荷瘤小鼠（精选7篇）
荷瘤小鼠 篇1
贯叶金丝桃为藤黄科金丝桃属多年生草本植物, 具有清热解毒、抗抑郁、抗病毒等功效[1]。金丝桃苷 ( Hyperin, Hyp) 属黄酮醇苷化合物, 是金丝桃属植物的特征性成分之一[2]。金丝桃苷毒性小, 具有镇痛、抗炎、止咳、抗氧化、保护心血管系统等多种药理学活性[3,4]。我们在前期的实验中发现金丝桃苷在体外可以显著抑制多种肿瘤细胞的增殖, 但目前尚无金丝桃苷对动物移植性肿瘤抑制作用的报道。本文通过小鼠移植性肿瘤模型的整体实验, 观察金丝桃苷对其肿瘤生长抑制作用, 为金丝桃苷用于肿瘤的临床治疗提供实验依据。
1 资料与方法
1.1 一般资料
结肠癌细胞株HCT8、肉瘤S180由哈尔滨医科大学肿瘤医院提供, 由本研究室定期腹腔接种传代保种。雌性昆明种小鼠 (合格证号:黑动字第99101001号) , 体重18～22g, 由佳木斯大学实验动物中心提供。金丝桃苷购自北京生物制品研究所。
1.2 方法
1.2.1 接种HCT8结肠癌细胞及S180肉瘤细胞
将预先接种HCT8、S180腹水瘤的小鼠处死, 从腹腔抽出的瘤液, 用生理盐水按1∶3 比例稀释成5×106个癌细胞/mL悬液, 每只小鼠右侧腋窝皮下接种0.2mL。以上操作在无菌条件下进行。
1.2.2 分组及给药
接种后随机分组, 每组10只。其中金丝桃苷设三个剂量组 (1.5、3.0、6.0 mg/kg , ip给药) , 阳性组 (顺铂3.0mg/kg, ip给药) , 阴性对照组给予灭菌生理盐水 (ip给药) 。接种24 h后给药, 每日1次, 记录各组小鼠生长情况并称重, 连续8d。
1.2.3 指标测定
实验组于末次给药次日, 处死小鼠, 剥离瘤块称其重量。并计算抑瘤率。
抑瘤率= (对照组瘤质量-给药组瘤质量) /对照组瘤质量×100%
1.2.4 数据处理
所有数据以平均值±标准差表示, 采用双侧T检验进行组间分析。以P<0.05作为显著性检验标准。
2 结果
2.1 不同处理对荷瘤小鼠外形变化影响
与正常对照组相比, 荷瘤对照组小鼠的瘤块明显增大, 质地较软且界限模糊, 难以剥离, 有的还扩散至胸骨、锁骨等处. 金丝桃苷不同剂量组和顺铂组小鼠的瘤块较小, 界限清晰, 质地较硬, 容易剥离; 金丝桃苷不同剂量组对小鼠的外形基本无影响, 其毛发、活动及体重基本正常;顺铂组小鼠毛发蓬松零乱、行动迟缓, 体重增加缓慢, 部分小鼠体重有微量减轻。
2.2 金丝桃苷对S180荷瘤鼠的抑瘤作用
金丝桃苷对S180荷瘤鼠具有很好的抑瘤效果, 金丝桃苷各剂量组的平均瘤质量与生理盐水组相比差异显著 (P<0.01) , 并且抑瘤效果有良好的剂量依赖性, 其中金丝桃苷6.0mg/kg组的抑瘤率最高, 达到62.93% (见表1) 。
2.3 金丝桃苷对HCT8异种移植瘤小鼠的抑瘤作用结果
金丝桃苷对HCT8异种移植瘤小鼠表现出明显的抑瘤作用, 可使其瘤重明显减轻, 与生理盐水组相比差异显著 (P<0.01) , 当剂量为6.0mg/kg时, 抑瘤率可达到65.04% (见表2) 。
注:与生理盐水组比较, *P<0.05, ** <0.01。
注:与生理盐水组比较, *P<0.05, **P<0.01。
3讨论
恶性肿瘤是临床常见的一种疾病, 严重威胁着人民的身心健康。肿瘤的化疗是治疗肿瘤不可缺少的手段, 由于现阶段用于临床的化疗药物对肿瘤细胞选择性普遍较差, 毒副反应大已成为当今肿瘤治疗的一大难题。近年来, 从植物中寻找天然抗肿瘤药物越来越受到人们的重视, 天然植物药因其毒性低、疗效好, 而成为治疗肿瘤的新途径, 是当前抗肿瘤新药研究的主要发展方向。
我们从整体的角度观察了金丝桃苷对结肠癌HCT8和肉瘤S180移植性模型小鼠肿瘤生长的影响, 结果表明金丝桃苷在小剂量时对荷瘤小鼠就产生抑瘤作用, 随着剂量增加其抑瘤效果逐渐提高并且金丝桃苷不同剂量组荷瘤小鼠的外形保持基本正常, 说明在此剂量范围内未表现出毒性, 通过进一步研究, 金丝桃苷有希望发展成为一种新型的抗癌药。
关键词：金丝桃苷,体内抗肿瘤,荷瘤小鼠
参考文献
[1]Josey E S, Tackett R L.St John’s wort:a new alternative for de-pression[J].International Journal of Clinical Pharmacology andTherapeutics, 1999, 37 (3) :111-113
[2]李艳, 曹学丽, 付鹏.贯叶金丝桃活性成分及其分离纯化与检测方法的研究进展[J].药学进展, 2008, 32 (1) :15-20
[3]张成伟, 周亚球, 陈磊.金丝桃苷药理作用研究进展[J].安徽医药, 2007, 11 (11) :961-963
[4]李庆林, 陈志武, 马传庚.金丝桃苷对原代培养的大鼠心肌细胞缺氧-再给氧损伤的影响[J].中草药, 2006, 37 (4) :575-577
荷瘤小鼠 篇2
1 材料
1.1 试剂
鲨鱼软骨低分子蛋白, 本研究组从鲨鱼软骨中获得, 分子量为10～100 kDa;胎牛血清 (Gibco公司) ;DMEM (Gibco公司) ;胰蛋白酶 (DIFCO公司) ;环磷酰胺 (CTX) (上海华联制药有限公司) ;其余试剂为国产分析纯。
1.2 小鼠及其分组情况
