小鼠肝癌细胞（共6篇）
小鼠肝癌细胞 篇1
凋亡是程序性细胞死亡, 是指为维持内环境稳定, 由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡异常在肿瘤发病中起了重要作用, 因此选择性地诱导肿瘤细胞凋亡为目标的凋亡干预技术已成为治疗恶性肿瘤的基本策略之一。有许多因素能诱导细胞发生凋亡, 如糖皮质激素、药物、损伤等, 有研究报道乙醇可诱导多种肿瘤细胞发生凋亡, 细胞凋亡是乙醇引起肿瘤细胞死亡的一个重要途径。本实验主要是观察乙醇对小鼠肝癌细胞 (H22) 凋亡的诱导作用, 以期能对相关实验提供一定的基础。
1 材料与方法
1.1 一般资料
1.1.1 细胞系
小鼠肝癌细胞由山东大学医学院免疫学研究所培养。
1.1.2
主要试剂RPMI1640, 胰蛋白酶 (GIBco公司) ;胎牛血清 (杭州四季青公司) ;碘化丙锭 (美国基因公司) ;0.01mol/LPBS (pH7.4) , 枸橼酸钠, 无水乙醇, 台盼蓝, D-Hanks液等。
1.1.3 主要仪器及材料
CO2培养箱;台式离心机;流式细胞仪;超净工作台, 倒置显微镜。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞传代培养
H22细胞, 用含15%胎牛血清, 青霉素和链霉素各100μg/mL的RPMI1640, 37℃, 5%CO2饱和湿度环境常规传代培养, 待生长至对数生长期, 细胞计数板计数, 接种于24孔板中, 每孔约 (2～3) ×105个细胞, 37℃, CO2培养箱培养过夜, 待细胞贴壁。
1.2.2 乙醇诱导细胞凋亡
上述培养细胞待贴壁生长至对数生长期, 吸去培养液, 用PBS (pH7.4) 洗2次, 将浓度分别为4%、6%、8%、10%、12%、14%的乙醇加入24孔板中, 放入37℃, CO2培养箱培养6h后, 倒置显微镜下观察结果。
1.2.3 倒置显微镜下观察H22细胞凋亡百分率
H22细胞与乙醇共培养6h后, 细胞加入终浓度为4g·L-1台盼蓝染色10min后, 在倒置显微镜观察, 计数凋亡细胞。凋亡细胞计数时, 随机选取视野, 计数1000个细胞中的凋亡细胞数。重复4次, 取平均值。
2 结果
倒置显微镜观察可见, 4%乙醇组细胞无明显的形态学变化, 6%～12%乙醇组可见部分细胞缩小变圆, 弯亮, 贴壁性降低和胞浆“出泡”等凋亡形态学特征其凋亡率分别为33%、70%、92%、99%。14%乙醇组大部分细胞变暗, 形状不规则, 胞浆收缩, 颗粒增多, 并有碎片状漂浮物, 为坏死的形态学变化。随着乙醇浓度的增加, 细胞的杀伤率逐渐增加。
3 结果
乙醇可诱导小鼠肝癌细胞凋亡, 12%乙醇与小鼠肝癌细胞共培养6h后诱导凋亡的百分率最高, 乙醇浓度再高则可使其发生坏死。
4 讨论
4.1 关于乙醇诱导细胞凋亡的方法已有很多报道, 但目前对于乙醇诱导小鼠肝癌细胞凋亡的研究很少。本实验探索了乙醇诱导小鼠肝癌细胞凋亡的方法, 希望能对有关小鼠肝癌细胞凋亡的实验提供一定的帮助。
4.2 乙醇诱导肝细胞凋亡的机制尚未完全阐明, 目前认为与以下几种因素有关系:细胞色素P4502E1 (CYP2E1) 的活化;肿瘤坏死因子 (TNF) 和肿瘤坏死因子受体 (TNF-R) 的活性增高;肌纤维母细胞和转化生长因子- (TGF-) 的作用;氧应激的作用;肝脏铁负荷增加等。总之, 乙醇诱导肝细胞凋亡是多个因素及基因调控的复杂过程。
摘要：目的研究乙醇诱导小鼠肝癌细胞凋亡的方法。方法不同浓度的乙醇与小鼠肝癌细胞共培养6h后观察细胞凋亡率。结果乙醇与小鼠肝癌细胞共培养6h后, 12%的乙醇诱导凋亡的百分率最大。结论乙醇可诱导小鼠肝癌细胞凋亡。
关键词：凋亡,小鼠肝癌细胞,乙醇
参考文献
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小鼠肝癌细胞 篇2
1材料与方法
