小鼠肿瘤模型（精选7篇）
小鼠肿瘤模型 篇1
乳腺炎是奶牛最常见的产科疾病之一, 已成为影响奶牛养殖业发展的最严重疾病之一, 不仅危害奶牛健康, 降低产奶量, 影响奶的品质, 而且还降低奶牛的繁殖性能。引起奶牛乳腺炎的最主要的病原菌是金黄色葡萄球菌和无乳链球菌, 其中金黄色葡萄球菌危害最严重。本试验用从乳腺炎病牛奶样中分离的金黄色葡萄球菌人工诱发小鼠乳腺炎, 建立小鼠乳腺炎模型, 通过ELISA法测定乳腺组织中肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 含量的变化研究动物体乳腺感染情况, 从而为乳腺炎的发病机理和乳腺防御机制的研究提供依据。
1 材料
Balb/c系封闭群清洁级泌乳10 d的母鼠、普通肉汤、血液琼脂、营养琼脂、麦康凯琼脂、三糖铁琼脂、电热恒温水浴箱、电热鼓风干燥机、生化培养箱、普通离心机、微量进样器、直立式超低温冰箱, 均由河北农业大学实验室提供。
2 方法
2.1 细菌的培养和计数
将冷冻保存的金黄色葡萄球菌接种于普通肉汤, 37℃培养24 h;镜检无杂菌者接种于血液琼脂斜面, 37℃培养24 h;4℃冰箱中保存, 备用。攻菌前将血液琼脂斜面保存的菌种接种于营养琼脂平皿上, 37℃培养24 h;用生理盐水洗下菌苔, 3 000 r/min离心30 min;取沉淀用生理盐水制成细菌混悬液, 进行细菌计数, 根据计数结果配制成每50μL细菌悬液中含金黄色葡萄球菌1×103cfu。
2.2 试验动物分组与人工感染
将泌乳10 d的母鼠随机分为3组, 每组5只。A组为健康对照组, 不做任何处理;B组为生理盐水组, 每只母鼠的第4对乳房分别注入50μL灭菌生理盐水;C组为模型组, 每只母鼠的第4对乳房分别注入50μL细菌悬液 (含金黄色葡萄球菌1×103cfu) 。
分娩后泌乳10 d的母鼠于攻菌前1小时与仔鼠隔离, 用乙醚麻醉后保定于木板上, 第4对乳房皮肤用75%乙醇消毒。在体视显微镜下, 左手持镊子夹持固定母鼠乳头, 右手持接种器, 将注射端钝头毛细玻璃管从母鼠第4对乳头口轻轻插入乳头管内, 然后将50μL细菌悬液或灭菌生理盐水注入母鼠乳池内。
2.3 TNF-α含量的测定
分别在6, 12, 24, 48, 72小时时处死母鼠, 取出乳腺组织, 匀浆后放入冰箱中待用, 采用ELISA法测定乳腺组织中TNF-α的含量。
2.4 乳腺炎的判定标准
乳房出现肿胀, 颜色发红, 乳腺组织内细菌数大于1×105cfu/g且显微镜下观察乳腺组织出现明显病理变化者判为发病。根据每克乳腺组织中的细菌数可将乳腺感染程度分为:严重感染 (>1×108cfu) 、中度感染 (1×105~1×108cfu) 、轻度感染 (1×102~1×105cfu) 和未感染 (<1×102cfu) 。
3 结果与分析
3.1 临床症状
健康对照组和生理盐水组母鼠未出现异常表现, 模型组母鼠饮水量和采食量减少, 竖毛, 精神萎靡, 反应迟钝, 蜷缩, 乳区红肿。
3.2 乳腺组织的病理变化
健康对照组和生理盐水组母鼠乳腺组织腺泡完整, 未见异常变化。模型组母鼠乳腺接种1×103cfu金黄色葡萄球菌后24小时, 乳腺充血, 间质水肿, 有炎性细胞浸润, 腺泡间隔增宽, 散在有嗜中性粒细胞, 部分腺上皮细胞坏死、脱落。
3.3 乳腺组织的感染程度 (结果见表1)
由表1可知:健康对照组和生理盐水组母鼠行为未见异常, 乳腺内细菌数量未达到炎症数值, 乳腺炎发病率都为0, 死亡率也为0;模型组母鼠乳腺接种1×103cfu金黄色葡萄球菌后, 乳腺内细菌数量达到 (7.835±0.875) lg, 引起母鼠乳腺炎, 发病率为100%, 死亡率为0, 故此接种剂量较适合建立乳腺炎模型, 因此选择1×103cfu作为攻菌剂量。
3.4 乳腺组织中TNF-α含量的测定 (结果见表2和图1)
ng·m L-1
由表2和图1可知, 健康对照组和生理盐水组母鼠乳腺内TNF-α含量均无明显变化。模型组母鼠乳腺内TNF-α水平在不同时间点均高于健康对照组和生理盐水组。模型组母鼠乳腺内TNF-α水平在攻菌后6小时即达到峰值, 然后逐渐下降, 在攻菌后48小时降到最低点, 到72小时又上升。经统计学分析, 模型组母鼠在感染金黄色葡萄球菌6~72 h之间, 乳腺内TNF-α含量极显著高于健康对照组和生理盐水组。
4 讨论
4.1 母鼠乳腺炎模型的建立
本试验以1×103cfu金黄色葡萄球菌作为攻菌剂量确立模型组, 并设立健康对照组和生理盐水组。观察攻菌母鼠的临床表现、乳腺组织的病理变化及乳腺的感染程度, 结果表明, 健康对照组和生理盐水组母鼠均无异常表现, 未发生乳腺炎。模型组母鼠乳腺炎发病率为100%, 并出现明显的临床症状, 乳腺组织病变明显, 比较适合作为乳腺炎模型。
4.2 TNF-α含量的变化
攻菌后6小时, 乳腺免疫细胞呈过度活化状态, 乳腺组织TNF-α水平急剧升高, 可进一步活化免疫细胞, 形成级联反应, 启动乳腺过度炎症, 加重乳腺病理损伤。攻菌后12~24 h之间, 模型组乳腺组织中TNF-α水平呈下降趋势, 但仍高于生理盐水组。攻菌后48小时, 在细菌初次侵入机体诱导的免疫应答中, 由于细菌的感染使免疫细胞激活并成熟, 这种作用有利于细胞的迁移、抗原的递呈和机体对细菌产生应答反应。攻菌后72小时, 乳腺组织中TNF-α水平与生理盐水组比较极显著升高, 在攻菌后48~72 h之间呈上升趋势。免疫应答在抗菌作用的起始时间上有先有后, 天然免疫屏障在感染即刻就存在, 早期诱导的天然免疫要迟大约4 h, 而获得性免疫通常在感染后4~5 d才开始发挥作用。
5 结论
用从乳腺炎病牛奶样中分离的金黄色葡萄球菌成功建立了小鼠乳腺炎模型, 通过ELISE法测定乳腺组织中TNF-α含量的变化, 结果表明, 乳腺感染后, 由于母鼠机体的免疫反应, 会产生大量的免疫因子, 其中TNF-α含量会呈规则的曲线变化, 攻菌后6小时, 乳腺中TNF-α水平最高, 这是引起乳腺急性炎症的主要原因之一。
小鼠肿瘤模型 篇2
1 资料与方法
1.1 一般资料
结肠癌细胞株HCT8、肉瘤S180由哈尔滨医科大学肿瘤医院提供, 由本研究室定期腹腔接种传代保种。雌性昆明种小鼠 (合格证号:黑动字第99101001号) , 体重18～22g, 由佳木斯大学实验动物中心提供。金丝桃苷购自北京生物制品研究所。
1.2 方法
1.2.1 接种HCT8结肠癌细胞及S180肉瘤细胞