C57BL/6健康、雄性小鼠40只, 6周龄, 体重 (20±2) g中国科学院上海医药工业研究院提供, 合格证号:沪动合证字第107号。
查随机数字表, 将C57BL/6小鼠40只, 随机分为4组: (1) 生理盐水对照组; (2) 环磷酰胺对照组; (3) 鲨鱼软骨低分子蛋白组; (4) 鲨鱼软骨低分子蛋白+环磷酰胺组。
2 方法
2.1 移植性小鼠Lewis肺癌模型的建立
取对数生长的小鼠Lewis肺癌细胞, 调整细胞密度为2×107个细胞/ml, 接种于小鼠右腋皮下0.1 ml/只, 保留生长旺盛的荷Lewis肺癌肿瘤小鼠。取生长旺盛的荷Lewis肺癌肿瘤小鼠瘤组织, 无菌匀浆离心后, 用培养液调整肿瘤细胞密度为2×107个细胞/ml, 将其接种于小鼠右腋皮下每只0.1 ml。
2.2 药物干预
接种后第2天腹腔注射给药, 按小鼠体重0.1 ml/10g计算每只用药量, 每天给药1次, 连续10 d。 (1) 生理盐水对照组, 用生理盐水干预; (2) 环磷酰胺对照组, 用含环磷酰胺10 mg/ml生理盐水干预; (3) 鲨鱼软骨低分子蛋白组, 用含10 mg/ml鲨鱼软骨低分子蛋白生理盐水干预; (4) 鲨鱼软骨低分子蛋白+环磷酰胺组, 用含10 mg/ml鲨鱼软骨低分子蛋白和10 mg/ml环磷酰胺的生理盐水干预。
2.3 对移植性小鼠Lewis肺癌的疗效观察
解剖并完整地分离出皮下瘤块, 称瘤体质量, 按下列公式计算肿瘤抑制率。肿瘤抑制率 (%) = (对照组平均瘤重-给药组平均瘤重) /对照组平均瘤重×100%。
2.4 统计学方法
本文采用SPSS10.0统计学软件进行统计分析数据, 计量资料用均数±标准差表示, 自身比较及组间比较均用t检验。
3 结果
鲨鱼软骨低分子蛋白与生理盐水组相比差异有统计学意义 (P<0.01) , 肿瘤抑制率为 (44.625±5.630) %;鲨鱼软骨低分子蛋白+环磷酰胺组的肿瘤抑制率明显高于环磷酰胺组, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。结果提示, 鲨鱼软骨低分子蛋白有抑制荷Lewis肺癌肿瘤小鼠瘤体生长的作用, 虽然其肿瘤抑制率不及化疗药物环磷酰胺, 但对化疗药物有增强疗效的协同作用。见表1。
2组与3组比较 (t=17.9779, P=0.0000) , 3组与1组比较 (t=16.3253, P=0.0000) , 4组与2组比较 (t=9.5979, P=0.0142) 。
4 讨论
从海洋生物中寻找高效、低毒的抗肿瘤药物是近年天然药物研究的热点, 近年来, 许多学者和研究人员把目光转移至鲨鱼软骨血管抑制因子, 包括anti-MMPs[3]、anti-VEGF[4]、细胞凋亡因子[5]、t PA激活因子[6]等等, 通过拮抗内皮细胞生长因子、下调内皮细胞生长因子受体、下调内皮细胞表面黏附分子和促进内皮细胞凋亡等综合作用可抑制新生血管的形成。Boivin等[7]研究发现, 85μg/ml的鲨鱼软骨粗提物可引起内皮细胞DNA断裂和细胞凋亡, 进而达到抑制血管形成的功效。本研究组提取的SC低分子蛋白已证实[1,2]可以抑制血管内皮细胞生长、黏附和迁移运动, 抑制新生血管的形成。本实验又进一步证实鲨鱼软骨低分子蛋白能抑制实体瘤生长, 与化疗药物环磷酰胺联合使用有协同作用, 有望成为恶性肿瘤化学治疗的靶向新药, 并在其他血管增生性疾病中也会有广阔的应用前景。
摘要：目的观察SC低分子蛋白对荷瘤小鼠肿瘤生长的影响。方法选C57BL/6小鼠40只, 随机分为4组, 建立荷Lewis肺癌肿瘤小鼠模型, 连续给药10d后, 计算各组肿瘤抑制率。结果鲨鱼软骨低分子蛋白能抑制荷Lewis肺癌肿瘤小鼠肿瘤生长, 鲨鱼软骨低分子蛋白组与生理盐水组相比差异有统计学意义 (P<0.01) , 抑制率为 (44.625±5.630) %;鲨鱼软骨低分子蛋白+环磷酰胺组抑制率明显高于环磷酰胺组, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。结论鲨鱼软骨低分子蛋白可抑制实体瘤的生长, 有望成为治疗恶性肿瘤及其他血管增生性疾病的新药。
关键词：鲨鱼软骨,低分子蛋白,抑制,肿瘤
参考文献
[1]尚俊英, 谢裕安, 杨帆, 等.鲨鱼软骨低分子蛋白的提取及其抑制新生血管形成的初步研究[J].广西医学, 2008, 30 (2) :156～158
[2]尚俊英, 谢裕安.鲨鱼软骨低分子蛋白对新生血管形成的影响[J].基层医学论坛, 2008, 12 (2) :157～159
[3]Falardeau P, Champagne P, Poyet P, et al.Neovastat, a naturally occur-ring multifunctional antiangiogenic drug, in phaseⅢclinical trials[J].Semin Oncol, 2001, 28 (6) :620～625
[4]Béliveau R, Gingras D, Kruger EA, et al.The antiangiogenic agent Neo-vastat (AE-941) inhibits vascular endothelial growth factor-mediated biological effects[J].Clin Cancer Res, 2002, 8 (4) :1242～1250
