小鼠抑郁症模型（精选7篇）
小鼠抑郁症模型 篇1
对于抑郁症的研究由来已久, 中医“三因学说”中, 将抑郁症归为情志性疾病, 多以郁证论治[1]。有大量的验方均可对该病进行治疗, 其中, 以半夏厚朴汤研究最多也最为广泛[2], 一般认为, 该方中最有效的成分为厚朴酚。但是对于半夏在其中作用的研究尚无明确报告。本实验以小鼠为研究动物, 探索了半夏对厚朴的协同作用。
1 实验材料与方法
1.1 实验材料
ICR小鼠:重量 (22±4.0) g, 共计110只, 随机分为5大组。其中:半夏组, 厚朴组, 半夏厚朴组分别30只, 醇提物以药物浓度计, 高剂量组500 mg/ (kg·d) , 中剂量组300 mg/ (kg·d) , 低剂量组100 mg/ (kg·d) ;其中半夏厚朴组的醇提物则以1:1配比。西药组10只, 灌服盐酸氯丙嗪30 mg/ (kg·d) 。空白组10只。
1.2 实验方法
①强迫游泳实验:将单只小鼠放入烧杯中, 保证水温为 (25±2) ℃。实验共进行6 min, 计算后4 min内小鼠的游泳不动时间。②悬尾实验:将小鼠尾端倒挂于铁杆上, 尾部以胶带固定, 头部距离箱底10 cm。实验共进行6 min, 计算后4 min内小鼠不动的时间。
1.3 统计学方法
实验结果以SASS 8.0 进行分析组间对比用x2检验, (P<0.05) 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 强迫游泳实验结果 具体结果见表1。
由结果可知, 随着浓度的不断下降, 药物的抗抑郁效果显著降低。但是复配组下降趋势较为缓慢, 当药物浓度为100 mg/ (kg·d) 时, 各组同对照组相比, 均无显著性差别。
2.2 悬尾实验结果 具体结果见表2。
由结果可知, 单一组分的高剂量组均会对于小鼠的悬尾实验结果带来一定促进作用。但是效果并不明显。组间比较, (P>0.05) 。但是两者复配后, 则效果明显, (P<0.05) , 差异有统计学意义。而且在中剂量复配组也呈现了较好的改善状态。但是该结果在100 mg/ (kg·d) 组内消失。
3 讨论
小鼠强迫游泳和悬尾模型由于操作便捷、对药物敏感而被广泛的应用于各种抗抑郁的药物筛选之中[3]。本研究的结果显示, 半夏, 厚朴及两者的醇提物均有效的缩短了小鼠不动时间, 有效的改善了小鼠的抑郁状态。虽然半夏在两个实验组内均体现了较低的活性 (同厚朴组及复配组相比) 。但是经过复配, 两者的混合物相比与厚朴呈现了明显的促进作用。证明半夏厚朴汤的[1]物质基础不仅仅是依靠厚朴的成分而实现, 还需半夏的辅助才能得到更好的发挥。
参考文献
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[2]王业民, 周建军, 孔令东.半夏厚朴汤及其组成中药抗焦虑和抑郁研究进展.世界科学技术:中医药现代化, 2003.
[3]Willner, P.Animal models as simulations of depression.Trends in pharmacological sciences, 1991, 12:131-136.
小鼠抑郁症模型 篇2
1 材料与方法
1.1 实验动物
昆明品系小白鼠,体重18-21g,2月龄,雌雄各半,由济宁鲁抗药业实验动物中心提供。实验小鼠分笼饲养,每日按灌胃手法抓取抚摸,使小鼠适应1周。
1.2 实验药物
中药复方枳菊解郁汤配方:石菖蒲15g、枳实10g、夜交藤20g、菊花15g、炒枣仁30g、勾藤30g、郁金15g、柏仁30g、胆星10g,由曲阜市中医医院提供。用量:按人鼠等效剂量(生药量175g)换算为低剂量,其二倍量为中剂量,四倍量为髙剂量。每日一次灌胃给药,每鼠每天0.2 ml。阳性药物对照组采用盐酸氟西汀胶囊,20mg/粒,由常州华生制药有限公司提供,国药准字:H19980138。用量:按人鼠等效剂量换算,3.6mg/kg.d,溶于0.2ml蒸馏水中,每日一次灌胃给药,每鼠每天0.2ml。
1.3 动物分组
小鼠适应一周后随机分组:对照组,模型组,氟西汀组,中药低、中、高剂量组。每组12只。对照组和模型组小鼠每天蒸馏水灌胃;氟西汀组小鼠每天氟西汀灌胃;中药低、中、高剂量组,根据各自的剂量,每只小鼠每天中药灌胃给药。各组小鼠应激前1h灌胃给药。
1.4 慢性应激抑郁模型的建立
除对照组外,各组小鼠均接受7种不同应激方式,包括电击足底(每隔1分钟每次持续10秒刺激,电压38V,共计15次)、冷水刺激(8℃冷水,共计3min)、斜笼(24h)、禁食(24h)、禁水(24h)、通宵照明、高台(1h,高台直径10cm、高160cm)。每天选取一种应激方式,随机选择,持续应激21天。对照组小鼠正常饲养,不给予任何应激。
1.5 Morris水迷宫实验
Morris水迷宫视频跟踪分析系统由圆形水池、平台、视频跟踪设施、分析软件4部分组成。水池内分为4个象限。平台放置在第一象限(目标象限),在对面象限(第三象限)做好明显标记物。平台在水面以下约1 cm。水温控制在25o C。定位航行实验共进行4天,每天每只小鼠共接受4次找平台训练。每只小鼠依次从四个象限的入水点入水池,记录小鼠从入水至爬上平台的逃避潜伏期(escape latency),检测小鼠的空间学习能力。空间搜索实验在实验第5天进行,平台撤除,小鼠从第三象限入水点入水,记录小鼠120s内在各个象限的游泳(停留)时间,检测小鼠的记忆保持能力。
1.6 小鼠海马和前脑皮层SDF-1的表达
水迷宫实验后立即进行灌流取脑,用戊巴比妥钠对小鼠进行腹腔麻醉,迅速打开胸腔,暴露心脏,经左心室快速灌注37℃生理盐水和预冷4%多聚甲醛磷酸盐(PFA)缓冲液,开颅取脑,梯度酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,行冠状切片(5μm)。按照SDF-1免疫组化试剂盒说明(武汉博士德生物工程有限公司提供)进行免疫组织化学染色。选取每只小鼠海马CA1、CA3、齿状回(DG)和前脑皮层(PFC)切片3张,每个玻片各随机取两个视野,用Motic Images Advanced 3.2图像处理系统检测SDF-1阳性细胞平均目标灰度值。
1.7 统计学分析方法
实验数据采用平均数±标准误(M±SE)表示。定位航行实验的逃避潜伏期采用重复测量的方差分析(Repeated-measures ANOVA);其它数据均采用单因素方差分析(One-way ANOVA),组间比较用N-K法,以P<0.05表示有统计学显著性差异。
2 结果
2.1 各组小鼠空间学习记忆能力的变化
定位航行实验结果显示(表1),对照组和模型组小鼠的逃避潜伏期迅速降低(P<0.01);氟西汀组、枳菊解郁汤低、中、高剂量组小鼠的逃避潜伏期均明显减少(P<0.001,P<0.01)。表明各组小鼠随着训练周期的增加,空间学习能力得到提高。与对照组小鼠相比,模型组小鼠4天的逃避潜伏期均显著增多(P<0.01,P<0.05);与模型组小鼠相比,氟西汀组和枳菊解郁汤中剂量组小鼠4天的逃避潜伏期均显著减少(P<0.01),高、低剂量组小鼠在第4天出现显著减少(P<0.05)。表明模型组小鼠的空间学习能力减弱,而枳菊解郁汤能改善抑郁小鼠的空间学习能力,且中剂量效果更好。
