输卵管上皮细胞

输卵管上皮细胞（精选8篇）

输卵管上皮细胞 篇1

实验室常用的细胞培养液的主要成分是氨基酸、葡萄糖、无机盐、维生素和微量元素等。为了维持稳定的pH,培养液中一般有一个pH缓冲系统,同时常加入少量的酚红作为pH指示剂。另外培养液中一般需要加入一定量的血清。 培养液中的氨基酸除了13种细胞生长所必须的氨基酸外,往往加入一些非必需的氨基酸以促进细胞的生长。在必需的氨基酸中,L-谷氨酰胺在溶液中不稳定(在4℃培养溶液中半衰期为3个星期,37℃中为1个星期),需要在使用时加入。 葡萄糖在培养液中的含量一般为1 g/L(低糖)或4.5 g/L(高糖)。它是细胞代谢重要的能量来源。 细胞培养液中都有一个平衡盐系统,用于维持细胞的渗透压、维持pH和细胞正常的代谢等。最常用的平衡盐系统有Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS)、 Earle's balanced salts (EBSS)和 Hanks' balanced salts (HBSS)。它们都含有细胞所必需的5种离子:钠离子、钾离子、钙离子、镁离子和磷酸根。培养液中的pH缓冲系统一般是碳酸氢钠和HEPES等。培养液中的维生素包括叶酸、维生素B、烟酰胺和吡哆醇等。培养液中的微量元素包括Cu2+、Zn2+、和Mn2+等。 血清中含有生长因子、促进细胞帖壁的因子、矿物质、激素、脂类等,另外血清可以抑制胰酶的活性。 一般培养液都含酚红作为pH指示剂,它是细胞培养液状态的一个很好的标志。过长时间的培养或者微生物的污染都会使培养液的pH发生改变。需要注意的是,酚红可以模拟类固醇激素(尤其是雌性激素)的作用,所以如果培养的细胞对雌性激素敏感(比如实验本身就是研究雌性激素对细胞的作用),就应当使用没有酚红的培养液。

在生殖系统细胞培养方面,基础培养液主要用M199培养液或DMEM培养液。DMEM培养基 (Dulbcco's Modifed Eagle Medium)含L-谷氨酰胺,不含碳酸氢铵、丙酮酸钠,2~8℃保存。DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基,DMEM细胞培养基是在MEM培养基的基础上研制的。与MEM比较增加了各种成分用量,同时又分为高糖型(低于4 500 g/L)和低糖型(低于1 000 g/L)。高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长,适于生长较快、附着较困难肿瘤细胞等。 这种培养基的特点:①氨基酸含量为依格尔培养基的2倍,且含有非必需氨基酸,如甘氨酸等; ②维生素含量为依格尔培养基的4倍; ③含有糖酵解途径中的重要物质——丙酮酸;④含有微量的铁离子。该类培养基广泛应用于疫苗生产和各种初代病毒宿主细胞的细胞培养及单一细胞培养;如:A9、3T6、BALB/3T3、COS-1、COS-3、COS-7、L6、WEHI-3b等细胞系的培养。

M199培养液含Earle’s salts 和 Hank’s salts。 Media 199可促使鸡胚成纤维细胞在无血清条件下生长。与配入血清可用于各种细胞的培养。Earle’s salts组成碳酸盐缓冲液,可维持在CO2培养箱中的pH值,在大气环境下会使培养液pH值迅速上升。Hank’s salts的盐溶液用于均衡大气,在CO2培养箱中使用会使培养液pH值迅速下降。

1 卵母细胞体外培养液成分

目前, 卵母细胞成熟液大部分采用稳定性较好的TCM199 作为基础培养液。在牛上, TCM199 添加10 %血清、促性腺激素和雌激素,卵母细胞成熟率可达到90 %;在猪上,卵母细胞成熟液除用TCM199 外,NCSU223 也被较多使用,但成熟率差别不大。由于在使用TCM199 时需加入成分比较复杂的血清,这使得在研究中难以明确找出影响卵母细胞成熟的因素及其程度。许多学者通过研究,寻找一些成分明确的培养液。研究结果表明,合成培养液(如SOFM、KSOM) 中用BSA 或PVA 及氨基酸代替血清,作为成熟培养液,可使卵母细胞成熟,并能进行受精后的发育( Eckert 等,1995)。用复合输卵管合成液(cSOFMaa) 培养成熟的牛卵母细胞发育到囊胚的能力与TCM199 + NCS培养成熟的卵母细胞相同(Wat son 等,1999) 。

1.1 激素

目前,绝大多数研究者在卵母细胞的体外成熟培养中,都添加促性腺激素或类固醇激素或两者的混合物,但它们对卵母细胞成熟、受精和早期发育的作用及作用机理尚未完全了解清楚。在猪的卵母细胞体外成熟液中加PMSG培养,成熟率为67.7 %,而不加的仅为17.8 %,可见生殖激素对促进卵母细胞成熟有明显作用(秦鹏春等,1995)。大量研究结果表明,FSH 可使卵丘细胞扩散达100 %,并且卵丘细胞的扩散程度随着FSH 浓度的增加而提高(Choi 等,2001)。0.05IU ree2hFSH添加到COCGs 的培养液中,导致卵母细胞胚泡破裂,COCGs 直径增加(Van 等,1996) ,2 ×10 - 3 IU/ mL FSH能够刺激腔前卵泡的生长及腔的形成,并且抑制颗粒细胞的凋亡(Mao 等,2002)。在无FSH 的培养中卵母细胞成熟率显著降低,且退化量达36%(Bottcher等,1991)。但也有学者认为,在含有血清的成熟液中添加FSH ,既没有提高卵母细胞形成第一极体的比例,也没有显著影响体外受精和核移植后的发育( Keefer 等,1993)。Brackett (1989)研究结果表明,卵母细胞体外成熟培养基中加入LH能促进卵母细胞发育,并有利于随后的体外受精和体外培养,而Fukui 等(1989)则认为LH无这一作用。江金益等(1989)添加人绒毛膜促性腺激素、促卵泡素,奶牛卵母细胞成熟率为83.5 % ,效果都很明显。类固醇激素对哺乳动物的作用仍有争论,在卵泡培养过程中,类固醇合成的抑制剂对卵母细胞成熟后的受精和发育能力有不良影响。Singh 等(1993)报道猪卵母细胞体外成熟在雌二醇和FSH 存在时,胚泡损伤率下降。

1.2 血清

血清中含有蛋白质、维生素、脂肪、激素、氨基酸等营养物质和多肽类生长因子,可防止透明带硬化和促进受精的发生。因此,体外成熟卵母细胞的大多数试验均添加一定浓度的血清,能有效提高卵母细胞的体外成熟率。试验结果表明,对于牛卵母细胞的体外成熟,发情牛血清和犊牛血清均优于BSA。已有研究结果表明,血清中可能存在不利于胚胎发育的成分,造成胎儿体重过大、流产等综合症,且血清质量和产地等的影响,使试验结果有大的误差。鉴于由血清培养产生的种种问题,人们在卵母细胞体外成熟液中常添加血清替代物,如:牛血清白蛋白、聚乙烯醇、氨基酸和非离子型表面活性剂Twin 280等。

1.3 生长因子和细胞因子

在基础培养基中添加各种生长因子和细胞因子,如胰岛素、EGF 、IGF21 、白血病抑制因子、转化生长因子、重组牛生长激素(rbGH)等,对卵母细胞的生长、成熟起重要调节作用。EGF是一种卵泡卵母细胞成熟的诱导剂,能促进卵母细胞的体外成熟。I m 等(1995)发现,30 μg/L 的EGF有利于牛卵泡卵母细胞的体外成熟,使达到第2 次减数分裂中期的卵母细胞达97%。

1.4 卵泡液

卵泡液是卵母细胞体外发育的介质,含有大量来自血清的生长因子和卵母细胞及卵泡细胞的分泌因子。卵泡液所含的这些因子在体内随体内分泌状态的变化而变化,用于体外培养时会表现出对卵母细胞成熟的促进和抑制两种相反的作用。卵泡液的促进作用主要表现在提高卵母细胞质成熟的质量,增加胚胎的发育能力。控制卵泡液在培养液中添加的浓度,可以清除其对核成熟的抑制作用(石德顺等,1994)。另据报道,成熟的抑制作用与所采卵泡的大小有关,来自小卵泡(<3 mm)和中卵泡(3~8 mm)的卵泡液抑制卵母细胞核成熟,大卵泡(>8 mm)对核成熟没有抑制作用[1]。

1.5 抗氧化物质和维生素

卵母细胞体外成熟过程中,特别在20%氧气的气相环境中,产生许多对卵母细胞成熟和胚胎发育有害的ROS ,它能导致线粒体功能障碍,损害DNA 、RNA 和蛋白质,抑制精卵结合,是引起细胞死亡的一个重要原因,谷胱甘肽(GSH)能清除不利于细胞发育的过氧化物,细胞本身能合成GSH ,且不同的发育时期,细胞内GSH含量不同,这在小鼠、仓鼠、牛和猪已得到证实。外源性GSH、半胱胺、β2巯基乙醇、半胱胺酸和胱胺酸等已在不同物种的成熟体系中被添加。在低氧(5% 或7%氧气)条件下,卵母细胞体外成熟液中是否需要添加抗氧化物质,还有待进一步研究。Bormann等(2003)在山羊卵母细胞的体外成熟液中添加维生素,促进胚胎的发育,研究结果证明,维生素是卵母细胞培养液中一种重要成分[2]。

王国华等(2007)采用无血清培养液,其成熟液OM的基础成份为:9.5 g/L M199(Gibico)+10 mmol/L Hepes+1 mmol/L 丙酮酸钠+25 mmol/L 谷氨酰胺+0.075 U/mL 尿促性腺激素(HMG)(Sereno) +1 μg/mL 17β雌二醇(17β-E2) 。根据实验设计在OM 液中添加不同物质配成0.3% BSA(m/V)、1% PVA(m/V)、1% ITS(V/V) 和5% FBS(V/V)( Gibco)。培养液的pH 控制在7.2~7.4,用前置于CO2 培养箱中预先平衡2 h[3]。