[5]Boivin D, Gendron S, Beaulieu E, et al.The antiangiogenic agent Neovasat (AE-941) induces endothelial cell apoptosis[J].Mol Cancer Ther, 2002, 1 (10) :795～802
荷瘤小鼠 篇3
1 材料和方法
1.1 材料
翡翠贻贝多糖(PVPS)、S180肿瘤细胞株,由广东医学院生物化学与分子生物学研究所提供;清洁级昆明种小鼠,雌雄各半,体重18~22g,由广东医学院实验动物中心提供;噻唑蓝(MTT)、刀豆蛋白A(ConA),Sigma公司;RPMI1640培养基,Gibco公司;小牛血清,杭州四季青试剂公司;环磷酰胺(CTX),江苏恒瑞医药股份有限公司;IL-2ELISA试剂盒,eBioscience公司;CO2恒温培养箱,Sanyo公司;Model550酶联反应仪,Bio-Rad公司。
1.2 荷瘤小鼠模型建立与分组
按参考文献[2]方法建立移植性S180实体瘤小鼠模型(每只小鼠接种肿瘤细胞2×106个)。接种次日按体重将小鼠随机分成5组,每组12只,分别为对照组、CTX组(0.02g/kg)、PVPS高(0.20g/kg)、中(0.10g/kg)、低(0.05g/kg)剂量组。每天每鼠腹腔注射给药0.1ml,连续15d,末次给药24h后摘眼球取血,3000r/min离心10min,取血清待测,然后脱颈椎处死小鼠。
1.3 对荷瘤小鼠的体内抑瘤作用
将处死的小鼠剥离瘤体,称量瘤体湿重,并计算抑瘤率,抑瘤率=(对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100%。
1.4 对荷瘤小鼠免疫功能的影响
按参考文献[3]方法检测T淋巴细胞增殖能力,无菌操作取小鼠脾脏制备成脾细胞悬液,调整细胞密度至5×109/L,加入96孔细胞培养板中,0.1ml/孔。再加入ConA 0.1ml/孔,使其终浓度为6mg/L,置入5%CO2培养箱37℃培养68h。取出,从每孔中吸出80μL上清后。加入MTT(5g/L)10μL/孔,置培养箱内4h。取出,加100g/LSDS-HCl溶液0.1ml/孔,振荡过夜,用酶标仪测定A570值。以各样本A570值代表T细胞增殖能力。取待测血清按按ELISA试剂盒中的方法测定血清中IL-2含量。
1.5 统计学分析
随机分组由Eecel 2003随机数发生器完成,数据用χ2表示,用SPSS 12.0统计软件,采用方差分析,组间比较采用t检验。
2 结果
与荷瘤小鼠对照组比较,PVPS各剂量组和CTX组的S180瘤体生长均明显受到抑制,且差异有显著性(P<0.05)或非常显著性(P<0.01),PVPS各剂量组间呈一定的量效关系,说明PVPS能抑制荷瘤小鼠S180瘤体生长,且随着浓度增加,PVPS抑瘤作用增强。与荷瘤小鼠对照组比较,PVPS各剂量组T淋巴细胞增殖能力和IL-2均升高,且差异有非常显著性(P<0.01),并且呈一定的量效关系,说明PVPS能显著改善荷瘤模型小鼠免疫功能。而CTX组与对照组比较,T淋巴细胞增殖能力和IL-2均降低,且差异有显著性(P<0.01),说明CTX会降低小鼠免疫功能。结果见表1。
注:与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01
3 讨论
本实验对翡翠贻贝多糖(PVPS)的体内抗肿瘤作用进行了研究。结果表明,PVPS各剂量组对荷瘤小鼠S180瘤体生长均有明显抑制作用,且随PVPS剂量增加,抑瘤作用增强。而阳性药物CTX组的抑瘤率虽然比PVPS各剂量组高,但其同时会造成荷瘤小鼠免疫功能的进一步降低。与荷瘤小鼠对照组比较,PVPS能显著改善荷瘤模型小鼠的免疫功能,提高T淋巴细胞增殖能力和IL-2分泌,因此PVPS的抗肿瘤作用可能与其调节免疫功能有关。肿瘤是严重危害人类生命的疾病之一,其死亡率居高不下,研究开发抗肿瘤药物任重而道远。近年来,多糖类天然产物的抗肿瘤作用研究日益受到重视,并取得了许多成果。多糖的药理功能主要有抗病毒、抗炎、抗衰老、免疫调节及抗肿瘤等,且具有毒副作用小、安全性高等优点。多糖最重要的功能为其免疫调节和抗肿瘤作用,在免疫调节方面,多糖能明显调节T、B、NK等细胞功能,促进Ig类抗体含量的提高,促进IL-2、IL-6等细胞因子的产生。在抗肿瘤方面,一方面多糖可以通过提高机体的细胞和体液免疫功能,促进细胞因子的合成和释放来达到抗肿瘤效果。另一方面多糖具有细胞毒性,对肿瘤细胞有直接抑制作用[4,5]。
参考文献
[1]李江滨,黄迪南.贻贝的药用价值研究进展.水产科学,2004,23(11):43-44.
[2]王晓波,姜红,王本华,等.马齿苋多糖对肿瘤细胞的体内外抑制作用.中国公共卫生,2005,21(12):1485-1486.
[3]张红军,唐小云,鞠宝玲,等.玉屏风散对S180荷瘤小鼠肿瘤生长及免疫功能的影响.细胞与分子免疫学杂志,2008,24(7):683-685.
[4]李循,孔繁智,朱婉萍.中药多糖抗肿瘤作用研究进展.浙江中医杂志,2006,41(2):113-116.