空间搜索实验结果显示(表2):对照组小鼠在第一象限(平台所在象限)停留时间明显高于其他象限(P<0.01);而模型组小鼠在第一象限停留时间明显低于第二、三象限停留时间(P<0.001)。与对照组小鼠相比,模型组小鼠的第一象限停留时间明显减少(P<0.01);与模型组小鼠相比,氟西汀组小鼠、枳菊解郁汤低、中、高剂量组均显著增加(P<0.01,P<0.05)。表明抑郁模型小鼠空间记忆能力减弱;枳菊解郁汤能改善抑郁模型小鼠空间记忆,且中剂量效果最明显。
2.2 各组小鼠海马和前脑皮层SDF-1的表达
各组小鼠免疫组化结果显示(表3):SDF-1在海马各区及前脑皮层均有不同程度的表达,与对照组相比,模型组小鼠CA1、CA3、DG和前脑皮层SDF-1的平均目标灰度值明显增高(P<0.01),模型组SDF-1的表达减弱;与模型组相比,氟西汀组、中药各剂量组SDF-1的平均目标灰度值均不同程度降低(P<0.01,P<0.05),SDF-1的表达增强。
3 讨论
有研究报道,慢性、低强度、长期的日常压力是引发抑郁症的主要原因[5],慢性应激抑郁动物模型被广泛应用于抑郁症的研究。英国心理学家Morris创建了水迷宫实验以评估动物的空间学习记忆能力,Morris水迷宫实验模型已经成为研究学习记忆的常用方法之一。定位航行实验是动物通过空间视觉线索找到隐匿平台,从水中逃生的程序,用于动物空间学习能力的检测;空间探索实验则用于评价动物空间记忆能力。本研究显示,模型组小鼠的逃避潜伏期均显著增多,空间搜索实验中在第一象限停留时间也明显减少,表明抑郁模型小鼠的空间学习和记忆能力均减弱;氟西汀组、枳菊解郁汤中剂量组的逃避潜伏期均减少,空间搜索实验的第一象限停留时间均明显增多,表明枳菊解郁汤能有效改善抑郁模型小鼠空间学习、记忆能力减退的现象,从而起到一定的抗抑郁效果。
慢性应激导致神经化学方面的改变可能参与了抑郁症的发生,尤其是神经内分泌、神经递质、神经可塑性的改变在抑郁症的发生中起到重要作用。研究发现慢性应激动物脑区海马及前脑皮层的整体形态发生改变[6],从而导致神经细胞受到损害。我们先前的研究表明,多因素慢性应激可引起小鼠脑内神经元的损伤[7]。SDF-1是一种表达于多种细胞和组织的基质细胞衍生因子[4],在胚胎发育、肿瘤转移、免疫系统、循环系统及中枢神经系统的发育和修复中起着重要作用,可影响海马神经元突起延伸、凋亡效应及神经干细胞的迁移。本研究结果显示,SDF-1在海马各区及前脑皮层均有不同程度的表达,模型组小鼠CA1、CA3、DG和前脑皮层SDF-1的平均目标灰度值明显增高;氟西汀组、中药各剂量组SDF-1的平均目标灰度值均不同程度降低,且中剂量有显著差异,表明枳菊解郁汤通过上调抑郁模型小鼠SDF-1在脑区的表达,对损伤的神经元进行修复,进而起到一定的抗抑郁作用。
摘要：目的 :探讨中药复方枳菊解郁汤对抑郁模型小鼠空间学习记忆能力的影响及其机制。方法 :采用多种因素慢性轻度不可预见性应激方式建立抑郁模型小鼠,分别给予小鼠低、中、高剂量枳菊解郁汤处理。采用Morris水迷宫实验,检测小鼠的空间学习记忆能力的变化;通过免疫组织化学方法检测脑内基质细胞衍生因子(SDF-1)的表达。结果:与对照组相比,模型组小鼠的空间学习记忆能力明显下降(P<0.01),SDF-1在海马CA1,CA3,DG及前脑皮层的表达明显降低(P<0.05);与模型组相比,枳菊解郁汤中剂量组小鼠的空间学习记忆能力明显增高(P<0.05),SDF-1在海马CA1,CA3,DG及前脑皮层的表达明显增加(P<0.05)。结论 :枳菊解郁汤的抗抑郁作用可能与SDF-1的表达上调有关。
关键词：中药复方,慢性应激,抑郁症,SDF-1,学习记忆,海马,前脑皮层
参考文献
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[6]张艳美.慢性应激、大脑损伤与抑郁症[J].国外医学精神病学分册,2001,28:105-109.
小鼠肺癌原位模型的建立 篇3
目前,肺癌动物模型的构建方法有化学诱导法、转基因法、异位移植法、原位移植法等。其中化学诱导模型耗时长,且诱导出来的肿瘤存在较大异质性[4],故有使用局限。转基因模型虽对肺癌早期的发病机制及干预性治疗效果的研究有很大帮助,但是由于该模型存在造模时间难掌握、花费较高、数量上难以满足实验要求以及转基因产物不一定符合要求等问题[5],故亦存在普遍使用的局限性。在过去的几十年中,异位移植法中的皮下移植是对肺癌进行实验研究的首选方法[6],由于其操作简单方便,通常只需在背部、腋部、后肢接种即可,但如今采取此种方法构建的肺癌模型所得出的实验数据常遭到学者们的质疑,认为其脱离了源组织的微环境,导致实验结果与临床治疗效果差异较大[7],此外 ,早在1989年外国学者Paget[8]的种子和土壤学说也证实了器官微环境会影响肿瘤细胞的表型表达,而皮下移植瘤模型转移发生率较小,并且生存曲线的数据不准确。原位移植法包括支气管内注射[9]、肺内注射[10,11,12],以及外科植入新鲜肿瘤组织[13]。其中支气管注射成瘤及瘤体大小、数目均不稳定,故使用局限性较大。相关实验证明,在肺癌原位移植模型中,瘤块外科原位移植法比肿瘤细胞悬液原位注射法转移率高,转移的发生也具有与临床相似的时间依赖性,但是由于其创伤大、手术病死率高、实验动物生存时间短,不宜普遍推广[13]。而本研究构建的肺癌原位模型是在以往的肺内注射法的基础上继续改良创新,以期构建出更为理想的小鼠肺癌原位模型。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1细胞系Lewis肺癌 (lewis lung carcinoma,LLC),源于C57 BL/6小鼠,属鼠源性的非小细胞肺癌细胞株,购于中科院。
1.1.2细胞转染 所需材料 转染试剂Lipofectamine2000TM购于Invitrogen公司,潮霉素(Hygromycin B)购于Roche公司 ,RPM1-1640购于HYCLONE公司 ,OPTI-MEMI购于Invitrogen公司。
1.1.3实验动物C57 BL/6小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司(SCXK(沪)2007-0005),雄性,5周龄,17只,体重18~22 g。所有小鼠在SPF级屏障系统中饲养[实验室使用许可证编号:SYXK(沪)2009-0069]。饲养室相对湿度为(55±10)%,温度为(22±2)℃,光照12 h明暗交替,小鼠所用饲料为上海仕林生物科技有限公司生产的辐照鼠料。
1.1.4 matrigel基质胶 /基底膜BD Matrigel TMmatrix Basement Membrane(BD公司,产品编号:356234)标准型浓度,-20℃下冷冻保存,避免多次冻融。
1.1.5活体成像仪器Caliper精诺真生物发光/荧光活体分子成像系统 (IVIS誖Lumina XR Imaging System)[铂金埃尔默 (Perkin Elmer), 型号 :Lumina XR], 成像图片分析软件:LuminaⅡliving image 4.3。