2 颗粒细胞体外培养液成分

颗粒细胞培养采集的牦牛卵巢用PBS反复冲洗几次后,用注射器从2~6 mm的卵泡中抽吸卵泡液。取0.5 mL卵泡液加入灭菌离心管,再加入2 mL/ L透明质酸酶1 mL,摇匀,于38.5℃置5 min,然后加入3 mL BO液,立即离心5min (1 500 r/ min),弃去上清液;再加入约3 mL M199 + 200 mL/ L FBS培养液,离心5 min (1 500 r/min),弃去上清液;给沉淀( 颗粒细胞) 加入适量的M199 + 200 mL/ LFBS ,将其浓度稀释成0.5 ×107 个/ mL 。吸取10μL颗粒细胞悬液,注入已在CO2 培养箱平衡2 h的成熟培养液滴内(50 μL/滴)或培养孔内,待颗粒细胞扩散后,吸弃大块的凝聚物。最后将颗粒细胞液滴放入培养箱培养,备用(颗粒细胞的最终浓度约为106 个/mL)[4]。王妍等(2007)采用D/F12 培养基+ 100 U/ mL青霉素+ 100 μg/mL链霉素+ 0.5 μg/ mL两性霉素2B +体积分数10 % FBS[5]。

3 输卵管上皮细胞体外培养液成分

输卵管上皮细胞体外培养液成分组成为:M 199+8%血清+HEPPES+NaHCO3+牛磺酸+丙酮酸钠+乳酸钠[6]。王益兵等(2007)采用的是DMEM/F12[7]。

4 子宫内膜细胞体外培养液成分

子宫内膜细胞体外培养液成分组成为:DMEM、10%胎牛血清、HEPES缓冲液、两性霉素B、青霉素、链霉素等[8]。李幼飞等(2007)采用20%胎牛血清的DMEM培养液[9]。

5 滋养层细胞体外培养液成分

李珍等(2005)的滋养层细胞体外培养液成分组成为:含100 mL/L胎牛血清的DMEM。蒋立艳等(2007)采用DMEM/F12[10]。其中,F12为Ham’s F12 nutrient medium。是动物细胞培养基,成分复杂,含有多种微量元素,最初设计用于克隆二倍体的中国地鼠卵巢细胞。起初是作为一种无血清配方设计的,现在常补加血清用于支持各种正常的和转化细胞的增殖。F12常和DMEM以1∶1结合,称为DME/F12培养基(DME/F12medium),作为开发无血清配方的基础,以利用F12含有较丰富的成分和DMEM含有较高浓度的营养成分的优点。综上所述,各培养液总的来说有如下特点:①DMEM、M199使用最多的基础培养液;②比较而言,卵母细胞的培养液成分最复杂,在基础培养液中还需加入许多其他成分;③无血清培养液,有利于对培养过程中的影响因素的研究,故将会是以后研究的重点所在。

参考文献

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输卵管上皮细胞 篇2

小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离、培养和鉴定

目的:建立一套可靠的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(AEC Ⅱ)分离、纯化和培养技术, 为进一步研究小鼠支气管肺泡干细胞(BASC)的增殖、分化及其在肺腺癌发生中的作用奠定基础.方法:采用分散酶消化小鼠肺组织块,经免疫黏附法纯化小鼠AEC Ⅱ,并进行原代培养.用SP-C和CCSP免疫荧光染色和透射电镜对所分离的细胞进行鉴定.结果:该方法所获得细胞产量大、纯度高.AEC Ⅱ比例约为(80±2.6)%(n=5),Clara细胞约(6.7±1.2)%(n=5),并能维持培养3～5 d.透射电镜观察AEC Ⅱ,细胞内可见板层小体.结论:该方法是一种可靠的`小鼠AEC Ⅱ的分离、纯化和培养技术,可满足一般的实验要求.

作 者：安江洪 钱莘 敖绪军 卓文磊 陈正堂 AN Jiang-hong QIAN Shen AO Xu-jun ZHUO Wen-lei CHEN Zheng-tang  作者单位：第三军医大学附属新桥医院解放军肿瘤研究所,重庆,400037 刊 名：医学研究生学报  ISTIC英文刊名：JOURNAL OF MEDICAL POSTGRADUATES 年，卷(期)：2008 21(3) 分类号：Q813.1 关键词：肺泡Ⅱ型上皮细胞   原代细胞培养   小鼠支气管肺泡干细胞  

输卵管上皮细胞 篇3

输卵管在卵巢与子宫之间,卵巢排出的卵母细胞在输卵管中与精子结合形成胚胎。胚胎在输卵管停留数天,发育至早囊胚期后进入子宫,因此需要输卵管为胚胎早期发育提供适宜的环境。输卵管上皮细胞处于输卵管官腔中,能够分泌大量胚胎发育所需的生长因子、糖蛋白和免疫因子等物质[3]。该研究旨在探索一种适合野猪输卵管上皮细胞原代培养、传代和冷冻保存的方法,构建野猪的输卵管上皮细胞系,为保护野猪遗传资源和进行深入的基础研究提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

供试的2月龄雌性小野猪取自黑龙江省双峰养殖场,DMEM高糖购自Gibco公司,其它药品如无特别说明均购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 原代培养

取雌性野猪,颈部放血致死,取出卵巢及部分与卵巢相连的子宫角,无菌PBS冲洗3次,无菌操作台中用镊子小心剥下包裹在卵巢外的输卵管伞,切开输卵管与子宫连接部位去除子宫角。将完整的含有伞部的输卵管整个浸泡在75%乙醇中杀菌5 min,无菌PBS反复冲洗4～5次。用灭菌手术剪将输卵管剪至2 mm小块。收集输卵管碎块至无菌离心管中,加DMEM培养液摇匀,1 000 r·min离心5 min,弃去上清,沉淀用DMEM培养液重悬,再离心,去上清,反复2次。最后,将沉淀的输卵管碎块均匀铺在35 mm培养皿底部,加少量含20%胎牛血清的DMEM培养液,使培养皿保持湿润。培养皿置于38.5℃、5%CO2饱和蒸汽压的培养箱内进行培养过夜。次日在培养皿中轻轻加入1 mL全培养液,将未贴壁的碎块浮起吸出弃去,培养皿中加入2 mL全培养液,于38.5℃、5% CO2饱和蒸汽压的培养箱内对贴壁组织块进行培养,每日在显微镜下观察其生长情况。

1.2.2 传代

当原代细胞生长至接近 90%汇合,弃去培养液,用PBS清洗2次,0.25 g·L-1胰酶消化至细胞收缩浮起,血清停止消化,将细胞液收集至离心管中,1 000 r·min-1离心5 min,弃去上清,沉淀以含20%FBS的DMEM培养液重悬,按1∶3的比例进行传代,继续培养备用。

1.2.3 细胞冻存

当细胞生长至70%～80%汇合,弃去培养液,用PBS清洗2次,0.25 g·L-1胰酶消化至细胞收缩浮起,血清停止消化,将细胞液收集至离心管中,1 000 r·min-1离心5 min,弃去上清,沉淀中加入预混的冻存液(70%DMEN高糖培养液,20%胎牛血清,10%DMSO)重悬。将含细胞的冻存液转移至灭菌冻存管中。含细胞冻存管于4℃放置20 min,-20℃放置2 h,-80℃冰箱过夜,次日将冻存管转移至液氮中长期保存。

1.2.4 细胞解冻复苏

液氮中取出冻存管迅速置于38℃水浴中,快速摇动冻存管使其中含细胞的冻存液解冻。无菌操作台中将冻存液转移至离心管中,1 000 r·min-1离心5 min,弃去上清,沉淀中加含20%胎牛血清的DMEM培养液重悬。悬液加入35 mm培养皿中,于38.5℃、5% CO2 饱和蒸汽压的培养箱内进行培养。

1.2.5 细胞活率计算

将细胞悬液调整至5×104个·mL-1的细胞密度,将细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以9∶1混合混匀(终浓度0.04%)。镜下观察,死细胞被染成明显的蓝色,而活细胞拒染呈无色透明状,分别统计死活细胞数,计算细胞活率。活细胞率/%=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100。

2 结果与分析

2.1 输卵管上皮细胞原代培养

野猪输卵管组织块贴壁过夜后加入1～2 mL全培养液可见大量未贴壁组织块浮起,贴壁组织块周围出现少量膜状物。培养2 d后部分组织块周围可游离出少量菱形细胞,72 h后组织块周围细胞成片单层生长,多数细胞呈菱形,并杂有少量梭形细胞(见图1)。在倒置显微镜下观察可见细胞透明,胞质突起丰满,胞体呈菱形,中央有圆形核,核仁清晰。培养7 d左右各个组织块周围游离细胞汇合,铺满皿底,并开始出现生长抑制现象。

2.2 细胞传代培养

原代培养的输卵管上皮细胞经2～3次传代后,细胞形态为更加均一的菱形,细胞生长状态好,增殖迅速。在经历4代以上的传代后,细胞的贴壁速度和生长速度都开始变慢,传代8次后,细胞的胞质中出现空泡,培养过程中细胞脱壁死亡现象增加,细胞老化严重。

2.3 解冻复苏后活性检测

细胞冻存前和复苏后细胞活率有所下降,分别为95.7%和82.9%。说明细胞在冻存和复苏过程中受到了某些因素如降温程序、保存过程中温度变化以及解冻温度和时间等的影响,对细胞造成了化学或机械的损伤,导致细胞死亡。

细胞在复苏4 h后开始出现贴壁,24 h后大部分细胞都已贴壁并变形。24 h换液将死细胞和未贴壁细胞去除,贴壁细胞经过分裂生长,形成大量“细胞岛”,6 d后细胞岛连接成片达到80%～90%汇合,可进行再次传代或冻存。

3 结论与讨论

输卵管上皮细胞是一种具有重要生理功能的成体细胞,因其在胚胎发育过程中起到重要的作用而越来越受到研究者的重视。目前已获得人[4]、小鼠、大鼠、牛、猪[5]等多种动物的输卵管上皮细胞系用于研究,但是野生动物这方面的研究还很少。