荷瘤小鼠 篇4
黄芪扶正汤这一经验方由黄芪、黄精、构祀、女贞子和灵芝组成,该五味中药均能不同程度的提高机体的免疫能力,但是未见该经验方用于抗肺肿瘤方面的报道。为了验证该方的抗肿瘤作用,我们以Lewis肺癌荷瘤小鼠为模型,观察其对肿瘤的发生以及转移的抑制作用,并比较该方对化疗药的减毒作用,为开发本方药新用途提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及细胞
近交es7BL/6纯系6~8周龄雄性小鼠(sPF级)46只,体质量介于16~20g,购于中山大学实验动物部,合格证号:粤实动证字2010034号。小鼠Lewis肺癌细胞株,购于中山大学医学院细胞中心实验室。
1.2 实验药物和试剂
采用黄芪、黄精、构祀、女贞子和灵芝按比例2∶1∶1∶1∶1制备黄芪扶正汤。组分各种药物均为同一批次统一购于本院中药房。采用水浸泡法,煮沸法等,得到粉剂放入4℃冰箱保存备用。用生理盐水将顺铂(齐鲁制药有限公司)配置为0.2mg/mL的溶液待用。DMEM培养基和RPMI-1640购自北京索莱宝科技有限公司;小牛血清和胰蛋白酶购自杭州四季青生物技术公司;DMSO(二甲基亚矾)和Con-A购自美国AMRESCO公司。
1.3 细胞培养
根据文献[4],将细胞置于含5%CO2,37℃恒温培养箱中培养,所用培养基为DMEM(10%小牛血清,100μ/mL青霉素,100μ/mL链霉素),待细胞进入对数生长后,经0.25%胰蛋白酶溶液消化传代,台盼蓝拒染法测定活细胞数,用无血清培养基调节细胞浓度为1×107个/mL,制成细胞悬液备用。
1.4 实验分组及给药
根据文献[4],将接种后的小鼠随机分为五组,分别为空白组、模型组、顺铂组、黄茂扶正汤组、化疗+中药组。待小鼠成瘤后,腹腔注射顺铂2mg/kg治疗[5],共给药5次;中药组每日灌服黄茂扶正汤溶液10mL/(kg·d),共14d;化疗+中药组两药用法同前;对照组给予等量的生理盐水灌胃。每天密切观察小鼠体质量变化,并记录肿瘤最长径(a)和最短径(b)。
1.5 标本采集
根据文献[4],给药后第7天,腹腔给药麻醉小鼠,由尾静脉取血50μL,并分离眼球血血清。肿瘤标本:用眼科剪摘除肿瘤迅速称重记录后使用10%的中性甲醛溶液保存。肺标本:Boulns液固定小鼠肺24h,经无水乙醇漂洗。计数各肺叶表面的Lewis肺癌转移灶数,计算肺转移抑制率。骨髓有核细胞标本:来源于小鼠完整右侧股骨,用白细胞计数板载显微镜下计数洗液中骨髓有核细胞数
1.6 测定外周血白细胞数和骨髓有核细胞数
根据文献[5],用白细胞计数板在显微镜下计数洗液中骨髓有核细胞数或外周血白细胞数,按下列公式计数/L=4个大方格内白细胞总数×10/4×20×106。
1.7 统计学分析
采用SPSSl3.0软件进行数据的统计学处理,计量资料用均数±标准差(mean±S)表示,组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用S-N-Kq检验法,计数资料的比较采用t检验。以P<0.05认为有显著性差异。
2 实验结果
2.1 黄芪扶正汤可以抑制肿瘤的生长
各组小鼠在肿瘤细胞接种后第7天开始,右上肢背部可摸到直径约3~6mm。与空白对照组小鼠比较,其中模型对照组和化疗组小鼠出现活动及进食减少,精神萎靡不振等现象最为明显,中药组表现较轻。各组小鼠肿瘤逐日增大,增长速度最快的为模型对照组,最慢的为化疗+中药组(图1,表1)。并且,中药组瘤重较模型对照组减轻(P<0.05);化疗组、中药组、化疗+中药组的抑瘤率分别是52.0%,387%,68.96%(表2,图2)。
注:*与模型对照组相比P<0.05;#与Cisplatin组比较P<0.05
注*与模型对照组相比P<0.05;#与中药组相比P<0.05
2.2 黄芪扶正汤抑制肿瘤肺转移灶的形成
从表3可以看出,相对于模型对照组而言,中药组可减少肺转移灶的形成,中药加化疗组肺转移数最少。
2.3 黄芪扶正汤促进小鼠白细胞和骨髓有核细胞增生
如表4所示,相对于模型对照组而言,接受顺铂治疗组外周血白细胞和骨髓有核细胞数下降(P<0.05),而同时接受化疗和中药治疗组白细胞数和有核细胞数均有升高(P<0.05)。
注:*与模型对照组相比P<0.05;#与中药组相比P<0.05
*与模型对照组相比P<0.05;#与中药组相比P<0.05
3 讨论
肿瘤是机体自身细胞在各种内外致癌因素作用下发生转化产生的。肿瘤细胞在生物学特征及免疫学方面与机体正常细胞不同,必然导致机体的免疫应答,主要是细胞免疫。肺癌患者体内常呈现免疫功能抑制状态[6],因此肺癌免疫治疗获得了极大的关注。我国近年来在中草药治疗肺癌方面,取得了较大的突破。动物实验和临床试验表明[7],黄芪扶正汤能够提高小鼠的免疫功能和改善老年人的细胞及体液免疫功能。目前化疗仍然是治疗肿瘤的主要手段,但是化疗药物往往会对正常组织或细胞均有不同程度的抑制作用。化疗药物的毒副作用限制了该类药物在临床上疗效的进一步提高。因此临床上迫切需要利用药物联合应用来提高药物的疗效和降低化疗药物的毒副作用。
