小鼠肺上皮细胞系（精选6篇）
小鼠肺上皮细胞系 篇1
支气管哮喘(简称哮喘)是一种气道慢性炎症性疾病,其发病机制复杂,至今尚未完全阐明。近年来随着对哮喘研究的逐渐深入,人们认识到气道上皮细胞及其屏障功能受损可能在哮喘发病机制中起着重要作用[1,2]。气道上皮细胞之间的连接由紧密连接、黏附连接和缝隙连接共同组成,是气道上皮屏障的主要组成部分,其中较为重要的是紧密连接[3]。 闭锁蛋白(occludin)是首先被发现的紧密连接相关蛋白,在细胞间紧密连接的形成中起着重要作用,但气道上皮occludin的表达变化与哮喘发病的关系尚缺乏深入研究[4]。雾化吸入糖皮质激素是目前治疗哮喘最有效的方法之一,而布地奈德是临床上普遍应用的吸入型激素。本研究旨在观察occludin在哮喘小鼠气道上皮的表达及吸入布地奈德对其表达的影响,探讨occludin在哮喘发病中的作用及吸入型糖皮质激素治疗哮喘的机制。
1材料与方法
1.1材料
卵清蛋白 (ovalbumin,OVA)、氢氧化铝干粉 (Sigma公司),兔抗鼠occludin多克隆抗体(博奥森公司),HRP山羊抗兔二抗(康成生物公司),RNA提取试剂盒(Tiangen Biotech公司),引物合成(上海生物工程有限公司),DAB显色试剂盒 (R&D公司), 2 ×Taq PCR Master Mix试剂盒 ,Rea Master Mix (SYBR GreenⅠ)荧光定量试剂盒(Tiangen公司), SP试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。
1.2方法
1.2.1动物分组及哮喘模型的制备将24只雌性BALB/c小鼠用随机数字表法分成哮喘组、布地奈德组及对照组,每组8只。哮喘组:0、7及14 d腹腔注射OVA+ 氢氧化铝的生理盐水混悬溶液0.2 ml(含OVA 20μg,氢氧化铝2 mg)致敏,第21天起给予1%OVA雾化激发30 min,1次 /d,连续14 d。每次激发前1 h雾化吸入生理盐水2 ml。布地奈德组:致敏及激发同哮喘组,但每次激发前1 h雾化吸入布地奈德混悬液1 mg(2 ml)。对照组:用相同的方法以生理盐水代替OVA进行致敏和激发。
1.2.2支气管肺泡灌洗液(BALF)嗜酸性粒细胞计数小鼠末次激发24 h后腹腔注射1%戊巴比妥钠0.2 ml麻醉,剖开胸腔,结扎右侧主支气管,以1 ml生理盐水灌洗左肺,每只小鼠重复灌洗3次,收集灌洗液离心,取细胞悬液涂片、染色,在光学显微镜下计数嗜酸性粒细胞(eosinophies,EOS)。
1.2.3支气管肺组织HE与PAS染色取右上肺组织于4%多聚甲醛溶液固定,常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片,厚度5μm。HE染色光镜下观察支气管及其周围组织的病理改变,PAS染色观察气道黏膜上皮层杯状细胞增生和黏液分泌情况。气道上皮杯状细胞增生评分标准参照文献[5],在400倍光镜下每只小鼠随机选择10个气道,计数PAS染色阳性的杯状细胞积分 (无杯状细胞为0分,<25%为1分,25%~50%为2分,50%~75%为3分,≥75%为4分),所有杯状细胞积分取平均值。
1.2.4电镜观察气道上皮超微结构取右肺中叶切成1 mm×1 mm×1 mm大小置于装有25%戊二醛的EP管中固定,磷酸缓冲液漂洗,1%锇酸固定,蒸馏水漂洗,脱水,1∶1的包埋液 + 丙酮常温渗透,100% 包埋液渗透,包埋,沉降,聚合,切片,厚度60 nm,行镜检。
1.2.5免疫组织化学方法检测occludin的表达取右下肺组织用4%多聚甲醛溶液固定,制备3μm石蜡切片,采用链霉菌抗生物素蛋白 - 过氧化物酶连结法(SP)行免疫组织化学染色,操作步骤按试剂盒说明书进行,兔抗小鼠occludin多克隆抗体以1∶ 400稀释。阳性染色为气道上皮细胞表面和细胞间的包膜上黄色或棕黄色染色,说明有occludin表达, 同时设置阴性对照。图像用Motic Fluo 1.0软件分析,在相同放大倍数(×400)下,每张切片随机选6个气道视野,测定其光密度(optical density,OD)值。 1.2.6实时荧光定量PCR检测肺组织occludin m RNA表达取右下肺组织,每份样品取约50 mg, 充分研磨,加入1ml Trizol提取总RNA并合成c DNA, 再PCR扩增。Occludin引物序列5'-AAGAGTACAT GGCTGCTGCT-3' 为上游引物,5'-TTTGCCTCTGGA GAGAATTG-3' 为下游引物,此对引物扩增出230 bp片段。以 β-actin为内参照,上游引物为5'-AATGG GTCAGAAGGACTCCT-3',下游引物为5'-ACGGTTG GCCTTAGGGTTCAG-3',此对引物扩增出250 bp片段。反应条件(95℃ 2 min,95℃ 5 s,55.7℃ 20 s, 72℃ 15 s,共40个循环,在循环第2步采集荧光)。 反应结束后记录Ct值(基本循环数),算出 ΔCt(基本循环与内参循环数差值) 和 ΔΔCt (最低样本 ΔCt值 - 其他各样本 ΔCt值),计算目的基因m RNA的相对表达量RQ值 (occludin m RNA/β-actin m RNA即RQ值 =2-ΔΔCt)。
1.3统计学方法
采用SPSS 11.5统计软件进行数据处理,计量资料用均数±标准差(±s)表示,每组样本均数经过方差齐性检验后,单因素方差分析用于组间比较, SNK检验用于组间两两之间的比较,P <0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1BALF中EOS计数
与对照组EOS计数(0.750±0.707)比较,哮喘组EOS计数(20.875±1.808)显著增高,差异有统计学意义(P <0.01);布地奈德组EOS计数(10.625± 1.302)明显低于哮喘组,但仍高于对照组,差异均有统计学意义(P <0.01)。
