依据。
1 材料
1. 1 试验动物
昆明小鼠[雌雄各半,体重18 ~ 22 g,合格证件编号为SCXK( 蒙) 2002 - 0001号],由内蒙古大学实验动物中心提供。
1. 2 仪器及试剂
低温保存箱( DW - 245W147) ,青岛澳柯玛超低温冷冻设备有限公司生产; 低速离心机 ( SC - 04型) ,安徽中科中佳科学仪器有限公司生产; 微量移液器,购自大龙兴创实验仪器( 北京) 有限公司; 全自动血液细胞分析仪( BC - 2600vet) ,北京曼程科技有限公司生产; 兽医专用生化分析仪( IDEXX VetT est) ,美国IDEXX艾德士生物公司生产; ZD制剂,自制;10% 硫化钠,苏州博贸物资贸易有限公司生产; 一次性真空采血管,山东奥塞特医疗器械有限公司生产。
2 方法
2. 1 半数致死量试验
取昆明小鼠50只,雌雄各半,体重18 ~ 22 g,随机分为5组,每组10只,1 ~ 4组分别以复合中药水提物( 3 200,320,32,3. 2 mg /mL原药) 灌胃,5组( 对照组) 用纯化水灌胃,每只小鼠0. 4 mL ,然后常规饲养,连续观察7 d,记录小鼠死亡数。找出0和100%的复合中药提取物致死浓度,计算出零致死量和全致死量,进而计算出半数致死量。如试验期间小鼠无死亡,则进行最大耐受量试验[6,7]。
2. 2 最大耐受量试验
取昆明小鼠20只,雌雄各半,体重18 ~ 22 g,随机分为给药组和对照组,每组10只。给药组以复合中药水提物最大混悬浓度( 每毫升含3 200 mg生药)灌胃,对照组采用纯化水灌胃,每只小鼠0. 4 mL ,给药4 h后常规喂食,连续观察7 d。灌胃给药后,常规饲养。给药2 h内每15 min观察1次,2 ~ 4 h每30 min观察1次,4 ~ 8 h每1 h观察1次; 8 ~ 24 h每4 h观察1次; 第2天起,每天上下午各观察1次。观测指标包括饮食情况、一般状态、行为活动、排泄物形状、体重变化、毒性反应及死亡情况。
2. 3 皮肤刺激试验
取昆明小鼠40只,雌雄各半,体重18 ~ 22 g,随机分为4组,每组10只,试验前称取体重,背部脱毛,用药组分别涂抹ZD制剂: 高剂量组 ( 0. 32 g /g原药) 、中剂量组( 0. 16 g /g原药) 、低剂量组( 0. 08 g /g原药) ,对照组涂抹凡士林,每天1次,连续21 d。每7 d称重1次,检测各组小鼠体重变化。21 d后进行眼球采血,用真空采血管收集血液,测定血液常规指标; 分离血清,测定血液生化指标。
2. 4 检查项目
2. 4. 1常规观察每日观察记录小鼠的外观体征、行为活动、粪便形状等,每周称重1次。
2. 4. 2血液常规指标涂药21 d后,测定16项血常规项目,包括: 白细胞( WBC) 、红细胞( RBC) 、血小板( PLT) 、淋巴细胞( Lymph) 、单核细胞( Mon) 、中性粒细胞( Gran) 数目和淋巴细胞( Lymph) 、单核细胞( Mon) 、中性粒细 胞 ( Gran) 比例,以及血红 蛋白( HGB) 浓度、血细胞比容( HCT) 、平均红细胞体积( MCV) 、平均红细胞血红蛋白含量( MCH) 、平均红细胞血红蛋白浓度( MCHC) 、红细胞体积分布宽度变异系数( RDW - CV) 、平均血小板体积( MPV) 。
2. 4. 3血液生化指标采血后离心,取血清,测定7项血液生化指标: 血糖 ( GLU) 、总蛋白 ( TP) 、白蛋白( ALB) 、碱性磷酸酶( ALKP) 、谷草转氨酶( AST) 、谷丙转氨酶( ALT) 、肌酐 ( CREA) 。
2. 5 统计学处理
使用EXCEL2010进行数据整理,采用SPSS20. 0统计分析软件进行统计学处理,用方差分析进行组间比较。
3 结果
3. 1 半数致死量试验结果
各试验组小鼠在整个试验期( 7 d) 内无死亡,40只小鼠全部存活; 对照组10只小鼠也全部存活,观察7 d,小鼠的一切活动和饮食状况良好,分泌物和排泄物均未见异常,处死后观察主要脏器病理变化均未发现异常。未能测出ZD制剂原药液的半数致死量,表明ZD制剂的毒性极低。
3. 2 最大耐受量试验结果
灌胃后给药组和对照组大部分小鼠出现静卧不动、活动减少、闭目、反应迟缓等现象,但没有竖毛、抽搐等异常现象,且在2 h后恢复正常,7 d内一切活动和饮食状况良好,无异常现象发生。7 d后称重,处死并解剖,观察心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏等主要脏器的外观,均未发现异常。给小鼠灌胃的最大耐受量为生药64 g /kg,且未出现毒性反应,表明复合中药水提物是安全的,急性毒性很小。
小鼠体重变化见表1。
g
注: 同列数据无肩标表示差异不显著( P > 0. 05) 。
由表1可见,给药组小鼠与对照组小鼠体重均较试验前( 0天) 有所增长,且饲养7 d后两组小鼠的体重无显著性差异( P > 0. 05) ,7 d内小鼠生长情况均良好,表明复合中药水提物对小鼠体重增长无影响。
3. 3 皮肤刺激试验结果