1.1材料雌性BALB/c小鼠, 4~6周, 购自北京维通利华实验动物技术有限公司。小鼠肝癌H22细胞株, 购自上海拜力生物科技有限公司。主要试剂:重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 (recom-binantmousegranulocyte-maerophagecolonystin-alatingfactor, rmGM-CSF) , 重组白细胞介素4 (re-combinantmouseinterleukin4, rmIL-4) 、购自美国PeproTech公司, 脂多糖 (Lipopolysacchrides, LPS) 购自Sigma公司。RPMI-1640培养基, 购自Gibco公司。抗小鼠CD1a-FITC、抗小鼠CD86-FITC, 购自BDPharmingen公司。抗小鼠CD11c-PE、抗小鼠CD80-PE-Cy5, 购自eBioscience公司。
1.2小鼠骨髓DC的制备将BALB/c小鼠颈椎离断处死, 取其胫骨和股骨, 用1ml注射器吸取RP-MI-1604培养基, 刺穿骨骺端冲洗骨髓腔, 将所得悬液离心、洗涤, 重悬细胞于10%胎牛血清的RPMI-1604培养基。调整收获的骨髓细胞的浓度至1×105/ml~1×106/ml, 加入rmIL-4 (终浓度10ng/ml) 和rmGM-CSF (终浓度20ng/ml) 培养, 保留贴壁细胞;隔日半量换液, 培养至第6天收集所有吹吸后的悬浮细胞。调整收集细胞的浓度为1×105/ml~1×106/ml, 加入LPS刺激24h使其成熟, 用0.4%台盼蓝染色后, 用血细胞计数板计活细胞数, 活细胞数在95%以上, 进行DC的光镜观察。
1.3DC表面标记分子的检测收集最终制备的悬浮细胞, 用磷酸盐缓冲液洗两遍 (1000r/min离心, 5min) , 用流式细胞仪专用细胞固定液调整细胞浓度至1×106/ml, 取300μl细胞悬液分别加入1μl的抗小鼠CD1a-FITC抗体、抗小鼠CD11c-PE抗体、抗小鼠CD80-PE-Cy5抗体、抗小鼠CD86-FITC抗体, 并避光孵育30min。用2ml的流式细胞仪专用细胞固定液洗两遍 (1000r/min离心5min) , 重悬细胞后用流式细胞仪检测荧光标记。
1.4H22肝癌细胞致敏的DCH22小鼠肝癌细胞以30μg/ml丝裂霉素灭活后与DC按1∶3混合, 以50%PEG37℃ 作用lmin, RPMI-1640培养基稀释后培养24h。
1.5建立皮下荷瘤鼠模型将生长良好处于对数生长期的H22 细胞接种于小鼠右后腿根部, 细胞浓度5×105/只, 建立皮下荷瘤小鼠模型, 2周后可见所有接种小鼠均生长出肿瘤, 3~4周后待小鼠肿瘤平均直径长至0.8cm左右即可用于实验。
1.6动物分组BALB/c小鼠随机分为实验组与对照组, 每组12 只。 观察指标:肿瘤体积、抑瘤率、生存期。 实验组分为DC治疗组、DC-H22治疗组, 对照组为生理盐水治疗组。DC及DC-H22注射治疗2 周后再次皮下注射H22 肝癌细胞 (每组4只) 。
1.7DC接种给荷瘤小鼠腹腔内注射DC、DC-H22、生理盐水, 1周后重复注射, 2周后测量肿瘤直径, 计算肿瘤体积、抑瘤率。 公式:V = LW2/2 (mm3) , V为体积, L为瘤体的最大直径, W为垂直直径。抑瘤率 (%) =[1- (治疗组开始平均瘤体积-治疗组结束平均瘤体积) / (对照组开始瘤体积-对照组结束平均瘤体积) ]×100%。
1.8统计学分析用SPSS17.0, 各组肿瘤体积的比较用One-WayANOVA方差分析, 生存期比较用单因素方差分析。
2结果
2.1DC光镜下形态观察分离的骨髓细胞体积小、圆形, 经rmIL-4、rmGM-CSF和LPS作用后, 观察到呈半贴壁状态的细胞形态不规则、大小不一、聚集成团, 逐渐发展为贴壁生长、胞体增大、树突状突起, 在高倍镜下细胞表面可观察到较多毛刺样突起, 呈现典型的成熟DC形态。