将预先接种HCT8、S180腹水瘤的小鼠处死, 从腹腔抽出的瘤液, 用生理盐水按1∶3 比例稀释成5×106个癌细胞/mL悬液, 每只小鼠右侧腋窝皮下接种0.2mL。以上操作在无菌条件下进行。
1.2.2 分组及给药
接种后随机分组, 每组10只。其中金丝桃苷设三个剂量组 (1.5、3.0、6.0 mg/kg , ip给药) , 阳性组 (顺铂3.0mg/kg, ip给药) , 阴性对照组给予灭菌生理盐水 (ip给药) 。接种24 h后给药, 每日1次, 记录各组小鼠生长情况并称重, 连续8d。
1.2.3 指标测定
实验组于末次给药次日, 处死小鼠, 剥离瘤块称其重量。并计算抑瘤率。
抑瘤率= (对照组瘤质量-给药组瘤质量) /对照组瘤质量×100%
1.2.4 数据处理
所有数据以平均值±标准差表示, 采用双侧T检验进行组间分析。以P<0.05作为显著性检验标准。
2 结果
2.1 不同处理对荷瘤小鼠外形变化影响
与正常对照组相比, 荷瘤对照组小鼠的瘤块明显增大, 质地较软且界限模糊, 难以剥离, 有的还扩散至胸骨、锁骨等处. 金丝桃苷不同剂量组和顺铂组小鼠的瘤块较小, 界限清晰, 质地较硬, 容易剥离; 金丝桃苷不同剂量组对小鼠的外形基本无影响, 其毛发、活动及体重基本正常;顺铂组小鼠毛发蓬松零乱、行动迟缓, 体重增加缓慢, 部分小鼠体重有微量减轻。
2.2 金丝桃苷对S180荷瘤鼠的抑瘤作用
金丝桃苷对S180荷瘤鼠具有很好的抑瘤效果, 金丝桃苷各剂量组的平均瘤质量与生理盐水组相比差异显著 (P<0.01) , 并且抑瘤效果有良好的剂量依赖性, 其中金丝桃苷6.0mg/kg组的抑瘤率最高, 达到62.93% (见表1) 。
2.3 金丝桃苷对HCT8异种移植瘤小鼠的抑瘤作用结果
金丝桃苷对HCT8异种移植瘤小鼠表现出明显的抑瘤作用, 可使其瘤重明显减轻, 与生理盐水组相比差异显著 (P<0.01) , 当剂量为6.0mg/kg时, 抑瘤率可达到65.04% (见表2) 。
注:与生理盐水组比较, *P<0.05, ** <0.01。
注:与生理盐水组比较, *P<0.05, **P<0.01。
3讨论
恶性肿瘤是临床常见的一种疾病, 严重威胁着人民的身心健康。肿瘤的化疗是治疗肿瘤不可缺少的手段, 由于现阶段用于临床的化疗药物对肿瘤细胞选择性普遍较差, 毒副反应大已成为当今肿瘤治疗的一大难题。近年来, 从植物中寻找天然抗肿瘤药物越来越受到人们的重视, 天然植物药因其毒性低、疗效好, 而成为治疗肿瘤的新途径, 是当前抗肿瘤新药研究的主要发展方向。
我们从整体的角度观察了金丝桃苷对结肠癌HCT8和肉瘤S180移植性模型小鼠肿瘤生长的影响, 结果表明金丝桃苷在小剂量时对荷瘤小鼠就产生抑瘤作用, 随着剂量增加其抑瘤效果逐渐提高并且金丝桃苷不同剂量组荷瘤小鼠的外形保持基本正常, 说明在此剂量范围内未表现出毒性, 通过进一步研究, 金丝桃苷有希望发展成为一种新型的抗癌药。
关键词：金丝桃苷,体内抗肿瘤,荷瘤小鼠
参考文献
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[3]张成伟, 周亚球, 陈磊.金丝桃苷药理作用研究进展[J].安徽医药, 2007, 11 (11) :961-963
小鼠肿瘤模型 篇3
1 材料
1.1 试剂
鲨鱼软骨低分子蛋白, 本研究组从鲨鱼软骨中获得, 分子量为10～100 kDa;胎牛血清 (Gibco公司) ;DMEM (Gibco公司) ;胰蛋白酶 (DIFCO公司) ;环磷酰胺 (CTX) (上海华联制药有限公司) ;其余试剂为国产分析纯。
1.2 小鼠及其分组情况
C57BL/6健康、雄性小鼠40只, 6周龄, 体重 (20±2) g中国科学院上海医药工业研究院提供, 合格证号:沪动合证字第107号。
查随机数字表, 将C57BL/6小鼠40只, 随机分为4组: (1) 生理盐水对照组; (2) 环磷酰胺对照组; (3) 鲨鱼软骨低分子蛋白组; (4) 鲨鱼软骨低分子蛋白+环磷酰胺组。
2 方法
2.1 移植性小鼠Lewis肺癌模型的建立
取对数生长的小鼠Lewis肺癌细胞, 调整细胞密度为2×107个细胞/ml, 接种于小鼠右腋皮下0.1 ml/只, 保留生长旺盛的荷Lewis肺癌肿瘤小鼠。取生长旺盛的荷Lewis肺癌肿瘤小鼠瘤组织, 无菌匀浆离心后, 用培养液调整肿瘤细胞密度为2×107个细胞/ml, 将其接种于小鼠右腋皮下每只0.1 ml。
2.2 药物干预
接种后第2天腹腔注射给药, 按小鼠体重0.1 ml/10g计算每只用药量, 每天给药1次, 连续10 d。 (1) 生理盐水对照组, 用生理盐水干预; (2) 环磷酰胺对照组, 用含环磷酰胺10 mg/ml生理盐水干预; (3) 鲨鱼软骨低分子蛋白组, 用含10 mg/ml鲨鱼软骨低分子蛋白生理盐水干预; (4) 鲨鱼软骨低分子蛋白+环磷酰胺组, 用含10 mg/ml鲨鱼软骨低分子蛋白和10 mg/ml环磷酰胺的生理盐水干预。
2.3 对移植性小鼠Lewis肺癌的疗效观察
解剖并完整地分离出皮下瘤块, 称瘤体质量, 按下列公式计算肿瘤抑制率。肿瘤抑制率 (%) = (对照组平均瘤重-给药组平均瘤重) /对照组平均瘤重×100%。
2.4 统计学方法
本文采用SPSS10.0统计学软件进行统计分析数据, 计量资料用均数±标准差表示, 自身比较及组间比较均用t检验。
3 结果
鲨鱼软骨低分子蛋白与生理盐水组相比差异有统计学意义 (P<0.01) , 肿瘤抑制率为 (44.625±5.630) %;鲨鱼软骨低分子蛋白+环磷酰胺组的肿瘤抑制率明显高于环磷酰胺组, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。结果提示, 鲨鱼软骨低分子蛋白有抑制荷Lewis肺癌肿瘤小鼠瘤体生长的作用, 虽然其肿瘤抑制率不及化疗药物环磷酰胺, 但对化疗药物有增强疗效的协同作用。见表1。
2组与3组比较 (t=17.9779, P=0.0000) , 3组与1组比较 (t=16.3253, P=0.0000) , 4组与2组比较 (t=9.5979, P=0.0142) 。
4 讨论