3. 3. 1常规观察情况给药21 d后,观察高、中、低剂量组与对照组小鼠的行为活动、粪便形状、外观体征、毛色等情况,并进行对比,各组之间均无明显差异,除对涂药部位正常性舔舐和抓挠外,小鼠活动正常,无异常行为表现。
3. 3. 2涂药后体重增长变化高、中、低剂量组及对照组小鼠每周体重均有增长,经过统计学分析无显著差异( P > 0. 05) ,表明连续给药21 d,药物对小鼠的体重没有明显影响,见表2。
3. 3. 3血液常规指标检测结果给药21 d后收集各组小鼠血液进行血常规检测,中药高、中、低剂量组与对照组比较没有统计学意义( P > 0. 05) 。各组数值虽有变化,但基本处于正常范围内,说明ZD制剂经皮肤作用,治疗过程中对血液指标无明显影响,见表3。
注: 同列数据无肩标表示差异不显著( P > 0. 05) 。
3. 3. 4血液生化指标检测结果给药21 d后,取小鼠血液分离血清进行血液生化指标检测,中药高、中、低剂量组与对照组比较没有统计学意义( P > 0. 05) 。各组数值虽有不同浮动,但基本处于正常范围内,说明该中药膏剂治疗过程中对血液生化指标无明显影响,见表4。
注: WBC - 白细胞,Lymph - 淋巴细胞,Mon - 单核细胞,Gran - 中性粒细胞,RBC - 红细胞,HGB - 血红蛋白,HCT - 血细胞比容,MCV - 平均红细胞体积,MCH - 平均红细胞血红蛋白含量,MCHC - 平均红细胞血红蛋白浓度,RDW - CV - 红细胞体积分布宽度变异系数,PLT - 血小板,MPV - 平均血小板体积。同列数据无肩标表示差异不显著( P > 0. 05) 。
注: GLU - 血糖,TP - 总蛋白,ALB - 白蛋白,ALKP - 碱性磷酸酶,AST - 谷草转氨酶,ALT - 谷丙转氨酶,CREA - 肌酐。同列数据无肩标表示差异不显著( P > 0. 05) 。
4 讨论
根据中草药制剂的有关规定,每种中药在两部以上古籍中记载为无毒,便视为无毒性作用。此复方中药制剂采用川椒、没药、红花、当归、透骨草等12味中草药,依据抗炎镇痛、活血化瘀的治疗原则来辨证组方,这些单方药物在《本草纲目》中未见有毒性记载,选取的药物安全可靠。
软组织损伤是指各种急性外伤或慢性劳损以及其他疾病病理等原因造成的皮肤、皮下浅深筋膜、肌肉、肌腱、腱鞘、韧带、关节囊、滑膜囊、椎间盘、周围神经血管等组织的病理损害。我国传统中草药的作用效果较温和,一般认为起效较慢,而个别药物本身存在毒性,且存在配伍中十八反、十九畏等配伍禁忌,可能出现毒性反应。本试验根据《中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则》的要求,对ZD制剂原药液进行半数致死量试验和最大耐受剂量的试验,并对ZD制剂进行皮肤刺激试验[8],结果表明,该复方药物具有较好的安全性能,可进一步应用于临床治疗试验。
摘要：为了研究用来治疗马属动物肢蹄急性软组织损伤的复合中药制剂ZD制剂的毒性作用,试验测定了ZD制剂对小鼠的半数致死量、最大耐受剂量,并进行了皮肤刺激试验。结果表明:ZD制剂水提物灌服小鼠未能检测出药物的半数致死量、最大耐受量,提示药物进入体内是安全的,且毒性作用小;用ZD制剂刺激小鼠皮肤,试验组小鼠与对照组小鼠无显著差异,提示该制剂外敷应用安全可靠。
关键词：ZD制剂,软组织损伤,动物模型,毒性试验,半数致死量,皮肤刺激试验
参考文献
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小鼠试验 篇2
1材料与方法
1.1实验小鼠
KM种小白鼠, 清洁级, 体质量18~20g, 雌雄各半, 购于上海斯莱克实验动物有限责任公司 (原中科院上海动物中心) , 合格号:SCXK (沪) ;2007-0005。
1.2供试药
补肾健脾方药, 含生药4g/ml浸膏。批号080911, 由本院中药药理室提供。
1.3小鼠伺养环境
清洁级, 合格证号SYXK (苏) ;2002-0007。
1.4实验方法
1.4.1预实验:取禁食16h以上的小鼠雌雄各5只, 用含生药4g/ml浸膏的补肾健脾方药为供试品, 按40ml/kg的给药量 (最大给药量) 灌胃给药。18h内给药2次, 给药总剂量为按生药量计320g/kg, 观察1周, 结果无小鼠死亡, 无法按常规测定LD50, 故进行最大给药量测定。
1.4.2最大给药量测定实验:选取健康小鼠20只, 雌雄各半, 平均体重:雌性 (♀) 为 (18.7±0.7) g, 雄性 (♂) 为 (19.2±0.8) g。小鼠禁食 (不禁水) 约16h小时后用含生药4g/ml的供试药液 (预先温热至25℃左右) , 按40ml/kg的最大给药量灌胃给药, 每天给药2次, 总剂量为按生药量计320g/kg。给药后小鼠正常饲养于清洁级饲养室[温度 (25±0.5) ℃;相对湿度45%~65%], 观察小鼠的活动、皮毛、饮食、粪便有无异常改变, 并观察有无中毒症状及死亡 (若有死亡, 则进行解剖及病理学检验) , 连续观察1周。1周后复称体质量, 处死小鼠进行解剖, 观察主要脏器有无异常变化。
2结果