2.2细胞表型特征制备的DC, CD1a、CD11c及CD86、CD80呈现高表达。
2.3DC对肿瘤体积的影响见表1。
单因素方差分析 (体积变化) 结果: (1) 方差齐性检验Levene检验, P=0.580, 可认为方差齐 (P>0.05) 。 (2) 方差分析表 (ANOVA) 表明, F =79.214, Sig=0.000, 按 α=0.05水准, 拒绝H0, 接受H1, 故可认为三组的治疗前、后体积变化有差别。 (3) 多重比较检验 (PostHocTests) 表明, 三组之间的体积变化有显著性差别 (P<0.05) 。说明:治疗前各组间的肿瘤体积基本相同, 不同治疗2周后, DC治疗组、DC-H22治疗组小鼠肿瘤体积较生理盐水治疗的对照组显著性减小, 说明DC及DC-H22治疗小鼠肝癌可以显著抑制皮下移植肿瘤的生长, 而致敏的DC对肿瘤的抑制程度更大。
2.4抑瘤率及生存期观察见表2。单因素方差分析 (生存期) 结果: (1) 方差齐性检验Levene检验, P=0.565, 可认为方差齐 (P>0.05) 。 (2) 方差分析表 (ANOVA) 表明, F=71.146, Sig=0.000, 按 α=0.05水准, 拒绝H0, 接受H1, 故可认为三组的生存期有差别。 (3) 多重比较检验 (PostHocTests) 表明, 三组之间的体积变化有显著性差别 (P<0.05) 。说明:DC治疗组、DC-H22组治疗2周后, 其抑瘤率分别为31.08%、68.3%, 小鼠的存活期亦较生理盐水对照组延长。
2.5复种H22肝癌细胞治疗2周后再次于对侧后腿根部皮下接种H22肝癌细胞, 荷瘤小鼠未见明显抑瘤作用。
3讨论
近20 余年来, 有关肿瘤组织中DC浸润程度与肿瘤转移及临床预后关系的报道陆续出现, DC的基础性研究及以DC为基础的肿瘤疫苗治疗正成为研究的热点[4,5]。利用DC来诱导机体抗肿瘤免疫已成为肿瘤免疫治疗的新途径, 其核心问题是如何在体外进行DC肿瘤抗原的特异性修饰, 从而发挥最大的特异性抗肿瘤作用。
本实验应用H22肝癌细胞致敏的DC治疗荷瘤小鼠, 结果显示治疗前各组间的肿瘤体积基本相同, 不同治疗2周后, DC治疗组、DC-H22治疗组小鼠肿瘤体积较生理盐水治疗的对照组显著性减小, 说明DC及DC-H22治疗小鼠肝癌可以显著抑制皮下移植肿瘤的生长, 而H22肝癌细胞致敏的DC对肿瘤的抑制程度更大, 发挥特异性抗肿瘤作用。DC治疗组和DC-H22治疗组其抑瘤率分别为31.08%、68.30%, 治疗后小鼠的进食情况、活动度等基本生命指标明显优于对照组, 其存活期亦较盐水对照组延长。
本实验可以观察到DC及H22肝癌细胞致敏的DC治疗荷瘤小鼠后, 无论是肿瘤体积还是生存期均有改善。但能否影响肿瘤的复发尚不确定, 融合性后抗原递呈作用持续多久、抗肿瘤时间也不确定, 可以发挥最大抗肿瘤作用的接种次数及间隔时间也还是未知数。本实验也经过DC及DC-H22治疗后复种H22肝癌细胞, 但并未观察到无瘤生存现象, 考虑与接种次数及间隔时间和小鼠的生存期短的干扰有关, 需进一步实验研究。
DC的体外制备目前虽已较为成熟, 但是如何增强其靶向性、特异性、持久性, 仍是临床肿瘤治疗中一个艰巨的挑战。未来还需要针对肿瘤特殊的免疫抑制环境, 整合DC疫苗以及其他的免疫治疗模式, 形成更强大的肿瘤免疫治疗组合。
参考文献
[1]Friedl J, Stift A, Paolini P, et al.Tumor antigen pulsed dendritic cells enhance the cytolytic activity of tumor in filtrating lymphocytes in human hepatocellular cancer〔J〕.Cancer Biother Radiopharm, 2000, 15 (5) :477-486.