2.2支气管肺组织HE染色结果
哮喘组小鼠气道上皮脱落不完整,气道黏膜层有大量炎症细胞浸润,黏液腺增生,黏膜下水肿,黏膜下层增宽,气道壁及气道平滑肌增厚,管腔狭窄, 部分气道管腔内可见黏液栓;布地奈德组病理改变较哮喘组减轻;对照组未见上述病理改变。见图1。
2.3PAS染色结果
哮喘组小鼠气道上皮PAS染色阳性的杯状细胞胞浆染成紫红色,细胞核为蓝色,可见大量杯状细胞增生,管腔内见大量染成紫红色的黏液;布地奈德组杯状细胞增生减少,管腔内见少量黏液;对照组未见明显杯状细胞增生和黏液分泌。与对照组杯状细胞积分(0.250±0.463)比较,哮喘组气道上皮PAS染色阳性的杯状细胞积分(3.375±0.744)明显增多, 差异有统计学意义(P <0.01);布地奈德组杯状细胞积分(1.625±0.518)明显低于哮喘组,但仍高于对照组,差异均有统计学意义(P <0.01)。见图2。
2.4电镜观察气道上皮的超微结构
对照组小鼠气道上皮纤毛完整,无脱落,微绒毛较多,结构清晰,上皮细胞间的连接结构完整,细胞紧密排列,基底膜完整;哮喘组气道上皮纤毛明显脱落、变稀、变短,微绒毛减少,细胞顶端呈泡状膨大,上皮细胞间的连接结构有松裂或缺失,细胞间隙增宽,基底膜不连续;布地奈德组上述表现较哮喘组减轻。见图3。
2.5免疫组织化学检测气道上皮occludin的表达
对照组小鼠气道上皮occludin主要在气道上皮细胞表面和细胞间的包膜上呈线性表达,阳性染色为黄色或棕黄色染色。布地奈德组小鼠气道上皮occludin表达较对照组明显减弱,但仍比哮喘组表达显著,见图4。哮喘组occludin的OD值(0.126± 0.032) 低于对照组(0.652±0.313) 及布地奈德组 (0.337±0.028),差异均有统计学意义(P <0.01);与对照组比较,布地奈德组的OD值仍减小,差异有统计学意义(P <0.01)。
2.6肺组织occludinmRNA的表达
目的基因的融解曲线为单峰曲线,融解温度均一,峰的形状较尖锐(见图5),表明无非特异性产物及引物二聚体生成,引物特异性良好,退火温适中。 各样品occludin m RNA的相对表达量(RQ值)见图6,3组小鼠occludin m RNA的RQ值分别为(7.200± 4.959)、(3.127±2.030)和(4.772±1.848),组间比较差异无统计学意义(F =1.960,P >0.05)。
3讨论
气道上皮屏障是支气管肺组织抵御外界环境有害刺激的第一道屏障,由气道上皮表面液和上皮细胞及上皮细胞间的连接构成,紧密连接作为细胞间连接的主要形式,位于气道上皮细胞的顶端和细胞间的侧膜上,是维持气道上皮屏障功能正常的关键结构[6]。Occludin是第一个被发现的紧密连接相关蛋白,是紧密连结结构的主要功能调节蛋白,通过封闭细胞间隙,调节细胞旁渗透性[4]。气道上皮细胞通过细胞间的连接结构阻挡环境中的变应原、粉尘、病毒等入侵,而这层结构的缺陷可导致各种环境激发因子和炎症细胞更快速地通过气道上皮屏障[7]。本实验不仅观察到哮喘小鼠气道上皮有大量炎症细胞浸润,黏液腺增生,气道壁及气道平滑肌增厚,管腔狭窄等病理改变,而且通过电镜观察还发现哮喘小鼠气道上皮细胞间的连接结构有松裂、缺失,细胞间隙增宽,基底膜不连续的现象。DE等[8]研究也发现,哮喘患者的支气管活检组织中气道上皮紧密连接相关蛋白α 连环素、ZO-1和E- 钙黏蛋白的表达较非哮喘患者明显降低,气道上皮间的紧密连接结构有缺失,哮喘患者气道上皮屏障的缺失导致环境激发因子更加容易入侵和嗜酸性粒细胞在气道上皮的浸润。本实验不仅发现哮喘小鼠气道上皮紧密连接结构遭受破坏,还观察到哮喘组小鼠气道上皮细胞occludin蛋白表达较正常对照组明显减弱,但occludin m RNA表达在3组小鼠之间的差异无统计学意义。XIAO等[9]在哮喘患者气道上皮细胞occludin表达的研究中也得到同样的结果。这也许是occludin在哮喘小鼠或哮喘患者气道上皮表达的减少与蛋白的翻译有关,而与蛋白的转录无关。本研究结果提示,气道上皮屏障结构的破坏与occludin表达的降低可能是哮喘发病的病理基础之一。
布地奈德是目前临床上普遍用于治疗哮喘的吸入型糖皮质激素,能减轻气道炎症,有效治疗哮喘[10]。 既往的研究表明,吸入糖皮质激素主要通过抑制EOS等炎症细胞在气道的募集和活性,抑制炎症介质的生成和释放,增强气道平滑肌细胞 β2肾上腺素受体的反应性等机制发挥抗炎作用[11,12]。本研究结果也显示,雾化吸入布地奈德能抑制哮喘小鼠气道上皮EOS浸润、抑制杯状细胞增生和黏液腺分泌,减轻气道黏膜充血水肿等炎症反应。但糖皮质激素对哮喘气道上皮细胞间的连接结构及occludin的表达有何影响,至今尚不清楚。SEKIYAMA等[13]的研究观察地塞米松对体外培养的人气道上皮细胞屏障功能的影响,结果发现地塞米松能促进气道上皮细胞间紧密连接的形成,降低上皮细胞的通透性, 改善气道上皮的屏障功能。本实验显示,雾化吸入布地奈德后,气道上皮细胞occludin的表达较哮喘组增加,差异有统计学意义(P <0.01)。电镜下观察到布地奈德组小鼠气道上皮细胞间紧密连接结构的破坏也较哮喘组减轻。提示布地奈德能上调哮喘小鼠气道上皮occludin的表达,促进气道上皮细胞间连接结构的修复,这也许是布地奈德治疗哮喘的另一药理机制。
综上所述,本研究结果表明,哮喘小鼠气道上皮屏障结构的不完整和occludin表达的降低,可能是哮喘发病和病情进展的机制之一,而布地奈德能上调气道上皮occludin的表达和促进受损气道上皮的修复,该研究结果为临床上雾化吸入布地奈德治疗哮喘提供了新的理论依据。
小鼠肺上皮细胞系 篇2
资料与方法
患者,男,52岁,体检发现左肺占位1个月余入院。既往有右侧颈肩部疼痛病史半年,近期加重,伴颈部活动受限。无咳嗽、咳痰、咯血等肺部症状肺部及颈部CT发现:C6椎体右侧及右侧附件区异常密度影;左肺上叶尖后段不规则形结节影。PET/CT示:左肺上叶周围型肺癌,C5、6水平右侧椎旁异常代谢影。临床诊断:①左肺上叶占位,肺癌?②C6椎体占位,转移瘤?患者于2015年1月行胸腔镜下左肺上叶楔形切除术,颈椎病灶未进一步治疗。电话随访至今患者健在,病情基本稳定。