给药7~8min后, 4只小鼠伏身不动, 30min后恢复正常。18h 2次给药后有10只小鼠伏身不动, ♀4只, ♂6只, 其余小鼠活动减少, 4h后小鼠排褐色稀便, 小便量少。24h后小便正常, 未见其他异常或不良反应, 也无小鼠死亡。1周后复称体质量, ♀为 (26.9±1) g, ♂ (29.6±2.2) g。处死解剖小鼠后, 其主要脏器均未见明显的异常病变。小鼠灌胃给药的最大给药量为按生药量计320g/kg, 此剂量相当于拟临床人用量的106.7倍 (临床人体质量按60kg计算, 每天用药量按生药量计为3g/kg) 。
3讨论
补肾健脾方行给小鼠灌胃给药最大给药量为按生药量计320g/kg, 相当于拟临床人体用量的106.7倍[2], 除给药后因给药量过大小鼠有短时间的不适、排稀便外, 未见明显的毒性反应。实验为我院临床使用该制剂的安全性提供可靠依据。
我院联合省中医药研究院, 通过解剖大鼠的卵巢和子宫组织, 进一步对补肾健脾方药物效应学进行了研究, 与正常对照组比较, 肉眼观察可见模型组大鼠的卵泡数目明显增多, 体积明显增大, 且多数呈深褐色, 有明显的瘀血和水肿症状。方药单独给药的高、低剂量组的卵泡数目也有增加, 但瘀血症状明显减轻, 体积增加不明显[3]。其余给药组的卵巢外观基本接近正常对照组。各组大鼠的子宫外观上未见明显的改变。
摘要：目的 观察补肾健脾方灌胃给药的急性毒性反应。方法 以含生药4g/ml浸膏的补肾健脾方药为供试品, 依40ml/kg的给药量 (最大给药量) 灌胃给药;小鼠每天2次灌胃给药, 最大给药量为按生药量计320g/kg。观察小鼠异常或不良反应、死亡及主要脏器异常病变。结果 灌胃给药后未见其他异常或不良反应, 无小鼠死亡。处死解剖未见主要脏器异常病变。结论 小鼠灌胃给药最大给药量为按生药量计320g/kg, 此剂量相当于拟临床人用药的106.7倍, 除给药后有短时间的不适外, 未见明显的毒性反应。
关键词：补肾健脾方,小鼠,急性毒性试验
参考文献
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[2] 张均田.现代药理实验方法[S].北京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社, 1998:1818.
小鼠试验 篇3
1 材料
地肤子有机硒,金银赫和崔在勋研制,延吉市喜康科技研究所提供;有机硒提纯品,延边大学农学生物技术实验教学中心提纯。
老龄(≥10月龄)小鼠,延边大学实验动物中心提供。
联苯三酚、谷胱甘肽等(国产分析纯),市购。
电子天平(FA2004A),上海精天电子仪器有限公司产品;JF-1高速匀浆机,江苏金坛华欧实验仪器厂产品;紫外可见分光光度计(UV759CRT),上海佑科仪器仪表有限公司产品;疲劳转棒仪,成都泰盟可以有限公司产品。
2 方法
2.1 急性毒性试验
计算1 d内地肤子有机硒添加于饲料中的最大浓度。把有机硒提纯浓缩物悬浮于1%羧甲基纤维素钠溶液中,一次灌胃最大浓度,观察小鼠有没有出现可见的毒性反应。连续给药7 d,计算小鼠存活率。
2.2 短期喂养及抗疲劳试验
将28只10月龄以上小鼠根据雌雄不同随机分为6组,分别为雌鼠对照组、雌鼠低硒组(0.2%)和雌鼠高硒组(1%),雄鼠对照组、雄鼠低硒组(0.2%)和雄鼠高硒组(1%)。试验组小鼠自由采食对应的有机硒饲料,饲喂3周。试验结束前利用转棒疲劳仪测定小鼠的抗疲劳能力。试验结束时剖检,取肝脏、大脑、肾脏部分组织,加生理盐水溶液,研磨,离心,制备10%组织匀浆,用于测定抗氧化指标。试验结束时同时测定小鼠体重。
参照庞占军等[5]的方法,采用连苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性,采用TBA比色法测定丙二醛(MDA)含量;采用四氧嘧啶法测定谷胱甘肽(GSH)活性。样品SOD比活力(U/mg)=单位体积SOD活性(U/mg)/样品液蛋白质含量(mg/m L);脏器指数(脏器占体重的百分比);以紫外可见分光光度计测出的光密度值(OD值)作为MDA、GSH相对含量。
3 结果与分析
3.1 急性毒性试验结果
样品有机硒含量为313.1 mg/kg,1 d最大给药量为(3×313.1/1 000)=0.939 g;换算后小鼠给药剂量为0.939/30/1 000=0.313 g/kg。
观察小鼠,没有出现可见的毒性反应,给药7 d后,100%存活。
3.2 抗疲劳试验结果
将小鼠置于转棒疲劳仪进行抗疲劳时间的测定,结果见图1。由图1可以看出:饲喂有机硒小鼠抗疲劳能力高于对照组,低硒组好于高硒组;雌雄小鼠的抗疲劳能力有所差异,雌性小鼠在转棒疲劳仪上坚持的时间普遍高于雄鼠。
3.3 短期喂养试验结果
3.3.1 体重变化
试验开始和试验结束时分别记录小鼠体重,结果见表1。
g
注:组间数据均无显著差异(P>0.05)。
3.3.2 小鼠剖检情况
剖解小鼠,没有肉眼可见的异常变化。取主要脏器称重,结果见表2。
由表2可以看出,饲喂有机硒各组小鼠主要脏器指数与对照组相比均无显著差异(P>0.05),雌雄小鼠间也无显著差异(P>0.05)。
3.3.3 小鼠的肝脏、大脑、肾脏主要抗氧化指标测定结果