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[3]金娟, 王保龙.RNA转染的树突状细胞疫苗及其在肿瘤治疗中的研究进展〔J〕.国际免疫学杂志, 2010, 33 (1) :53-55.
[4]张晓娟, 董坚, 吴振林, 等.HSP70多肽复合物修饰DCs疫苗抗胰腺癌荷瘤小鼠的实验研究〔J〕.中国免疫学杂志, 2009, 25 (9) :792-796.
小鼠肝癌细胞 篇3
1 材料和方法
1.1 细胞系和细胞培养
小鼠腹水型肝癌高、淋巴道转移株Hca-F和Hca-P细胞由大连医科大学病理教研室自建并冻存。复苏液氮冻存的Hca-F和Hca-P细胞,用含10%胎牛血清(PPA公司)的RPMI 1640完全培养基(Invitrogen公司)37℃、5%二氧化碳(CO2)孵箱(Thermo公司)培养细胞24 h,收集细胞分别进行下列实验。
1.2 细胞增殖能力的检测
1.2.1 制作吸光度与细胞数关系的标准曲线
无血清培养基培养Hca-F和Hca-P细胞24 h,调整细胞浓度为1×104/m L、2×104/m L、4×104/m L、8×104/m L和1.6×105/m L分别加入96孔板中,每孔加100μL,每组设5个复孔,然后再向每孔细胞悬液中加入10μL CCK8(日本Dojindo公司),37℃、5%CO2孵箱继续孵育1 h,酶标仪(Thermo公司)在450 nm波长下测每组的吸光度。RPMI 1640完全培养基加CCK8作为空白对照,细胞吸光度为测得的吸光度减去空白对照。
1.2.2 CCK8法检测细胞增殖能力
收集Hca-F/Hca-P细胞,用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养基调整细胞浓度为1×104/m L,加入96孔板中,每孔加100μL,每组设5个复孔,分别在5%CO2孵箱中37℃孵育0、24和48 h,然后再向每孔细胞悬液中加入10μL CCK8,37℃、5%CO2孵箱继续孵育1 h,酶标仪在450 nm波长下测每组的吸光度,观察不同的时间点细胞数目的变化。RPMI 1640完全培养基加CCK8作为空白对照。
1.3 Transwell小室法检测细胞侵袭能力
无血清培养基培养Hca-F和Hca-P细胞24 h,然后分别稀释Hca-F和Hca-P细胞至3×105/m L,每个Transwell小室加入50μL Matrigel(BD公司),5%CO2孵箱37℃孵育1 h,无血清培养基水化30min。各组细胞悬液按每孔100μL加入Transwell小室(Coring公司)的上室,在下室加入500μL含20%胎牛血清的RPMI 1640完全培养基37℃、5%CO2孵箱培养细胞24 h。0.1%的结晶紫染色20 min。在正置显微镜(Olympus公司)下观察Transwell小室下室面发生侵袭的细胞,每组随机选取5个视野进行计数。同时对下室培养基进行计数,以观察下室有无细胞的漏出。
1.4 膜联蛋白A7在亚细胞结构中的表达
1.4.1 亚细胞结构的分离提取
利用Proteo Extract subcellular Proteome Extraction Kit(S-PEK)(Calbiochem公司)分别分离提取上述Hca-F细胞和Hca-P细胞中细胞浆、细胞膜、细胞核和细胞骨架成份。
1.4.2 双向凝胶电泳
在10%聚丙烯酰胺凝胶中进行,膜联蛋白A7抗体(Sigma公司)浓度1︰1 500,HRP标记山羊抗鼠Ig G多克隆抗体(北京中杉金桥公司)浓度1︰1 500。内参:细胞浆采用GAPDH(康晨公司);细胞膜采用Pan-cadherin(Abcam公司);细胞核采用C-jun(Abcam公司);细胞骨架采用β-actin(Santa Cruz公司)。为了最小化各种变量的影响,蛋白表达采用相对值,即目的蛋白与内参之比。
1.5 统计学方法