从海洋生物中寻找高效、低毒的抗肿瘤药物是近年天然药物研究的热点, 近年来, 许多学者和研究人员把目光转移至鲨鱼软骨血管抑制因子, 包括anti-MMPs[3]、anti-VEGF[4]、细胞凋亡因子[5]、t PA激活因子[6]等等, 通过拮抗内皮细胞生长因子、下调内皮细胞生长因子受体、下调内皮细胞表面黏附分子和促进内皮细胞凋亡等综合作用可抑制新生血管的形成。Boivin等[7]研究发现, 85μg/ml的鲨鱼软骨粗提物可引起内皮细胞DNA断裂和细胞凋亡, 进而达到抑制血管形成的功效。本研究组提取的SC低分子蛋白已证实[1,2]可以抑制血管内皮细胞生长、黏附和迁移运动, 抑制新生血管的形成。本实验又进一步证实鲨鱼软骨低分子蛋白能抑制实体瘤生长, 与化疗药物环磷酰胺联合使用有协同作用, 有望成为恶性肿瘤化学治疗的靶向新药, 并在其他血管增生性疾病中也会有广阔的应用前景。
摘要：目的观察SC低分子蛋白对荷瘤小鼠肿瘤生长的影响。方法选C57BL/6小鼠40只, 随机分为4组, 建立荷Lewis肺癌肿瘤小鼠模型, 连续给药10d后, 计算各组肿瘤抑制率。结果鲨鱼软骨低分子蛋白能抑制荷Lewis肺癌肿瘤小鼠肿瘤生长, 鲨鱼软骨低分子蛋白组与生理盐水组相比差异有统计学意义 (P<0.01) , 抑制率为 (44.625±5.630) %;鲨鱼软骨低分子蛋白+环磷酰胺组抑制率明显高于环磷酰胺组, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。结论鲨鱼软骨低分子蛋白可抑制实体瘤的生长, 有望成为治疗恶性肿瘤及其他血管增生性疾病的新药。
关键词：鲨鱼软骨,低分子蛋白,抑制,肿瘤
参考文献
[1]尚俊英, 谢裕安, 杨帆, 等.鲨鱼软骨低分子蛋白的提取及其抑制新生血管形成的初步研究[J].广西医学, 2008, 30 (2) :156～158
[2]尚俊英, 谢裕安.鲨鱼软骨低分子蛋白对新生血管形成的影响[J].基层医学论坛, 2008, 12 (2) :157～159
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[5]Boivin D, Gendron S, Beaulieu E, et al.The antiangiogenic agent Neovasat (AE-941) induces endothelial cell apoptosis[J].Mol Cancer Ther, 2002, 1 (10) :795～802
小鼠肺癌原位模型的建立 篇4
目前,肺癌动物模型的构建方法有化学诱导法、转基因法、异位移植法、原位移植法等。其中化学诱导模型耗时长,且诱导出来的肿瘤存在较大异质性[4],故有使用局限。转基因模型虽对肺癌早期的发病机制及干预性治疗效果的研究有很大帮助,但是由于该模型存在造模时间难掌握、花费较高、数量上难以满足实验要求以及转基因产物不一定符合要求等问题[5],故亦存在普遍使用的局限性。在过去的几十年中,异位移植法中的皮下移植是对肺癌进行实验研究的首选方法[6],由于其操作简单方便,通常只需在背部、腋部、后肢接种即可,但如今采取此种方法构建的肺癌模型所得出的实验数据常遭到学者们的质疑,认为其脱离了源组织的微环境,导致实验结果与临床治疗效果差异较大[7],此外 ,早在1989年外国学者Paget[8]的种子和土壤学说也证实了器官微环境会影响肿瘤细胞的表型表达,而皮下移植瘤模型转移发生率较小,并且生存曲线的数据不准确。原位移植法包括支气管内注射[9]、肺内注射[10,11,12],以及外科植入新鲜肿瘤组织[13]。其中支气管注射成瘤及瘤体大小、数目均不稳定,故使用局限性较大。相关实验证明,在肺癌原位移植模型中,瘤块外科原位移植法比肿瘤细胞悬液原位注射法转移率高,转移的发生也具有与临床相似的时间依赖性,但是由于其创伤大、手术病死率高、实验动物生存时间短,不宜普遍推广[13]。而本研究构建的肺癌原位模型是在以往的肺内注射法的基础上继续改良创新,以期构建出更为理想的小鼠肺癌原位模型。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1细胞系Lewis肺癌 (lewis lung carcinoma,LLC),源于C57 BL/6小鼠,属鼠源性的非小细胞肺癌细胞株,购于中科院。
1.1.2细胞转染 所需材料 转染试剂Lipofectamine2000TM购于Invitrogen公司,潮霉素(Hygromycin B)购于Roche公司 ,RPM1-1640购于HYCLONE公司 ,OPTI-MEMI购于Invitrogen公司。
1.1.3实验动物C57 BL/6小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司(SCXK(沪)2007-0005),雄性,5周龄,17只,体重18~22 g。所有小鼠在SPF级屏障系统中饲养[实验室使用许可证编号:SYXK(沪)2009-0069]。饲养室相对湿度为(55±10)%,温度为(22±2)℃,光照12 h明暗交替,小鼠所用饲料为上海仕林生物科技有限公司生产的辐照鼠料。
1.1.4 matrigel基质胶 /基底膜BD Matrigel TMmatrix Basement Membrane(BD公司,产品编号:356234)标准型浓度,-20℃下冷冻保存,避免多次冻融。
1.1.5活体成像仪器Caliper精诺真生物发光/荧光活体分子成像系统 (IVIS誖Lumina XR Imaging System)[铂金埃尔默 (Perkin Elmer), 型号 :Lumina XR], 成像图片分析软件:LuminaⅡliving image 4.3。
1.2 方法
1.2.1构建表达荧光素酶的LLC稳转细胞系本实验所用质粒载体是EGFP-FFLuc-Hy Tk-p MG^pac,该载体同时表达绿色荧光蛋白(GFP)、虫萤光素酶(luciferase)、潮霉素(hygromycin B)和自杀基因(Tk基因),是由本研究组通过材料转移协约(material transfer agreement,MTA) 从德州大学MD安德森癌症中心获得。用含10%胎牛血清和1% 青链霉素的RPM1-1640培养液培养LLC细胞。转染前将细胞接种于35 mm培养皿中,置于5%CO2,饱和湿度的37℃培养箱中培养。当细胞达到70%~80%融合浓度时开始转染。转染24 h后加入600μg/m L的潮霉素进行抗性克隆筛选,挑选GFP阳性克隆,然后用300μg/m L的潮霉素进行维持。