组织中分离细胞的最常用方法为组织块贴壁法和酶消化法。酶消化法是组织块在消化酶作用下,将所需细胞从组织块上分离下来再进行培养,此方法能够较早获得相对较纯的细胞,但赵晓娥等在用消化法建立小鼠输卵管上皮细胞系时发现,消化酶会对细胞活性产生影响,该研究采用的组织块贴壁法操作简单,获得的细胞活力好,细胞形态饱满,细胞边界清晰,但在大量输卵管上皮细胞中含有部分成纤维细胞。随着培养时间延长,输卵管上皮细胞和成纤维细胞都会大量增殖,因此,组织块在培养至4 d时进行消化传代可以最大程度降低成纤维细胞的污染。混杂有少量成纤维细胞的输卵管上皮细胞可在传代过程中利用上皮细胞与成纤维细胞对胰酶的敏感性不同、贴壁时间不同的特点加以纯化,经过2～3次传代后,基本可去除成纤维细胞,得到较纯的输卵管上皮细胞。

在该研究条件下,在传代过程中,细胞在传代后1～2 d生长速度较慢,3 d后进入快速生长期,7 d左右铺满整个培养皿。第3、4代的细胞生长状态最好,细胞形态和生长速度等处于最佳状态,并且细胞相对较纯,此时,最适合用来进行各类研究。在不特别添加生长因子类物质的条件下,经过5次左右传代后,细胞开始发生退化,细胞形态变得扁平,胞质中出现空泡,如果继续进行传代,细胞的贴壁能力和增殖能力都会明显降低,退化凋亡的细胞增多。该结果与吕自力等在牛输卵管上皮细胞培养中的结果基本一致[6]。因此在实验时要根据最终的目的选择不同传代次数的细胞。

摘要：采用组织块贴壁培养法分离获得野猪输卵管上皮细胞,并进行传代、冻存和复苏,并对其生物学特性进行观察研究。结果表明:组织块在培养2d开始有细胞爬出,7d左右可长满全皿,原代细胞形态呈菱形,其中混有少量成纤维细胞。传代2～3次,细胞生长状态最好,4代后细胞退化;细胞经冷冻保存再解冻后细胞死亡率上升。通过此方法能够获得较纯的野猪输卵管上皮细胞,为野猪资源保存和进一步的研究提供技术支持。

关键词：野猪,输卵管上皮细胞,原代培养

参考文献

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输卵管上皮细胞 篇4

1 材料与方法

1.1 乳腺组织的获取

用无菌外科手术的方法取处于妊娠后期或泌乳期的健康初产荷斯坦奶牛乳腺组织5～10 g,置于DMEM/F12完全培养液[含青霉素300 IU/mL、链霉素300 μg/mL、两性霉素2.5 μg/mL、庆大霉素50 μg/mL、20%胎牛血清(FBS)]中,迅速带回实验室。

1.2 主要试剂与仪器

DMEM/F12(12400-016),Invitrogen公司生产;胎牛血清(南美洲,SV30087.02),Hyclone公司生产;胰蛋白酶(1∶250,0458),Amresco公司生产;细胞角蛋白-18(MS-142-P0)、波形蛋白(MS-129-P0),Neomarker公司生产;兔/鼠通用S-P免疫组化试剂盒(KIT9710)、DAB(0031),福州迈新生物技术开发有限公司生产;抗体稀释液(C-0007),北京博奥森生物技术有限公司生产;DMSO(D-5879),Sigma公司生产;青霉素钠、硫酸链霉素,华北制药股份有限公司生产;丙酮等其他试剂均为国产分析纯。

CO2培养箱(型号为HEPA class 100),Thermo公司制造;倒置相差显微镜(型号为IX71),Olympus公司制造;普通光学显微镜(型号为YS100),Nikon公司制造;离心机(型号为3-30K),Sigma公司制造;生物安全柜(型号为AC2-4S1),ESCO公司制造。

1.3 奶牛乳腺组织细胞的原代培养

用组织块贴壁法培养原代细胞,具体方法如下:将带回实验室的乳腺组织用37 ℃预热的灭菌生理盐水洗涤数次,清除血迹、乳汁及其他杂质;用无菌小剪镊分离腺泡于盛有灭菌生理盐水的小烧杯中,反复冲洗至冲洗液清亮后,将腺泡转移至生物安全柜中盛有灭菌PBS(含有青霉素200 IU/mL、链霉素200 μg /mL,pH值为7.4)的小烧杯中;将腺泡组织置于75%乙醇中浸泡约1 min后,用双抗PBS洗涤3次,每次3 min;然后将其转入青霉素小瓶中剪至约1 mm3大小的小块,备用。用牙科探针挑取组织块,将其轻轻铺于细胞培养瓶底壁上,植块间距0.5 cm,尽量使组织块黏附于瓶壁后沿对侧瓶壁加入DMEM/F12培养液(含青霉素200 IU/mL、链霉素200 μg/mL、15%FBS),旋上瓶盖,翻转培养瓶,使有组织块的一面向上,置于37 ℃、含5% CO2的饱和湿度培养箱中翻转培养2 h,使组织块微干涸;然后轻轻将培养瓶翻转过来,使培养液浸没组织块,根据培养液的颜色变化及细胞的生长情况每3～4 d更换一次培养液;待大多数组织块周围游出较多细胞时,用牙科探针轻轻掀掉组织块,并将组织块转瓶,使其继续贴壁培养,原瓶换液使细胞长满至汇合。

1.4 奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的纯化培养

每日观察细胞的生长情况并记录,待细胞生长至汇合后,根据成纤维细胞和上皮细胞对胰蛋白酶的耐受时间与贴壁速度的差异,结合使用差时胰酶消化与差时贴壁2种方法分别纯化出奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞,具体方法如下:弃去培养液,用D-hank’s液冲洗3次后,加入0.05%胰蛋白酶-0.02%EDTA于37 ℃消化3～5 min;至成纤维细胞变圆、细胞间距增大、有少量细胞团块漂起后,加入培养液(含青霉素100 IU/mL、链霉素100 μg/mL、10%FBS)终止消化,反复轻轻吹打成纤维细胞区域,吸取消化液转入新的细胞培养瓶中,置于培养箱培养1 h;待大多数成纤维细胞贴壁后,轻轻去除上清液,加入新的培养液继续培养至细胞长满并汇合,得到以成纤维细胞为主的细胞;去除成纤维细胞后,用D-hank’s液再冲洗3次,然后加0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA于37 ℃消化4～5 min;至上皮细胞回缩变圆、细胞间距增大乃至细胞成片(团)脱落时加入含10%FBS的DMEM/F12培养液终止消化,反复轻轻吹打,按细胞密度加入培养液,置于培养箱中约1 h;取培养上清液转到新的细胞瓶中继续培养至细胞长满、汇合,得到以上皮细胞为主的细胞。如此反复进行纯化以得到较纯净的奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞。

1.5 奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的形态学观察与鉴定

1.5.1 倒置相差显微镜观察

每天定时观察细胞的形态和生长情况,拍照并作记录。根据每天对细胞生长情况的观察,掌握奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的生长特性和细胞形态的差异。

1.5.2 奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的鉴定

将处理过的小盖玻片置于12孔细胞培养板的底壁,加少量培养液使其粘在培养孔底壁,分别将纯化的乳腺上皮细胞和成纤维细胞接种于含盖玻片的孔中,培养5 d后,用无血清培养基处理24 h并进行鉴定。

姬姆萨染色:将细胞爬片取出,PBS洗3次,每次3 min;冷冰酮固定20 min;用PBS洗3次,每次3 min;姬姆萨染液染色50 min;用灭菌水反复冲洗,置37 ℃温箱干燥6 h以上;二甲苯透明,中性树胶封片,镜检,观察细胞的形态并拍照。

免疫组化鉴定:每组细胞爬片分成3份,分别作为细胞角蛋白、波形蛋白和阴性对照,具体步骤为将细胞爬片取出,PBS浸洗3次,每次3 min;冷丙酮固定20 min,PBS浸洗3次,每次3 min,并将爬片放入湿盒中;加0.5%TritonX-100(用PBS配制)室温作用20 min;用PBS冲洗3次,每次3 min;滴加内源性过氧化酶阻断液(S-P试剂盒A液),避光作用10 min;用PBS液冲洗3次,每次3 min;滴加动物非免疫血清(羊) (S-P试剂盒B液),37 ℃孵育20 min;轻轻甩掉血清,勿冲洗;分别滴加鼠抗人细胞角蛋白-18单克隆抗体和鼠抗人波形蛋白单克隆抗体,均用抗体稀释液按1∶100倍稀释,阴性对照加PBS,37 ℃孵育2 h;PBS液冲洗3次,每次3 min;滴加生物素标记羊抗鼠/兔IgG(S-P试剂盒C液),37 ℃孵育20 min;PBS液冲洗3次, 每次3 min;滴加链霉素抗生物蛋白-过氧化酶(S-P试剂盒D液),37 ℃孵育20 min;用PBS液冲洗3次,每次3 min;滴加DAB作用5～10 min (现配现用),显微镜下观察并控制显色,用纯化水漂洗终止显色;苏木精复染5 min,在 0.25%盐酸乙醇溶液中浸提一下,自来水返蓝15 min;用纯化水浸洗,37 ℃温箱干燥6 h以上,二甲苯透明,中性树胶封片,镜检并拍照。

1.5.3 细胞生长曲线的绘制

分别将乳腺上皮细胞和成纤维细胞按每孔2×105个接种于24孔板中,每组3孔,共分为14组。分别于接种后每天同一时间计数细胞平均数,每孔计2次,直至细胞的生长达到平台期。以培养时间为横坐标、细胞数为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.6 细胞的冻存与复苏

1.6.1 细胞的冻存

用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA将细胞消化下来,1 000 r/min离心5 min;收集细胞,加入1 mL新鲜培养液重悬细胞,用台盼蓝染色,用血细胞计数板计数后,加含20%FBS的DMEM/F12培养液调整细胞数至5×106～10×106个/mL,并按10%的比例缓慢加入DMSO,混匀后分装于2 mL冻存管中,每管1 mL,4 ℃放置15 min;-20 ℃放置20 min;-80 ℃过夜,然后沉入液氮罐中长期保存。

1.6.2 细胞的复苏

从液氮罐中取出冻存管,立即投入37 ℃水浴中晃动,使其在1 min内完全融化。加入5 mL培养液悬浮细胞,1 000 r/min离心5 min;收集细胞,根据细胞密度加入生长培养液重悬细胞,将其接种于细胞培养瓶中,置37 ℃、含5% CO2的饱和湿度培养箱中培养。

2 结果

2.1 奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的培养纯化及形态观察结果

2.1.1 组织块的培养结果(见169页彩图1)