1.2 方法
1.2.1构建表达荧光素酶的LLC稳转细胞系本实验所用质粒载体是EGFP-FFLuc-Hy Tk-p MG^pac,该载体同时表达绿色荧光蛋白(GFP)、虫萤光素酶(luciferase)、潮霉素(hygromycin B)和自杀基因(Tk基因),是由本研究组通过材料转移协约(material transfer agreement,MTA) 从德州大学MD安德森癌症中心获得。用含10%胎牛血清和1% 青链霉素的RPM1-1640培养液培养LLC细胞。转染前将细胞接种于35 mm培养皿中,置于5%CO2,饱和湿度的37℃培养箱中培养。当细胞达到70%~80%融合浓度时开始转染。转染24 h后加入600μg/m L的潮霉素进行抗性克隆筛选,挑选GFP阳性克隆,然后用300μg/m L的潮霉素进行维持。
1.2.2动物模型的建立1配制细胞混悬液 :将含有表达虫萤光素酶的LLC细胞(0.5×105个)50μL的细胞悬液与50μL的matrigel基质胶等体积混匀,将其抽吸入事先预冷好的胰岛素注射器。2麻醉固定:使用浓度为1%、剂量为5 mg/kg的戊巴比妥钠将小鼠麻醉固定。3剃毛:用剃毛器将小鼠左胸部及腋下的黑毛剃除干净,以充分暴露左侧胸壁。4剪开皮肤:于小鼠左腋前线下1 cm处用左手持镊子将皮肤拎起,右手持眼科手术剪将皮肤横向剪开约1 cm的小口。5定位:观察小鼠心脏搏动处,将心脏定位好后再水平向左移动皮肤切口,可发现与心脏暗红色组织不同的白色实质性的左肺组织。6进针:定位好后将事先抽吸好的胰岛素注射器插入左肺,进针深度3 mm,角度以垂直为佳,注射完后停顿5~10 s,再在伤口上滴洒含庆大霉素的生理盐水少许。7缝合:切口缝合1~2针。8伤口护理:最后在伤口上涂抹红霉素眼膏,帮助伤口愈合,造模完成。
1.2.3小动物活体成像操作方法小鼠于造模后进行活体成像,首先给予小鼠腹腔注射虫萤光素酶底物,浓度为15 mg/m L,剂量为150μL/只,底物作用时间5 min,5 min后予以异氟烷吸入麻醉5 min,然后再放入主机箱内,曝光10 s后进行图像拍摄。构建原位模型,于小鼠左肺 注射等比 例的LLC- 虫荧光素 本酶细胞(0.5×105个)与matrigel基质胶混悬液共100μL。同一只小鼠按上述方法造模后分别于术后的第4、11、18天进行活体成像。
2 结果
2.1 稳定表达虫萤光素酶的 LLC 细胞系构建完成
由于EGFP-FFLuc-Hy Tk-p MG^pac载体在同一启动子下表达EGFP(增强型绿色荧光蛋白)和虫荧光素本酶,因此,EGFP的表达代表了虫荧光素本酶的表达。如图1(封三)所示,LLC细胞在转染EGFP-FFLucHy Tk-p MG^pac质粒DNA后 , 稳定表达EGFP, 表示稳定表达虫荧光素本酶的LLC细胞系构建成功,可以用于进一步研究。
2.2 小动物活体成像结果
将模型小鼠于造模后的第4天按照上述操作方法进行第1次活体成像,结果如图2(封三),共造模17只小鼠 ,除第8号小鼠出现腹腔种植转移外 ,其他16只小鼠均在胸部出现明显荧光素酶信号 , 表示在胸部有肿瘤形成,其造模成功率为94%。
2.3 病理学检测
小鼠活体成像结果说明在小鼠胸部有肿瘤形成,进行病理检查进一步明确肿瘤在肺组织内而非在胸腔内。按照常规病理切片流程,取材:将10只小鼠于术后第4天活体成像后处死并立即进行活体取材,取出肺组织,此时肉眼观察肺组织尚未见明显的病变表现;接着使用10%中性福尔马林溶液肺部灌流、固定;二甲苯透明、浸石蜡、包埋、切片、HE染色:二甲苯脱蜡2次,各10 min,无水乙醇漂洗二甲苯2次,各1 min;95%酒精1次,1 min,90% 酒精1次 ,1 min,85% 酒精1次 ,1 min,自来水冲洗2 min;苏木精染色4 min,自来水冲洗1 min;1%盐酸酒精分化20 s,自来水冲洗1 min, 伊红染色1 min, 自来水洗30 s; 梯度酒精脱水:70%酒精1次 ,20 s,90%酒精1次,20 s,95%酒精2次,各1 min,无水乙醇2次,各2 min;二甲苯透明2次,各3 min;中性树胶封片。显微镜下鉴定小鼠左肺肿瘤病灶,有荧光信号的左肺经病理学检测后证实为肿瘤组织(图3,封三)。
2.4 模型小鼠大体解剖结果
于小鼠术后第18天进行第3次活体成像,成像后给予小鼠脱颈处死并对其进行解剖,观察模型小鼠肿瘤生长及转移情况,如图4(封三),可见有荧光信号的左侧肺部也正是解剖后左肺背部(进针部位)有明显深红色或白色肿瘤组织的地方,质地较硬,贯穿于整个左肺,在右肺、对侧胸腔还可见散在的白色肿瘤组织。
2.5 模型小鼠肿瘤形成及转移情况的监测
模型小鼠于术后第4天进行第1次活体成像,于第11天进行第2次活体成像,于第18天进行第3次活体成像,以监测小鼠肿瘤形成及转移情况。3次活体成像的条件,如底物浓度、底物作用时间、麻醉时间、曝光时间、标尺等均为一致,成像结果如图5(封三),可见模型小鼠在没有药物干预的情况下,肿瘤细胞的荧光信号强度显现出时间依赖性(随着时间增加而增强、增多),从第4天左肺较弱的蓝色信号,至第18天整个胸廓出现红色的强信号 , 说明本研究采用的虫萤光素酶标记的LLC细胞所进行的生物发光法确实可以较好地监测小鼠体内肿瘤形成及转移情况。
3 讨论
3.1 原位模型构建四大关键点
第一,尽可能保证每只小鼠所注射的细胞数量的均一性。手术时所用的matrigel基质胶是为了让肿瘤细胞固定在局部,成为其生长的支架,有助于形成单一病灶,但matrigel基质胶具有遇高温凝固的不可逆性,所以据笔者经验,须事先将细胞悬液与matrigel基质胶在超净台中等比例充分混匀后抽吸入胰岛素注射器内(注意:凡与matrigel基质胶接触的用品均需预冷),以确保每只小鼠注射的细胞数量的一致性,抽吸完毕后立即将注射器插入事先准备好的冰盒中。第二,在手术过程中最为关键的就是定位,手术切口在左腋前线下1 cm处,切口为横向切口,首先找到心脏搏动处,其颜色为随心脏起伏的暗红色组织,与心脏平行的左侧就可看见与搏动的暗红色组织形成对比的白色实质性的左肺,此时方可进针。第三,如图2所示,8号小鼠于造模后第4天进行第1次活体成像时荧光信号布满了整个腹腔,说明注射器可能刺进了心脏,导致细胞与matrigel基质胶的混悬液直接参与了血液循环,所以强调进针的深度以3 mm为佳(小鼠肺叶厚度在3 mm左右)。第四,左肺进针注射完毕后,不要急于出针,需停顿5~10 s,以防混悬液渗漏被注射器带出。
3.2 肺癌原位模型的构建对中医药抗肿 瘤的意义