研究表明黄芪和黄精均可以通过增加骨髓造血干细胞数目和外周白细胞数目来增加机体的免疫能力[7,8,9],构祀也能明显促进小鼠造血功能[10,11]。本中药复方成分为黄芪、黄精、构祀、女贞子、灵芝五味中药,虽然每味中药均能改善机体的免疫功能,但是复方是否也能从提高自身免疫能力的角度来抑制肿瘤的发生发展以及减弱化疗药物的毒副作用呢?本实验结果显示中药组的瘤重减轻(P<0.05),瘤体积减小、肺转移数减少(P<0.05)。同时中药组肿瘤生长速度减慢。说明应用黄芪扶正汤对肿瘤生长和肺部转移有一定的抑制作用。并且我们采用了顺铂作为实验的阳性对照。在实验中观察各组小鼠用药后的基本情况。结果提示,化疗组小鼠出现精神萎靡,活动迟缓等现象,中药组以及中药组+化疗组小鼠情况较好,无明显消瘦或聚集现象。可能原因是由于化疗药物的不良反应导致小鼠进食减少,体质量增加减少,而联合中药治疗后,明显提高化疗效果。说明黄芪扶正汤对化疗药物具有解毒作用,联合用药可以增加化疗药物的疗效。结果同时提示,应用顺铂治疗后,小鼠的白细胞和骨髓有核细胞被抑制,表现为细胞数目下降,但是联用黄芪扶正汤后,外周血白细胞数和骨髓有核细胞数均高于顺铂单独使用组,提示该中药复方可以减轻化疗药物的毒副作用。但是黄芪扶正汤具体抑制肿瘤的机制仍然需要进一步治疗。
摘要：目的 观察黄芪扶正汤与顺铂联合使用后对Lewis肺癌小鼠的治疗作用。为其在临床上的进一步应用提供实验依据。方法 将实验小鼠随机分为下列五组:空白组、模型组、黄芪扶正汤组、顺铂组、化疗+中药组。观察小鼠生活状态,体质量变化等,做详细记录。取血后处死小鼠,取实体瘤称重并计算抑瘤率、肺转移抑制率,评价黄芪扶正汤的抗肿瘤的作用。结果 中药组处理后的Lewis肺癌小鼠肿瘤明显减轻,肿瘤肺转移数目明显减少,并且对小鼠的白细胞和骨髓有核细胞几乎没有影响。结论 黄芪扶正汤可通过减低化疗药物的毒性和提高化疗药物的疗效来抑制肿瘤的生长和转移。
荷瘤小鼠 篇5
本试验研究酵母多糖对S180荷瘤小鼠抗氧化机能和免疫功能的影响及其抗肿瘤机制,为酵母多糖在肿瘤防治方面的应用提供试验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
酵母多糖:由安琪酵母股份有限公司提供。瘤株:小鼠S180瘤细胞引自第二军医大学中医学实验室。注射用环磷酰胺(Cy)为江苏恒瑞医药公司产品。
1.2 动物与分组
试验用健康雄性昆明种小鼠,体重20±2 g,由第二军医大学动物实验中心提供。标准啮齿类动物饲料喂食,实验动物分笼饲养,每笼10只,适应性喂养3 d。动物饲养实验室符合国标清洁级,室温20～24℃,相对湿度50～60%,空间50 m2,室内照明控制在12 h/12 h光暗周期节律。
试验前称小鼠体重,按体重随机分为7组(每组10只),设正常对照组(NC)、肿瘤对照组(TC)以及Cy组、酵母多糖低、中、高剂量组和酵母多糖高剂量+Cy组。
1.3 方法
1.3.1 S180荷瘤小鼠模型的建立及试验设计:
在无菌条件下抽取腹腔保种7 d的S180小鼠腹水,用生理盐水制成细胞数每毫升为1×106的细胞悬液,每只小鼠右前肢腋皮下接种0.2 mL。
按试验设计每日灌胃1次,每次0.4 mL,连续给药7 d,NC组、TC组给等量生理盐水灌胃,Cy组给予腹腔注射给药。采用自由饮水、采食的饲养方式。试验第7 d接种S180瘤,第19 d后全部处死。每组10只小鼠的肝组织用于测定丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)活力;小鼠的肿瘤组织用于检测IL-2、TNF-α、TGF-β1的含量。
1.3.2 体内抑瘤试验:
第7 d接种肿瘤,19 d试验结束。试验小鼠处死后,剥离完整肿瘤块,称重,计算抑瘤率。肿瘤抑制率(%)=(对照组平均瘤重-试验组平均瘤重)/(对照组平均瘤重)×100
1.3.3 免疫指标测定:
按小鼠IL-2、TNF-α、TGF-β1定量PCR试验所需试剂盒 (5×逆转录buffer, dNTPs, MMLV, DEPC处理水, 5×定量PCRbuffer,Taq酶, ddH2O,上游引物F,下游引物R, TaqMan probe)说明书操作检测IL-2、TNF-α、TGF-β1含量。PCR试剂盒由广州达晖生物公司提供。
1.3.3.1组织总RNA的抽提
将所试验的标本按序排放在管架,依次将各组肿瘤组织转移至5 mL玻璃试管中,依次每一管中加入1 mL预冷Trizol,8000 r·min-1电动匀浆器处理30～45 s,每标本间处理后用酒精棉球擦拭, DEPC处理水清洗,按照试剂盒说明书操作提取RNA。所提RNA用DEPC处理水20 μL溶解,-20℃冰箱保存待用。
1.3.3.2逆转录(RT)反应合成cDNA
将经过稀释后的RNA样本进行RT,反应体系为:5×逆转录buffer 4 μL,上、下游引物各0.4 μL,dNTPs 0.2 μL,逆转录酶(MMLV)1 μL,DEPC处理水10 μL,RNA模板4 μL,总体积20 μL。反应条件:37℃ 1 h;95℃ 5 min,灭活MMLV。
1.3.3.3 引物设计
IL-2的上下游引物分别为:5′- ACTCCATGCACCGAGATGTTT-3′和5′- CTGGAAGCCCTGCAGATGAG -3′,合成片段长度为145 bp;TNF-α的上下游引物分别为5′-GGCTGCCCCGACTATGTG -3′和5′- TGACTTTCTCCTGGTATGAAATGG -3′,合成片段长度为169 bp;TGF-β1的上下游引物分别为:5′-GCTGCTGACCCCCACTGAT-3′和5′-TGCCGGACAACTCCAGTGA-3′, 合成片段长度为151 bp。