培养1～2 d后细胞贴壁,3～5 d后开始游出,以成纤维样细胞和上皮细胞为主,并且这2种细胞并不混杂生长,存在着明显的界限(见169页彩图1a,b)。其中成纤维样细胞先从组织块周围向外游出,其形态多为长梭形,排列疏松,呈旋涡状或放射状生长(见169页彩图1a,b);而后上皮样细胞从组织块周围游出,多为单层多角形,排列紧密,细胞核呈圆形或椭圆形,核仁清晰可见,多呈鹅卵石样或铺路石样聚集生长(见169页彩图1a,b)。

2.1.2 奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的纯化及形态学观察结果

经差时胰酶消化和差时贴壁2种方法对奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞分别进行纯化,上皮细胞多成团生长,未纯化完全时成纤维细胞常包裹于上皮细胞的外围生长(见169页彩图1c)。细胞经3～5次纯化后即可分别得到较为纯净的奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞。纯化的上皮细胞大多为多角形,细胞排列紧密,细胞核呈圆形或椭圆形,有时可出现双核或多核现象,核仁清晰可见,以3～5个居多,多呈单层铺路石样或鹅卵石样成团聚集生长(见169页彩图1d)。传代的上皮细胞贴壁后,多成团聚集生长形成岛屿状,并且成团的多角形上皮细胞聚集生长时增殖快,而单个散在圆形贴壁细胞很难继续增殖。随着培养时间的延长,一些上皮细胞的胞浆出现大小不一的空泡和泡状结构(见169页彩图1e),这是上皮细胞分泌产生的大小不等的乳滴。上皮细胞传到第5～6代时生长仍很旺盛,随着细胞密度的增加,多形成类似腔的结构,在腔的周围细胞密集包绕生长,更换培养液后继续培养,一些生长迅速的新生细胞可向腔内生长,并出现拉丝样支架将两侧细胞连接起来(见169页彩图1f),细胞沿着支架继续增殖可达到融合,形成类似圆顶样结构,随传代次数的增多和培养时间的加长这种结构会逐渐增多。此外,在一些区域,上皮细胞还可形成腺泡样结构(见169页彩图1g)。上皮细胞传至第7～8代,其形态基本一致,只不过有些细胞体积较大,呈圆饼样,增殖速度慢;有的细胞体积较小,呈鹅卵石样,增殖迅速,随着培养时间的加长,细胞间的界限愈加明显;随着细胞密度的增加,细胞受到挤压,一些细胞呈短梭形。而当细胞传到第8～9代以后形态变得非常不均一(见169页彩图1h),出现长形、梭形和三角形等多种形态共存,而典型的上皮细胞越来越少。纯化的奶牛乳腺成纤维细胞单层生长,呈典型的放射状或旋涡状排列(见169页彩图1i),且随着传代次数的增多,成纤维细胞的形态和生长特性基本不发生改变。

2.2 细胞的鉴定结果

2.2.1 姬姆萨染色法鉴定细胞的形态(见169页彩图2)

乳腺上皮细胞为深蓝染,胞核呈圆形或椭圆形,核仁清晰可见,多为3～5个,并且胞浆内常可见大小不一的白色空泡(见169页彩图2a),这是上皮细胞分泌的乳滴。成纤维细胞多呈长梭形,胞核蓝染,为椭圆形,位于细胞中央,一般可见核仁呈旋涡状或放射状排列生长(见169页彩图2b)。

2.2.2 免疫组织化学法鉴定细胞的纯度

镜检可见细胞胞浆内有特异性棕黄色或棕褐色颗粒沉着者判为阳性。结果(见170页彩图3)显示,乳腺上皮细胞角蛋白-18反应呈阳性,波形蛋白反应呈阴性(见170页彩图3a,b);乳腺成纤维细胞角蛋白-18反应呈阴性,波形蛋白反应呈阳性(见170页彩图3c,d);阴性对照均为阴性(见170页彩图3e,f)。经纯化后,2种细胞的纯度均可达到95%以上。乳腺上皮细胞传至第8～9代以后,细胞的形态开始发生变化,出现长形、梭形、三角形等多种细胞共存,而直至细胞传至第14代时,细胞角蛋白-18反应仍呈阳性(见170页彩图3g),阴性对照为阴性(见170页彩图3h)。

2.3 细胞的生长曲线(见图4)

奶牛乳腺上皮的生长曲线(见图4a)和成纤维细胞的生长曲线(见图4b)均呈较典型的“S”型,其中成纤维细胞较上皮细胞潜伏期短,增殖快。

2.4 细胞的冻存与复苏

代次较低的奶牛乳腺上皮(3～6代)细胞经冻存复苏后生长状态良好,传1～2代后细胞的形态和生长特性均未发生改变,而代次较高(7～8代)的细胞冻存复苏后形态正常,但传代后细胞形态就发生了改变。复苏后的成纤维细胞生长状态良好,形态和生长特性均未发生明显改变。

3 讨论

3.1 奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的培养与纯化

目前,有关奶牛乳腺上皮细胞培养的研究已有很多,培养方法主要有组织块培养法、机械破碎法和酶消化方法。也有人从乳汁中分离出奶牛乳腺上皮细胞[6,7],有待于进一步验证。机械破碎法和酶消化法极易丢失和损伤细胞,最终造成细胞不能正常生长和增殖[8,9],其中以组织块培养法最能保持乳腺上皮细胞二倍体特性,不破坏细胞的活性。本试验根据奶牛乳腺上皮细胞较成纤维细胞贴壁和生长慢、贴壁牢、不易被消化下来的特性,应用组织块贴壁转瓶培养,采用差时胰酶消化法和差速贴壁法结合的方法,用较少的组织即分别培养及纯化出奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞。

目前,关于奶牛乳腺细胞体外培养的研究主要集中在上皮细胞上,而关于成纤维细胞的报道并不多见,不过后者培养和纯化都相对较容易。研究发现,奶牛乳腺上皮细胞纯化的难易程度跟乳腺组织的取材也有很大的关系,在腺泡发育好的妊娠期和泌乳期取材所获取的细胞活性好,生长快,细胞中上皮细胞占的比例较大[10,11],此时纯化出上皮细胞就相对较容易,所以把握取材时机非常关键。另外,去除脂肪和结缔组织,分离乳腺腺泡进行培养也很关键[10,12]。

3.2 奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的形态学观察

试验培养得到的奶牛乳腺上皮细胞的形态特征与王亨等[10]、彭新荣等[11]及E.Matitashvili等[13]的报道基本一致,奶牛乳腺成纤维细胞的形态特征与吴娟等[14]报道的结果一致。乳腺上皮细胞是构成乳腺腺泡的主要成分,具有分泌乳汁的功能。本研究中,在体外培养奶牛乳腺上皮细胞时,胞浆内出现大小不一的空泡和泡状结构即为上皮细胞分泌的乳滴,与崔立莉[7]报道的结果一致;与彭新荣等[11]报道的结果不一致,其认为胞浆内出现的小颗粒和泡状结构可能为变形的线粒体及溶酶体。上皮细胞还可形成乳腺腺泡管样结构,与王治国等[15]和E.Matitashvili等[13]的试验结果一致。不过,王治国等[15]的试验中添加了一些激素和生长因子,E.Matitashvili等[13]的试验中添加了ECM,而本试验中未添加。而上述现象在成纤维细胞中均没有,可见在体外培养条件下,奶牛乳腺上皮细胞仍保留着其原有的一些功能和特性。

体外培养的乳腺上皮细胞传代后的大小和形态并不完全一致,经纯化传代后,细胞多成团、聚集成岛屿状,其中体积较小的呈鹅卵石样,聚集成长的细胞增殖较快,而体积较大的呈圆饼形,细胞的增殖则较慢,这2种细胞可能为乳腺上皮细胞不同发育时期的细胞。前者可能为较幼稚的细胞,分裂增殖较快;而后者为接近终末分化的细胞,故增殖较慢。与王亨等[10]的试验结果相一致。另外,乳腺上皮细胞成团时增殖较快,而单个细胞很难贴壁并增殖[10,11];因此细胞的接种密度对于细胞的生长非常重要。随着上皮细胞生长密度的增加,可形成许多类似腔的结构,细胞继续增殖达融合后,可形成类似圆顶样结构,与丁月云等[16]的试验结果相一致,而8～9代以后部分细胞渐渐分化,细胞形态变得不均一,出现长形、梭形和三角形的细胞,与彭新荣等[11]的试验结果相一致。

3.3 细胞鉴定

奶牛乳腺腺泡上皮细胞中的骨架蛋白以角蛋白-7,8,18为主,而肌上皮细胞以角蛋白-5和14为主[16],故角蛋白-18可用于奶牛乳腺腺泡上皮细胞的鉴定。波形蛋白是间质细胞特异性表达的一种中间纤维蛋白,是间质细胞和成纤维细胞的标志蛋白之一[17],可用于成纤维细胞的鉴定。综合应用这2种蛋白不仅可以鉴定细胞的类型,而且可以鉴定细胞的纯度。本试验结果表明:奶牛乳腺上皮细胞对角蛋白-18反应阳性,与E.Matitashvili等[13]的研究结果一致;对波形蛋白反应阴性,与J.L.Anaya-Lopez等[18]的研究结果一致。而成纤维细胞与上皮细胞的结果相反,对角蛋白-18反应阴性,对波形蛋白反应阳性,表明结果成立。经鉴定,上皮细胞传至14代后,对细胞角蛋白-18的反应仍为阳性,表明虽然细胞的形态发生了变化,但所得的细胞仍为上皮细胞。

3.4 细胞的冻存与复苏

由于原代奶牛乳腺上皮细胞具有二倍体的特性,属于有限细胞系,随着传代次数的增多,细胞的形态和生长特性会逐渐发生改变,导致其失去二倍体细胞的特性甚至发生细胞转化;因此,在纯化后对其及早进行冻存非常重要[5]。与上皮细胞不同,奶牛乳腺成纤维细胞的形态和生长特性受传代和冻存的影响相对较小,但仍应在其生长旺盛、传代次数较少时将其冻存,以防影响细胞的特性。