首先,从中医藏象理论出发,肺癌异位移植与原位移植在病位、病理变化上有很大的差别。有研究显示,两种不同的移植方式在肿瘤的形成过程中对缺氧的反应也表现出截然不同的结果[14]。而肺癌原位移植不仅可以制造出局部的肿瘤病变,而且还可以模拟肺脏受损后肺功能失常的一系列生理、病理变化,故原位移植模型更符合临床实际。其次,从中药作用的机制出发,不同的中药对各个脏腑经络有各自的指向作用,即所谓的“归经”,如治疗肺癌的常用化痰药物:天南星、半夏、鱼腥草、贝母、射干等,他们的“归经”都是肺脏,即这些药物在对肺脏其本身的病变有更好的治疗效果。有研究发现,有些中药对原位移植的肺癌模型小鼠有效但对皮下移植的模型小鼠效果差甚至无效,反之,有些中药可能对皮下移植的肿瘤效果好,而对原位肿瘤效果不佳,从而产生药物治疗效果的假阳性[15]。可见 ,采用异位移植模型得到的实验结果与临床应用的实际效果之间存在较大差距,而原位模型的建立可以很好地解决以上存在的问题。原位移植法不仅可提高肿瘤成瘤率,突显肿瘤的侵袭和转移特性,还可观察肿瘤血管的生成情况,从更大程度上模拟了人体肺部肿瘤的微环境[16],同时也提升了模型实验数据的可信度,故成为了研究关注的焦点。所以,肺癌原位模型的建立对于中医药抗肺癌无论是从理论角度还是从科研的角度来说都是至关重要的。
综上所述,本研究所构建的小鼠肺癌原位模型,因其只需剪开皮肤,不流血,创伤小,无手术死亡现象,且所需细胞数量少,成瘤率高,转移性好,操作简单,可重复性强,大幅度地提升了肺癌原位模型的成功率,同时还可利用小动物活体成像系统中的生物发光技术监测小鼠肿瘤形成及转移情况,为深入研究肺癌奠定了基础,也为中医药抗肺癌踏入国际舞台奠定了基础。
A:非小细胞肺癌细胞荧光强度 ;B:明场 ;C:荧光与明场合成
A 为小鼠造模后于术后第 4 天活体成像图;B 为该小鼠肺组织病理检查结果
A、B、C 均为小鼠术后活体成像图;a、b、c 分别为小鼠 A、B、C 术后左肺肿瘤组织
摘要：目的肺癌的发病率和病死率居高不下,而目前用于实验研究的肺癌动物模型存在较大的局限性,故本研究认为建立一个稳定、类似于人体肿瘤微环境的肺癌原位模型是深入研究肺癌的基础。方法 直接将稳定表达虫萤光素酶的鼠Lewis肺腺癌细胞与基质胶的混悬液注射于C57 BL/6小鼠左肺,无需打开胸腔只需将小鼠左胸部皮肤剪开约1 cm小口,定期利用小动物活体成像系统中的生物发光技术监测小鼠肿瘤形成及转移情况,并将小鼠处死后立即进行肺部组织活体取材,采用石蜡包埋、切片、HE染色做出病理学诊断。结果 采用肺内注射的原位造模法成瘤率高,Lewis肺腺癌细胞数量只需0.5×105个即可成瘤,成功率达90%以上,且利用活体成像系统中的生物发光技术能监测到模型小鼠肿瘤可转移至对侧胸廓、对侧肺组织、双侧腋下及腹股沟淋巴结等。结论 注射虫萤光素酶稳定表达的鼠Lewis肺腺癌细胞与基质胶混悬液构建的肺癌原位模型所需细胞数量少,成瘤率高,无手术死亡风险,转移性好,监测方便,操作简单且可重复性高,为深入研究肺癌提供了良好模型。
小鼠抑郁症模型 篇4
组蛋白2A变异体 ( histone family 2A variant, H2AX) 是核心组蛋白H2A的一个亚型。有研究发现,DNA双链断裂后可诱导位于丝氨酸139位C端保守区域内的H2AX磷酸化,形成 γH2AX。利用激光共聚焦显微镜可直接观测到细胞核内 γH2AX焦点数,直观地了解DNA双链断裂的情况,并进行DSBs的定性、定位及定量。目前,采用 γH2AX特异性抗体进行的免疫荧光检测方法已成为衡量DSBs发生的金标准[5,6,7],γH2AX产生的数量可判断DNA双链断裂的程度[8,9]。J. A. Downs[10]的研究表明, DSBs修复后,γH2AX蛋白存在一个去磷酸化过程, γH2AX焦点逐渐消失,故可通过观察 γH2AX蛋白焦点数量的减少情况来检测DNA双链断裂损伤的修复情况。毛细血管共济失调突变基因( ataxiatelangiectasia mutated,ATM) 是一种在感应和传递DNA双链断裂损伤信号、启动损伤DNA修复中起重要作用的功能蛋白。DSBs诱导H2AX的磷酸化 主要是通 过ATM激酶来介导的,感应到损伤后,ATM丝氨酸1 981位发生自动磷酸化而激活,使ATM靶向下游底物H2AX、BRCA1、53BP1等[11]。有研究发现,其他类型的DNA损伤也可通过ATR和DNA - PK形成 γH2AX,但ATM所介导的 γH2AX的形成必定与DSBs的存在有关。因此,同一细胞内活化的ATM和 γH2AX同时出现是DSBs存在的强有力证据[12,13]。
H2O2是一种重要的化学性DNA诱裂剂,已成为生命科学研究细胞氧化损伤的重要工具[14]。为了研究DNA损伤修复相关基因在小鼠胚胎DNA损伤修复中的作用,本试验以H2O2为DNA损伤诱导剂构建小鼠胚胎DNA损伤模型,观察胚胎氧化应激后DNA损伤指标 γH2AX和磷酸化ATM ( Phosphorylation - ATM,ρATM) 蛋白的表达变化,以期为进一步了解胚胎DNA损伤修复机制奠定基础。
1材料
1.1试验动物
FVB小鼠,亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室自繁,母鼠群养,公鼠独笼饲养,用颗粒饲料饲喂,自由采食、饮水,饲养室温为21 ~ 25 ℃,选用健康、3 ~ 5周龄的FVB母鼠进行超数排卵。
1.2主要试剂
PMSG,购自上海市计划生育研究所; HCG,购自宁波第二激素厂; 过氧化氢( 3% H2O2) 和Triton X 100,购自Sigma公司。
一抗Phospho - Histone H2A. X( ser139) ( 20E3) 兔单克隆抗体( Cell Signaling) ,配成10% 母液,使用时稀释度为1∶200; 一抗 ρATM( 10H11. E12) : SC 47739 ( SANTA CRUZ) ,配成10% 母液,使用时稀释度为1∶400。二抗荧光素标记羊抗兔Ig G抗体( Millipore) ,使用时稀释度为1 ∶1 000。荧光素标记羊抗鼠Ig G抗体( Cell Signaling) ,使用时稀释度为1 ∶ 200,二抗均避光保存于4 ℃冰箱。
小鼠胚胎体外操作液M2,参照《小鼠胚胎操作实验手册》( 第3版) 的方法进行配制; 透明质酸酶 ( HYT) ( 300 mg /L) ,将0. 3 g HYT溶于100 m L M2中配制而成; 小鼠胚胎培养液为KOSM和KOSM( - ) ( 去除KOSM配方中的L - 谷氨酞胺) ,以KOSM( - ) 为基础液,分别配制含有1. 5,1. 8,2. 1,2. 4 μmol/L H2O2的小鼠胚 胎培养液,标记为KOSM ( - ) + 1. 5 μmol / L H2O2、KOSM( - ) + 1. 8 μmol/L H2O2、KOSM ( - ) + 2. 1 μmol / L H2O2、KOSM ( - ) + 2. 4 μmol / L H2O2。
1.3主要仪器
实体显微镜( SMZ645) ,购自Nikon公司; 激光扫描共聚焦显微镜( LSM510 meta) ,购自Leica公司。
2方法
2. 1试验动物分组
按小鼠胚胎培养液所含的H2O2浓度梯度进行分组,分别为KOSM ( - ) + 1. 5 μmol/L H2O2组、 KOSM( - ) + 1. 8 μmol / L H2O2组、KOSM ( - ) + 2. 1 μmol / L H2O2组、KOSM( - ) + 2. 4 μmol/L H2O2组,以KOSM组及KOSM( - ) 为对照组。