方法与试剂:标本采用1 0%福尔马林液固定,石蜡包埋,常规HE切片染色,光镜下观察。免疫组化采用SP法染色,即用型单克隆抗体CD34、Ⅷ因子、FLI-1、CK、Vimentin等试剂。
病理特点:大体观察:送检肺叶组织大小约9 cm×4.5 cm×3cm,切面灰红,切开见一肿物大小约2.5 cm×2cm×1.8 cm,切面灰白,散在坏死区域,质中偏硬,无包膜,界尚清。镜下观察:肿瘤为界限清楚的嗜酸性结节,中心可见均匀的类似淀粉样变组织,结节显示外周细胞增多,瘤细胞呈上皮样,可呈实性巢状,瘤细胞出现脂肪样空泡。细胞异型性不明显,核分裂象罕见,肿瘤侵犯细支气管,肿瘤呈乳头状充满肺泡腔,见图1～3。
免疫组化结果:Ki67:10%,CD34(+++),F8(-),Vimentin(+++),FLI-1 (+++),CKh(-),CKL(++),EGFR(-),CD68(++),TTF-1(+),CK20(-),SP-B(-)Villin(-),CK7(+),TOPOII(+),见图4和图5。
病理结果:左肺上叶肺上皮样血管内皮细胞瘤。
讨论
PEH首先由Dail等于1983年报道[2],当时由于对其组织来源不甚清楚,将本病称为“血管内支气管肺泡肿瘤(IVBT)”。随着免疫组化技术的发展,证实了其组织来源于血管内皮细胞,随后1986年由Weiss等首次提出了PEH的命名[3]。PEH的免疫组化结果显示,某些或者全部的血管内皮标志物CD31、CD34、Ⅷ因子、FLI-1因子在细胞质内呈弥漫性着色阳性,证明了IVBT实际上是一种起源于血管内皮细胞的肿瘤。PEH是一种罕见的交界性或低度恶性的血管源性肿瘤,肺和肝脏是原发性上皮样血管内皮细胞瘤常见的好发部位,可通过血行转移至其他部位,如骨骼、软组织。2003年世界卫生组织(WHO)将其定义为“一种低到中级别的血管肿瘤,是由包埋于黏液透明性基质中的短索状和巢状的上皮样内皮细胞组织”[4]。
临床特点:PEH是一种罕见的起源于肺血管内皮细胞的肿瘤,根据目前的文献,世界范围内只有108例被公开报道。关于PEH最大宗的文献包含93个病例,平均年龄(40.1±17.3)岁,女性更多见,发病率73%。几乎半数的患者无明显临床症状,常在体检中发现。常见的临床症状包括呼吸困难、咳嗽(18.3%),胸痛(16%),咳血、体重减轻(6.5%)。骨转移常见于中轴骨,可引起受累部位疼痛、病理性骨折、脊柱压缩性骨折,甚至引起感觉异常、肌无力、截瘫[5,6,7]。肺部影像学常表现为双肺部多发小结节,病灶沿血管及支气管分布,以双下肺为重。结节大小约0.1～3.0 cm,可有钙化,少数累及胸膜并出现胸腔积液。
病理特点:PEH大体表现是大小0.3～1.0 cm的多发散在的结节,在接近胸膜下的区域分布有增多趋势。在组织切开活检时常发现相对于X线检查更多的病灶,结节的颜色从浅灰白色至浅灰褐色,偶可见黄色斑点,切片时具有软骨样的质地,切面均匀一致,结节中心有时因钙化而变得质地坚硬。低倍镜显示为圆形或卵圆形的结节,由淡粉色的无细胞核心和周围的富细胞区构成。偶尔结节的中心可能有坏死、钙化、骨化,结节外周的细胞构成一般变化不大,很多时候肿瘤的大部分是由呈软骨样透明变性,或呈黏液瘤样外观的肿瘤间质构成。瘤细胞呈上皮样,细胞境界清楚,可呈实性巢状、条索样。胞质丰富,可呈玻璃样或颗粒状,可见胞质内空泡,可见红细胞。细胞核仁不明显,核分裂少见,局部可见较多核分裂,呈轻到中度异型性。结节周边的瘤细胞可呈舌状、息肉状伸人周围的肺泡腔内或小气道,甚至胸膜。
尽管PEH的病因尚不明确,但免疫组化和电镜技术已经揭示了肿瘤的内皮细胞来源，淋巴转移途径罕见符合内皮细胞肿瘤的特点。肿瘤细胞强表达vimentin,表达CD31、CD34、Ⅷ因子抗原等血管内皮标记物中的1项或多项,20%～30%病例局灶性表达CK[8],不表达EMA、TTF-1、SMA、S-100等,Ki67一般为低表达。FLI-1基因是ETS转录因子家族中的一员,其编码蛋白是一种敏感、可靠的内皮分化标志物,对于PEH的诊断也是非常有意义的[9]。此外有文献报道血管内皮生长因子(VEGF)及血管内皮生长因子受体(VEGF Receptor)在肿瘤细胞中的表达呈阳性,提示VEGF可作为肿瘤治疗的分子靶点[10,12]。
鉴别诊断:①硬化性血管瘤:单发最常见,组织结构多样,由间质细胞和表面细胞这2种细胞构成,均表达TTF-1,而不表达CD31、CD34、Ⅷ因子等。②转移瘤:一般有原发性肿瘤病史,肺部病变有着相似于原发病灶的组织学形态,对血管源性标记物进行检测,可以鉴别。③间皮瘤:瘤细胞一般分布弥漫,分界清楚,不表达CD31、CD34、Ⅷ因子等。④上皮样血管瘤:由增生的毛细血管构成分叶状结构,界限模糊不清,血管分化较成熟,增生的血管内皮细胞无异型性。⑤上皮样肉瘤:上皮样肉瘤细胞空泡非原始血管腔,表达EMA、34βE12,胞质表达CD31,不表达Ⅷ因子,从而与PEH进行鉴别。⑥乳头状内皮细胞增生:乳头核心为纤维脉管束,增生的内皮细胞扁平。
治疗及预后:由于本病罕见,目前尚未确定统一的治疗方法。对于无症状的患者,谨慎的观察也不失为一种方法。一般情况下,对于那些局灶单结节或多结节的患者首选外科手术切除。扩大切除术与楔形切除手术相比,并不能提高患者的长期存活率[13],化疗也仅显示了微弱的效果[14]。由于肿瘤细胞的放射生物学特性(生长缓慢),放射治疗被视为无效的。但也有研究表明外科手术联合放疗对于骨转移患者的病情控制是有效果的。合适的放射治疗剂量可以保持患者对放疗有较好耐受性的同时,达到缓解局部疼痛、改善生活质量的目的。一些研究显示免疫治疗,如干扰素α对于一些肺部弥漫性病变的控制有效[15]。
小鼠肺上皮细胞系 篇3