试验采取妊娠后期或泌乳期荷斯坦奶牛乳腺组织分离腺泡,培养后应用组织块贴壁转瓶培养,采用差时胰酶消化和差速贴壁结合的方法,用较少的组织即分别培养并纯化出了乳腺上皮细胞和成纤维细胞,所得细胞形态良好,生长曲线呈较典型的“S”型,符合细胞生长的一般生物学规律,经鉴定细胞的纯度可达95%以上。目前,国内外的许多研究者认为乳腺上皮细胞的贴壁依赖于基质,生长依赖于激素和生长因子的添加,而本试验中未使用基质和激素也成功培养出了生长良好并具有泌乳功能的乳腺上皮细胞,避免了胶原和激素所造成的影响,为相关的后续研究奠定了良好的基础。

a.细胞从组织块中游出并在组织块周围生长(100×);b.上皮细胞与成纤维细胞不混杂生长,之间存在明显的界限,上皮细胞排列紧密形成细胞单层,而成纤维细胞排列疏松(100×);c.成纤维细胞包裹未纯化完全的上皮细胞(100×);d.纯化的上皮细胞呈鹅卵石样或铺路石样生长(100×);e.上皮细胞胞浆内有大小不一的空泡和泡状结构(100×);f.细胞向腔内生长,并出现拉丝样支架将两侧细胞连接起来,细胞沿着支架继续增殖可达到融合(200×);g.上皮细胞形成腺泡样结构(100×);h.上皮细胞的形态发生改变(100×);i.纯化的成纤维细胞呈旋涡状或放射状生长(100×)。

a.中央处上皮细胞深蓝染,细胞核为圆形或椭圆形,核仁清晰可见,胞浆内还可见许多大小不一的白色空泡;b.成纤维细胞为长梭形,呈旋涡状或放射状排列生长。

子宫上皮样滋养细胞肿瘤误诊1例 篇5

患者, 27岁, 因“宫颈妊娠”第3次化疗停药23天于2009年4月30日入住我院。患者于2007年7月足月妊娠行剖宫产术, 术后恢复良好。术后6月月经复潮并放置宫内节育器 (IUD) 避孕, 2008年9月17日月经正常来潮, 9月28日开始阴道不规则流血, 量少, 伴下腹胀痛, 不伴恶心、呕吐、肛门坠胀等, 未行诊治。11月26日在当地医院测血β-HCG 1945 U/ L, B超检查提示:宫颈管内异常回声。诊断为“宫颈妊娠”, 给予米非司酮口服, 肌内注射甲氨蝶呤 (MTX) 1次, 宫颈局部肌内注射MTX 3次 (具体药量不清) 后, 于2008年12月4日行清宫术并取IUD, 清出组织送病理检查, 结果提示“血凝块, 纤维素样物”。术后1周复查血β-HCG 38.5 U/L, 2周后监测血β-HCG从13.7 U/L逐渐上升。2009年1月28日血β-HCG 2046 U/L, 即从1月29日至4月7日, 给予FA方案 (氟尿嘧啶联合放线菌素D) 化疗3疗程。期间复查血β-HCG在50～290 U/L反复, 多次复查B超均提示:宫颈管内少许异常回声, 其周边可见血流信号。遂转入我院治疗。患者入院后查血β-HCG 24.75 U/L;盆腔彩超检查提示:宫腔内异常回声, 原切口处组织残留1.5 cm ×2.0 cm;胸片未见异常。于5月2日至9日给予FA方案 (替加氟联合放线菌素D) 化疗, 化疗第5天时全身麻醉下行子宫切口处病灶切除术。术中见子宫不大, 前壁原切口处血流丰富, 肌层稍薄, 肌层下见沥青样及蛋清样组织, 手术切除病灶并缝合子宫。术后病理检查示:镜下见子宫平滑肌组织及血凝块, 另见少许坏死组织, 其中可见少许上皮样组织, 未见绒毛结构及明显合体滋养细胞。免疫组织化学:免疫上皮样细胞 (PCK, +) 、抑制素a散在 (+) 、P63散在 (+) 、CD34 (-) 、HCG (-/+) 。病理诊断:上皮样滋养细胞肿瘤 (epithelioid trophoblastic tumour, ETT) 。5月11日复查血β-HCG 22.68 U/L, 26日23.09 U/L, 6月1日24.52 U/L。术后于6月1日至8日行FA方案 (替加氟联合放线菌素D) 化疗, 6月13日测β-HCG 45.67 U/L, 7月1日测β-HCG 76.17 U/L。7月3日至11日再次以FA方案 (替加氟联合放线菌素D) 化疗, 期间于7月6日行子宫全切术, 术中见子宫大小形态正常, 剖开切除子宫见子宫下段近宫颈处有淤血, 下段右后壁见一约0.3 cm ×0.5 cm乳头状新生物。于子宫下段暗红色区域反复多处取材, 镜下在颈管宫体交界处黏膜层见一坏死灶, 周围小血管增生, 仅个别区域见少许上皮样细胞残留, 结合前次病理检查考虑为ETT。7 月9日β-HCG 26.95 U/L, 7月30日β-HCG 24.9 U/L, 于8月2日至4日给予TP方案 (紫杉醇联合奈达铂) 化疗, 监测β-HCG渐正常, 继续以TP方案巩固2疗程。目前密切随访中, 患者一般情况尚好。

2 讨 论

上皮样滋养细胞肿瘤是近年认识的一种由绒毛膜型中间型滋养细胞组成的滋养细胞肿瘤。多发生在15～48岁的育龄期妇女, 也有报道发生于围绝经期和绝经期妇女。一般有妊娠史, 肿瘤发生与前次妊娠的间隔时间为1～18年, 平均6.2年。临床主要表现为阴道异常流血, HCG轻度升高, 少数可异常增高至148460 U/L[1,2]。ETT多发于子宫下段, 呈分散或孤立性结节样病灶, 可突入宫腔或侵入子宫颈及子宫肌层, 可伴有出血、囊性变。本例患者年龄27岁, 足月剖宫产术后16月发病, 以阴道流血、HCG轻度升高、发现子宫下段病灶为就诊原因, 与文献报道相似。

本病缺乏特异性临床表现, 诊断主要依赖于常规病理检查和免疫组化检查。光镜下, ETT由相对一致的绒毛膜型中间型滋养细胞形成巢状、索状、团块状, 周围有丰富的玻璃样物质和坏死的肿瘤细胞, 形成地图样外观。瘤细胞呈上皮样分化, 具有丰富的嗜酸性或透明的胞质。核分裂象0～9个/10 HPF, 平均2个/10 HPF。免疫组化可见细胞角蛋白、上皮膜抗原、E钙黏蛋白和表皮生长因子受体呈弥漫阳性反应;抑制素a (a-inhibin) 呈弥漫或局部阳性;滋养细胞特异性标记物HSD3B1阳性[3];而人胎盘催乳素 (HPL) 、HCG、Mel-CAM以及胎盘碱性磷酸酶可有局灶或非常少的细胞阳性。免疫组化研究显示, P63阳性指数在ETT中为45%～80%, 而在绒毛膜癌中为0～5.62%, 胎盘部位滋养细胞肿瘤 (PSTT) 中则为阴性[4]。本例免疫组化染色结果PCK阳性, 证实其上皮分化, 其他指标与文献报道相似。由于ETT少见, 临床表现缺乏特异性, 组织形态兼有滋养细胞肿瘤与癌的特征, 主要需与PSTT、绒毛膜癌、宫颈鳞状细胞癌、上皮样平滑肌肉瘤、宫颈妊娠、妊娠组织残留等相鉴别, 及时病理检查及免疫组化可予以鉴别诊断。本例被误诊为“宫颈妊娠”, 原因在于基层医院病理检查相对薄弱, 难以为临床提供有力的支持, 而临床医生对ETT缺乏认识, 容易被经验误导, 发生ETT的误诊率极高。

目前ETT治疗以手术为主, 辅以化疗。ETT对常规化疗不敏感, 但认为对于有转移、复发或合并绒毛膜癌病例是必要的。目前对ETT化疗的最佳用药及作用并不清楚, 临床常用EMA-CO/EMA-EP方案。Knox等[5]报道子宫ETT合并绒毛膜癌的复发病例用高剂量MTX、放线菌素D、依托泊苷、甲酰四氢叶酸、环磷酰胺、长春新碱等化疗辅以外周血干细胞支持治疗疗效较好。本例因患者已用FA方案治疗6疗程, 其中在我院化疗时, 将氟尿嘧啶更换为替加氟, 后者为氟尿嘧啶衍生物, 作用持久, 吸收好, 毒性低, 但化疗效果均不理想。而EMA-CO方案周期长, 副反应大, 鉴于肿瘤呈上皮样分化, 改用TP方案 (紫杉醇联合奈达铂) 化疗, 其抗肿瘤谱广, 化疗时间短, 化疗反应轻。本例患者化疗期间无明显化疗反应, 监测血清β-HCG值下降至正常。ETT为低度恶性肿瘤, 转移率约25%, 死亡率10%[1]。因相关病例及随访资料少, 尚缺乏良好的预测预后指标。

参考文献

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[2]Macdonald MC, Palmer JE, Hancock BW, et al.Diagnostic challenges in extrauterine epithelioid trophoblastic tumours:a report of two cases[J].Gynecol Oncol, 2008, 108 (2) :452-454.

[3]Mao TL, Kurman R J.Jeng Y M, et a1.HSD3B1as a novel trophoblast-associated marker that assists in the diferential diagnosis of tropho-blastic tumors and tumorlike lesions[J].Am J Surg Pathol, 2008, 32 (2) :236-242.