2. 2小鼠的超数排卵
采用PMSG - HCG法进行超数排卵。取3 ~ 4周龄的雌性小鼠,12: 00注射5 IU的PMSG( 0. 1 m L) 到小鼠腹腔,48 h后再注射5 IU的HCG( 0. 1 m L) 。注射HCG后立即将母鼠放入公鼠笼中,公母鼠按1∶1比例交配过夜,公鼠为2 ~ 3月龄。
2. 3受精卵的体外培养
注射HCG 22 ~ 24 h后,脱颈椎处死小鼠,迅速剥离出输卵管,在实体显微镜下用一次性1 m L注射器在膨大部处撕开一个小口,受精卵团自动溢出,移入HYT( 300 μg / m L) 中静置2 ~ 3 min; 待颗粒细胞脱落后,收集形态正常的受精卵,用M2冲洗2 ~ 3遍,再用小鼠胚胎培养液冲洗2 ~ 3遍,移入预先平衡好的各试验组 的小鼠胚 胎培养盘 中,置于饱和 湿度、 37 ℃ 、5% CO2的培养箱中培养24 h; 于实体显微镜下观察记录各试验组2 - 细胞胚胎的发育情况,计算分裂率; 96 h后再观察并记录其囊胚的发育情况,计算囊胚率。
2. 4免疫荧光检测
分别收集各试验组体外培养的1 - 细胞和2 - 细胞期小鼠胚胎,放于含4% 多聚甲醛的PBS中室温固定30 min; 在1% Triton X - 100 ( 用D - PBS配制) 中透化处理10 min; 1% BSA室温孵育1 h; 加一抗Phospho - Histone H2A. X( ser139) ( 20E3) 单克隆抗体或一抗 ρATM( 10H11. E12) 于4 ℃ 孵育过夜; 次日, 37 ℃ 孵育20 min; 用对应的二抗荧光素标记羊抗兔Ig G或二抗荧光素标记羊抗鼠Ig G,于室温避光孵育1. 5 h; 制成片子,在激光共 聚焦显微 镜下观察 γH2AX或 ρATM的表达情况。每组试验至少重复3次,每次取小鼠胚胎20 ~ 30个。免疫组化试验设置空白组( 以1% BSA替代一抗和二抗) 、阴性对照组1 ( 以1% BSA替代一抗,二抗不变) 、阴性对照组2( 以1% BSA替代二抗,一抗不变) 。
2.5数据分析
试验数据采用SPSS18. 0软件进行差异显著性分析,P < 0. 05为差异显著。
3结果与分析
3.1H2O2对小鼠胚胎发育的影响
用含不同浓度H2O2的培养液体外培养小鼠胚胎,观察H2O2处理对小鼠胚胎发育能力的影响,结果表明: 与KOSM对照组相比,KOSM( - ) 组小鼠胚胎的分裂率下降,但无显著差异( P > 0. 05) ; 囊胚率显著下降( P < 0. 05) 。与KOSM( - ) 对照组相比,随着H2O2浓度的增加,小鼠胚胎的分裂率和囊胚率呈下降趋势。从1. 8 μmol/L H2O2浓度开始,小鼠胚胎的分裂率和囊胚率均显著下降 ( P < 0. 05) ; 2. 1, 2. 4 μmol / L H2O2处理组间胚胎的分裂率和囊胚率无显著差异,2. 4 μmol/L H2O2处理的胚胎不能发育到囊胚期。以上结果说明1. 5 ~ 2. 4 μmol/L H2O2处理对小鼠早期胚胎发育均有影响,见表1。
3.2小鼠胚胎γH2AX和ρATM表达的检测
分别收集KOSM、KOSM( - ) 和1. 5,1. 8,2. 1, 2. 4 μmol / L H2O2处理组体外培养的1 - 细胞、2 - 细胞期胚胎,采用免疫荧光技术检测 γH2AX和 ρATM的表达情况,结果表明,KOSM和KOSM( - ) 对照组中2 - 细胞期胚胎的 γH2AX焦点数多于1 - 细胞期胚胎,ρATM在两对照组的两个时期胚胎中均未检测到。1. 5,1. 8 μmol/L H2O2处理组1 - 细胞期胚胎中均未检测到 γH2AX和 ρATM; 两处理组的2 - 细胞期胚胎表达 γH2AX,未检测到 ρATM。2. 1,2. 4 μmol/L H2O2处理组的1 - 细胞和2 - 细胞期胚 胎均有 γH2AX和 ρATM表达,其中2. 4 μmol / L H2O2处理组的两个时期胚胎 γH2AX焦点数高于2. 1 μmol/L H2O2处理组,说明2. 1,2. 4 μmol/L H2O2处理可诱导小鼠胚胎产生明显的DSB现象( 见295页彩图1、 图2) 。
注: 同列数据肩标字母不同表示差异显著( P < 0. 05) ,含有相同( P > 0. 05) 。
4讨论
H2O2作为一种化学性DNA诱导剂,能直接攻击DNA使其断裂或降解,产生自由基HO·,故H2O2常被用于建立DNA氧化损伤模型。R. G. Allen等[15]认为纳摩尔水平的活性氧可促进细胞增生,微摩尔水平的活性氧可导致细胞凋亡,毫尔摩水平的活性氧可引起细胞损伤死亡。在用H2O2处理卵母细胞及早期胚胎时,常采用相对较低的浓度[16,17]。韩荣勋[18]在小鼠胚胎发育的不同阶段添加不同浓度H2O2( 1. 5, 1. 8,2. 1,2. 4,2. 6 μmol / L) 处理时发现,随着外源性H2O2浓度的增高,囊胚发育率显著降低,外源性H2O2诱发小鼠1 - 细胞期胚胎体外发育阻滞的最低浓度是2. 1 μmol/L。本研究结果表明: 随着H2O2处理浓度的增加,小鼠胚胎的分裂率和囊胚率均呈逐渐下降趋势。当H2O2浓度为2. 1 μmol/L时,胚胎的分裂率和囊胚率显著低于对照组( P < 0. 05) ; 当H2O2浓度为2. 4 μmol/L时,小鼠胚胎发育停滞于2 - 细胞期,这与韩荣勋[18]的报道相一致。
ROS引起的氧化损伤对胚胎发育的影响是多方面且机制极其复杂,对胚胎氧化应激性DNA损伤的耐受情况如何,目前所知甚少。DSBs的形成可诱导H2AX组蛋白C端丝氨酸139位大量而迅速的磷酸化形成 γH2AX,其可作为评估各种化学或压力作用诱导的DNA双链断裂的生物学标志物[17,18]。有研究发现,H2AX可在H2O2引起的成熟精子氧化应激性DNA损伤处发生磷酸化,并发现Rad50和53BP1同时出现在损伤处,对DNA损伤产生了应答反应; 与体细胞不同的是,这些修复蛋白并没有发挥有效的DNA修复功能,推测它们在DNA损伤修复的机制中可能发挥着其他重要的作用[19]。S. K. Adiga等[20]采用3 Gy照射小鼠1 - 细胞和2 - 细胞胚胎后发现,在2 - 细胞期以后的胚胎细胞内检测到 γH2AX焦点, 因而认为 γH2AX在2 - 细胞期以后才参与胚胎细胞的DNA修复。本研究发现,未处理的对照组小鼠胚胎在2 - 细胞期的 γH2AX焦点数多于1 - 细胞期胚胎,这与S. K. Adiga等[20]的发现相一致。
H2AX的磷酸化与PI3K家族成员ATM、ATR及DNA - PK有关,DSBs所诱导的 γH2AX的形成多是由ATM所介导的; 因此,同一细胞内活化的ATM和 γH2AX同时出现是DSBs存在的强有力证据[13,14], 相关研究中也均是采用免疫荧光方法检测H2AX和ATM的磷酸化来监测DNA的损伤情况[21,22,23,24,25,26,27]。本研究分析了不同H2O2处理组早期胚胎的 γH2AX及 ρATM表达情况,以作为DSB的判断指标,结果表明: γH2AX和 ρATM在1. 5,1. 8 μmol / L H2O2处理组的1 - 细胞期胚胎中均未检测到; 2 - 细胞期胚胎表达 γH2AX,未检测到 ρATM。 当H2O2浓度为2. 1, 2. 4 μmol / L时,小鼠1 - 细胞和2 - 细胞期胚胎中可检测到 γH2AX和 ρATM的表达,且 γH2AX焦点数较多,说明过高的H2O2处理会导致胚胎DSBs现象增多。以上结果说明,2. 1,2. 4 μmol/L H2O2处理可诱导小鼠胚胎产生明显的DSB现象,2. 1 μmol/L H2O2处理为较适宜的诱导条件。