所有实验数据应用SPSS 13.0(snow panther,USA)进行分析,数据结果以均数±标准差(±s)表示,膜联蛋白A7亚型差异用独立样本的t检验,采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 细胞增殖能力的检测
2.1.1 制作标准曲线
Hca-F/Hca-P细胞数对应的吸光度(见附表)及标准曲线(见图1)。
2.1.2 CCK8检测细胞增殖能力
无细胞单纯1640孵育0、24和48 h后加入CCK8的吸光度为(0.106±0.001 vs 0.097±0.003 vs 0.097±0.003,P>0.05),1640空白对照在3个时间点差异无统计学意义。孵育第0 h,Hca-F和Hca-P细胞各1 000个,未孵育(即孵育0 h)CCK8检测吸光度(0.146±0.015 vs 0.147±0.03,P>0.05),Hca-F和Hca-P细胞各1 000个,继续孵育24 h及48 h,CCK8检测吸光度为(0.866±0.102 vs 0.190±0.003;2.414±0.020vs 0.424±0.030,均P<0.05),即在第24 h和第48 h两个时间点,Hca-F细胞的增殖能力都高于Hca-P细胞,二者差异有统计学意义(见图2)。
注:吸光度值=测量值-空白对照
用CCK8法检测各时间点(0、24和48 h)的吸光度。0 h:细胞未孵育;24 h:细胞孵育24 h后;48 h:细胞孵育48 h后。F cell为Hca-F细胞;P cell为Hca-P细胞;1640为无细胞,单纯加入1640
2.2 Transwell小室检测细胞侵袭能力
Hca-F细胞在Transwell小室穿过膜的细胞数明显高于Hca-P细胞,二者有统计学意义[(90±4)个和(69±9)个,P<0.05]。下室未发现有细胞漏出。结果见图3。
用Transwell小室检测各组细胞的侵袭能力(即穿膜细胞数)。Hca-F细胞在Transwell小室穿过膜的细胞数[(90±4)个]明显高于Hca-P细胞[(69±9)个](P<0.05)
2.3 膜联蛋白A7在亚细胞结构中的表达
膜联蛋白A7的47 k D和51 k D两种亚型在Hca-F细胞和Hca-P细胞均有表达。其中,47 k D亚型在Hca-F细胞的细胞浆、细胞膜细胞器膜、细胞骨架中的表达均明显高于Hca-P细胞,两株细胞在上述3种亚细胞器的表达依次为(73±7)%vs(49±19)%(P<0.05)、(36±8)%vs(24±9)%(P<0.05)和(53±7)%vs(40±12)%(P<0.05)。47 k D亚型在Hca-F细胞和Hca-P细胞细胞浆中的表达都明显高于在细胞膜细胞器膜、细胞核、细胞骨架中的表达,Hca-F细胞为(73±7%)vs(36±8)%、0及(53±7)%(P<0.01);Hca-P细胞为(49±18)%vs(24±9)%、0及(40±12)%(P<0.05)。在Hca-F细胞和Hca-P细胞细胞膜、细胞核、细胞骨架中未见明显51 k D亚型的表达。见图4。
Hca-F细胞Hca-P细胞A为膜联蛋白A7在Hca-F/P细胞的表达结果;B为GAPDH在Hca-F/P细胞细胞浆的表达结果;C为Pan-cadherin在Hca-F/P细胞细胞膜、细胞器膜的表达结果;D为C-jun在Hca-F/P细胞细胞核的表达结果;E为β-actin在Hca-F/P细胞细胞骨架的表达结果
3 讨论
Hca-F细胞和Hca-P细胞是利用可移植性小鼠腹水性肝癌细胞(H22)接种于有正常免疫功能的615小鼠足垫,经多次淋巴系统筛选而得到的2个来源于同一亲本细胞的细胞株,但两者淋巴道转移能力明显不同,Hca-F细胞淋巴道转移率为70%~80%,而Hca-P细胞淋巴道转移率为20%~30%[1,2,3]。体外实验证实[1,11,12],Hca-F细胞无论是在增殖能力还是侵袭能力都明显高于Hca-P细胞。膜联蛋白A7主要在细胞浆表达,其次为细胞骨架结构及细胞膜和细胞器膜;两种细胞均以47 k D亚型表达为主,且在Hca-F细胞的表达高于Hca-P细胞。