试验通过体外试验,用不同浓度LPS刺激肾小管上皮细胞(TEC)和肺泡巨噬细胞(AM)不同时间,观察LPS对细胞免疫的激活作用,从而明确不同浓度的LPS与细胞因子产生效价的相关性。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 试验动物
清洁级6～8周SPF级Balb/c小鼠36只,购自天津医科大学实验动物中心。
1.1.2 主要仪器
二氧化碳培养箱,Shillab公司生产;高速冷冻离心机和紫外分光光度仪,Beckman公司生产;DMEM培养基,Gibco生产。
1.1.3 主要试剂
LPS,DIFCO公司生产;DMEM培养基,Gibco公司生产;IL-12 ELISA试剂盒,GeneMay公司生产;TNF-α ELISA检测试剂盒,Endogen公司生产;胎牛血清,宝灵曼公司生产。
1.2 方法
1.2.1 小鼠TEC的分离及培养
无菌取6～8周龄、健康、雄性Balb/c小鼠的肾脏,去包膜及髓质,置80目钢筛研磨;收集过筛悬液,用200目钢筛收集肾小管,4 ℃、1 000 r/min离心5 min;弃上清液,以含5%胎牛血清的DMEM培养液悬浮肾小管,用培养瓶于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育;经鉴定确定为TEC后,取3～5代细胞用于试验。
1.2.2 原代AM的分离及培养
无菌取6～8周龄、健康、雄性Balb/c小鼠(雌雄不分)分离原代AM,方法参照参考文献[3]。将AM接种于24孔细胞培养板,置于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育;经鉴定为AM细胞后用于试验。
1.2.3 检测LPS诱导TEC分泌IL-12的动态变化
用含有LPS的DEME培养液重悬TEC,调整细胞使其处于静止期(C0期),同时设PBS对照组。用2 μg/mL的LPS刺激分组细胞,每个试验组设6个复孔,分别于0,4,8,12,16,20,24,36小时时收集上清液0.5 mL,用ELISA法测定IL-12的浓度。
1.2.4 检测LPS诱导TEC分泌IL-12的量效关系
以浓度梯度为0,5,10,20,30,40,50 μg/mL的LPS分别刺激分组的TEC,每个试验组设6个复孔,同时设PBS对照组。收集培养24小时的上清液0.5 mL,用ELISA法测定IL-12的浓度。
1.2.5 检测LPS诱导AM分泌TNF-α的动态变化
将分离的AM随机分组,同时设PBS对照组。用10 μg/mL的LPS刺激24孔细胞培养板中的AM,分别于0,1,2,3,4,5,6小时时收集上清液,用ELISA法检测TNF-α的浓度。
1.2.6 检测LPS诱导AM分泌TNF-α的量效关系
将分离的AM随机分组,同时设PBS对照组。以浓度梯度为0,1,10,20,40,60,80,100 μg/mL的LPS分别刺激AM,每个试验组设6个复孔,收集培养24小时的上清液0.5 mL,用ELISA法测定TNF-α浓度。
1.2.7 统计学处理
应用SPSS 10.0统计软件对试验数据进行统计学分析。数据用平均值±标准差表示,组间均数比较用t检验。
2 结果
2.1 LPS诱导TEC分泌IL-12的动态变化
用2 μg/mL的LPS刺激C0期TEC不表达IL-12;刺激8 h后,细胞表达IL-12的量开始逐渐增加;24小时达到高峰;36小时明显下降,与24小时相比差异显著(P<0.05)。见图1。
2.2 LPS诱导TEC分泌IL-12的量效关系
5 μg/mL的LPS可诱导TEC表达IL-12,随着LPS浓度的增加,TEC分泌IL-12的量逐渐增大。当LPS的浓度增加到20 g/mL时,IL-12的分泌量达到峰值;随后当LPS的浓度继续增加时,IL-12的分泌量反而下降,但与20 μg/mL LPS浓度组相比差异不显著(P>0.05)。见图2。
2.3 LPS诱导AM分泌TNF-α的动态变化
随着LPS刺激时间的延长,TNF-α的分泌量逐渐升高;LPS(10 μg/mL)刺激2 h后,TNF-α的分泌量达到峰值(P<0.01),随后TNF-α的分泌量逐渐下降。见图3。
2.4 LPS诱导AM分泌TNF-α的量效关系
随着LPS浓度的增加,TNF-α分泌水平也有明显不同;用10 μg/mL LPS刺激2 h后,TNF-α的分泌量达到最大,且刺激组与对照组之间的差异有统计学意义(P<0.01)。见图4。
3 讨论
LPS可诱导炎症细胞因子的表达。研究用LPS刺激TEC,可诱导IL-12的表达,且IL-12的表达量与LPS呈剂量及时间依赖关系。LPS作用TEC 8 h后,细胞即表达IL-12;但当LPS浓度增加到20 μg/mL及刺激36小时时,TEC的IL-12表达量反而减少,提示细胞对LPS的长时间及高浓度的刺激可能表现耐受性。LPS耐受性是机体对内毒素刺激的一种保护性调节机制。
巨噬细胞是体内分布最多的天然免疫细胞。AM是肺脏局部最早接触外来病原体或细菌内毒素的免疫防御细胞之一。正常情况下,AM的主要功能是摄取和吞噬进入肺泡腔的颗粒或细菌毒素,保持肺泡腔清洁和起到抗菌的作用,同时AM作为肺内局部炎症反应的主要启动细胞,可以产生过量的炎性介质,并可引起其他免疫活性细胞的激活及炎性因子的释放,进而造成肺脏局部过度炎症反应,形成急性肺损伤[4,5]。本试验结果表明:用10 μg/mL LPS刺激小鼠体外培养的AM,在刺激后2小时时TNF-α的合成释放达到峰值。随着LPS浓度的增加,TNF-α分泌水平也有明显不同,用10 μg/mL LPS刺激后2小时时TNF-α分泌量达到最大。此结果为LPS作为非特异性免疫调节剂应用于感染性疾病的防治提供了理论依据。
参考文献
[1]TRAUTMANN M,CROSS A S,REICH G.Evaluation of a competi-tive ELISA method for the determination of Klebsiella O antigens[J].J Med Microbiol,2001,44(1):44-51.