1.2.2动物模型的建立1配制细胞混悬液 :将含有表达虫萤光素酶的LLC细胞(0.5×105个)50μL的细胞悬液与50μL的matrigel基质胶等体积混匀,将其抽吸入事先预冷好的胰岛素注射器。2麻醉固定:使用浓度为1%、剂量为5 mg/kg的戊巴比妥钠将小鼠麻醉固定。3剃毛:用剃毛器将小鼠左胸部及腋下的黑毛剃除干净,以充分暴露左侧胸壁。4剪开皮肤:于小鼠左腋前线下1 cm处用左手持镊子将皮肤拎起,右手持眼科手术剪将皮肤横向剪开约1 cm的小口。5定位:观察小鼠心脏搏动处,将心脏定位好后再水平向左移动皮肤切口,可发现与心脏暗红色组织不同的白色实质性的左肺组织。6进针:定位好后将事先抽吸好的胰岛素注射器插入左肺,进针深度3 mm,角度以垂直为佳,注射完后停顿5~10 s,再在伤口上滴洒含庆大霉素的生理盐水少许。7缝合:切口缝合1~2针。8伤口护理:最后在伤口上涂抹红霉素眼膏,帮助伤口愈合,造模完成。
1.2.3小动物活体成像操作方法小鼠于造模后进行活体成像,首先给予小鼠腹腔注射虫萤光素酶底物,浓度为15 mg/m L,剂量为150μL/只,底物作用时间5 min,5 min后予以异氟烷吸入麻醉5 min,然后再放入主机箱内,曝光10 s后进行图像拍摄。构建原位模型,于小鼠左肺 注射等比 例的LLC- 虫荧光素 本酶细胞(0.5×105个)与matrigel基质胶混悬液共100μL。同一只小鼠按上述方法造模后分别于术后的第4、11、18天进行活体成像。
2 结果
2.1 稳定表达虫萤光素酶的 LLC 细胞系构建完成
由于EGFP-FFLuc-Hy Tk-p MG^pac载体在同一启动子下表达EGFP(增强型绿色荧光蛋白)和虫荧光素本酶,因此,EGFP的表达代表了虫荧光素本酶的表达。如图1(封三)所示,LLC细胞在转染EGFP-FFLucHy Tk-p MG^pac质粒DNA后 , 稳定表达EGFP, 表示稳定表达虫荧光素本酶的LLC细胞系构建成功,可以用于进一步研究。
2.2 小动物活体成像结果
将模型小鼠于造模后的第4天按照上述操作方法进行第1次活体成像,结果如图2(封三),共造模17只小鼠 ,除第8号小鼠出现腹腔种植转移外 ,其他16只小鼠均在胸部出现明显荧光素酶信号 , 表示在胸部有肿瘤形成,其造模成功率为94%。
2.3 病理学检测
小鼠活体成像结果说明在小鼠胸部有肿瘤形成,进行病理检查进一步明确肿瘤在肺组织内而非在胸腔内。按照常规病理切片流程,取材:将10只小鼠于术后第4天活体成像后处死并立即进行活体取材,取出肺组织,此时肉眼观察肺组织尚未见明显的病变表现;接着使用10%中性福尔马林溶液肺部灌流、固定;二甲苯透明、浸石蜡、包埋、切片、HE染色:二甲苯脱蜡2次,各10 min,无水乙醇漂洗二甲苯2次,各1 min;95%酒精1次,1 min,90% 酒精1次 ,1 min,85% 酒精1次 ,1 min,自来水冲洗2 min;苏木精染色4 min,自来水冲洗1 min;1%盐酸酒精分化20 s,自来水冲洗1 min, 伊红染色1 min, 自来水洗30 s; 梯度酒精脱水:70%酒精1次 ,20 s,90%酒精1次,20 s,95%酒精2次,各1 min,无水乙醇2次,各2 min;二甲苯透明2次,各3 min;中性树胶封片。显微镜下鉴定小鼠左肺肿瘤病灶,有荧光信号的左肺经病理学检测后证实为肿瘤组织(图3,封三)。
2.4 模型小鼠大体解剖结果
于小鼠术后第18天进行第3次活体成像,成像后给予小鼠脱颈处死并对其进行解剖,观察模型小鼠肿瘤生长及转移情况,如图4(封三),可见有荧光信号的左侧肺部也正是解剖后左肺背部(进针部位)有明显深红色或白色肿瘤组织的地方,质地较硬,贯穿于整个左肺,在右肺、对侧胸腔还可见散在的白色肿瘤组织。
2.5 模型小鼠肿瘤形成及转移情况的监测
模型小鼠于术后第4天进行第1次活体成像,于第11天进行第2次活体成像,于第18天进行第3次活体成像,以监测小鼠肿瘤形成及转移情况。3次活体成像的条件,如底物浓度、底物作用时间、麻醉时间、曝光时间、标尺等均为一致,成像结果如图5(封三),可见模型小鼠在没有药物干预的情况下,肿瘤细胞的荧光信号强度显现出时间依赖性(随着时间增加而增强、增多),从第4天左肺较弱的蓝色信号,至第18天整个胸廓出现红色的强信号 , 说明本研究采用的虫萤光素酶标记的LLC细胞所进行的生物发光法确实可以较好地监测小鼠体内肿瘤形成及转移情况。
3 讨论
3.1 原位模型构建四大关键点
第一,尽可能保证每只小鼠所注射的细胞数量的均一性。手术时所用的matrigel基质胶是为了让肿瘤细胞固定在局部,成为其生长的支架,有助于形成单一病灶,但matrigel基质胶具有遇高温凝固的不可逆性,所以据笔者经验,须事先将细胞悬液与matrigel基质胶在超净台中等比例充分混匀后抽吸入胰岛素注射器内(注意:凡与matrigel基质胶接触的用品均需预冷),以确保每只小鼠注射的细胞数量的一致性,抽吸完毕后立即将注射器插入事先准备好的冰盒中。第二,在手术过程中最为关键的就是定位,手术切口在左腋前线下1 cm处,切口为横向切口,首先找到心脏搏动处,其颜色为随心脏起伏的暗红色组织,与心脏平行的左侧就可看见与搏动的暗红色组织形成对比的白色实质性的左肺,此时方可进针。第三,如图2所示,8号小鼠于造模后第4天进行第1次活体成像时荧光信号布满了整个腹腔,说明注射器可能刺进了心脏,导致细胞与matrigel基质胶的混悬液直接参与了血液循环,所以强调进针的深度以3 mm为佳(小鼠肺叶厚度在3 mm左右)。第四,左肺进针注射完毕后,不要急于出针,需停顿5~10 s,以防混悬液渗漏被注射器带出。
3.2 肺癌原位模型的构建对中医药抗肿 瘤的意义
首先,从中医藏象理论出发,肺癌异位移植与原位移植在病位、病理变化上有很大的差别。有研究显示,两种不同的移植方式在肿瘤的形成过程中对缺氧的反应也表现出截然不同的结果[14]。而肺癌原位移植不仅可以制造出局部的肿瘤病变,而且还可以模拟肺脏受损后肺功能失常的一系列生理、病理变化,故原位移植模型更符合临床实际。其次,从中药作用的机制出发,不同的中药对各个脏腑经络有各自的指向作用,即所谓的“归经”,如治疗肺癌的常用化痰药物:天南星、半夏、鱼腥草、贝母、射干等,他们的“归经”都是肺脏,即这些药物在对肺脏其本身的病变有更好的治疗效果。有研究发现,有些中药对原位移植的肺癌模型小鼠有效但对皮下移植的模型小鼠效果差甚至无效,反之,有些中药可能对皮下移植的肿瘤效果好,而对原位肿瘤效果不佳,从而产生药物治疗效果的假阳性[15]。可见 ,采用异位移植模型得到的实验结果与临床应用的实际效果之间存在较大差距,而原位模型的建立可以很好地解决以上存在的问题。原位移植法不仅可提高肿瘤成瘤率,突显肿瘤的侵袭和转移特性,还可观察肿瘤血管的生成情况,从更大程度上模拟了人体肺部肿瘤的微环境[16],同时也提升了模型实验数据的可信度,故成为了研究关注的焦点。所以,肺癌原位模型的建立对于中医药抗肺癌无论是从理论角度还是从科研的角度来说都是至关重要的。