膜联蛋白A7是Ca2+依赖的磷脂结合蛋白,已有实验[13]表明大多数的膜联蛋白A7位于静息细胞的胞浆中,至少是在培养细胞中。膜联蛋白A7在细胞中的分布直接间接地与细胞浆和内膜系统相联系,参与胞吐胞饮,与细胞骨架蛋白结合,并与膜运输、Ca2+的自稳态调节与信号转导、细胞分化和细胞增殖等有关[4]。这些均与定位实验结果,膜联蛋白A7特别是47 k D蛋白亚型主要分布于细胞浆、细胞膜、细胞骨架中相符合。实验表明[13,14,15]膜联蛋白A7的分布依赖于细胞钙离子的水平,在钙离子载体中孵育30 min,膜联蛋白A7显示定位于细胞膜,而孵育4 h后,则显示为核膜定位。本实验所发现的膜联蛋白A7特别是47 k D亚型在细胞浆中的大量表达,是否与高淋巴道转移潜能的肿瘤细胞具有更加富集的钙离子浓度有关,还值得进一步深入研究。但研究中有关肿瘤细胞侵袭实验结果已表明[1],高淋巴道转移潜能的Hca-F细胞较之低淋巴道转移潜能的Hca-P细胞具有更加活跃的增殖与侵袭能力。因此可以推测其与细胞内钙离子调节具有某种相关。
膜联蛋白A7由于在其N末端不同的剪切产生了47 k D和51 k D两个蛋白亚型,有文献[9]表明,在人和小鼠的大部分组织仅表达47 k D亚型;骨骼肌仅表达51 k D亚型;而在脑和心脏这两种亚型都表达。本实验显示膜联蛋白A7在高/低淋巴道转移细胞模型中,47 k D亚型的表达都明显高于51 k D亚型,而51 k D亚型仅少量存在于胞浆中,即在肝癌组织中仍以47 k D亚型表达为主。这些可能与细胞的分化状态有关。
小鼠肝癌细胞 篇4
1 材料与方法
1.1 中药仙鹤复方水提物的准备
复方原料购自惠州市惠康医药有限公司,我院药剂科中药师鉴别确认,其水提取物由中国医学科学院放射医学研究所药物实验室提供(要求每ml相当于3.60g生药药液),并再分别稀释成1.80g/ml和0.9g/ml,共3种溶液。置4℃冰箱备用。
1.2 受试动物与瘤株
昆明种品系小鼠,雌雄各半,体质量18～22g,由北京动物实验中心提供,医学实验动物合格证号:SCXK2007-001,实验室适应性喂养1周后用于实验。鼠源S180肉瘤细胞和H22肝癌细胞,由天津药物研究院提供。
1.3 阳性对照药物与配制
环磷酰胺干粉,现用现配,0.9%氯化钠溶液溶解,配成20mg/ kg 的浓度备用。
1.4 方法
1.4.1 受试药物剂量
口服灌胃给药浓度分别为 3.6g·kg-1·d-1、1.8g·kg-1·d-1和0.9g·kg-1·d-1;阳性对照药物,环磷酰胺(CTX)4mg·kg-1·d-1灌胃给予;对照组灌胃给予等量0.9%氯化钠溶液,1次/d。
1.4.2 肿瘤细胞的复苏与传代
从液氮罐中取出S180和H22细胞株,37℃水浴中使之迅速解冻移入离心管内,加入10ml RPMI 1640培养液,振摇混匀,2000r/min离心2次,除去冻存液,用10ml RPMI 1640培养液稀释10倍,振摇成混悬液,在超净工作台上进行小鼠腹腔注射1ml传代。
1.4.3 肿瘤细胞悬液的制备
取传代第8天的S180或H22的腹水小鼠,脱颈椎处死,无菌抽取腹水,以无菌0.9%氯化钠溶液调至瘤细胞浓度为3.2×107个/ml的瘤细胞混悬液供接种用。
1.4.4 接种
取昆明种小鼠50只,用1ml的一次性注射器吸取S180肿瘤细胞悬液0.2ml,右前肢腋窝部皮下注射。H22:接种同上,接种40只雌雄各半小鼠。
1.4.5 受试动物的处理
接种肉瘤 S180细胞次日对小鼠称重,随机分为5组,每组8只,雌雄各半,分为空白对照组、阳性对照组及中药仙鹤复方水提取物高、中、低3个剂量组。中药仙鹤复方水提取物灌胃给药,1次/d,连续给药10d;环磷酰胺组为腹腔注射(4mg·kg-1·d-1),隔天给药1次,共给药3次;空白对照组灌胃给予等量0.9%氯化钠溶液,1次/d,连续10d。期间每日观察小鼠的一般活动、皮毛及粪便等情况。于末次给药后24h后颈椎脱臼处死小鼠剥取瘤组织称重,同时剥取小鼠肝、脾脏、胸腺称重,计算抑瘤率、脾指数及胸腺指数。H22肝癌细胞荷瘤小鼠处理方法同上操作。实验重复3次。抑瘤率(%)=(1-给药组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100%;脾脏指数=脾脏平均质量(mg) /小鼠平均体质量(g);胸腺指数=胸腺平均质量(mg)/小鼠平均体质量(g)。