注: 浅色图是常光下拍摄的,深色图是激光扫描后拍摄的。
摘要：为了研究胚胎DNA损伤修复机制,试验以H2O2为DNA损伤诱导剂,建立小鼠胚胎DNA氧化损伤模型,采用不同浓度H2O2培养小鼠受精卵,观察其对小鼠胚胎发育能力的影响;再通过免疫荧光方法检测γH2AX和ρATM蛋白的表达状况,以判断H2O2处理所导致的胚胎DNA损伤情况及较适宜的诱导条件。结果表明:1.5~2.4μmol/L H2O2处理对小鼠胚胎发育能力具有影响,与KOSM(-)对照组相比,H2O2处理组小鼠胚胎的分裂率、囊胚率呈下降趋势,其中1.8~2.4μmol/L H2O2处理组的胚胎分裂率、囊胚率呈显著下降趋势(P<0.05)。免疫荧光法检测发现KOSM(-)对照组中,2-细胞期胚胎的γH2AX焦点数多于1-细胞期胚胎,ρATM在两个时期的胚胎中未检测到。γH2AX和ρATM在1.5,1.8μmol/L H2O2处理组的1-细胞期胚胎中均未检测到;2-细胞期胚胎表达γH2AX,未检测到ρATM。2.1,2.4μmol/L H2O2处理组的1-细胞和2-细胞期胚胎均有γH2AX和ρATM表达,其中2.4μmol/L H2O2处理组两个时期胚胎的γH2AX焦点数多于2.1μmol/L H2O2处理组。说明1.5~2.4μmol/L H2O2处理会影响小鼠胚胎体外发育能力,2.1,2.4μmol/L H2O2处理可诱导小鼠胚胎发生DNA双链断裂现象。
小鼠结肠癌肝转移模型的构建 篇5
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
4~6周龄体质量20~24g的BALB/C小鼠雄性(♂)81只,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,动物许可证号:京动许字(2000)第004号总049号,在Ⅱ级动物实验室饲养。
1.1.2 瘤株
小鼠结肠癌C26细胞株(美国引进,广安门医院肿瘤实验室惠赠)。经3次皮下接种传代后,无菌条件下摘取瘤体,生理盐水洗涤,剪成小块,匀浆,离心后取沉淀,反复3次,培养于10%新生牛血清和RPMI1640培养液(含青霉素100U/m L、链霉素100U/m L),置37℃、含5%CO2培养箱中3d,每日换液。将细胞液机械吹打成单个细胞,离心取沉淀,加生理盐水调整细胞浓度为7×105/m L,观察细胞活力>95%,备用。
1.2 方法
1.2.1 脾脏注射切脾法
随机选取39只小鼠称重,采用0.5%的戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔内注射麻醉,3~5min麻醉成功后,用胶布固定小鼠于手术台上。安尔碘皮肤消毒,左侧腋后线肋缘下纵行切口,长0.5~1cm,进腹后于腹外侧找到柳叶状脾脏,牵出腹腔外,用1m L注射器从脾下极进针,将瘤细胞液0.2m L注射于脾内,拔针后,酒精棉球按压针眼,轻轻按揉脾脏5min,使瘤细胞经脾静脉进入肝脏,注射区苍白隆起消失后,结扎脾蒂,切除脾脏,查无出血,依次间断缝合肌肉、皮肤关腹。术后继续在Ⅱ级动物实验室饲养。
1.2.2 脾脏注射保脾法
造模小鼠42只称重,采用0.5%的戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔内注射麻醉,3~5min麻醉成功后,用胶布固定小鼠于手术台上。安尔碘皮肤消毒,左侧腋后线肋缘下纵行切口,长0.5~1cm,进腹后于腹外侧找到柳叶状脾脏,牵出腹腔外,用1m L注射器从脾下极进针,将瘤细胞液0.2m L注射于脾内,拔出针头后酒精棉球压迫注射部位1~2min,查无出血,依次间断缝合肌肉、皮肤关腹。
造模后死亡1只,考虑失血过多致死。
2 结果
造模后15d内自然死亡小鼠35只,切脾组21只,保脾组14只,于第12天处死小鼠23只,切脾组8只,保脾组15只,第15天将剩余小鼠22只全部处死,切脾组10只,保脾组12只。切脾小鼠自然生存期11~15d,平均(13.05±0.71)d,保脾小鼠自然生存期9~15d,平均(11.64±1.49)d。
尸检小鼠肝脏均有转移,转移率为100%。切脾小鼠肝各叶皆布满大小不一的瘤结节,大部分小鼠肝脏无正常肝组织,完全被肿瘤占据,肝重多3.5g以上,保脾小鼠脾内肿瘤巨大,肝内转移灶较少,肝脏形态、重量无明显变化,大多数为散在的米粒大小瘤结节转移,最大瘤结节为0.8×0.5cm,肝重多为0.8g左右(图1)。
3 讨论
结肠癌是一种常见恶性肿瘤,发病率在世界范围内为恶性肿瘤的第3位,肝脏是结肠癌常见的转移部位,15%~25%的患者在确诊已发生肝转移,20%~35%的患者转移灶仅出现在肝脏,50%~70%的晚期结肠癌患者出现肝转移。结肠癌肝转移是结肠癌患者死亡的主要原因,因此,结肠癌肝转移的治疗日益受到临床的重视。而寻找合适的动物模型可以为结肠癌肝转移的研究提供良好的实验基础。
Kozlowski等[1]提出研究肿瘤肝脏转移的最佳模式是从脾脏内植入瘤细胞,许勤等[2]同法用BALB/C小鼠脾内注射小鼠结肠腺癌细胞(CT26)造模成功率100%。左国华等[3]用BALB/C-nu/nu小鼠脾内注射人结肠癌低分化腺癌细胞株LS174T制造肝转移模型,成功率也达到100%。韩斌[4]将小鼠结肠癌细胞(CT26)悬液接种于615小鼠脾被膜下建立结肠癌肝转移模型,结果肝转移发生率为93.33%。
脾脏注射瘤细胞液造模模拟了结肠癌根治术后血行转移肝脏的途径和过程,造模成功率高。脾脏注射后保脾小鼠肝转移率为100%,但是,肿瘤多为散在的瘤结节,数目较小、体积较小,可能无法满足较大组织量的检测要求。同时,由于脾内肿瘤较大,小鼠常较早死于脾内肿瘤,无法满足多个时间点检测的需要。脾脏注射瘤细胞液切脾法则可获得转移肿瘤组织较多,能满足各种检测方法取材的需要,尤其是基因芯片检测取材需近500mg组织,且小鼠生存时间较保脾组长,可以满足多个时间点的取材。另外,在切断脾蒂前将脾脏完全暴露,便于进针注射及结扎、切断脾蒂,避免了脾脏大出血,减少动物造模的死亡率。
因此,小鼠结肠癌肝转移模型的建立以脾脏注射瘤细胞液后切脾法最佳,尤其适用于结肠癌肝转移的基因组表达谱研究,可同时满足检测组织量及选取多个时间点的要求。
参考文献
[1]Kozlowski JM,Fidler IJ,Campbell DE,et al.Metastatic behavior of human tumor cell lines grown in the nude mouse[J].Cancer Res,1984,44(8):3522-3529.