综上所述,本研究所构建的小鼠肺癌原位模型,因其只需剪开皮肤,不流血,创伤小,无手术死亡现象,且所需细胞数量少,成瘤率高,转移性好,操作简单,可重复性强,大幅度地提升了肺癌原位模型的成功率,同时还可利用小动物活体成像系统中的生物发光技术监测小鼠肿瘤形成及转移情况,为深入研究肺癌奠定了基础,也为中医药抗肺癌踏入国际舞台奠定了基础。
A:非小细胞肺癌细胞荧光强度 ;B:明场 ;C:荧光与明场合成
A 为小鼠造模后于术后第 4 天活体成像图;B 为该小鼠肺组织病理检查结果
A、B、C 均为小鼠术后活体成像图;a、b、c 分别为小鼠 A、B、C 术后左肺肿瘤组织
摘要：目的肺癌的发病率和病死率居高不下,而目前用于实验研究的肺癌动物模型存在较大的局限性,故本研究认为建立一个稳定、类似于人体肿瘤微环境的肺癌原位模型是深入研究肺癌的基础。方法 直接将稳定表达虫萤光素酶的鼠Lewis肺腺癌细胞与基质胶的混悬液注射于C57 BL/6小鼠左肺,无需打开胸腔只需将小鼠左胸部皮肤剪开约1 cm小口,定期利用小动物活体成像系统中的生物发光技术监测小鼠肿瘤形成及转移情况,并将小鼠处死后立即进行肺部组织活体取材,采用石蜡包埋、切片、HE染色做出病理学诊断。结果 采用肺内注射的原位造模法成瘤率高,Lewis肺腺癌细胞数量只需0.5×105个即可成瘤,成功率达90%以上,且利用活体成像系统中的生物发光技术能监测到模型小鼠肿瘤可转移至对侧胸廓、对侧肺组织、双侧腋下及腹股沟淋巴结等。结论 注射虫萤光素酶稳定表达的鼠Lewis肺腺癌细胞与基质胶混悬液构建的肺癌原位模型所需细胞数量少,成瘤率高,无手术死亡风险,转移性好,监测方便,操作简单且可重复性高,为深入研究肺癌提供了良好模型。
小鼠肿瘤模型 篇5
1 材料与方法
1.1 动物
1月龄昆明小鼠购自广东省实验动物中心(许可证号SCXK粤2008-0002),雄雌各半,体重(20±2)g。
1.2 细胞株
S180瘤株由中山大学医学院细胞中心提供。
1.3 药物
由广州医学院蛇毒研究所提供。
1.4 试剂与仪器
环磷酰胺(Sigma,USA);caspase-3抗体(cell singal公司);鼠抗人Actin抗体(newmarker公司);PVDF膜(威佳公司);Annexin-V/PI双染试剂盒(凯基公司);透射电镜(CM10 Philips,Mahwah,NJ);流式细胞仪:Coulter,USA;蛋白转移电泳槽(PowerPac Basic,Bio-Rad,USA)。
1.5 模型的制备
S180肿瘤细胞在小鼠腹腔内稳定传2代后,无菌条件下抽取生长良好的乳白色腹水,用生理盐水稀释至1×107个/ml,以0.2 ml/只接种于小鼠前肢右侧腋下皮下。
1.6 分组和给药方法
小鼠适应性饲养7 d后进行接种。肿瘤接种后小鼠称重,并按体重大小随机分为五组,每组10只,分别为荷瘤对照组、环磷酰胺组、CTX低剂量组、CTX中剂量组和CTX高剂量组。接种S180细胞24 h后,荷瘤对照组腹腔注射0.1 ml生理盐水;环磷酰胺组腹腔注射30 mg/kg环磷酰胺0.1 ml;CTX低、中、高剂量组分别以0.2、0.4、0.8 mg/kg腹腔给药。1次/d,0.1 ml/次,连续给药12 d。于停药次日,颈椎脱臼处死小鼠。剥离小鼠腋下皮下瘤体,称肿瘤重量。按下列公式计算抑瘤率(%)=[A-B/A]×100%,A代表对照组瘤重,B代表处理组瘤重。
1.6 透镜电镜观察CTX对S180荷瘤小鼠的亚显微结构的影响
取荷瘤对照组和CTX中剂量组的S180肿瘤组织,用2.5%戊二醛预固定,1%锇酸后固定,环氧树酯包埋,超薄切片,醋酸铅-铀双染色,透射电镜观察各组肿瘤细胞的形态。
1.7 Annexin-V/PI双染检测凋亡率
用PBS清洗剥离出的各组肿瘤组织,然后用注射器针芯在200目筛网上轻搓肿瘤组织,边搓边滴入PBS缓冲液。然后用PBS洗涤细胞两次,加入500μl的Binding Buffer悬浮调整细胞浓度为1×106/ml。最后分别加入5μl Annexin V-FITC和5μl PI,避光、室温反应15 min后,用流式细胞仪检测凋亡率。
1.8 免疫印迹法检测
用PBS清洗剥离出的各组肿瘤组织,然后用注射器针芯在200目筛网上轻搓肿瘤组织,边搓边滴入PBS缓冲液。用PBS洗涤细胞两次,提取蛋白:每106个细胞依次加入300μl RIPA蛋白裂解液及3μl PMSF(phenylmethysulfonyl fluoride)溶液,用200μl枪头吸打混匀,冰上放置30 min,4℃12 000×g离心30 min。将上清移至新管,BCA法测定蛋白含量。
SDS-PAGE凝胶电泳:配制12%的分离胶与5%浓缩胶,灌胶,待胶聚合完全,将准备好的样品液和预染Marker分别上样,使用Bio Rad电泳装置,80V恒压电泳15 min,120 V恒压电泳70 min。转膜300 mA 1 h,转移完成后取出膜,切角做标记。加5%的脱脂奶粉封闭孵育膜,室温摇床振荡l h。加一抗(稀释度1∶1000),室温摇床孵育2 h。PBST洗膜,15 min×3次,加HRP标记的二抗(稀释度1:8000),室温摇床孵育l h,PBST洗膜,15 min×3次,进行化学发光检测。
1.9 统计学处理
采用SPSS 12.0统计软件分析,实验数据用表示,进行方差分析、q检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 CTX对S180荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用
CTX对肿瘤重量的抑制作用随剂量增加而增加,CTX低、中、高剂量组的肿瘤重量都明显低于荷瘤对照组(P<0.05)。CTX低、中、高剂量组肿瘤重量的抑瘤率分别为23.8%、54.1%、63.2%。见图1。
注:A为荷瘤对照组和处理组的肿瘤重量;B为肿瘤重量的抑制率。与荷瘤对照组比较,*P<0.05,**P<0.01
2.2 CTX对S180荷瘤小鼠肿瘤细胞亚显微结构的影响
连续给药12 d后,剥离肿瘤组织,透射电镜观察细胞的亚显微结构。荷瘤对照组的肿瘤细胞,其核膜和核仁结构清晰,染色质分布均匀,说明细胞生长良好(图2A);而CTX中剂量组小鼠的肿瘤细胞,其染色质发生浓缩,聚集在核膜边缘,线粒体出现不同程度的膨胀,甚至空泡化,呈现明显的凋亡特征(图2B)。