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输卵管上皮细胞 篇6

有资料显示, 对于反刍动物瘤胃上皮细胞的培养技术早在1980年就有记录, P.Gálfi等[2]采取胰蛋白酶消化法对牛瘤胃上皮细胞进行分离, 并成功培养了牛的瘤胃上皮细胞。此后, 研究者们在此基础上对反刍动物瘤胃上皮细胞的培养技术进行了多次改进, 但大多局限于牛和绵羊[3], 其他反刍动物瘤胃上皮细胞体外培养的技术鲜有报道, 而对驯鹿瘤胃上皮细胞体外培养的技术未见报道。

本研究以内蒙古呼伦贝尔市敖鲁古雅乡的中国驯鹿为研究对象, 结合牛、羊瘤胃上皮细胞的培养技术对驯鹿的瘤胃上皮细胞进行原代分离及体外培养, 以期为相关的体外研究提供一定的技术支持。

1 材料

1.1 试验动物

驯鹿, 内蒙古自治区呼伦贝尔市某猎民点淘汰的驯鹿。

1.2 主要试剂

细胞培养试剂:M199培养基和胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂 (insulin-transferrin-selenium-X) (ITS) , 购自Gibco公司;胰蛋白酶 (trypsin) 、L-谷氨酰胺、Na HCO3, 购自Sigma公司;胎牛血清 (FBS) , Hyclone公司生产;两性霉素B, 购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

细胞培养用液:磷酸盐缓冲液 (PBS) , M199培养基添加了15%的FBS、2 mmol/L L-谷氨酰胺、2μg/m L ITS、200 IU/m L青霉素及200μg/m L链霉素等。

细胞鉴定试剂:细胞角蛋白一抗 (醛缩酶A, CK19) , 购自Sigma公司;即用型快捷免疫组化MaxVisionTM试剂盒和苏木素体细胞快速染色液, 由福州迈新生物技术有限公司提供。

其余试剂为实验室常规试剂。

2 方法

2.1 驯鹿瘤胃上皮细胞的分离

将取来的瘤胃组织用4℃灭菌生理盐水冲洗去食糜及污染物后, 浸入4℃灭菌PBS溶液 (含500μg/m L青霉素, 250μg/m L链霉素, 0.5μg/m L两性霉素B, 100μg/m L庆大霉素) 中, 带回实验室;钝性分离瘤胃组织的黏膜上皮层和固有层, 并取2~4 cm2的上皮层以上述PBS溶液反复清洗3次, 再用不含抗生素的灭菌PBS溶液浸泡10 min;置入约15 m L 0.25%Trypsin-0.02%EDTA消化液中于37℃水浴中连续振荡消化, 每30 min取其消化液过滤并于显微镜下观察, 同时更换新的消化液, 直至消化液中出现非上皮细胞。将主要包含上皮细胞的消化液用200目的不锈钢细胞滤网过滤收集并用15 m L含有10%血清的培养液终止消化。将混合液转移至离心管, 吹打混匀后1 500 r/min离心10 min;弃去上清液, 加入PBS缓冲溶液后, 充分吹打混匀, 1 500 r/min离心10 min;如此反复洗涤2次, 第2次弃去上清液后, 加入10 m L完全培养液, 充分吹打混匀后, 调整细胞密度至1×105/m L, 并转移至细胞培养瓶中, 于37℃、5%CO2的培养箱中静置培养, 24 h后观察有无染菌, 在显微镜下观察其生长状况。

2.2 驯鹿瘤胃上皮细胞的传代培养

培养基采用M199加15%的FBS, 将细胞分装于25 cm2培养瓶中, 置于37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养48~72 h后, 更换培养液, 弃去未贴壁的细胞, 根据细胞生长情况, 每3~4 d全量换液1次。待细胞达到80%~90%融合时, 用0.25%Trypsin-0.02%EDTA消化液消化3~4 min, 显微镜下观察, 如细胞隆起, 胞质回缩变圆、变亮, 加入含有血清的培养液终止消化, 并用移液枪轻轻吹打使之悬浮, 再转移至离心管中离心、洗涤 (方法同原代培养) , 最后转移至细胞培养瓶中, 继续于37℃、5%CO2的培养箱中静置培养。

2.3 驯鹿瘤胃上皮细胞的形态学观察及免疫细胞化学鉴定

在显微镜下对细胞的形态和生长情况进行观察。

根据上皮细胞的标志性中间丝蛋白为细胞角蛋白, 对驯鹿瘤胃上皮细胞的角蛋白进行免疫细胞化学的鉴定。取对数生长的瘤胃上皮细胞用37℃的0.25%Trypsin-0.02%EDTA消化液消化下来, 在6孔细胞培养板中进行常规的盖玻片爬片培养 (3 d) ;取出爬片, 用4%多聚甲醛固定15 min;PBS洗涤3次, 加0.5%Triton作用20 min;PBS洗涤3次, 加3%H2O2孵育15 min;PBS洗涤3次, 加封闭血清孵育20 min;加入一抗, 37℃孵育60 min;PBS冲洗3次, 加入通用型二抗工作液37℃孵育30 min;PBS洗涤3次;DAB显色;自来水冲洗;苏木素核复染, 自来水冲洗;显微镜下观察照像。空白对照用PBS代替一抗。

3 结果

3.1 驯鹿瘤胃上皮细胞的分离结果

瘤胃上皮细胞经0.25%Trypsin-0.02%EDTA消化液消化第4次起在显微镜下可观察到大量上皮细胞分散存在, 直到消化至第6次, 细胞数量开始减少, 且组织变得黏腻。收集后于显微镜下观察, 可见细胞数量多, 单个散在, 大小均一, 具有较好的折光度 (见228页彩图1A) 。调整细胞密度进行培养, 培养的细胞在72 h后有大部分贴壁, 细胞颜色发暗, 呈多角形, 并已开始生长, 呈岛屿状分布;也有未贴壁悬浮的细胞, 细胞折光度好, 体积较小, 形态较圆 (见228页彩图1B) 。96 h后生长迅速, 细胞增殖明显, 可见典型的铺路石状生长, 进入对数生长期 (见228页彩图1C) 。随后的7~9 d, 细胞生长融合成片, 呈单层状生长 (见228页彩图1D) 。

3.2 驯鹿瘤胃上皮细胞的传代培养结果

传1代后的细胞可在12 h内贴壁, 并迅速进入对数期生长增殖, 细胞形态完整, 生长良好 (见228页彩图2A) , 可在3~4 d铺满细胞瓶。传2代后细胞增殖迅速, 但细胞形态发生变化, 大小极不均一, 部分细胞胞体宽大、扁平, 胞浆内出现空泡和黑色颗粒 (见228页彩图2B) , 后期细胞增殖减慢, 甚至生长停滞, 逐渐死亡, 从瓶壁脱落。

3.3 驯鹿瘤胃上皮细胞的形态学及免疫细胞化学鉴定结果

细胞经分离培养48 h后, 可见细胞单个或数个贴壁, 呈扁平多角形, 胞浆丰富, 轮廓清晰。进入对数期后, 细胞呈小岛屿状生长, 各细胞岛屿间可见有细胞连接。7~9 d时, 各细胞岛屿连接成片, 呈铺路石样生长, 是典型的上皮形态 (见228页彩图3A) 。经免疫细胞化学方法的鉴定, 可见细胞胞浆为黄褐色, 即角蛋白CK19染色呈阳性 (见228页彩图3B) , 可判断所培养细胞为上皮细胞。

4 讨论

近年来, 我国驯鹿的数量一直徘徊在千只左右, 内蒙古大兴安岭北部敖鲁古雅民族自治乡的驯鹿是我国唯一的驯鹿种群, 均为鄂温克族所豢养, 呈半野生状态。虽然我国于2003年实行了生态移民, 但移民后的2个月间 (7—9月份) 有200多头驯鹿因消化不良引起疾病死亡, 驯鹿种群数量由搬迁前的800多只下降至不足600只[4]。无奈大部分鄂温克族人又牵着驯鹿返回原始森林过着游牧生活, 不定期地迁居, 是中国最后的狩猎部落。因此, 加强驯鹿圈养的相关科学研究, 不仅能恢复驯鹿种群的数量, 也是结束“中国最后狩猎部落”的有效办法。

P.Gálfi等[2]首次培养牛的瘤胃上皮细胞时采用剪切瘤胃乳头的方法进行分离及培养, 成功建立了牛的瘤胃上皮细胞的体外培养方法;同样类似的方法于第2年成功地培养了绵羊瘤胃上皮细胞[5];F.Stumpff等[6]在前人的培养技术基础上改进了取材方法, 设计并制作了一种模具, 使胰蛋白酶只作用于乳头来分离上皮细胞;沈赞明等[7]在培养奶公牛瘤胃上皮细胞时, 钝性分离瘤胃黏膜上皮与固有层以获得较为纯净的上皮细胞。本试验在总结前人试验的基础上, 采用钝性分离瘤胃黏膜得到上皮层的方法, 对上皮组织整体进行胰蛋白酶消化, 经试验鉴定获得了可扩增培养的瘤胃上皮细胞。本试验方法简便易行, 具有较强的可操作性。

有研究表明, 胃肠道上皮细胞的原代培养已在实践中大量应用。有人指出, 人的胃黏膜上皮细胞是以胶原酶和透明质酸酶对胃黏膜进行处理得到的[8];猪小肠黏膜上皮细胞采用组织块贴壁法能获得活性好的黏膜上皮细胞[9];而周传丽等[10]报道, 利用Ⅺ型胶原酶和Ⅰ型中性蛋白酶的混合液灌注仔猪小肠能消化分离小肠黏膜上皮组织得到形态完整、容易贴壁生长的小肠绒毛细胞团。本试验采用0.25%的胰蛋白酶-0.02%EDTA对驯鹿瘤胃黏膜上皮进行处理, 结果表明, 可以获得大量活性较好的上皮细胞, 易于培养。

反刍动物的瘤胃壁由黏膜、黏膜下层、肌层和浆膜4层构成。瘤胃黏膜表面被覆复层扁平上皮, 其由外至内分为角质层、颗粒层、棘细胞层和基底层[11], 其中角质细胞没有细胞活性, 而基细胞具有很强的分裂增殖能力, 其次为颗粒细胞[2]。分离瘤胃上皮细胞时选择胰酶多次连续振荡消化可获得大量上皮细胞, 但在细胞的游离状态下不能确切区分每一层的细胞。本试验中发现, 角质细胞不贴壁, 不生长, 不影响其他细胞的贴壁和生长, 在换液时会随细胞培养液被弃掉。由本试验结果可以推测, 尽管细胞贴壁生长但由于处于非生理的条件下, 在显微镜下观察均呈典型的上皮样生长, 不体现颗粒细胞、棘细胞或是基细胞的形态特性。

角蛋白存在于上皮细胞胞浆中构成上皮细胞内细胞骨架, 是上皮细胞中特异性的抗原, 具有多种表型。有人对仔猪小肠黏膜上皮细胞[9]和肾小管上皮细胞[12]的CK18进行了鉴定;多曙光等[13]对牛乳腺上皮细胞中的CK5和CK8进行了鉴定;李海甲[14]培养的兔气管黏膜细胞是采用广谱抗角蛋白单克隆抗体进行免疫组织化学染色。本试验在形态鉴定的基础上, 对所培养细胞中的角蛋白CK19进行了免疫细胞化学的染色, 呈阳性反应。