[2]许勤,吴文溪,马利民,等.小鼠结肠腺癌肝转移模型的建立[J].实用癌症杂志,2000,15(5):456-457.
[3]左国华,葛海燕.人结肠癌裸小鼠肝转移模型的建立[J].中华实验外科杂志,1999,16(4):373.
小鼠结肠癌远处转移模型的构建 篇6
1.1 材料
1.1.1 实验动物
4~6周龄体质量20~24g的BALB/C小鼠雄性 (♂) 20只, 雌性 (♀) 15只, 由北京维通利华实验动物技术有限公司提供, 动物许可证号:京动许字 (2000) 第004号总049号, 在II级动物实验室饲养。
1.1.2 瘤株
小鼠结肠癌C26细胞株 (美国引进, 广安门医院肿瘤实验室惠赠) 。经3次皮下接种传代后, 无菌条件下摘取瘤体, 生理盐水洗涤, 剪成小块, 匀浆, 离心后取沉淀, 反复3次, 培养于10%新生牛血清和RPMI1640培养液 (含青霉素100单位/m L、链霉素100单位/m L) , 置37℃、含5%CO2培养箱中3d, 每日换液。将细胞液机械吹打成单个细胞, 离心取沉淀, 加生理盐水调整细胞浓度为7×105/m L, 观察细胞活力>95%, 备用。
1.2 方法
1.2.1 尾静脉注射瘤细胞液造模
取♂5只、♀10只, 将瘤细胞液0.2m L于尾静脉注入。
1.2.2 脾脏注射瘤细胞液造模
♂15只小鼠称重, 采用0.5%的戊巴比妥钠 (50mg/kg) 腹腔内注射麻醉, 3~5min麻醉成功后, 用胶布固定小鼠于手术台上。安尔碘皮肤消毒, 左侧腋后线肋缘下纵行切口, 长0.5~1cm, 进腹后于腹外侧找到柳叶状脾脏, 牵出腹腔外, 用1m L注射器从脾下极进针, 将瘤细胞液0.2m L注射于脾内, 拔针后, 酒精棉球按压针眼, 查无出血, 依次间断缝合肌肉、皮肤关腹。
1.2.3 肠壁内注射瘤细胞液造模
将♀5只小鼠称重, 采用0.5%的戊巴比妥钠 (50mg/kg) 腹腔内注射麻醉, 3~5min麻醉成功后, 用胶布固定小鼠于手术台上。安尔碘皮肤消毒, 取腹正中切口, 长约1.5cm, 暴露腹腔, 将瘤细胞液0.2m L注射于肠壁内, 查无出血, 依次间断缝合肌肉、皮肤关腹。因小鼠肠管极薄, 估计此法造模困难, 仅行5例造模。
2 结果
2.1 尾静脉注射小鼠
肺转移发生率为100%, 小鼠生存时间12~16d, 平均荷瘤生存时间为 (14.49±1.03) d。尸检腹腔未见转移, 胸腔内见血性胸水, 肺布满白色瘤结节, 最大直径0.2cm。
2.2 脾内注射小鼠
肝转移发生率100%, 小鼠生存时间9~15d, 平均荷瘤生存时间 (12.49±0.93) d。尸检见大量血性腹水, 脾内布满白色瘤结节, 第10天肝脏可见散在转移瘤结节, 最大0.2cm×0.2cm。第15天肝内布满转移瘤结节, 最大0.5cm×0.5cm, 肺内可疑有微小转移。
2.3 肠壁内注射小鼠
尸检腹腔见明显血性腹水, 肝脾未见转移, 肠管上可见1.5cm×1.5cm肿瘤, 肺内可疑有微小转移。
3 讨论
结肠癌在世界范围内是发病率居于第3位的恶性肿瘤, 远处转移主要是肝脏, 约50%的患者会发生肝脏转移, 约有30%的患者在手术前已有B超或CT无法检测的阴匿性肝转移。其次是肺、脑、骨的转
2北京中医药大学东直门医院 (100700) 移。因此, 寻找合适的动物模型可以为结肠癌的研究提供良好的实验基础。
Kozlowski等[1]提出研究肿瘤肝脏转移的最佳模式是从脾脏内植入瘤细胞, 许勤等[2]同法用BALB/C小鼠脾内注射小鼠结肠腺癌细胞 (CT26) 造模成功率100%。左国华等[3]用BALB/C-nu/nu小鼠脾内注射人结肠癌低分化腺癌细胞株LS174T制造肝转移模型, 成功率也达到100%。韩斌[4]将小鼠结肠癌细胞 (CT26) 悬液接种于615小鼠脾被膜下建立结肠癌肝转移模型, 结果肝转移发生率为93.33%。结肠癌肺转移的模型未见文献报道。
根据以上文献及临床结肠癌转移途径选取了以上3种造模方法, 其中尾静脉法有肺转移, 无肝脏转移, 结肠癌肺转移模型建立成功;肠壁内注射模拟人体大肠癌的转移途径, 希望形成肠系膜淋巴结到肝脏转移的模型, 但造模难度较大, 可行性差, 造模小鼠未见肝内转移;脾脏注射可见肝内转移, 结肠癌肝转移模型建立成功。
摘要：目的 建立小鼠结肠癌远处转移模型。方法 将小鼠结肠癌细胞 (C26) 悬液分别接种于BALB/C小鼠脾被膜下、肠壁内和尾静脉内, 于术后第10、第15天处死35只小鼠, 观察胸腔及腹腔内肿瘤生长情况, 其余小鼠待其自然死亡, 观察生存天数, 解剖并记录远处转移情况。结果 尾静脉注射肺转移发生率为100%, 小鼠生存时间1216d, 平均荷瘤生存时间为 (14.49±1.03) d。脾内注射肝转移100%, 小鼠生存时间915d, 平均荷瘤生存时间 (12.49±0.93) d。结论 成功建立了小鼠结肠癌肝、肺转移模型, 为筛选抗肿瘤药物和研究结肠癌转移行为提供了有用的模型, 具有一定的实验价值。
关键词：结肠癌肝转移,结肠癌肺转移,动物模型
参考文献
[1]Kozlowski JM, Fidler IJ, Campbell DE, et al.Metastatic behavior of human tumor cell lines grown in the nude mouse[J].Cancer Res, 1984, 44 (8) :3522.