注:A为荷瘤对照组(10000×);B为中剂量CTX组(9000×)
2.3 CTX对小鼠体内S180细胞的凋亡影响
为了进一步证实CTX所诱导的凋亡,笔者用Annexin V/PI双染法来检测凋亡率。由图3可见,荷瘤对照组,CTX低、中、高剂量组的早期凋亡率分别为7.9%、15.8%、30.1%和20.4%,而晚期凋亡率则从15.6%增加到47.8%,提示CTX诱导的细胞凋亡涉及其抗肿瘤效果。
2.4 CTX对小鼠体内S180细胞caspase-3蛋白表达的影响
为了研究CTX所诱导的S180细胞凋亡是否依赖caspase途径,笔者检测了caspase-3蛋白的表达。免疫印迹杂交结果显示,与荷瘤对照组比较,CTX低、中、高剂量组的caspase-3蛋白酶原表达降低,提示caspase-3被剪切活化。见图4。
3 讨论
眼镜蛇毒细胞毒素是从中华眼镜蛇毒中提取纯化的一种生物活性物质,国内外学者发现其对体内外的多种肿瘤细胞有直接的杀伤作用[3,4,5],但具体的作用机制尚未清楚。目前认为,蛇毒的抗肿瘤作用可能与细胞膜磷脂成分相互作用、干扰膜转运机制、与膜受体作用、干扰肿瘤细胞的DNA复制和诱导肿瘤细胞发生凋亡有关[6]。研究表明,蛇毒中的出血毒素能诱导血管内皮细胞凋亡[7];来自眼镜蛇毒的神经毒素Ⅱ能诱导白血病K562和L929细胞的凋亡[8]。但很少有CTX诱导肿瘤细胞凋亡的报道。
本研究用三种不同剂量的CTX作用于小鼠体内S180肿瘤细胞,结果表明,低、中、高剂量组都对体内肿瘤细胞的生长有不同程度的抑制作用,且随着CTX浓度的增大,抑瘤率也越大,CTX中、高剂量组的肿瘤重量显著低于对照组(P<0.01)。在透射电子显微镜下,经过CTX处理过的S180细胞具有明显的凋亡特征,如染色质浓缩、线粒体空泡化;Annexin V/PI双染检测也证实S180发生了凋亡。通过免疫印迹杂交实验,笔者检测了pro-caspase-3蛋白的表达,结果发现pro-caspase-3的表达量下降,提示CTX通过激活caspase-3来诱导S180细胞发生凋亡。
凋亡的信号途径主要有两种类型:外在途径,也称为死亡受体途径;内在途径,也称为线粒体途径。他们在不同的通路发挥作用,但最终都会导致凋亡的效应蛋白caspase-3,-6或-7的激活[9],从而激活核酸内切酶,使染色质发生浓缩,形成凋亡小体[10]。此研究也表明,CTX所诱导的细胞凋亡途径是一种caspase依赖性途径。
小鼠肿瘤模型 篇6
关键词：微米冬凌草甲素,细胞调亡
肝癌是我国较常见的恶性肿瘤。在各种恶性肿瘤引起的国民死亡率中位居第二。目前对于肝癌的发生和发展过程与细胞凋亡的关系尚认识不足。因此,深入了解肝癌细胞生长增殖的规律,研究诱导肝癌细胞凋亡的途径和机制,有助于探索肝癌治疗的新方法,为肿瘤的预防、控制和治疗提供重要的理论依据。冬凌草甲素是冬凌草的主要成分之一,为贝壳杉烷二萜类化合物,对培养中的多种肿瘤细胞具有杀伤效应,而对正常细胞生长无影响。向小鼠体内肿瘤注射冬凌草甲素可抑制肿瘤生长。但由于冬凌草甲素本身为晶体状结构,不溶于水,因而不利于体内的吸收,极大地降低了药效。把药物的单元尺寸减小至微米甚至亚微米级,则药物的活性和生物利用度可能得到大幅度提高。本实验通过不同浓度的微米冬凌草甲素作用于H22小鼠肿瘤,观察其对肿瘤细胞中Caspase3基因表达的影响,引起肿瘤细胞的凋亡从而延长小鼠的生存期,提高其生存率。
1 材料和方法
1.1 分组和动物模型的建立
由佳木斯大学实验动物中心提供昆明种小鼠100只,雄性,体重18～22g。艾氏腹水瘤(H22)大鼠(Aishi Sorcoid Tumor Rat),雄性,购于哈尔滨肿瘤研究所。无菌条件下用注射器抽取腹水以灭菌生理盐水稀释调整细胞量为1×107个/mL,接种到100只小鼠腋下,每只0、2mL,1×107个/mL)中,制作实体瘤模型。并分别随机分成5组,每组20只。A组,低剂量组;B组,中剂量组;C组,高剂量;阳性对照组和阴性对照组。24h后每天分别灌胃不同浓度的微米冬凌草甲素,阳性对照组灌胃丝裂霉素,阴性对照组灌胃生理盐水。连续灌胃10d。
1.2 方法
1.2.1 标本采集
第11天后处死小鼠,取肿瘤组织,称重计算抑瘤率,然后保存于10%中性福尔马林中。用于常规病理切片HE染色和细胞凋亡检测。
1.2.2 Caspase3的免疫组化检测
SABC免疫组化试剂盒购自武汉博士德公司。具体操作参见试剂盒说明。
1.3 统计学处理
结果用均数±标准差
2 结果
2.1 对照组小鼠于第2天开始出现肿块,而给药组则于第6天出现肿块,说明微米冬凌草甲素对小鼠H22作用明显。抑瘤率与对照组比较差异明显且随剂量的增加抑瘤效果增强;该瘤对丝裂霉素也较敏感。瘤重也明显低于生理盐水组(P<0.01),见表1。
2.2 免疫组织化学检测肿瘤细胞凋亡明显,细胞凋亡率呈明显的剂量依赖型。
P<0.01,组间比较有显著性差异。
P<0.01,组间比较有显著性差异。
3 讨论
微米冬凌草甲素对H22实体瘤表现出明显的抑瘤作用可使荷瘤小鼠的瘤重明显减轻。与空白对照组比较有显著性差异(P<0.01),且随剂量的增加抑瘤效果增强,抑瘤作用与阳性对照组比无显著性差异(P<0.05)。微米冬凌草甲素能透过肿瘤细胞膜进入细胞内,通过激活Caspase级联反应,诱导肿瘤细胞的凋亡。
参考文献
[1]张典瑞,任天池.冬凌草甲素的药学研究进展[J].中国药学杂志,2003,38(11):817
[2]张春玲,吴立军.冬凌草甲素通过激活caspase诱导HeLa细胞凋亡[J].中国药理学通报,2003,15(5):52-525
[3]张典瑞,任天池,娄红祥,等.冬凌草甲素硬脂酸固态类脂纳米粒的实验研究[J].中国药学杂志,2004,39(2):123
小鼠肿瘤模型 篇7