制取主要脏器(肝脏、大脑、肾脏)的组织匀浆,测定抗氧化指标。小鼠肝脏SOD比活力和MDA相对含量测定结果见图2,大脑SOD比活力和MDA相对含量测定结果见图3,肾脏SOD比活力和MDA含量测定结果见图4,肝脏、大脑和肾脏GSH相对含量比较结果见表3。
由图2~4可以看出:雌鼠低硒组、雌鼠高硒组小鼠肝脏SOD比活力都高于雌鼠对照组,MDA相对含量都低于雌鼠对照组;而雄鼠也有类似趋势,但差别没有雄鼠那么明显;各组大脑SOD比活力和MDA相对含量没有明显差异;雄鼠低硒组、雄鼠高硒组小鼠肾脏SOD比活力比雄鼠对照组略有增高。
%
注:组间数据均无显著差异(P>0.05)。
由表3可以看出:低硒组、高硒组小鼠肝脏、大脑、肾脏GSH相对含量均略高于对照组;雌雄小鼠间相比无规律性差别。
4 讨论
低硒组、高硒组雌雄小鼠SOD比活力均高于对照组,MDA比活力均低于对照组。说明有机硒能够更好地清除自由基,使自由基钝化,降低MDA比活力,使抗氧化酶能力增强,提高机体抗氧化能力。
注:组间数据均无显著差异(P>0.05)。
对于小鼠肝脏、大脑和肾脏GSH相对含量来说,低硒组、高硒组小鼠GSH相对含量都相应增大。说明有机硒增强了小鼠抗氧化能力。动物内脏器官是动物各项生理功能的具体执行者,脏器指数可近似地反映相应脏器的功能状态和病变情况。本试验中,各组间小鼠体重变化、脏器指数无显著差异,说明有机硒对老龄小鼠体重、脏器功能均无影响。
硒的抗氧化作用主要通过影响GSH的合成和活性来实现。补硒可显著升高机体谷胱甘肽水平和酶活性,增强其清除脂质过氧化物的能力,减少氧自由基[6]。当机体受到氧化损伤时,脂质过氧化物如丙二醛大量增加,氧自由基迅速产生,导致细胞膜结构破坏,进而影响组织器官的正常代谢。
在本试验中,雌性小鼠在转棒疲劳仪上坚持的时间长于雄性,产生这种差异的原因有待进一步研究。
5 结论
在本试验条件下,添加地肤子有机硒及提取浓缩物小鼠没有出现急性毒性,说明地肤子有机硒及提取浓缩物低毒、安全;饲喂有机硒对于小鼠有抗疲劳作用,有机硒能增强老龄小鼠的抗氧化能力,对雌性小鼠的抗疲劳作用优于雄性;地肤子有机硒适宜添加浓度为0.2%。
参考文献
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[5]庞占军,周玫,陈瑗.自由基医学研究方法[M].北京:人民卫生出版社,2000.
小鼠试验 篇4
1 材料
1.1 试验动物
清洁级昆明系健康小白鼠[许可证号为SCXK(甘)2003-1]90只,购自兰州生物药厂实验动物场,体重为18～22 g,60日龄,雌雄各半,雌性未产未孕。
清洁级SD健康大白鼠[许可证号为SCXK(甘)2006-0010]20只,购自兰州大学药学院,体重为180～260 g,70日龄,雌雄各半,雌性未产未孕。
试验前均饲养1周,以适应试验环境。
1.2 药物
氢溴酸槟榔碱片剂为白色圆片状固体,批号为20080418,规格为15 mg,150 mg/片,由中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所药物室提供。给药前依据每只动物的体重和给药量准确称量药物,研细后用纯化水配成合适的浓度与体积。
2 方法
2.1 动物分组、给药方法和急性毒性试验
采用递加法进行预试验以确定小鼠(约30只)最小致死量(LD100)和最大耐受量(LD0)分别为4.0 g/kg和10.0 g/kg。根据预试验结果,用寇氏法将50只小鼠随机分为5组,每组10只,雌雄各半,设4 000,5 120,6 600,7 000,10 000 mg/kg共5个剂量组,由于正式试验时10 000 mg/kg组小鼠没有全部死亡,试验又按等比级数增加10只小鼠,最后给药量确定为12 500 mg/kg。
根据预试验结果,确定大鼠LD0值(即100%存活的给药量)大于10.0 g/kg。依据化学药物毒性分级标准属于实际无毒物质,按照化学药物急性毒性试验指导原则,将大鼠样本数量增加至10只,雌雄各半,如果试验结果仍然100%存活即可终止试验,直接得出试验结论。
给药方法采用经口一次性灌胃给药法。给药前禁食4～8 h,但不限制饮水。给药后观察1周,记录动物死亡数,采用改良寇氏法计算半数致死量(LD50)及其95%可信区间。 改良寇氏法的计算公式:LD50 = lg-1 [ Xm-i(∑P-0.5)] ;undefined;LD50的95 %可信限= lg-1( lgLD50±1.96 Sx50 )。
式中:i为组距,即相邻两组剂量对数剂量之差,Xm为最大剂量对数值,p为各剂量组死亡率(用小数表示),∑P为各组动物死亡率的总和,q为各组动物存活率,Sx50为lgLD50的标准误。
2.2 给药后动物的饲养管理与观察
给药后试验动物自由采食、饮水,观察动物的临床症状,记录其死亡数量和时间,观察时间为1周,并将死亡动物剖检,观察其主要实质器官的病理变化。
3 结果
3.1 氢溴酸槟榔碱对大鼠的口服急性毒性试验结果
按体重10.0 g/kg的剂量对10只大鼠经口一次性给予氢溴酸槟榔碱片剂,要想使药剂保持液体状态(实际是较稠的混悬剂),每只大鼠的给药量至少用8 mL以上纯化水稀释才能做到,会导致每只大鼠的给药体积超过10 mL;因此采用24 h内分3～4次的给药方法,以防一次给药量过大而撑死大鼠影响试验结果。