尽管对于瘤胃细胞的原代培养有大量文献佐证, 但未见有关其传代培养的报道。本试验经多次反复尝试与改进, 成功地进行了驯鹿瘤胃上皮细胞的传1代体外培养, 但对于驯鹿瘤胃上皮细胞能否连续传代培养, 是否受培养条件局限, 仍需进一步验证。

J.J.Gildea等[15]分别用传统的方法和三维细胞培养技术培养了人的肾上皮细胞, 结果表明, 用三维细胞培养技术获得的细胞在基因表达、基质分泌及细胞功能活动等方面与传统细胞培养技术获得的细胞有差异, 而与体内细胞的生长情况更为相似, 而且三维细胞培养既能保留体内细胞微环境的物质结构基础, 又能体现细胞培养的直观性及条件可控制性, 所得到的研究结果也更为可靠。由此启示人们, 今后可以从这一方面加以突破。

中国驯鹿瘤胃上皮细胞体外分离培养方法的初步建立为体外研究中国驯鹿瘤胃上皮细胞的生理功能奠定了试验基础。

子宫血管周上皮样细胞肿瘤1例 篇7

患者,女,41岁。因“经量增多、经期延长2年余”于2011年4月11日入院。患者两年前开始出现经量增多、经期延长,伴痛经,自觉乏力、头昏。既往体健,孕3产1流2。入院后查体:贫血貌。妇科检查:子宫增大如孕2月余大小,质中偏硬,活动欠佳,压痛,双侧附件区未扪及明显包块、无压痛。B超:子宫增大(大小73 mm×76 mm×64 mm),子宫后壁低回声结节(大小35 mm×36 mm×23 mm),病理性质待定,肌瘤?血常规:血红蛋白78 g/L。术前诊断:(1)子宫腺肌病;(2)子宫肌瘤;(3)贫血(中度)。给予输血治疗后于2011年4月14择期行全子宫+双侧输卵管切除术+左侧卵巢囊肿剥除术,术中发现子宫增大如孕2月余大小,质中偏硬,双侧输卵管充血、水肿,与同侧卵巢黏连,左侧卵巢增大,直径约3 cm,内为巧克力样液体,右侧卵巢外观色泽正常。台下矢状位剖开子宫见子宫内膜增厚,未见菜花状组织,子宫肌层增厚,见暗红色出血灶,右侧宫底部浆膜下有一直径约3 cm的包块,包膜不明显,边界清楚,未见暗红色出血灶及漩涡状结构,呈灰白色,左侧卵巢囊肿囊壁光滑,无乳头,双侧输卵管充血水肿。术后病检:巨检:子宫体积10.5 cm×8 cm×6 cm;宫腔深7 cm;内膜厚0.2 cm;肌层厚3～4 cm,可见暗红色出血灶;右宫底浆膜面肌层局部增厚可见结节,体积35 mm×36 mm×23 mm,表面灰白色,包膜不完整,切面实性,呈鱼肉状,质地软。镜检:子宫腺肌症;子宫内膜单纯性增生过长;慢性宫颈炎;左侧卵巢巧克力囊肿;双侧输卵管慢性炎症;右宫底浆膜面见大小35 mm×36 mm×23 mm肿块与输卵管系膜相连,来源待定(建议上级医院会诊)。肌层免疫:Desmin++、Actin++、ER+、PR+。遂要求家属将笔者所在医院切面送中南大学湘雅医院会诊,会诊结果如下:病理切片形态符合免疫组化为血管周上皮样细胞肿瘤,本病例形态上细胞丰富、无明显恶性特征,HMB45++、SMA++、CD117++、S-100+、CK-P-、CD10-、Ki-67约1%。术后患者恢复好,随访1月余暂无不适。

2 讨论

2.1 子宫血管周上皮样细胞肿瘤(PEcomas)定义

WHO(2003)女性生殖器官肿瘤分类中定义子宫血管周上皮样细胞肿瘤(PEComas)主要或全部由HMB45阳性的血管周上皮样细胞组成,细胞具有嗜酸性颗粒状胞质。这组病变还包括血管平滑肌脂肪瘤、淋巴管平滑肌瘤以及透明细胞“糖”瘤等,主要涉及肾、肺和肝,子宫罕见,自1996年Pea等首先报道至今仅30余例[1,2,3,4,5,6]。

2.2 子宫PEComa的临床与病理特点

子宫PEComa是非常少见的子宫间叶性肿瘤,国内近年来有个案报告。。其发病年龄一般在40～75岁(平均54岁),多发生在宫体,少数报告在宫颈发生。临床表现多数患者有不规则阴道出血或发现子宫占位性肿瘤。少数病例伴有结节性硬化综合征。

病理大体标本检查:多数病例表现为子宫孤立性肿瘤结节,发生在肌壁间,少数为浆膜下或黏膜下。大小:多数为1.5～5 cm。呈棕黄色,肿瘤边界清楚,无包膜。组织学观察:肿瘤细胞呈多边形、圆形;细胞形态较规则;细胞质丰富,有的为淡嗜酸性颗粒状;核仁不明显,核分裂象多少不一(0～11个/10HPF)。免疫组化染色:HMB45弥漫表达为其特点,α-SMA、desmin有的病例有表达,Melan A、CD 10和S-100表达阴性。电镜观察:肿瘤细胞胞浆内见有黑色素小体或前黑色素小体。

2.3 子宫血管周上皮样细胞肿瘤的生物学特性

子宫PE-coma多为良性,亦可见恶性病例,提示该肿瘤为恶性潜能未定肿瘤。根据报告恶性病例可得出:(1)肿瘤可发生于各年龄女性,平均发病年龄与良性肿瘤相似。(2)恶性肿瘤直径较良性肿瘤偏大,肿瘤多>8 cm。(3)病理上恶性肿瘤多见坏死,有明显细胞异型性,如核分裂象>1/50HPF,则应考虑肿瘤恶性可能。

2.4 诊断、治疗及预后

该疾病诊断主要依靠病理组织学,其病理学特征如下:(1)瘤细胞围绕血管周围排列。(2)可由上皮样和梭形细胞混合组成。(3)肿瘤细胞胞质透明至颗粒状、弱嗜酸性。(4)细胞核小、染色质密度中等,核仁不明显,可有核异型性及核分裂象。(5)间质富于血管,可为分支状毛细血管网或透明变性的厚壁血管。(6)表达肌细胞和黑色素细胞标志物,以HMB45最为敏感,较少表达desmin。

目前认为,子宫PEcoma最直接有效的治疗手段是行全子宫加双附件切除术,有些复发、转移患者行放疗、化疗,但疗效不得而知。肿瘤多为良性特征,一般预后良好,本文患者存活,但也有一些病例可以复发而呈恶性经过。

参考文献

[1]Martignon IG.I'ea M,Reghellin D,et al.PEComas:the past,the present and the future.Virchows Arch,2008,452:1 19 - 132.

[2]Kolpe AL.Mentzel T,Lehr HA.et al.Perivascular epithelioid cell neoplasms of soft tissue and gynecologic origin.Am JSurg Patho,2005, 29(12):1558 -1575.

[3]Vang R,Kempson RL.Perivascular epithelioid cell tumor(PKComa) of the uterus:a subset of HMB 45 positive epithelioid mesenchym al neoplasms with an uncertain relationship to pure smooth muscle tumors.Am J Surg Patho.2002,26(1):1 - 13.

[4]Green e LA,Mount SL.Schned AR.et al.Recurrent perivascular epithelioid cell tumor of the uterus(PECom a);an immunoh isto chemical study and review of the literature.Gynecol On co,2003,90(3 ): 677 -681.

[5]廖琼,孙维纲,杨素琼,等.子宫血管周上皮样细胞肿瘤1例.诊断病理学杂志,2008,15(3):247-248.

输卵管上皮细胞 篇8

1 材料与方法

1.1 大鼠肝卵圆细胞的分离

选用昆明医科大学动物实验中心繁育的近交系SPF级雄性SD大鼠, 体质量 (250±20) g, 实验动物饲养于昆明医科大学天然药物重点实验室的SPF级动物实验室, 单笼饲养, 喂食普通饲料, 引用高压蒸汽灭菌水, 饲养环境温度波动于22~25℃, 湿度为40%~80%。应用二乙酰氨基芴/部分肝切除法 (2AAF/PH) 建立大鼠HOC增殖模型, 肝切除术后7d采用改良二步酶消化法[3]分离HOC, 并对HOC进行体外培养。

1.2 HOC体外培养及诱导向胆管上皮细胞分化体系的建立

细胞培养所用的新生牛血清 (new born calf serum) , DMEM-F12培养基购于hyclone公司, 表皮生长因子 (endothelial growth factor, EGF) 、干细胞生长因子 (stem cell growth factor, SCF) 、白血病抑制因子 (leukemia inhibitory factor, LIF) 购于sino生物公司。原代分离的HOC 3 d内培养于含20%新生牛血清的DMEM-F12培养基中, 第4天更换为含20%新生牛血清、SCF 20 ng/m L、EGF 10 ng/m L、LIF 10ng/m L的DMEM-F12培养基, 细胞培养于37℃, 5%二氧化碳细胞培养箱。

1.3 细胞形态观察及细胞生长曲线的绘制

每3 d于倒置相差显微镜下观察实验组及对照组细胞形态及生长情况, 必要时更换培养基并传代。在细胞培养过程中, 对第1、3、5和7代细胞进行传代时取部分细胞悬液, 调整细胞浓度为1×104/m L, 按5×102/孔将细胞接种于96孔板, 每代细胞接种7个复孔, 待细胞贴壁后分别于第0、1、2、3、4、5和6天取出培养板, 以MTT法比色法检测吸光度, 绘制细胞生长曲线。