组蛋白2A变异体 ( histone family 2A variant, H2AX) 是核心组蛋白H2A的一个亚型。有研究发现,DNA双链断裂后可诱导位于丝氨酸139位C端保守区域内的H2AX磷酸化,形成 γH2AX。利用激光共聚焦显微镜可直接观测到细胞核内 γH2AX焦点数,直观地了解DNA双链断裂的情况,并进行DSBs的定性、定位及定量。目前,采用 γH2AX特异性抗体进行的免疫荧光检测方法已成为衡量DSBs发生的金标准[5,6,7],γH2AX产生的数量可判断DNA双链断裂的程度[8,9]。J. A. Downs[10]的研究表明, DSBs修复后,γH2AX蛋白存在一个去磷酸化过程, γH2AX焦点逐渐消失,故可通过观察 γH2AX蛋白焦点数量的减少情况来检测DNA双链断裂损伤的修复情况。毛细血管共济失调突变基因( ataxiatelangiectasia mutated,ATM) 是一种在感应和传递DNA双链断裂损伤信号、启动损伤DNA修复中起重要作用的功能蛋白。DSBs诱导H2AX的磷酸化 主要是通 过ATM激酶来介导的,感应到损伤后,ATM丝氨酸1 981位发生自动磷酸化而激活,使ATM靶向下游底物H2AX、BRCA1、53BP1等[11]。有研究发现,其他类型的DNA损伤也可通过ATR和DNA - PK形成 γH2AX,但ATM所介导的 γH2AX的形成必定与DSBs的存在有关。因此,同一细胞内活化的ATM和 γH2AX同时出现是DSBs存在的强有力证据[12,13]。
H2O2是一种重要的化学性DNA诱裂剂,已成为生命科学研究细胞氧化损伤的重要工具[14]。为了研究DNA损伤修复相关基因在小鼠胚胎DNA损伤修复中的作用,本试验以H2O2为DNA损伤诱导剂构建小鼠胚胎DNA损伤模型,观察胚胎氧化应激后DNA损伤指标 γH2AX和磷酸化ATM ( Phosphorylation - ATM,ρATM) 蛋白的表达变化,以期为进一步了解胚胎DNA损伤修复机制奠定基础。
1材料
1.1试验动物
FVB小鼠,亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室自繁,母鼠群养,公鼠独笼饲养,用颗粒饲料饲喂,自由采食、饮水,饲养室温为21 ~ 25 ℃,选用健康、3 ~ 5周龄的FVB母鼠进行超数排卵。
1.2主要试剂
PMSG,购自上海市计划生育研究所; HCG,购自宁波第二激素厂; 过氧化氢( 3% H2O2) 和Triton X 100,购自Sigma公司。
一抗Phospho - Histone H2A. X( ser139) ( 20E3) 兔单克隆抗体( Cell Signaling) ,配成10% 母液,使用时稀释度为1∶200; 一抗 ρATM( 10H11. E12) : SC 47739 ( SANTA CRUZ) ,配成10% 母液,使用时稀释度为1∶400。二抗荧光素标记羊抗兔Ig G抗体( Millipore) ,使用时稀释度为1 ∶1 000。荧光素标记羊抗鼠Ig G抗体( Cell Signaling) ,使用时稀释度为1 ∶ 200,二抗均避光保存于4 ℃冰箱。
小鼠胚胎体外操作液M2,参照《小鼠胚胎操作实验手册》( 第3版) 的方法进行配制; 透明质酸酶 ( HYT) ( 300 mg /L) ,将0. 3 g HYT溶于100 m L M2中配制而成; 小鼠胚胎培养液为KOSM和KOSM( - ) ( 去除KOSM配方中的L - 谷氨酞胺) ,以KOSM( - ) 为基础液,分别配制含有1. 5,1. 8,2. 1,2. 4 μmol/L H2O2的小鼠胚 胎培养液,标记为KOSM ( - ) + 1. 5 μmol / L H2O2、KOSM( - ) + 1. 8 μmol/L H2O2、KOSM ( - ) + 2. 1 μmol / L H2O2、KOSM ( - ) + 2. 4 μmol / L H2O2。
1.3主要仪器
实体显微镜( SMZ645) ,购自Nikon公司; 激光扫描共聚焦显微镜( LSM510 meta) ,购自Leica公司。
2方法
2. 1试验动物分组
按小鼠胚胎培养液所含的H2O2浓度梯度进行分组,分别为KOSM ( - ) + 1. 5 μmol/L H2O2组、 KOSM( - ) + 1. 8 μmol / L H2O2组、KOSM ( - ) + 2. 1 μmol / L H2O2组、KOSM( - ) + 2. 4 μmol/L H2O2组,以KOSM组及KOSM( - ) 为对照组。
2. 2小鼠的超数排卵
采用PMSG - HCG法进行超数排卵。取3 ~ 4周龄的雌性小鼠,12: 00注射5 IU的PMSG( 0. 1 m L) 到小鼠腹腔,48 h后再注射5 IU的HCG( 0. 1 m L) 。注射HCG后立即将母鼠放入公鼠笼中,公母鼠按1∶1比例交配过夜,公鼠为2 ~ 3月龄。
2. 3受精卵的体外培养
注射HCG 22 ~ 24 h后,脱颈椎处死小鼠,迅速剥离出输卵管,在实体显微镜下用一次性1 m L注射器在膨大部处撕开一个小口,受精卵团自动溢出,移入HYT( 300 μg / m L) 中静置2 ~ 3 min; 待颗粒细胞脱落后,收集形态正常的受精卵,用M2冲洗2 ~ 3遍,再用小鼠胚胎培养液冲洗2 ~ 3遍,移入预先平衡好的各试验组 的小鼠胚 胎培养盘 中,置于饱和 湿度、 37 ℃ 、5% CO2的培养箱中培养24 h; 于实体显微镜下观察记录各试验组2 - 细胞胚胎的发育情况,计算分裂率; 96 h后再观察并记录其囊胚的发育情况,计算囊胚率。
2. 4免疫荧光检测
分别收集各试验组体外培养的1 - 细胞和2 - 细胞期小鼠胚胎,放于含4% 多聚甲醛的PBS中室温固定30 min; 在1% Triton X - 100 ( 用D - PBS配制) 中透化处理10 min; 1% BSA室温孵育1 h; 加一抗Phospho - Histone H2A. X( ser139) ( 20E3) 单克隆抗体或一抗 ρATM( 10H11. E12) 于4 ℃ 孵育过夜; 次日, 37 ℃ 孵育20 min; 用对应的二抗荧光素标记羊抗兔Ig G或二抗荧光素标记羊抗鼠Ig G,于室温避光孵育1. 5 h; 制成片子,在激光共 聚焦显微 镜下观察 γH2AX或 ρATM的表达情况。每组试验至少重复3次,每次取小鼠胚胎20 ~ 30个。免疫组化试验设置空白组( 以1% BSA替代一抗和二抗) 、阴性对照组1 ( 以1% BSA替代一抗,二抗不变) 、阴性对照组2( 以1% BSA替代二抗,一抗不变) 。
2.5数据分析
试验数据采用SPSS18. 0软件进行差异显著性分析,P < 0. 05为差异显著。
3结果与分析
3.1H2O2对小鼠胚胎发育的影响