3.2 氢溴酸槟榔碱片剂对小鼠的口服急性毒性试验结果(见表1)
根据表1中的死亡率及改良寇氏法计算氢溴酸槟榔碱对小鼠的口服半数致死量,得到LD50为6 545 mg/kg,95%可信区间为5 534～7 740 mg/kg。
3.3 临床症状
所有剂量组试验动物在给药后迅速出现四肢、口唇、尾巴青紫、全身颤抖、翘尾、腹部贴地的症状,但出现的时间不同,剂量越高出现症状的时间越短;继而出现流涎、眼睛充血、流泪、腹泻等症状;高剂量组腹痛症状更为明显,表现为两前肢趴在笼壁上或其他动物身上、弓腰缩腹、打滚、上窜下跳、躁动不安等。随着时间的推移和症状加重,出现精神沉郁、呼吸短促、张口呼吸、犬坐等症状,或躺卧或俯卧,对惊吓及疼痛等刺激淡泊,逐渐衰竭而死,死前无明显的挣扎现象。耐过的受试动物,一般给药后5～12 h恢复饮食欲,被毛及活动亦逐渐恢复正常。
3.4 剖检病理变化
试验结束后,对所有死亡动物进行剖检,可见被毛干燥、篷乱,眼睛干瘪、塌陷,口唇、四肢、尾巴青紫。实质器官的主要病理变化:肝脏颜色变为深褐色或土黄色,有针尖状散在的出血点,质脆易碎;脾脏颜色变深,体积增大;胃、十二指肠甚至整个小肠充血、出血、肠壁水肿,内容物呈煤焦油状,胃肠黏膜糜烂易脱落;肺脏气肿,有出血斑点,有的布满针尖状的出血点。盲肠、直肠、肾脏、膀胱等器官没有明显的眼观病理变化。
4 讨论
1)本试验结果表明,氢溴酸槟榔碱片剂对小鼠的口服LD50为6 545 mg/kg,95%可信区间为5 534～7 740 mg/kg,对大鼠最大耐受量大于10.0 g/kg,为临床推荐用量(1～5 mg/kg)的数百倍,临床应用非常安全,按毒性分级标准属于低毒性药物[5]。
2)氢溴酸槟榔碱中毒主要表现在胃肠道,死亡动物都有胃肠道充血、出血,肝脏、脾脏变色和体积增大,肺脏出血,说明中毒后对上述组织器官均有不同程度的损害,最终使呼吸器官麻痹而死亡。
摘要：为了研究氢溴酸槟榔碱片剂对小鼠及大鼠的口服急性毒性,试验以小鼠及大鼠为实验动物,经口一次性灌胃给药,统计死亡率,用改良寇氏法计算半数致死量(LD50)并观察毒性作用。结果表明:氢溴酸槟榔碱片剂对小鼠的口服LD50为6 545 mg/kg,其95%可信区间为5 534～7 740 mg/kg;对大鼠的最大耐受量(LD0)大于10.0 g/kg,则其LD50必大于10.0 g/kg。说明氢溴酸槟榔碱片剂属于低毒性的或实际无毒的药物,以20～50 mg/kg的剂量应用于临床非常安全。
关键词：氢溴酸槟榔碱,小鼠,大鼠,口服,急性毒性
参考文献
[1]乌日嘎.抗绦虫药物的研究进展[J].内蒙古石油化工,2002,27:5-7.
[2]姚伟星,夏国瑾,李泱,等.槟榔碱对大鼠门静脉和钙通道电流的剂量与效应关系[J].中国寄生虫病防治杂志,2001,14(2):139-141.
[3]陈潮燕.槟榔碱的提取分离及其对胃肠道平滑肌收缩作用的影响[J].广东药学,2000,10(2):48-50.
[4]杜志敏,万新祥,伍爱婵,等.槟榔碱对小鼠小肠运动的影响[J].广州医高专学报,1999,22(1):27-28.
小鼠试验 篇5
近几年, 虽然国内外学者对猪附红细胞体病有一定研究, 但目前还没有治疗该病的特效药物和疫苗。佐剂疫苗因不受母源抗体干扰、产生抗体水平整齐均一、抗体持续期长而在各种传染病的防控上得到了广泛应用。试验应用白油佐剂制备亚单位疫苗免疫Balb/c小鼠, 采用ELISA方法测定免疫应答的抗体水平, 并进行攻毒试验检测其对Balb/c小鼠的免疫保护作用, 旨在为猪附红细胞体病的防治奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 动物
8周龄Balb/c小鼠40只, 雌性, 经鲜血压滴标本镜检法鉴定无附红细胞体感染。
1.1.2 试剂
猪附红细胞体抗原、白油佐剂, 由延边大学农学院预防兽医实验室制备;引物, 由上海英俊生物公司合成;ExTaq 酶, 购自宝生物工程 (大连) 有限公司;山羊抗鼠IgG酶 (HRP) 标二抗, 购自Sigma公司。
1.2 方法
1.2.1 疫苗的制备
无菌取附红细胞体感染率在85%以上的猪颈静脉抗凝血, 参照参考文献[6]中的方法用不加血清的RPMI-1640培养液置37 ℃培养箱中培养;每隔12 h收集1次培养物, 以1 500 r/min离心5 min, 收集上清液;将最终收集的上清液15 000 r/min离心1 h, 收集沉淀;置-20 ℃冰箱中反复冻融、超声波粉碎处理6次后以2 000 r/min离心10 min, 收集上清液, 即为猪附红细胞体抗原;取1 mL猪附红细胞体抗原与等量的白油佐剂混匀乳化后制备亚单位疫苗。
1.2.2 Balb/c小鼠的免疫
选择40只体重为20 g左右的Balb/c小鼠随机分成2组:第1组 (30只) 为免疫组, 注射亚单位疫苗;第2组 (10只) 为阴性对照组, 注射PBS。3次免疫抗原浓度分别为3, 6, 12 mg/mL, 每只Balb/c小鼠均背部皮下多点注射, 3次的注射剂量相同, 每次间隔时间为7 d。