[2]THOMAS K H,MARTIN E A.Granulocyte colony-stimulating fac-tor worsens the outcome of experimental Klebsiella pneumoniae pneu-monia through direct interaction with the bacteria blood[J].1998,91(7):2525-2535.
[3]黄宏,蒋建新,朱佩芳,等.细菌脂多糖、脂蛋白和DNA对小鼠肺泡巨噬细胞体外激活的协同作用[J].2005,85(21):1468-1470.
[4]INANE K.Microglial activation by purines and pyrimidines[J].Gli-a,2002,40(2):156-163.
小鼠肺上皮细胞系 篇4
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
清洁级、8周龄雌性NOD小鼠(中国科学院上海实验动物中心),饲养环境通风良好,小鼠自由进食进水,标准饲料。仅在葡萄糖耐量试验测量的前夜禁食。
1.1.2 主要试剂及仪器
人GLP-1(7-36)酰胺(San Jose),BrdU(Sigma),兔抗细胞角蛋白抗体(Nichirei,Tokyo),生物素化的山羊抗兔IgG抗体(Vector),卵白素-FITC(Vector),豚鼠抗猪胰岛素抗体(Dako),罗丹明标记的山羊抗豚鼠IgG抗体(Chemicon,Temecula),兔抗PDX-1抗体(Chemicon,Temecula),FITC标记的山羊抗兔IgG抗体(Molecular Probes,Eugene),小鼠抗BrdU单克隆抗体和过氧化物酶标记的抗小鼠IgG2a抗体(Amersham Pharmacia Biotech)。微型渗透泵(Cupertino),光镜和免疫荧光显微镜(Provis AX80T and AX80TR,Olympus)。
1.2 方法
1.2.1 动物分组及处理
将腹腔葡萄糖耐量试验中糖耐量没有差异的8只小鼠选为实验动物,随机分为两组,实验组和对照组各4只,实验组用GLP-1治疗,对照组用生理盐水治疗。根据药代动力学、GLP-1分子量、小鼠体质量,计算出所需要的GLP-1的血药浓度,根据血药浓度,决定每只小鼠所需的GLP-1量。GLP-1半衰期短,需要持续给药,用微型渗透泵运载GLP-1和生理盐水,以1.5 pmol/(kg·min)的恒定速度给药,按照泵操作说明书,在无菌条件下,将泵埋在小鼠皮下,并保证泵发挥作用,保持有效的血药浓度。用药4周后,向两组小鼠腹腔内注射BrdU 100μg/g体质量[6]。
1.2.2 组织切片制备
注射BrdU 6 h后,将小鼠用乙醚麻醉,切除其胰腺,用10%中性甲醛固定,石蜡包埋切片(5～7μm厚,间距500μm)。
1.2.3 用双重免疫荧光染色检测DCK和胰岛素
胰腺组织切片用兔抗细胞角蛋白抗体和生物素化的山羊抗兔IgG抗体孵育,用卵白素-FITC显色进行DCK染色。再用豚鼠抗猪胰岛素抗体和罗丹明标记的山羊抗豚鼠IgG抗体进行胰岛素染色。荧光显微镜下观察胰腺导管上皮细胞的分化。
1.2.4 用双重免疫荧光染色检测PDX-1和胰岛素
胰腺组织切片用兔抗PDX-1抗体和FITC标记的山羊抗兔IgG抗体进行PDX-1染色。再用豚鼠抗猪胰岛素抗体和罗丹明标记的山羊抗豚鼠IgG抗体进行胰岛素染色。荧光显微镜下观察PDX-1和胰岛素在胰腺导管上皮中的表达。
1.2.5 用双重免疫染色检测BrdU和DCK并计数BrdU-阳性的导管上皮细胞
胰腺组织切片用小鼠抗BrdU单克隆抗体和过氧化物酶标记的抗小鼠IgG2a抗体孵育,二氨基联苯胺(DAB)显色。用兔抗细胞角蛋白抗体和生物素化的山羊抗兔IgG抗体孵育,ABC法用苏丹绿(SG)显色进行DCK染色。光镜下观察导管上皮细胞的增殖并计数导管上皮细胞,计算出BrdU-阳性的导管上皮细胞相对于所有计数的导管上皮细胞的百分比,即BrdU-阳性导管上皮细胞的百分数。
1.3 统计学方法
应用SPSS 15.0统计软件进行统计学分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,组间比较采用两独立样本t检验,P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 DCK/胰岛素双重免疫荧光染色结果
在GLP-1治疗组小鼠胰腺导管上皮细胞(DCK阳性,绿色)中出现胰岛素阳性细胞(红色)及包含胰岛素阳性细胞的胰岛样细胞团(见图1),而在对照组没有观察到。
A:起源于胰腺导管上皮的单个胰岛素阳性细胞;B:起源于胰腺导管上皮的包含胰岛素阳性细胞的胰岛样细胞团
2.2 PDX-1/胰岛素双重免疫荧光染色结果
在GLP-1治疗组小鼠胰腺导管上皮细胞中可见PDX-1(绿色,在细胞核中)和胰岛素(红色,在细胞浆中)双阳性细胞(见图2),而在对照组没有观察到。
2.3 BrdU/DCK双重免疫染色后BrdU-阳性导管上皮细胞的计数结果
在GLP-1治疗组小鼠的胰腺组织切片中见到较多BrdU阳性的导管上皮细胞,而在对照组没有或很少见到。GLP-1治疗组小鼠BrdU-阳性导管上皮细胞的百分数为(0.20±0.03)%,与对照组小鼠BrdU-阳性导管上皮细胞的百分数(0.02±0.02)%相比明显增高(t=9.245,P<0.001)。
A、B、C所示为同一个起源于胰腺导管上皮的胰岛样细胞团,A:PDX-1阳性的细胞核;B:胰岛素阳性的细胞浆;C:细胞核PDX-1阳性并细胞浆胰岛素阳性的双阳性细胞
3 讨论
实验发现,在GLP-1治疗组小鼠胰腺导管上皮细胞中出现了胰岛素阳性细胞及包含胰岛素阳性细胞的胰岛样细胞团,而在对照组没有观察到,这表明GLP-1促进了NOD小鼠胰腺导管上皮细胞向胰岛素阳性细胞的分化。