1.5 统计学方法
采用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理,计数资料采用χ2检验;计量资料以
2 结果
空白对照组、环磷酰胺组、高剂量组、中剂量组、低剂量组S180肉瘤和H22肉瘤抑瘤率、脾脏指数、胸腺指数比较,差异均无统计学意义(P>0.05);5组之间平均瘤重比较,差异有统计学意义(P<0.05);其中高剂量组、中剂量组、低剂量组S180肉瘤和H22肉瘤平均瘤重较空白对照组均明显降低,差异有统计学意义(P<0.05,见表1、2)。
3 讨论
实验结果表明,中药仙鹤复方水提取物对鼠源移植型S180肉瘤细胞及H22肝癌细胞在荷瘤小鼠体内的增殖生长均具有明显的抑制作用,抑瘤率分别在24.1%～46.1%和12.6%～26.21%,相关免疫器官指数均好于空白对照组。
通过本实验可以看出,环磷酰胺在抑制肿瘤生长的同时对小鼠的体质量及胸腺、脾等重要免疫器官也产生了非常明显的抑制作用,传统的抗肿瘤药物由于有较明显的不良反应从而限制了其临床应用,但是本方水提取物3个剂量组不仅对肿瘤的生长有抑制作用,而且对实验动物的体质量及胸腺、脾等免疫器官的影响较小,使其有较好的耐受性
注:与空白对照组比较,*P<0.05
注:与空白对照组比较,*P<0.05
参考文献
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小鼠肝癌细胞 篇5
关键词：肝癌,H22细胞,原位移植模型,小鼠
肝癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一, 因其发病率高、恶性程度高、死亡率高, 素有“癌中之王”的称号[1]。目前已有大量研究为肝癌临床的治疗提供基础依据, 而肝癌动物模型一直是肝癌临床与基础研究工作的重要工具。目前有关人肿瘤转移模型大多是用裸大鼠、裸小鼠, 动物肿瘤则多数是用Wistar或SD大鼠建立的, 而用小鼠建立原位肿瘤移植模型国内外报道较少。小鼠作为一种更经济, 易饲养, 易获得的实验研究载体, 在发挥其普遍应用性方面有着重大的作用。小鼠肝癌原位移植模型作为一种新型的动物模型是否能更好地模拟人肝癌在体内发生、发展、侵袭及转移的过程, 本实验将研究报道如下。
1 材料与方法
1. 1 实验动物及瘤株
SPF级昆明小鼠40 只, 雄性, 鼠龄5 周龄, 体重约18 ~ 22g; 腹水型肝癌H22 细胞株, 由佳木斯大学中心实验室代为冻存。
1. 2 实验仪器及材料
台式低温高速离心机、切片机、光学显微镜、游标卡尺、电子精密天平、无菌操作台、10% 福尔马林固定液、水合氯醛、伊红、苏木素、琼脂糖等。
1. 3 模型制作
1. 3. 1 异位模型制作: 将冻存的肝癌H22 细胞株复苏, 体外培养至对数期后, 以生理盐水调整细胞浓度至1 × 107个/m L, 每只小鼠腹腔内注射0. 5m L, 共4 只。注射7d后在无菌条件下抽出腹水, 离心, 去除杂质细胞, 调整癌细胞浓度至1 × 107个/m L备用, 进行原位移植[2]。
1. 3. 2 原位模型制作: 采取开腹手术直接注入肝脏法。昆明小鼠共36 只。 ( 1) 取5 周龄小鼠, 抓取固定, 腹部剃毛, 75% 医用酒精消毒, 按小鼠体重的0. 3% 比例行水合氯醛腹腔注射麻醉, 麻醉起效后, 将小鼠四肢固定小手术台上, 腹部再次消毒, 取剑突下上腹部正中切口, 长约1. 2cm, 剪开皮肤、腹白线及腹膜, 压迫止血, 轻轻挤压小鼠双侧腹壁, 将小鼠肝左叶挤压出腹腔。 ( 2) 取无菌注射器将0. 1m L H22 肿瘤细胞注入左肝实质内, 退出针头, 轻压针眼, 取烧红的铁丝轻灼针眼, 防止肿瘤细胞逃逸, 发生腹腔种植, 将肝左叶轻轻送回腹腔。 ( 3) 查无活动性出血, 取1 号丝线缝合腹壁各层, 消毒, 小创口贴切口黏贴, 结束造模。