1.2.3 Balb/c小鼠抗体效价的检测
分别于首次免疫后第0, 7, 14, 21, 28天对两组小鼠尾尖采血, 分离血清, 应用贾立军等[7]建立的间接ELISA方法检测两组小鼠猪附红细胞体抗体水平, 将被检血清OD410值≥0.18定为阳性反应, ≤0.14定为阴性反应, 0.14～0.18之间定为疑似反应。
1.2.4 攻毒试验
第3次免疫后2周 (首免后第28天) 对两组小鼠腹腔注射猪附红细胞体感染率在85% 以上的猪抗凝血300 μL, 观察两组小鼠感染及死亡情况, 在攻毒后的第3, 4, 5, 7, 14, 21天取两组小鼠尾静脉抗凝血进行PCR鉴定。
1.2.5 PCR检测
以提取的Balb/c小鼠DNA为模板, 应用于龙政等[8]建立的PCR检测方法对攻毒后的两组小鼠进行PCR检测, 连续观察25 d, 统计感染率。
1.2.6 免疫保护力的测定
按下式计算猪附红细胞体亚单位疫苗对Balb/c小鼠的相对免疫保护率 (RPS) 。相对免疫保护率 (%) =[ (1-免疫组死亡率/感染率) / (对照组死亡率/感染率) ]×100%。
2 结果
2.1 抗体效价的检测结果
取首次免疫第0, 7, 14, 21, 28天两组小鼠血清, 稀释至1∶400, 用间接ELISA方法进行抗体检测。第1次免疫后第21 天免疫组的抗体水平最高, 峰值为0.697, 达到高峰以后逐步下降;对照组无明显变化。具体结果见图1。
2.2 攻毒试验的镜检结果
用猪附红细胞体感染率在85%以上的猪抗凝血对两组Balb/c小鼠进行攻毒。攻毒3 d后免疫组有7只Balb/c小鼠出现精神萎靡、食欲不振、黄疸、贫血等典型的临床症状, 其余23只小鼠精神状态良好, 食欲正常;而对照组Balb/c小鼠均出现精神萎靡、食欲不振、黄疸、贫血等典型的临床症状。对两组Balb/c小鼠尾尖采血, 涂片、镜检, 免疫组未出现临床症状的23只Balb/c小鼠红细胞正常, 剩余7只和对照组Balb/c小鼠均可见附红细胞体的存在。具体见图2和图3。
2.3 攻毒后免疫组Balb/c小鼠的PCR检测结果
攻毒后免疫组有7只Balb/c小鼠出现了临床症状, 经PCR扩增得到与预期片段相同的特异性扩增产物, 经琼脂糖凝胶电泳检查得到单一的扩增条带, 条带清晰, 大小约为541 bp, 结果证明攻毒后免疫组也有部分Balb/c小鼠受感染;其余Balb/c 小鼠经PCR扩增未得到目的片段。具体见图4。
M. DL-2 000 Marker; 1.阳性对照 (标准附红细胞体) ;2.阴性对照 (阴性红细胞) ;3～4.出现临床症状的Balb/c小鼠血液DNA扩增产物;5～9.未感染猪附红细胞体的Balb/c小鼠血液DNA扩增产物。
2.4 攻毒后对照组Balb/c小鼠的PCR检测结果
应用于龙政等[8]设计的猪附红细胞体特异性引物P1和P2, 以对照组攻毒后3, 7, 14, 21天Balb/c小鼠血基因组DNA为模板, 进行PCR扩增, 结果显示攻毒后3, 7, 14, 21天均扩增出了与预期片段相同的特异性扩增产物, 经琼脂糖凝胶电泳检查得到单一的扩增条带, 条带清晰, 大小约为541 bp。具体见图5。
M. DL-2 000 Marker;1.阳性对照 (标准附红细胞体) ;2.阴性对照 (阴性红细胞) ;3.攻毒后第3天血液DNA扩增产物;4.攻毒后第7 天血液DNA扩增产物;5.攻毒后第14 天血液DNA扩增产物;6.攻毒后第21天血液DNA扩增产物。
2.5 免疫保护力的测定结果
(见表1)
3 讨论
中国是养猪大国, 集约化养猪发展迅速, 而传染病是制约养猪业发展的重要因素之一。猪附红细胞体病在世界范围内已有广泛报道, 我国已有多个省市报道了该病。该病不仅导致畜产品质量和产量降低, 动物生育力下降, 而且还可导致动物发生严重的临床症状甚至死亡, 阻碍了养猪业的发展, 造成了重大的经济损失。因此, 研制一种安全性高、保护力强的猪附红细胞体疫苗迫在眉睫。亚单位疫苗只含有病原体的一种或几种抗原, 不含有病原体的其他遗传信息, 因而有安全性好、稳定性强和无需灭活的优点, 具有广阔的应用前景。试验应用免疫应答较高的白油佐剂与猪附红细胞体混合制备亚单位疫苗, 用其免疫Balb/c小鼠以评估该疫苗的免疫效果, 免疫保护率达到76.70%。
国内外关于疫苗效检的研究发现, 免疫组常出现不完全保护的现象。本试验结果也出现了免疫组小鼠部分感染的情况, 这或许和作者选择的攻毒剂量、疫苗的保护效果有一定的关系。
试验用猪附红细胞体亚单位疫苗免疫Balb/c小鼠取得了一定的免疫效果, 该疫苗能否在其他动物体内产生免疫保护作用还有待于进一步研究。
摘要：为检测猪附红细胞体亚单位疫苗对Balb/c小鼠的免疫保护作用, 试验将猪附红细胞体抗原与白油佐剂混合制备亚单位疫苗后免疫Balb/c小鼠, 应用间接ELISA方法测定体液免疫水平, 并进行攻毒试验。结果表明:在三免后第7天时, 检测抗体的OD410值达0.697;攻毒7d后, PCR检测30只Balb/c小鼠的血液, 共有7只为阳性, 保护率为76.70%。说明猪附红细胞体亚单位疫苗对Balb/c小鼠具有一定的保护作用。