PDX-1是胰腺原基中最早的分子标记,是胰腺早期发育和较晚期胰岛β细胞分化的关键性转录因子,而且能调节包括胰岛素、葡萄糖转运蛋白2、葡萄糖激酶在内的多种基因的表达,具有维持成熟β细胞功能的作用[7,8]。经过PDX-1/胰岛素双重免疫染色,实验人员在GLP-1治疗组小鼠胰腺导管上皮细胞中见到PDX-1/胰岛素双阳性细胞,而在对照组没有观察到,可见GLP-1诱导了导管上皮细胞向胰岛素阳性细胞的分化和导管上皮细胞内PDX-1的生成,这与以往的报道[9]相一致,PDX-1的表达标志着导管上皮细胞重新获得分化潜能。另外有研究显示,GLP-1可能通过促进PDX-1的转录和翻译,加速PDX-1的磷酸化使其从胞浆转位到胞核,使PDX-1与胰岛素基因启动子的结合活性增加[10];在胰岛素启动子中,PDX-1能招募更多的核蛋白如E47/Panl、BETA2/NeuroD1等形成复合物,并通过彼此间的相互作用共同促进胰岛素的转录[11]。本实验中见到的PDX-1/胰岛素双阳性细胞PDX-1也出现在细胞核中,这表明PDX-1可能在GLP-1诱导胰腺导管上皮细胞向胰岛素阳性细胞分化的过程中起重要作用。
BrdU是胸腺嘧啶核苷的类似物,当细胞处于DNA合成期(S期)时,会有BrdU掺入到新合成的DNA中,它可作为增殖细胞的标记物。在本实验中,GLP-1治疗组小鼠的胰腺组织切片中可见到较多BrdU阳性的导管上皮细胞,而在对照组没有或很少见到。与对照组相比,GLP-1治疗组小鼠BrdU-阳性导管上皮细胞的百分数明显增高,这表明GLP-1促进了NOD小鼠胰腺导管上皮细胞的增殖。
小鼠肺上皮细胞系 篇5
1 材料
新生小鼠,吉林大学动物试验中心提供;RPMI1640细胞培养基、0.25%胰蛋白酶、台盼蓝染液,均由Sigma公司生产;胎牛血清,Hyclone公司生产。
2 方法
2.1 不同血清浓度培养小鼠肺细胞
将小鼠颈椎脱臼法处死,解剖,取出肺组织,加入0.25%胰酶液,37℃消化30 min后终止消化,液体过300目筛置于无菌培养皿中,用注射器的活塞橡胶头在筛子上轻轻研磨组织,得到滤液2 000 r/min离心10 min,弃上清液。加入0.5 m L红细胞裂解液,常温裂解2 min,离心5 min,PBS缓冲液2 m L重悬细胞,离心10 min,弃上清液。加入PBS缓冲液5 m L,再次离心1次,弃上清液,血细胞计数板计数。将细胞数量调整到5×105/m L左右,转移至96孔培养板中分别用配制好的血清浓度为5%、10%、20%、40%的培养液中,在37℃恒温培养箱中培养。
2.2 观察与计数
每2 d在倒置显微镜下观察细胞形态,并拍照记录。细胞活性测定(台盼蓝排斥试验)。重复3次求平均值,并计算细胞的存活率[6]。
3 结果与分析
3.1 细胞形态学观察结果
细胞培养5 d后,在倒置显微镜下能看到5%、10%、20%、40%血清浓度组的肺细胞,细胞成规则的卵圆形,透亮折光度较好,但均未见贴壁细胞。
5%血清浓度组细胞生长状态好,细胞数目较多(见298页彩图1)。10%血清浓度组目测细胞数目最多,细胞生长状态较好,能清晰看到细胞中心的细胞核(见298页彩图2)。20%血清浓度组细胞数目较少,有形态不完整的细胞(见298页彩图3)。40%血清浓度组细胞数量最少(见298页彩图4)。
3.2 台盼蓝染色检测肺细胞成活数目
乳鼠肺细胞在第3~5 d达到对数生长期,生长速度较快,第7天后趋于平缓,维持一定时间的稳定期后,细胞数量开始减少。在4个浓度中,10%浓度组的细胞生长状况较好。5%血清浓度组的细胞总体生长状况良好,细胞数目仅次于10%血清浓度组;10%血清浓度组的细胞,活细胞数量是4个浓度组中最多的,细胞生长趋势好;20%血清浓度组的细胞,指数生长期后细胞有膜破损状况,细胞死亡数目开始增多,短暂的稳定期后细胞数量开始下降;由于血清浓度过高,40%血清浓度组的细胞潜伏期及指数期时细胞增长速度缓慢,后期细胞死亡速率超过细胞生长速率,因此细胞数量是4个浓度中最少的(见图5)。
4 讨论
呼吸系统疾病发病率高,在该领域内的试验性研究已从实验动物的大体水平逐渐转移到单细胞乃至分子水平,要从结果复杂的肺组织检测某种细胞必须对肺组织进行分离,首要步骤是肺细胞体外原代培养,这就需要一种简单、稳定、高效的肺细胞原代培养的方法,为科研工作提供高效的平台[8]。研究发现:不同血清浓度培养基对乳鼠肺细胞原代培养有不同程度的影响,5%血清浓度组的细胞生长状态较好,可能因血清浓度不是很高,营养不够充分,活细胞数量少于10%血清浓度组的细胞;20%血清浓度组的细胞,显微镜下细胞数量较少,偶有细胞膜破损的细胞,生长曲线显示,指数期后细胞的死亡速率低于生长速率,细胞成衰退趋势,这个血清浓度不太适宜肺细胞的体外原代培养;40%血清浓度组的细胞生长状况不好,细胞生长缓慢且细胞膜破碎,潜伏期及指数期细胞均生长缓慢,短暂的稳定期后细胞数量急剧下降,此血清浓度过高不适宜小鼠肺细胞的体外原代培养;10%血清浓度组的细胞,在倒置显微镜下的细胞形态完整,台盼蓝染色测定的活细胞数目最多,是4个浓度组中生长状态最好的,因此也是体外小鼠肺细胞原代培养的最适血清浓度。
摘要：为了比较不同血清浓度的培养基对小鼠肺细胞原代培养的影响,在常规RPMI 1640培养基的基础上添加不同浓度的新生牛血清(5%、10%、20%、40%),每隔1 d在倒置显微镜下观察培养细胞的形态并用台盼蓝染色法统计细胞数目,绘制生长曲线。结果表明:4个血清浓度组中均有原代肺细胞生长增殖,血清浓度为10%的培养液培养的细胞生长状况最好,细胞形态完整清晰,数量较多,更适合小鼠的肺细胞生长。说明10%血清浓度的培养液最适合小鼠肺细胞的原代培养。
关键词：小鼠,肺细胞,胰酶消化法,原代培养,血清浓度,生长曲线
参考文献
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[6]王祎,杨磊,王海东,等.不同浓度血清对肝细胞原代培养的影响[J].农业技术与装备,2009(2):42-43.