1.3.3.4 FQ-PCR反应
将制备好的cDNA进行PCR扩增,PCR反应体系总体积为50 μL。PCR循环条件为:95℃10 min,1个循环;95℃ 0.25 min,进行40个循环反应,最后60℃退火、延伸1 min。试验采用的Real-time检测仪(美国ABI-7300)。
1.3.4 酵母多糖对肝组织抗氧化指标的测定:
试验结束后,取出试验小鼠肝组织,用冷生理盐水冲洗、拭干,准确称取肝组织重量按1:9的比例加入生理盐水,制成10%的匀浆。2500 r·min-1,离心10 min,取上清组织匀浆,测定超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)含量。上述指标的测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所,测定方法按试剂盒进行。
1.4 统计方法
试验结果采用SPSS11.5统计软件进行方差分析,所有数据用均数±标准差undefined表示。P<0.05认为有统计学意义,有显著差异;P<0.01认为差异非常显著。
2 结果与分析
2.1 对荷瘤小鼠的瘤重和抑瘤率的影响
由表1结果可见,TC组平均瘤重>1 g,说明造模成功,肿瘤生长良好。zymosan-L、M、H组小鼠的一般状态比TC组好,小鼠活动自如,毛皮光滑,瘤体外观苍白,与周围组织无粘连,易于剥离。各组与TC组相比,有显著性差异(P<0.01)。随着酵母多糖水平的提高,酵母多糖抑瘤作用具有明显增强的趋势。20 mg.kg-1.d-1的Cy治疗组抑瘤率为69.41%,当同时使用Cy和酵母多糖时,抑瘤率增加至71.46%,与TC相比有显著差异(P<0.01)。
a:P<0.01 与肿瘤对照组相比
2.2 对荷瘤小鼠体内抗氧化活性的影响
由表2可知,TC组SOD 活性较NC组降低,酵母多糖给药组中荷瘤小鼠肝脏的SOD活力都随剂量的增加而增大,呈现剂量-效应关系,且zymosan-H组SOD活力达到了239.36 u/ml,高于NC组,zymosan-H灌胃联合Cy腹腔注射组活力达到了242.28 u/ml,明显高于NC组和单独使用Cy治疗组,说明酵母多糖联合使用化疗药物有很好的自由基清除效果。
a : P<0.01 , b : p<0.05 与正常组相比;C:P<0.01 肿瘤对照组相比;d : P<0.01 , e : p<0.05与正常组相比;f: P<0.01 肿瘤对照组相比
除zymosan-H +Cy治疗组,各给药组和TC组小鼠肝脏GSH-Px活力与NC组都有显著性差异(P<0.01),其中Cy治疗组和zymosan-H治疗组(P<0.05)。与TC组相比,酵母多糖给药组均表现出了一定的抗氧化活性,有明显的剂量-效应关系,且Cy治疗组、zymosan-H治疗组及二者联合使用组GSH-Px活力较TC组显著提高(P<0.01)。
与NC组相比,各组荷瘤小鼠肝脏MDA值均有升高,其中TC组升高最为显著(P<0.01),其次为zymosan-L治疗组(P<0.05)。与TC组相比,除了zymosan-L治疗组无显著性差异外,各给药组MDA生成量均低于TC组(P<0.01),说明酵母多糖能很好的抑制荷瘤小鼠肝脏中MDA的生成。
2.3 对荷瘤小鼠肿瘤组织TNF-α、IL-2和TGF-β1 mRNA表达的影响
从图1、图3发现荷瘤使小鼠TNF-α和IL-2 mRNA表达水平极显著地下降,但各给药组肿瘤组织中检测到TNF- mRNA表达水平显著高于TC组(P<0.01),IL-2 mRNA表达水平在Cy组与TC组之间无显著差别,在酵母多糖用药组IL-2 mRNA表达水平显著高于TC组(P<0.01),且在一定范围内,随酵母多糖剂量增加,TNF- 和IL-2 mRNA表达水平提高,Cy组也可一定程度提高荷瘤鼠TNF-α和IL-2 mRNA表达含量,但明显较酵母多糖用药组低(图2和图4)。酵母多糖对肿瘤组织中TNF-α和IL-2 mRNA表达水平的增加以zymosan-H组最为明显,与Cy组和TC组比较差异有显著性(P<0.01)。但zymosan-H联合应用Cy组IL-2 mRNA表达水平与单纯应用zymosan-H治疗组无显著差别。
由图6可知,TC组TGF-β1 mRNA表达水平明显增高,在酵母多糖用药组TGF-β1 mRNA表达水平有明显的下降,尤以zymosan-H组下调最为显著(与TC组比较,P<0.01)。
3 讨论
本研究结果表明,酵母多糖在100～400 mg·kg-1剂量范围内抑瘤率为26.63～57.02%,与环磷酰胺合用抑瘤率可达71.46%,说明酵母多糖与环磷酰胺联合抗小鼠S180瘤具有协同作用。
酵母多糖抑制小鼠S180瘤生长的同时,能提高荷瘤小鼠的抗氧化能力,减少脂质的过氧化作用。与TC组相比,高剂量的酵母多糖对荷瘤小鼠抗氧化机能的改善作用不仅表现在提高肝脏中SOD活力,而且各个剂量组的酵母多糖均显著提高GSH-Px活性。SOD和GSH-Px是机体抗氧化系统的重要抗氧化酶,其中SOD是生物体中主要的自由基清除酶,GSH-PX是机体内广泛存在的一种催化过氧化氢分解酶,具有清除过氧化氢(H2O2)、脂类过氧化物的作用,其解毒功能将H2O2还原为H2O和O2,保护细胞免受氧自由基的损害,两者在体内的主要作用是还原过氧化物并及时清除体内过量的可使机体衰老、降低免疫功能并导致癌变的自由基[10,11],从而缓解肿瘤的发生。在荷瘤小鼠体内,肿瘤的发生会导致组织内氧自由基的脂质过氧化反应增强,脂质过氧化物增多[12],反应终产物MDA的含量也会上升。本试验中酵母多糖与环磷酰胺联合治疗较TC组显著降低了肝脏中MDA水平,认为该多糖的抑瘤活性可能与增强机体抗氧化作用有关。