关键词：猪附红细胞体,亚单位疫苗,免疫保护
参考文献
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小鼠试验 篇6
1 材料与方法
1.1 药品与试剂
1.1.1 药品
EEPF,批号:20160310,按高效液相色谱法测定[2],含补骨脂素5.22 mg/g、异补骨脂素3.78 mg/g和补骨脂酚231.15 mg/g。药材购自新疆齐康哈博维药有限责任公司(批号:20151027),由新疆维吾尔医药研究所希尔艾力主任药师鉴定为正品。提取方法:取药材10 kg,10倍量75%乙醇加热回流提取1 h,共3次,合并提取液浓缩干燥,出膏率为9.51%。
1.1.2 试剂
丙氨酸氨基转移酶(ALT)(批号:140215003);天门冬氨酸氨基转移酶(AST)(批号:140115002);碱性磷酸酶(ALP)(批号:140314022);尿素氮(BUN)(批号:141315001);肌酐(Cr)(批号:141315016);总蛋白(TP)(批号:140815002);白蛋白(ALB)(批号:140915013);总胆固醇(TC)(批号:141615013);血糖(GLU)(批号:141515012);总胆红素(TBIL)(批号:140615012);磷酸肌酸激酶(CK)(批号:142515012);三酰甘油(TG)(批号:141715014);谷氨酰转肽酶(GGT)(批号:141715032),均由深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司提供。血液学试剂,SYSMEX公司,批号:A2007。
1.2 动物
昆明小鼠,体重(20±2)g,购自新疆实验动物研究中心,SPF级,许可证号:SCXK(新)2011-0001。饲养于新疆维吾尔医药研究所SPF级动物房,自由饮水、摄食,室温20~26℃,湿度40%~70%,光照/黑暗12/12 h。
1.3 方法
1.3.1 EEPF急性毒性试验
1.3.1. 1 分组及剂量
设对照组(0.5%CMC-Na)、EEPF[12.0 g/(kg·d)]组,每组20只,雌、雄各半。按补骨脂药材每天临床用量10 g[2]、出膏率为9.51%计算,相当于日服用提取物0.951 g,EEPF 12.0 g/(kg·d)相当于临床人(60 kg计算)每公斤体重用药量的约750倍。
1.3.1.2给药方法
以EEPF最大配制浓度20%,每次灌胃给药0.3 m L/10 g(每次6.0 g/kg),2次/d,间隔4~5 h给药第2次,合计12.0 g/(kg·d)。进行常规指标观察。
1.3.2 EEPF亚急性毒性试验
1.3.2. 1 分组及剂量
小鼠随机分组,每组20只,雌、雄各半,设对照组(Ⅰ组),EEPF 0.65 g/kg(Ⅱ组)、1.30 g/kg组(Ⅲ组),分别为临床剂量的40、80倍。
1.3.2. 2 给药方法
以EEPF配制浓度3.4%(低剂量)、6.8%(高剂量),灌胃给药0.2 m L/10 g,1次/d,共14 d。
1.4 观察指标
给药前(D0)和给药第1、4、7、11、14天称取体重;末次给药后禁食过夜毛细管眼眶采血加入抗凝剂检测红细胞(RBC)、白细胞计数(WBC)、血小板(PLT)、血红蛋白(HGB)、血细胞比容(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、平均血红蛋白量(MCH)、平均血红蛋白浓度(MCHC)、网织红细胞(Ret)。另外眼眶采血1.5 m L不加抗凝剂测定血液生化学指标。取肝脏、肾脏、胸腺、脾脏称重计算脏器系数(脏器重量/体重×100%),肝脏、肾脏于15%甲醛溶液固定,HE染色,观察组织形态变化。
1.5 统计学方法
采用PEMS统计软件进行统计,组间比较时采用单因素方差分析,方差齐时用t检验,方差不齐时用秩和检验。结果以均数±标准差(±s)表示,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 EEPF急性毒性试验
第1次给药后小鼠出现活动减少、呼吸急促、倦怠、竖毛等症状,无死亡;第2次给药后1 h内死亡14只,其中雄性5只、雌性9只,解剖可见肝脏充血,剩余动物24 h后恢复正常,观察14 d未见明显症状。由图1~2可见,组织病理学检查EEPF组肝脏中央静脉扩张充血,部分肾小管扩张。
2.2 EEPF亚急性毒性试验
2.2.1 一般观察
与Ⅰ组比较,亚急性毒性试验EEPF组给药14 d未见明显反应,动物无死亡。
2.2.2 体重、脏器重量级系数
与Ⅰ组比较,Ⅲ组雌性给药第4~14天体重升高,雄性未见明显改变(图3~4);雄性低剂量组脾脏重量及系数明显降低(P<0.05),雌性低剂量组胸腺重量及系数明显升高(P<0.05),雌性高剂量组肾脏系数显著降低(P<0.01)。见表1。
(n=10)
(n=10)
注:与Ⅰ组比较,*P<0.05,**P<0.01
2.2.3 血液学