用含不同浓度H2O2的培养液体外培养小鼠胚胎,观察H2O2处理对小鼠胚胎发育能力的影响,结果表明: 与KOSM对照组相比,KOSM( - ) 组小鼠胚胎的分裂率下降,但无显著差异( P > 0. 05) ; 囊胚率显著下降( P < 0. 05) 。与KOSM( - ) 对照组相比,随着H2O2浓度的增加,小鼠胚胎的分裂率和囊胚率呈下降趋势。从1. 8 μmol/L H2O2浓度开始,小鼠胚胎的分裂率和囊胚率均显著下降 ( P < 0. 05) ; 2. 1, 2. 4 μmol / L H2O2处理组间胚胎的分裂率和囊胚率无显著差异,2. 4 μmol/L H2O2处理的胚胎不能发育到囊胚期。以上结果说明1. 5 ~ 2. 4 μmol/L H2O2处理对小鼠早期胚胎发育均有影响,见表1。
3.2小鼠胚胎γH2AX和ρATM表达的检测
分别收集KOSM、KOSM( - ) 和1. 5,1. 8,2. 1, 2. 4 μmol / L H2O2处理组体外培养的1 - 细胞、2 - 细胞期胚胎,采用免疫荧光技术检测 γH2AX和 ρATM的表达情况,结果表明,KOSM和KOSM( - ) 对照组中2 - 细胞期胚胎的 γH2AX焦点数多于1 - 细胞期胚胎,ρATM在两对照组的两个时期胚胎中均未检测到。1. 5,1. 8 μmol/L H2O2处理组1 - 细胞期胚胎中均未检测到 γH2AX和 ρATM; 两处理组的2 - 细胞期胚胎表达 γH2AX,未检测到 ρATM。2. 1,2. 4 μmol/L H2O2处理组的1 - 细胞和2 - 细胞期胚 胎均有 γH2AX和 ρATM表达,其中2. 4 μmol / L H2O2处理组的两个时期胚胎 γH2AX焦点数高于2. 1 μmol/L H2O2处理组,说明2. 1,2. 4 μmol/L H2O2处理可诱导小鼠胚胎产生明显的DSB现象( 见295页彩图1、 图2) 。
注: 同列数据肩标字母不同表示差异显著( P < 0. 05) ,含有相同( P > 0. 05) 。
4讨论
H2O2作为一种化学性DNA诱导剂,能直接攻击DNA使其断裂或降解,产生自由基HO·,故H2O2常被用于建立DNA氧化损伤模型。R. G. Allen等[15]认为纳摩尔水平的活性氧可促进细胞增生,微摩尔水平的活性氧可导致细胞凋亡,毫尔摩水平的活性氧可引起细胞损伤死亡。在用H2O2处理卵母细胞及早期胚胎时,常采用相对较低的浓度[16,17]。韩荣勋[18]在小鼠胚胎发育的不同阶段添加不同浓度H2O2( 1. 5, 1. 8,2. 1,2. 4,2. 6 μmol / L) 处理时发现,随着外源性H2O2浓度的增高,囊胚发育率显著降低,外源性H2O2诱发小鼠1 - 细胞期胚胎体外发育阻滞的最低浓度是2. 1 μmol/L。本研究结果表明: 随着H2O2处理浓度的增加,小鼠胚胎的分裂率和囊胚率均呈逐渐下降趋势。当H2O2浓度为2. 1 μmol/L时,胚胎的分裂率和囊胚率显著低于对照组( P < 0. 05) ; 当H2O2浓度为2. 4 μmol/L时,小鼠胚胎发育停滞于2 - 细胞期,这与韩荣勋[18]的报道相一致。
ROS引起的氧化损伤对胚胎发育的影响是多方面且机制极其复杂,对胚胎氧化应激性DNA损伤的耐受情况如何,目前所知甚少。DSBs的形成可诱导H2AX组蛋白C端丝氨酸139位大量而迅速的磷酸化形成 γH2AX,其可作为评估各种化学或压力作用诱导的DNA双链断裂的生物学标志物[17,18]。有研究发现,H2AX可在H2O2引起的成熟精子氧化应激性DNA损伤处发生磷酸化,并发现Rad50和53BP1同时出现在损伤处,对DNA损伤产生了应答反应; 与体细胞不同的是,这些修复蛋白并没有发挥有效的DNA修复功能,推测它们在DNA损伤修复的机制中可能发挥着其他重要的作用[19]。S. K. Adiga等[20]采用3 Gy照射小鼠1 - 细胞和2 - 细胞胚胎后发现,在2 - 细胞期以后的胚胎细胞内检测到 γH2AX焦点, 因而认为 γH2AX在2 - 细胞期以后才参与胚胎细胞的DNA修复。本研究发现,未处理的对照组小鼠胚胎在2 - 细胞期的 γH2AX焦点数多于1 - 细胞期胚胎,这与S. K. Adiga等[20]的发现相一致。
H2AX的磷酸化与PI3K家族成员ATM、ATR及DNA - PK有关,DSBs所诱导的 γH2AX的形成多是由ATM所介导的; 因此,同一细胞内活化的ATM和 γH2AX同时出现是DSBs存在的强有力证据[13,14], 相关研究中也均是采用免疫荧光方法检测H2AX和ATM的磷酸化来监测DNA的损伤情况[21,22,23,24,25,26,27]。本研究分析了不同H2O2处理组早期胚胎的 γH2AX及 ρATM表达情况,以作为DSB的判断指标,结果表明: γH2AX和 ρATM在1. 5,1. 8 μmol / L H2O2处理组的1 - 细胞期胚胎中均未检测到; 2 - 细胞期胚胎表达 γH2AX,未检测到 ρATM。 当H2O2浓度为2. 1, 2. 4 μmol / L时,小鼠1 - 细胞和2 - 细胞期胚胎中可检测到 γH2AX和 ρATM的表达,且 γH2AX焦点数较多,说明过高的H2O2处理会导致胚胎DSBs现象增多。以上结果说明,2. 1,2. 4 μmol/L H2O2处理可诱导小鼠胚胎产生明显的DSB现象,2. 1 μmol/L H2O2处理为较适宜的诱导条件。
注: 浅色图是常光下拍摄的,深色图是激光扫描后拍摄的。
摘要：为了研究胚胎DNA损伤修复机制,试验以H2O2为DNA损伤诱导剂,建立小鼠胚胎DNA氧化损伤模型,采用不同浓度H2O2培养小鼠受精卵,观察其对小鼠胚胎发育能力的影响;再通过免疫荧光方法检测γH2AX和ρATM蛋白的表达状况,以判断H2O2处理所导致的胚胎DNA损伤情况及较适宜的诱导条件。结果表明:1.5~2.4μmol/L H2O2处理对小鼠胚胎发育能力具有影响,与KOSM(-)对照组相比,H2O2处理组小鼠胚胎的分裂率、囊胚率呈下降趋势,其中1.8~2.4μmol/L H2O2处理组的胚胎分裂率、囊胚率呈显著下降趋势(P<0.05)。免疫荧光法检测发现KOSM(-)对照组中,2-细胞期胚胎的γH2AX焦点数多于1-细胞期胚胎,ρATM在两个时期的胚胎中未检测到。γH2AX和ρATM在1.5,1.8μmol/L H2O2处理组的1-细胞期胚胎中均未检测到;2-细胞期胚胎表达γH2AX,未检测到ρATM。2.1,2.4μmol/L H2O2处理组的1-细胞和2-细胞期胚胎均有γH2AX和ρATM表达,其中2.4μmol/L H2O2处理组两个时期胚胎的γH2AX焦点数多于2.1μmol/L H2O2处理组。说明1.5~2.4μmol/L H2O2处理会影响小鼠胚胎体外发育能力,2.1,2.4μmol/L H2O2处理可诱导小鼠胚胎发生DNA双链断裂现象。