研究表明,多糖成分对肿瘤细胞无直接抑制作用,大多是通过提高宿主的免疫功能而发挥作用。TNF-α1 和IL-2是宿主BRM(biological response modifiers,BRM)系统中具有抗肿瘤作用的细胞因子,具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用[13,14]。TNF-α在肿瘤机体免疫功能中是非常重要的细胞因子,由单核-巨噬细胞产生,其可以直接杀伤肿瘤细胞,如通过作用于胞膜磷脂酶、蛋白酶和核酸酶途径杀伤肿瘤细胞;还可以通过间接途径杀伤肿瘤细胞,如阻断肿瘤细胞血液供应,增加肿瘤血管内皮细胞的凝血活性,使血管内皮细胞受损,以及抑制血管内皮细胞迁移等[15]。IL-2是T细胞分泌的,是T细胞增殖的信号,可以促进T细胞大量增殖,此外还可促使自然杀伤(NK)细胞的活化增殖,也可促使B细胞的增殖、分化和合成抗体。因此,TNF-α、IL-2是目前公认的两种重要的抗肿瘤作用细胞因子。本试验结果也表明酵母多糖不仅有明显抗肿瘤作用,且在体内抗肿瘤有效剂量下,明显增强荷瘤小鼠肿瘤组织中TNF-α、IL-2 mRNA的表达,这可能是酵母多糖抗肿瘤作用的机制之一。
荷瘤小鼠 篇6
1 材料与方法
1.1 主要实验材料
瘤株:H22肝癌细胞购于哈尔滨医科大学附属肿瘤医院动物中心;实验动物:昆明种近交系小鼠, 体重 (20±2.0) g, 雄性, 佳木斯大学实验动物中心提供, 许可证号:黑动字第99101001, 普通级, 普通环境饲养。灰树花多糖粉末 (浙江方格药业有限公司, 多糖含量90%) 。顺铂粉剂 (山东齐鲁制药厂) 。Caspase-3抗体 (河北博海生物) 。SP-9001试剂盒 (北京中杉金桥) 。
1.2 实验方法
1.2.1 动物模型的建立、分组与给药方式
40只昆明种小鼠各自接种1×107/mL细胞悬液于右侧腋下, 随机分成4组, 每组10只。24h, 开始给药。给药时间为:每日早上进行灌胃一次, 晚上进行腹腔注射一次, 间隔时间12h, 连续给药14d。具体给药方法见表1。
1.2.2 肿瘤抑制率
肿瘤抑制率 (%) = (阴性组平均瘤重-给药组平均瘤重) /阴性组平均瘤重×100%。
1.2.3 HE染色
按说明书操作。
1.2.4 免疫组化
采用SP法。Caspase-3阳性为细胞膜和细胞浆着色。
1.3 统计分析
采用SPSS10.0统计软件进行数据统计分析, 结果以均数±标准差表示。采用完全随机设计两样本均数比较t检验和方差分析, P<0.05为有差异。
2 结果
2.1 肿瘤抑制率
注:与阴性组比较*P<0.05, **P<0.01。
2.2 HE染色
HE染色后在高倍镜下观察:阴性组的H22肿瘤细胞大小和形态很不一致, 呈多形性, 棱形或多边形铺层生长, 可观察到瘤巨细胞。细胞核的体积增大, 核质比增高。出现巨核、双核、多核或奇异形核。核仁明显, 体积大, 数目增多, 核分裂相增多, 出现异常的核分裂相;各给药治疗组的H22肿瘤细胞与细胞间接触的消失, 但细胞膜依然完整。染色质固缩, 形成新月形帽状结构等形态, 沿着核膜分布。可见凋亡小体的形成。
2.3 免疫组化
对免疫组化的片子进行显微镜观察, caspase-3为细胞膜和细胞浆着色。采用免疫组化评分法, 由2名观察者对切片盲式阅片, 显微镜下随机选择5个高倍镜视野 (×400) , 观察所选择视野中的所有细胞, 记录阳性染色细胞百分数并计分。评分标准如下:
A为阳性细胞数分级0~1%=0;1%~10%=1;10%~50%=2;50%~80%=3;80%~100%=4。
B为阳性细胞显色强度分级0 (阴性) 、1 (弱阳性) 、2 (阳性) 、3 (强阳性) 。
IHS=A×B
对所得数值进行完全随机设计两样本均数比较t检验。
注:与对照组比较*P<0.05, **P<0.01。
3 讨论
灰树花多糖是从灰树花子实体、菌丝体中提取的, 具有增强免疫功能、抑制肿瘤、抗HIV病毒、稳定血压、降低血糖、改善脂肪代谢等广泛的生理活性[1]。有研究表明, PGF对体内S180肉瘤具有抑制作用[2]。 通过HE染色在光镜下观察各组细胞形态, 阴性组的H22肿瘤细胞呈棱形或多边形铺层生长, 细胞分裂增殖活跃, 多见分裂相;各给药组的H22肿瘤细胞表现出典型的细胞凋亡特征, 说明顺铂和灰树花多糖均可诱导H22肿瘤细胞凋亡。 Caspase被认为是细胞凋亡的核心执行者即凋亡的共同通路。Caspase-3是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路且位于该细胞级联反应的下游, 它通过下游效应因子切断细胞间的信号传递, 重组细胞骨架, 关闭DNA复制和修复, 破坏DNA和细胞核结构, 诱导凋亡小体来执行凋亡功能[3]。本实验结果说明灰树花联合顺铂抑制肿瘤生长与促进Caspase-3高表达有关。 通过本实验观察到, 灰树花多糖组、顺铂组、联合组均对H22细胞具有杀伤作用, 以联合组效果最明显。各治疗组均对肿瘤细胞有抑制作用, 联合组最强, 其次为顺铂组, 再次为灰树花多糖组。联合组抑瘤效果最佳, 且小鼠生命力旺盛, 说明灰树花多糖对于顺铂有增敏作用, 且明显。