[7]董萍,杨永鹏,丁克祥,等.不同血清浓度及体外培养时间对小鼠成纤维细胞L929细胞系生长曲线和细胞形态学的影响[J].中国老年学杂志,2011,31(6):2020-2024.
小鼠肺上皮细胞系 篇6
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
小鼠胚胎成纤维细胞 (NIH3T3) 购于中国典型培养物保藏中心;DMEM培养基购于Hyclone公司;新鲜特等优质胎牛血清 (FBS) 购自杭州四季青公司;重组ADAMTS-1 购自Abcam公司;RNA提取试剂盒购于康为世纪;逆转录试剂盒、c DNA合成试剂盒购于Fermants公司;Ⅰ型胶原蛋白抗体由广州威佳科技有限公司提供试用装;TGF-β 单克隆抗体及HRP- 标记的羊抗兔二抗购自康为世纪;BCA蛋白浓度测定试剂盒、RIPA裂解液、PMSF购于碧云天生物技术研究所。
1.2 实验方法
1.2.1 NIH3T3的体外培养和分组
NIH3T3用含10%胎牛血清的DMEM在5%二氧化碳 (CO2) 、37℃下恒温培养, 0.25%胰蛋白酶消化、传代;将细胞均匀接种在6孔板上, 待细胞亚融合后改用无血清的DMEM培养液同步化饥饿12 h, 依实验要求共分正常对照组、低浓度组 (1 nmol) 、中浓度组 (10 nmol) 和高浓度组 (20 nmol) 4组, 每组10个样本。刺激24 h后检测COL1、TGF-β1水平, 实验重复3次。
1.2.2 RT-PCR
各组采用试剂盒法提取总RNA, 每10 cm2加入1 mL Buffer RLT, 裂解, 室温下5min;以每1 mL Buffer RLT加入200μL氯仿摇匀, 室温下2 min, 4℃离心12 000 r/min 10 min;取上清液移至新EP管, 加入等体积的70%乙醇;将液体移入装有收集管的吸附柱中, 4℃离心12 000 r/min, 20s;加入700μL Buffer RW1, 4℃离心12 000 r/min, 20s;加入500μL Buffer RW2, 4℃离心12 000r/min, 2 min, 吸附柱室温晾干, 置去酶离心管中, 加入30μL RNase-Free water, 4℃离心12 000 r/min, 1 min, 收集RNA溶液。用核酸蛋白分析仪鉴定RNA纯度和量, 所用RNA的OD260/OD280均在1.8~2.0之间, 表示样品为纯RNA。获得的RNA按逆转录试剂盒说明书进行操作, 加入总RNA 5μL、Primer oligo1μL、DEPC处理的水6μL、5×buffer 4μL、Ribolock Rnase inhibitor 1μL、10 mmol dNTP mix 2μL、M-Mu LV 1μL, 70℃5 min, 42℃60 min, 70℃5 min, 合成cDNA。产物置于-70℃保存, 以备PCR扩增。引物均由上海生物工程技术有限公司合成。总反应体系为20μL。目的基因COL1上游引物:5'-GACAGACTGGCAACCTCAAGAA-3', 下游引物:5'-GGATGGAGGGAGTTTACACGAA-3', 产物长度273 bp。反应条件:94℃预变性2 min, 94℃变性20 s, 56.8℃退火1min, 72℃延长30 s, 循环30次, 最后72℃延伸10min。目的基因TGF-β1上游引物:5'-GACCGCAACAACGCAATCTATG-3', 下游引物:5'-TATTCCGTCTCCTTGGTTCAGC-3', 产物长度300 bp。反应条件:94℃预变性3 min, 94℃变性30 s, 54℃退火30 s, 72℃延长1 min, 循环30次, 最后72℃延伸5 min。内参β-actin上游引物:5'-TGTCCCTGTATGCCTCTGGT-3', 下游引物:5'-GGTCTTTACGGATGTCAACG-3', 产物长度459 bp。在相同的条件下同管扩增β-actin。扩增结束后, 各组PCR产物取5μL进行琼脂糖凝胶电泳, EB染色, Alpha Imager 3400凝胶成像分析系统成像, Photoshop CS5软件测定各组吸光灰度值, 计算目的/内参灰度比值。
1.2.3 Western blotting
按实验分组条件处理后, 收集细胞, 用预冷PBS洗涤3次, 加入细胞蛋白裂解液100μL, 冰浴裂解30min, 4℃离心20000r/min, 15 min, 收集上清液。BCA蛋白定量法测定蛋白含量。波长490 nm处紫外分光光度计测吸光度, 以﹝ (样本孔OD值-对照孔OD值) ×1893.021-42.306﹞×10-3计算各样本蛋白含量。测得蛋白含量最低的样品加20μL, 再根据蛋白量相等原则计算出其他样品上样量, 用去离子水将总体积补足至20μL, 移至EP管中, 加入适量体积的5×上样缓冲液, 100℃变性5~10min, 然后进行10%SDS-PAGE电泳, PVDF膜转印2 h, 行Western blotting检测。以5%脱脂奶粉封闭2 h, 分别加入一抗 (1︰100, 1︰750) 4℃过夜, 孵育二抗 (1∶1 000) 1 h, 采用ECL显色法显色;凝胶成像系统扫描分析, Photoshop CS 5.0软件测定各组灰度值, 以COL1/APDH、TGF-β1/GAPDH显影条带灰度值的比值表示COL1、TGF-β1的相对蛋白含量。实验重复3次。
1.3 统计学方法
采用SPSS 13.0 软件进行统计学分析, 所有实验数据以均数±标准差 (±s) 表示, 组间比较用单因素方差分析, P <0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 ADAMTS-1 对Ⅰ型胶原蛋白的影响
RT-PCR及Western blotting结果显示, 加入ADAMTS-1 刺激后COL1 m RNA水平及蛋白水平均降低, 并且随着ADAMTS-1 浓度升高, 成纤维细胞中COL1 m RNA水平、蛋白水平也逐渐降低, 见图1。