1.4 流式细胞检测CK-19及OV-6阳性细胞的表达

分别取所培养的细胞原代及第4、6代细胞进行流式细胞检测, 流式细胞检测所用的小鼠抗大鼠OV-6抗体、兔抗大鼠CK-19抗体、FITC标记的山羊抗小鼠抗体以及PE标记的山羊抗兔抗体均购于Santa Cruz公司。将生长良好并铺满瓶底的上述代次细胞以胰酶消化使贴壁细胞漂浮后终止消化, 细胞离心后以PBS缓冲液悬浮, 调整细胞数量为1×105/m L, 将同一代细胞悬液分别置于3个流式管, 设立阴性对照组、OV-6组及CK-19组。1 200 r/min离心8 min, 弃上清, OV-6组及CK-19组分别加入相应的一抗, 振荡混匀后避光孵育30 min, 加入PBS缓冲液1 m L, 振荡后1 200 r/min离心8 min, 弃上清, 加入相应的二抗振荡混匀, 避光孵育30 min后上机检测。

1.5 免疫荧光显微镜观察胆管上皮细胞细胞分化

将实验组第1、3、5、7代细胞接种于24孔板, 待细胞细胞铺满后吸去培养基, 加入4%多聚甲醛固定15 min, 37℃下PBS振荡洗涤3次, 每次5 min, 以1%Triton-X100溶液破膜30 min, 37℃下PBS振荡洗涤3次, 每次5 min, 按1∶100稀释一抗后加入孔板, 37℃避光孵育20 min, 放入4℃冰箱中避光过夜。次日吸去一抗工作液, 37℃下PBS振荡洗涤3次, 每次5 min, 按1∶100稀释荧光标记的山羊抗兔抗体, 37℃避光孵育30 min, PBS振荡洗涤3次, 每次5 min, 每孔加入200μL DMEM培养基封闭, 上机检测。

1.6 统计学分析

实验数据以SPSS18.0进行统计学处理, 组间及组内差异采用单因素方差分析及LSD法进行比较, 检验水准α=0.05, P<0.05差异有显著性。

2 结果

2.1 原代HOC形态特点

以2AAF/PH方法3建立大鼠HOC增殖模型后以改良二步酶消化法分离的HOC在光镜下呈卵圆形, 细胞体积较小, 核质比大, 可见有较多体积较大的非卵圆细胞 (图1A) , 随着培养过程的进行, 非卵圆细胞逐渐减少, 培养第4天, 加入含有细胞因子的培养基后, 细胞生长速度增快, 至第8天可见典型的集落形成 (图1B) , 细胞传代后可见大量细胞为梭形或类圆形, 有少量细胞表现为不规则形, 细胞体积仍较小 (图1C) 。细胞培养传代至第3代时, 可见大量细胞为不规则形, 细胞体积较大, 细胞质变薄, 部分细胞可见明显的细胞核 (图1D) 。

2.2 细胞生长曲线

诱导后的HOC生长速度增快, 根据MTT法测吸光度后绘制的生长曲线可见, 第3代细胞生长速度最快, 而第5代及第7代生长速度虽然较第3代细胞慢, 但仍保持了较好的增殖活性, 生长较第1代细胞更为良好。

A:原代培养的大鼠干卵圆细胞, 可见细胞大小不一, 非目的细胞较多 (×100) ;B:诱导后的大鼠肝卵圆细胞形成典型的集落, 部分细胞形态发生变化 (×100) ;C:第3代HOC细胞形态发生改变, 大部分呈梭形, 仍可见少量类圆形细胞 (×100) ;D:第7代HOC细胞形态呈现不规则形, 细胞较薄, 呈典型的上皮样细胞形态 (×100)

2.3 流式细胞结果

%

注:1) 与原代细胞相比, P<0.05, 差异有显著性;2) 与第4代细胞相比, P<0.05, 差异有显著性

附表和图3提示, 原代HOC中表达OV-6阳性的细胞比例较高, 约为 (94.30±1.40) %, 而原代细胞CK-19阳性细胞率仅为 (3.16±1.87) %, 而诱导后并传代的HOC, 第4代细胞CK-19阳性细胞比率为 (61.23±3.21) %, 而OV-6阳性细胞比率, 则下降至 (27.13±2.89) %, 与原代HOC相比, 差异有显著性 (P<0.05) 。而至第6代细胞, 此差异则更为明显。

A:原代HOC OV-6阴性对照流式细胞结果;B:原代HOC OV-6阳性细胞比率;C:诱导后的第4代HOC OV-6阳性细胞比率;D:原代HOC CK-19阴性对照流式细胞结果;E:原代HOC CK-19阳性细胞比率;F:诱导后的第4代HOC CK-19阳性细胞比率

2.4 免疫荧光显微镜结果

免疫荧光显微镜下, 第3代HOC中可见OV-6阳性细胞, 但表达强度不高, OV-6阳性细胞体积较小, 呈类圆形 (图4A) , 部分OV-6强阳性细胞可见突出的伪足样结构 (图4B) 。诱导后的第3代HOC CK-19广泛表达, 并可见部分细胞表达强阳性 (图4C) , 免疫荧光显微镜下可见CK-19阳性细胞体积较大, 细胞质较薄, 可见“伪足”样突起, 且可见诱导后的HOC并非平铺于孔板底部, 而是具有一定的立体空间结构 (图4D) 。

A:OV-6阳性细胞体积较小, 呈类圆形;B:部分OV-6强阳性细胞可见突出的伪足样结构;C:诱导后的第3代HOC CK-19广泛表达, 并可见部分细胞表达强阳性;D:免疫荧光显微镜下可见CK-19阳性细胞体积较大, 细胞质较薄, 可见“伪足”样突起

3 讨论

胆管上皮细胞在以往被认为是被覆于肝内外胆管的一类简单的上皮细胞, 其功能是维持胆道的结构完整以保持其输送胆汁进入肠道。而近几年来越来越多的研究证实, 胆管上皮细胞不仅仅是一类仅在结构上维持完整的细胞群, 而是在胆汁分泌、炎症发生及排斥反应等方面均起到重要作用的细胞群[4]。从组织起源来看, 肝内胆管由来源于肝芽突的肝前体细胞延门静脉分支形成, 而肝外胆管则由肝芽突及腹胰突之间的内胚层细胞形成[4]。目前, 对于胆管上皮细胞的组织来源及分化过程尚不完全明确, 但有研究认为, 胆道系统与肝脏及胰腺同样来源于胚胎发育过程中的内胚层前肠 (foregut) 。在肝外胆道中, 存在大量的胆管周围腺体 (peribiliary glands, PBGs) , 这些腺体中存在一类SOX17+/PDX1-的细胞亚群, 能够分化为肝外胆管上皮细胞[5]。而在肝内组织中, hering管中的肝卵圆细胞则被认为是肝内干细胞, 能够分化为成体肝细胞或胆管上皮细胞, 从而维持肝内的结构和功能完整。

目前对于肝卵圆细胞的表面及胞内分子标志, 尚无统一的认识, 目前的研究发现, HOC可表达c-kit、CD90和OV-6等表面标志[6]。因此, 有学者认为OV-6可标记大部分的卵圆细胞。而胆管上皮细胞则可表达SOX17、γ-GT和CK19等表面和胞内分子标志, 其中CK-19被认为是胆管上皮细胞的特异性标志。根据以上研究结果, 本研究选择了OV-6作为大鼠肝卵圆细胞的标志, CK-19作为诱导后胆管上皮细胞的标志, 自原代培养的细胞开始以流式细胞检测OV-6阳性肝卵圆细胞及CK-19阳性胆管上皮细胞的比例变化。

目前, 对于体外培养胆管上皮细胞的研究较少, 这不仅仅因为成体的胆管上皮细胞难以分离、纯化, 作为一种分化成熟的细胞, 成体胆管上皮细胞体外培养容易老化, 在培养过程中增殖能力有所减弱[7]。而对于通过肝卵圆细胞诱导获得胆管上皮细胞, 尚无统一有效地方法, 有研究采用丁酸钠作为诱导分化剂, 可诱导大鼠肝卵圆细胞分化为胆管上皮细胞, 但过高浓度的丁酸钠反而有可能抑制细胞生长[8]。

表皮生长因子 (epithelial growth factor, EGF) 是促有丝分裂因子, EGF通过与其膜受体EGFR结合, 起到促进细胞增殖的作用, 有研究使用EGF对实施2AAF/PH后的大鼠进行体内灌注EGF, 证实EGF能够促进胆小管细胞及其周围细胞的增殖, 并且能够促使HOC从汇管区向肝实质迁移[9]。此外, 干细胞生长因子 (stem cell growth factor, SCF) 是一种重要的造血刺激因子, 通过与细胞表面的c-kit结合, 是细胞活化并产生增殖。HOC表面可表达c-kit, 并且SCF可能在卵圆细胞的增殖活化过程中起到关键作用[10]。

对于大鼠肝卵圆细胞体外分化为胆管上皮细胞的研究, 目前还较少, 本实验通过EGF及SCF的协同作用, 成功诱导大鼠肝卵圆细胞分化为表达CK-19的胆管上皮细胞, 并且细胞形态发生了明显的改变, 符合上皮细胞形态特点, 并且免疫荧光证实CK-19在培养细胞中的表达。但对于诱导过程中的具体机制, 还需要进一步研究来阐明其作用途径及机制。

摘要：目的 通过对大鼠肝卵圆细胞进行体外培养, 建立诱导大鼠肝卵圆细胞分化为胆管上皮细胞的诱导体系。方法 通过2AAF/PH建立大鼠肝卵圆细胞活化模型, 使用二步酶消化法获得原代肝卵圆细胞, 应用20ng/mL干细胞生长因子及10 ng/mL表皮生长因子诱导肝卵圆细胞向胆管上皮细胞分化, 并应用流式细胞及免疫荧光观察细胞分化过程中OV-6及CK-19标志的表达变化。结果 原代肝卵圆细胞OV-6阳性细胞为 (94.30±1.40) %, CK-19阳性细胞为 (3.16±1.87) %, 诱导后第7代细胞OV-6阳性细胞为 (4.97±0.21) %, CK-19阳性细胞为 (96.17±1.21) %, 差异有显著性 (P<0.05) 。免疫荧光结果证实CK-19广泛表达。结论 成功诱导大鼠肝卵圆细胞分化为表达CK-19的胆管上皮细胞, 细胞形态符合上皮细胞形态特点, 表皮生长因子及干细胞生长因子可诱导肝卵圆细胞分化为胆管上皮细胞。

关键词：大鼠,肝卵圆细胞,胆管上皮细胞,细胞分化

参考文献

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