与Ⅰ组比较,EEPF组雄性RBC、HGB、HCT、LYMPH明显升高(P<0.05),MONO明显降低(P<0.05),Ⅱ组NEUT明显降低(P<0.05),WBC显著升高(P<0.01);雌性动物Ⅲ组PLT、PCT显著升高(P<0.01),RBC明显升高(P<0.05),其余指标与Ⅰ组比较未见明显改变,见表2~3。
2.2.4 血液生化学
与Ⅰ组比较,雄性动物Ⅲ组ALT、TG显著降低(P<0.01),Ⅱ组A/G显著升高(P<0.01),BUN明显升高(P<0.05);雌性动物EEPF组TBIL明显降低(P<0.05),TG显著降低(P<0.01),Ⅲ组GLOB明显降低(P<0.05),Ⅱ组ALT、TBA明显升高(P<0.05),其余指标与Ⅰ组比较未见明显改变,见表4~5。
注:与Ⅰ组比较,*P<0.05,**P<0.01;EEPF:补骨脂乙醇提取物;WBC:白细胞计数;RBC:红细胞;HGB:血红蛋白;HCT:血细胞比容;NEUT:中性粒细胞计数;LYMPH:淋巴细胞;MONO:单核细胞
注:与Ⅰ组比较,*P<0.05,**P<0.01;EEPF:补骨脂乙醇提取物;RBC:红细胞;PLT:血小板计数;PCT:血小板压积
注:与Ⅰ组比较,*P<0.05,**P<0.01;EEPF:补骨脂乙醇提取物;ALT:丙氨酸氨基转移酶;A/G:白球比;BUN:尿素氮:TG:三酰甘油
注:与Ⅰ组比较,*P<0.05,**P<0.01;EEPF:补骨脂乙醇提取物;ALT:丙氨酸氨基转移酶;TBIL:总胆红素;GLOB:球蛋白;TG:三酰甘油;TBA:总胆汁酸
2.2.5 组织病理学检查
Ⅰ组肝肾组织未见明显改变。EEPF组可肝细胞坏死、肾小球萎缩。见图5~6。
3 讨论
急性毒性EEPF可致70%动物死亡,且雌性死亡多于雄性,死亡动物肝脏中央静脉扩张充血,部分肾小管扩张。亚急性毒性试验雌性高剂量组体重明显升高,雄性体重未见明显改变,EEPF组脾脏、胸腺重量及系数与对照组比较虽有统计学差异,但均为低剂量改变,无明显剂量效应关系,考虑非药物引起。血液生化学雄性ALT的降低、雌性TBIL的降低虽有统计学差异,无毒理学意义,雌雄小鼠TG均明显降低,雌性GLOB有一定降低,判断与影响肝脏脂质代谢相关,组织病理学检查可见EEPF组肝细胞坏死、肾小球萎缩,且雌性肾脏系数有一定降低,雌性ALT、TBA升高,临床报道其肝损伤特点多为女性ALT、TBA升高,与临床表现具有相似性[6,11],判断TG、GLOB的降低和LYMPH的升高与影响肝脏功能相关,考虑EEPF对雌性肝、肾有一定影响。
另外,EEPF可引起小鼠RBC、HGB、HCT、PCT升高,对小鼠血液学有一定影响。有文献报道补骨脂素具有提高小鼠造血功能的作用[12,13]。《中国药典》中含补骨脂的此类复方有“补肾养血丸”“再造生血片”等均作用于造血系统[14]。因此,判断EEPF对小鼠血液学的影响可能与其功能主治相关。
补骨脂要含香豆素、黄酮等化合物[15,16,17,18]。临床应用[5,6]和毒理学研究[7,8,9]发现补骨脂及复方对肝脏有一定的毒性作用[19,20,21]。韩国曾报道了与食用补骨脂有关的急性肝炎病例[5],部分含有补骨脂的中成药亦偶见肝毒性报道[10]。2009年香港报道3例肝损害病例,患者均使用补骨脂方剂[11]。本研究可见EEPF可致肝细胞坏死、肾小球萎缩,其毒性特点、毒性成分及机制有待进一步研究。
摘要：目的 研究补骨脂乙醇提取物(EEPF)的急性毒性特点。方法 急性毒性分对照组和EEPF组[12.0 g/(kg·d)],灌胃给药,亚急性毒性分对照组和EEPF 0.65、1.30 g/kg组,灌胃给药14 d,进行一般观察,检测体重、脏器重量及系数、血液学及血液生化学,并进行肝脏、肾脏组织病理学检查。结果 急性毒性小鼠死亡14只,可见肝脏中央静脉扩张充血,部分肾小管扩张;亚急性毒性给药14 d未见明显反应,EEPF低剂量组雄性脾脏重量及系数明显降低、雌性胸腺重量及系数明显升高(P<0.05),雌性高剂量组体重明显升高(P<0.05)、肾脏系数显著降低(P<0.01);血液学:EEPF组雄性中性粒细胞计数(NEUT)比例(%)、单核细胞(MONO)比例(%)明显降低(P<0.05),红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、血细胞比容(HCT)(%)、淋巴细胞(LYMPH)(%)明显升高(P<0.05),雌性RBC明显升高(P<0.05),血小板计数(PLT)和血小板压积(PCT)显著升高(P<0.01);血液生化学:EEPF雄性低剂量组A/G显著升高(P<0.01),尿素氮(BUN)明显升高(P<0.05),高剂量组丙氨酸氨基转移酶(ALT)和三酰甘油(TG)显著降低(P<0.01),雌性低、高剂量组总胆红素(TBIL)明显降低(P<0.05),TG显著降低(P<0.01),总胆汁酸(TBA)和ALT明显升高(P<0.05),高剂量球蛋白(GLOB)明显降低(P<0.05);EEPF组出现肝细胞坏死、肾小球萎缩。结论 EEPF最大给药量12.0 g/kg可致部分小鼠70%死亡;亚急性毒性EEPF 0.65、1.30 g/kg对小鼠血液学、血液生化学有一定影响,肝脏、肾脏可见毒性病变。