2.2 ADAMTS-1 对TGF-β 的影响
RT-PCR及Western blotting结果显示, 加入ADAMTS-1 刺激后TGF-β m RNA水平及蛋白水平均降低, 并且随着ADAMTS-1 浓度升高, 成纤维细胞中TGF-β m RNA水平、蛋白水平也逐渐降低, 见图2。
A:COL1的RT-PCR结果以及关于COL1与β-actin灰度比的统计条图;B:COL1的Western blotting结果以及关于COL1与GAPDH灰度比的统计条图。1) 与对照组比较, P<0.05;2) 与低浓度组比较, P<0.05;3) 与中浓度比较, P<0.05
A：TGF-β 的 RT-PCR 结果以及关于 TGF-β 与 β-actin 灰度比的统计条图；B：TGF-β 的 Western blotting 结果以及关于 TGF-β与 GAPDH 灰度比的统计条图。1）与对照组比较，P <0.05；2）与低浓度组比较，P <0.05；3）与中浓度比较，P <0.05
3 讨论
近20 余年来, 肺纤维化的发病率和死亡率在世界各地均呈上升趋势, 国外报道, IPF的发病率约为14~43 人/10 万, 确诊后中位生存期3~5 年, 严重危害人类健康[4]。该病的形成机制复杂, 尚不完全清楚, 临床上缺乏有效的治疗手段。历来应用皮质类固醇和环磷酰胺、硫唑嘌呤等免疫抑制剂及秋水仙碱等抗纤维化制剂治疗, 但疗效欠佳。因此, 研究该病的发病机制, 阐明其病理生理过程, 寻找有效的治疗药物和靶点成为目前国内外学者研究的热点。以往都致力于致肺纤维化因子的研究, 很少对拮抗纤维化的因子进行探讨。
ADAMTS-1 意为含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶, 是继基质金属蛋白酶MMP后新发现的一类Zn2+依赖的分泌型金属蛋白酶, 是ADAMTS家族的第一个成员, 1997 年由KUNO等人[5]在小鼠结肠癌基因差异显示和筛选中发现并命名, 在哺乳动物组织中广泛表达, 可由巨噬细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞等多种细胞合成和分泌。与多种疾病有关, 如肿瘤浸润[6]、动脉粥样硬化[7]、椎间盘退变[8]、哮喘[9]、关节炎[10]等。郭春艳[11]通过动物实验发现ADAMTS-1 与心肌纤维化密切相关, 本课题组肖兴洲等人[3]也发现在肺纤维化大鼠肺部组织中ADAMTS-1 的表达降低, 推测ADAMTS-1具有抗纤维化作用。
从本实验检测各组COL1 m RNA及蛋白表达的结果来看, 对照组COL1 的表达较各ADAMTS-1 浓度组高, 并且ADAMTS-1 浓度越高, COL1 表达越低。该结果说明ADAMTS-1 可以降低成纤维细胞内Ⅰ型胶原蛋白的表达。
细胞外基质包括Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、纤连蛋白和蛋白多糖。肺纤维化是各种致纤维化因素和抗纤维化因素之间的平衡被打破, 细胞外基质积聚, 最后疤痕组织形成的结果。所以, ADAMTS-1 通过降低Ⅰ型胶原蛋白可能具有一定的抗纤维化作用。
纤维化的重要调节因子包括:细胞因子 (IL-13、IL-21 和TGF-β1) 、趋化因子 (MCP-1 和MIP-1β) 、血管生成因子 (VEGF) 、生长因子 (PDGF) 、过氧化物酶体增殖物激活受体 (PPARs) 、急性期蛋白 (SAP) 、半胱氨酸蛋白酶、肾素- 血管紧张素- 固酮系统 (血管紧张素Ⅱ) 。在众多调节因子中, TGF-β1是公认的最重要的调控因子, 是诱导器官纤维化的总开关。在组织损伤或炎症时, TGF-β1促进成纤维细胞分化成肌成纤维细胞, 肌成纤维细胞表达 α- 平滑肌肌动蛋白 (α-SMA) 、钙调蛋白和细胞外基质, 促使细胞外基质过度积聚, 疤痕形成, 导致纤维化。本实验检测TGF-β1m RNA及蛋白的表达发现, 各ADAMTS-1 浓度组TGF-β1的表达较对照组低, 并且ADAMTS-1 浓度越高, TGF-β1的表达越低。证明ADAMTS-1 能够降低成纤维细胞内TGF-β1的表达。ADAMTS-1 降低Ⅰ型胶原蛋白, 下调TGF-β1可能是其潜在机制。
TGF-β1可由各种细胞合成, 以转化生长因子-转化生长因子结合蛋白复合体的形式分泌。在纤维蛋白溶酶、活性氧、血小板反应素-1 和酸性物质蛋白水解作用下, TGF-β1与转化生长因子结合蛋白 (LTBP) 分离, 具有活性, 与相应的受体识别结合, 激活下游的信号通路, 发挥其功能[12]。目前, 下游部分分子途径已经被确认, 包括Smad途径、PI3K/Akt途径和MAPK途径[13]。ADAMTS-1 是否下调或者抑制TGF-β1的下游信号通路, 下调或者抑制TGF-β1的哪条下游信号通路, 目前并不明确, 还有待进一步实验研究。探索拮抗纤维化的因子在纤维化过程中的变化规律并进行外源性的干预, 可能为寻求拮抗纤维化的方法开辟新的思路。
摘要：目的 探讨含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶 (ADAMTS-1) 对小鼠肺成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白 (COL1) 表达的影响及可能的机制。方法 应用细胞培养技术进行小鼠肺成纤维细胞培养, 利用ADAMTS-1为刺激因子, 将培养的细胞分为空白组、低、中、高浓度组, 应用逆转录-多聚酶链反应技术 (RT-PCR) 观察COL1 mRNA、转化生长因子β1 (TGF-β1) mRNA在各组中的表达情况;采用蛋白质印迹法 (Western blotting) 观察各组细胞COL1、TGF-β1的变化。结果 与空白组相比, 低浓度组、中浓度组、高浓度组的COL1、TGF-β1表达水平下降, 其中高浓度组表达水平最低 (P<0.05) 。结论 ADAMTS-1能降低COL1的表达, 抑制TGF-β1是其抗纤维化作用的可能潜在机制。