本研究提示顺铂、灰树花多糖可以有效地抑制H22肿瘤细胞的增殖, 从而导致H22肿瘤细胞大量凋亡。应用灰树花多糖联合顺铂具有一定的协同作用, 在降低化疗药物毒副作用的同时有效诱导H22肿瘤细胞凋亡, 提高综合治疗效果。综合考虑灰树花多糖的多种功效和高安全性, 它具有可能成为肿瘤化疗辅助剂的巨大潜力。
关键词：灰树花多糖,顺铂,细胞凋亡,caspase-3
参考文献
[1]Mayell M.Maitake extracts and their therapeutic potential[J].Altern Med Rev, 2001, 6 (1) :48- 60
[2]杜景卫, 夏作理, 李清初, 等.灰树花多糖抗S180肉瘤的实验研究[J].泰山医学院学报, 2005, 25 (2) :193 -195
荷瘤小鼠 篇7
1 材料与方法
1.1 实验动物
昆明种小鼠由佳木斯大学动物室提供, 普通饲养, 体重18～22g, 共28只, 雌雄各半, 接种肝癌细胞成皮下荷瘤鼠和腹水瘤鼠各14只, 随机分两组, 每组14只, 普通饲养, 实验组随意饮用白术水煎剂, 对照组随意饮用自来水, 15d后取存活小鼠断头采血[4]并取瘤体称重。白术水煎剂按常规法煎制[5]制成含生药量5%水煎剂供饮用。试剂β-内啡肽 (β-EP) 放射免疫测定盒购于北京海科锐生物技术中心, 批号20100211, P物质 (SP) 放免测定药盒购于中国医学科学院, 批号20090812。
1.2 方法
断头采血2mL, 静置于4℃冰箱, 24h内标本离心 (3000r/min) 15min, 分离血清置30℃, 冰箱内保存备用。采用放射免疫测定中平衡饱和分析方法对血清标本直接测定, 按说明书进行实验。瘤体用普通扭力天平称重。
1.3 统计学处理
所有实验数据均以undefined表示, 采用两样本均数t检验, 及率的显著性检验进行统计学处理, P<0.05有显著差异。
2 结果
实验组血清β-内啡肽浓度明显高于对照组 (P<0.01) ;实验组血清P物质浓度与对照组比较无显著性差别 (P>0.05) ;实验组瘤体重量明显低于对照组 (P<0.01) 见表1。实验组死亡率 (0.27) , 对照组死亡率 (0.46) , 两组存活时间无显著性差别 (P>0.05) , 见表1。
**P<0.01与对照组比较;*P>0.05与对照组比;#P<0.01与对照组比较。
3 讨论
白术在《神农本草》译文中被列为中药上品。其性温、味甘、苦[6]具有健脾益气, 燥温利水, 止汗安胎之功效。主要用于脾益食少, 腹胀泄泻, 痰饮眩悸、自汗、水肿、胎动不安等症的治疗。因此国内外对此展开了较多研究。白术的抗肿瘤作用是白术挥发油以100mg/kg及50mg/剂量腹腔给药, 对小鼠艾氏腹水癌及淋巴肉瘤腹水型有较强的抑制作用, 大剂量给药1次 (150mg/kg) 可明显延长患瘤小鼠的寿命[7]。研究证明100%白术注射液有抑制S180实体瘤作用, 能降低瘤细胞的增值率, 降低瘤组织的侵袭性, 提高机体的抗瘤反应和对肿瘤细胞的细胞毒作用[8]。实验结果表明, 白术水煎剂能显著提高荷瘤鼠血清β-内啡肽浓度 (P<0.01) , 但对荷瘤鼠血清P物质浓度无显著影响 (P>0.05) , 并明显降低荷瘤鼠的瘤体重量 (P<0.01) 。结果提示, 饮用白术水煎剂可以通过对中、晚期荷瘤鼠血清中β-内啡肽水平升高和延缓瘤体生长, 达到缓解荷瘤鼠的疼痛效果。提示, 饮用白术水煎剂对临床中、晚期肿瘤患者可能有缓解疼痛及减慢肿瘤生长的作用。在临床上被广泛应用于肿瘤的预防与治疗, 尤其是对晚期消化系统癌症具有显著的疗效, 表明白术在肿瘤的预防与治疗方面具有重要价值[10]。另外, 白术的资源极为丰富, 具有广阔的开发前景。为肿瘤的综合治疗提供了一条新的尝试途径。
摘要：目的:探讨白术水煎剂对荷瘤小鼠血清β内啡肽及P物质水平的影响。方法:采用放免方法测定了饮用白术水煎剂的荷瘤小鼠血中β—内啡肽及P物质水平的变化。结果:荷瘤小鼠血中β—内啡肽水平明显升高 (P<0.01) , P物质浓度无显著变化 (P>0.05) 。结论:饮用白术水煎剂可起到减轻肿瘤小鼠的疼痛的作用。
关键词：白术水煎剂,荷瘤小鼠,β-内啡肽,P物质
参考文献
[1]江苏医学院编.中药大辞典 (上册) .北京:人民卫生出版社, 1977, 1376
[2]宋立人主编.现代中药学大辞典 (上册) .北京:人民卫生出版社, 2001, 646
[3]江明性主编.药理学 (第4版) .北京:人民卫生出版社, 1997, 119
[4]徐叔云, 卞如濂, 陈修主编.药理实践方法学 (第2版) .北京:人民卫生出版社, 1994, 165
[5]扬中林, 付启凤.炮制甘草对免疫功能的影响[J].中药材, 1991, 14 (2) :29-30
[6]李家实主编.中药鉴定学[M].上海:科学技术出版社, 1998, 201
[7]张宗, 张鸿翔, 史天良, 等.白术挥发油的抗肿瘤作用研究[J].肿瘤研究与临床, 2006, 18 (12) :799-820
[8]孙喜才, 张玉五, 连文太, 等.健脾益气方841-A对小鼠S180实体瘤增殖的影响[J].陕西中医, 1987, 8 (2) :90-91