[2]许勤, 吴文溪, 马利民, 等.小鼠结肠腺癌肝转移模型的建立[J].实用癌症杂志, 2000, 15 (5) :456-457.
[3]左国华, 葛海燕.人结肠癌裸小鼠肝转移模型的建立[J].中华实验外科杂志, 1999, 16 (4) :373.
小鼠利血平法脾虚证模型的建立 篇7
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物
昆明种SPF级健康小鼠, 7~8周龄, 雌、雄各半, 体重 (20±2) g, 由甘肃中医学院SPF实验中心提供。饲养于甘肃中医学院实验动物中心, 常规饲养3天以适应环境。
1.1.2 实验药物及试剂
参苓白术散:山西华康制药有限公司 (批准文号:Z14020346) ;利血平:广东邦民制药厂有限公司 (批准文号:H44021892) ;D-木糖。小鼠胃泌素 (GAS) 酶联免疫 (ELISA) 检测试剂盒 (美国RD公司, REF:DIE20384) ;小鼠D-木糖测定试剂盒 (南京建成, 批准文号:20110504) 。
1.2 方法
1.2.1 造模方法及给药
将小鼠雌雄分笼饲养, 保持适宜的环境 (SPF实验动物中心, 室温18℃~29℃, 相对湿度50%~80%, 空气洁净度:相当于1万级) , 适应性喂养3天后开始造模。方法如下:正常组小鼠注射等量生理盐水, 模型组给与利血平注射液, 每只小鼠按0.1mg/kg于背部皮下注射, 1次/d, 连续17d。第11~17日治疗组同时灌服参苓白术散, 1次/d, 低剂量组为临床等效剂量的5倍, 1.5g/kg;高剂量组为临床等效剂量的10倍, 3g/kg, 模型组灌服生理盐水。正常饮食饮水, 造成脾虚模型, 实验时间共17d。
1.2.2 动物分组
造模前随机设正常对照组20只和造模组60只。造模成功后将造模组小鼠再随机分为模型组, 参苓白术散高、低剂量组, 共4组。
1.2.3 模型观测标志
实验期间, 每日上午称体重、记录食量等, 并观察精神状态、活动状况、皮毛色泽等状况。小鼠出现以下表现就视为造模成功:①大便溏泄;②食少纳呆;③消瘦, 体重减轻;④神态萎靡, 毛色无光泽;⑤蜷缩聚堆;⑥易疲劳, 饮食及饮水量下降;血清D-xylose和GAS水平降低。
1.2.4 血清D-xylose检测
禁食24h, 按10mL/kg剂量给予小鼠3%D-木糖溶液灌服, 1h后采用摘眼球取血, 4℃静置2h后以5 000r/min离心10min取上清液, 备用。按照D-木糖试剂盒说明书的操作步骤进行, 应用比色分析法测定各组小鼠血清D-xylose含量。
1.2.5 血清GAS测定
禁食24h后采用摘眼球取血, 4℃静置2h后以5 000r/min离心10min取上清液, 备用。按照酶联免疫检测试剂盒说明书的操作步骤进行, 应用 ELISA法测定各组小鼠血清GAS含量。
1.2.6 统计学方法
计量资料以均数±标准差undefined表示, 并用IBM SPSS19.0统计软件对各组数据进行t检验及方差分析, P<0.05为有统计学差异, P<0.01为有显著统计学差异。各组小鼠实验指标比较见表1、表2。
注:模型组与正常组比较, *P<0.01。
注:和模型组比较, *P<0.05, ▲P<0.01。
2 结果
正常对照组:双眼明亮有神, 活动灵活, 皮毛顺滑有光泽, 饮食、饮水适中, 大便正常;模型组:造模第3天小鼠皮毛失去光泽、拱背、扎堆、活动减少, 随后出现皮毛枯槁、倦卧、嗜睡、便塘、肛周污秽、食量减少 (P<0.01) 、消瘦、干瘪等症状, 血清D-木糖及胃泌素均明显降低 (P<0.01) 。参苓白术散高、低剂量治疗组:治疗后第4天起, 一般情况逐渐好转, 进食量增多, 活动逐渐增加。
3 讨论
中医作为我国的传统医学已有数千年的历史, 随着现代医学的发展, 中医也进入现代化的发展历程。中医基础实验是传统医学走向现代化的桥梁, 而各种中医证型的动物模型就成为中医基础研究的基石。能否模拟出中医的各种证候的动物模型就成为研究成功与否的关键。中医证候动物模型是以中医理论为指导, 在动物身科学的复制, 以实验动物、器官、组织、细胞为研究对象, 建立的具有人类病证现象的动物模型。通过对动物模型的研究, 来揭示中医病症的本质, 从而推动中医的发展。
脾虚证是临床较为常见的。脾位于中焦, 在五脏阴阳中属阴中之至阴, 在五行中属土, 主要生理功能是主运化水谷、水液、输布水谷精微, 为“气血生化之源”。生命活动的继续和精气血津液的化生和充实, 皆依赖脾所化生的水谷精微以濡养, 故称脾为“后天之本”。素体脾虚或饮食不节、情志因素、劳逸失调, 药、食损脾或慢性肾病患者湿邪久居, 损伤脾气等原因引起脾的功能虚衰、生化之源不足。因脾胃是食物消化和吸收的脏器, 因此, 大多数的胃肠道病变都可出现或伴有脾虚。
本实验体系中所采用利血平的造模法不失为既简便易行且有较高成功率的方法, 利血平属于肾上腺能神经阻断剂, 用药后交感神经系统的功能受到遏制, 副交感神经系统的功能相对占优势, 于是出现如鼻粘膜血管扩张而鼻塞, 消化功能亢进而致大便次数增多、腹痛、腹泻、胃酸分泌增加、溃疡病等副作用。其表现和中医脾虚证有高度的相符性。基于利血平上述的药理作用, 基础实验中就采用该法建立脾虚模型。
从本实验结果可知, 参苓白术散低、高剂量组在治疗前出现了拱背、扎堆、倦卧、嗜睡、活动减少、便塘、食量减少、消瘦、干瘪等症状, 这说明本模型的复制符合脾虚证的临床特点[1]。在用经典的治疗脾虚证方剂的治疗下其便塘、食量减少、消瘦等症状都明显改善, 而模型组则无明显变化。在客观指标方面, 血清D-木糖吸收率是验证脾虚的经典指标[2], 用于检测小肠吸收功能;胃泌素是一种重要的胃肠激素, 它主要由胃窦, 胃底、十二指肠和空肠等处的G细胞分泌。当胃肠功能不全时, 胃泌素分泌紊乱[3,4];另外进食量的多少可直接反应胃肠功能。从实验结果可以看出, 脾虚模型小鼠血清D-木糖吸收降低明显;血清胃泌素亦明显降低。这些客观指标均符合中医脾虚的指标, 说明该方法建立脾虚证模型是成功的。
参考文献
[1]陈永辉.健脾止泻颗粒对脾虚泄泻患儿消化吸收与肠道局部免疫功能的影响[J].中国中西医结合消化杂志, 2000, 9 (2) :90.
[2]谷建钟, 郭勇.脾虚证荷瘤小鼠模型的建立[J].中华中医药学刊, 2011, 29 (4) :767-769.
[3]聂克, 王建华, 王汝俊.胃泌素与脾虚证关系的研究进展[J].广州中医药大学学报, 1999, 16 (1) :161.