1. 4 观察指标及方法
1.4.1模型观察:定期观察荷瘤小鼠生存、活动状况及腹部体征。扪查腹部了解移植瘤形成时间、质地及大小, 以小鼠腹部可触及实体性包块为成瘤标志。留取10只荷瘤小鼠观察其带瘤的自然生存期。
1.4.2解剖学及病理学观察:当小鼠出现消瘦、精神萎靡等体征时处死小鼠。开腹肉眼观察肿瘤生长部位、质地、活动度、浸润、腹水及腹腔转移情况。游标卡尺测量瘤体的长 (l) 、宽 (w) 、高 (h) , 体积 (v) =π (l×w×h) /6计算[3,4]。10%福尔马林液固定瘤体, 石蜡包埋, 切片, 经HE染色作常规病理检查。
1.4.3血清学检测:小鼠处死前, 采用眼球摘除法取血, 及时分离血清。ELISA法检测AFP[5]、DCP[6], γ-GTⅡ检测用聚丙烯酰胺凝胶梯度电泳法分离, 凡出现Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ带任一条即可判定结果阳性[7]。
1. 5 统计学方法
采用SPSS17. 0 统计软件包, 计量资料采用均数加减标准差表示。
2 结果
2. 1 造模情况
模型成功率达94. 4% ( 34 /36) 。移植5d左右小鼠皮肤伤口愈合。10d左右中上腹可扪及直径约0. 4 ~ 0. 6cm, 位置固定、质地稍软的实体肿块。14d可扪及较明显的肿块, 随后肿瘤生长速度增快, 肿瘤大小略有差异。21d瘤径达2. 0cm左右, 可见腹部膨隆, 部分小鼠出现消瘦、精神萎靡、行动迟缓等现象。模型平均自然生存期28d。
2. 2 大体解剖观察
移植瘤形态相对规则, 成圆形或椭圆形, 大部分暗红色, 局部为白色, 实质性, 质较硬, 与周围肝组织间完全或部分包膜包绕, 表面有大小不等的结节, 以浸润性生长为主, 见图1。21d原位模型移植瘤平均体积 ( 664. 28 ± 72. 63) mm3, 平均重量 ( 1. 54 ±0. 23) g, 晚期出现肝内、皮下及肠系膜腹腔淋巴结转移率79. 4% ( 27 /34) , 大量腹水占35. 3% ( 12 /34) 。
2. 3 病理组织观察
HE染色光镜下观察癌细胞表面不规则, 分化程度差, 核大成圆形, 深染, 核质比大, 游离核糖体增多等; 肿瘤边缘浸润肝组织, 转移淋巴结内可见大量癌细胞, 排列紧密, 见图2。
2. 4 血清AFP、DCP及 γ - GTⅡ检测
移植瘤保持了癌细胞分泌AFP、DCP, γ - GT的特点, 且 γ - GTⅡ检测均为阳性。
3 讨论
肝癌动物模型的建立包括诱发性、转基因及移植型, 移植型又包括异位移植型及原位移植型。前两种动物模型由于自发性肝癌发病率低且模型稳定率差、病变的发生时间较难预测, 且成本高、模型成功率低、癌细胞的形态学及免疫学特征常多样, 所以具有一定的研究局限性[8]。异位移植模型虽能维持来源肿瘤的组织结构及生物特性, 但很少发生转移, 从而影响了在研究人类肿瘤转移特性方面的价值。原位移植是二十世纪八十年代逐渐发展起来的一种移植方式, 与异位移植相比可以更好地再现临床肿瘤在人体内发生、发展及转移的全过程[9]。我们利用移植经腹水传代的H22 肿瘤细胞成功的建立了小鼠肝癌原位移植模型, 制模周期短、成本低, 成功率高达94. 4% , 转移率为79. 4% , 且降低了早期腹水的发生率, 晚期大量腹水占35. 3% , 未发现自发性消退, 还保持了绝大多数的生物学特性, 包括肿瘤的组织结构, AFP、DCP高分泌与 γ - GTⅡ阳性的特点, 基本模拟了人类肝癌的生长、浸润和转移的自然过程, 适用于对肝癌的药物治疗及侵袭、转移机制方面的研究。本实验表明, 小鼠肝癌原位移植模型可成为今后人类研究肝癌的重要动物模型。
本实验能够成功建立小鼠肝癌原位移植模型并发淋巴结转移的主要原因归结于以下几方面: ( 1) 精确的麻醉技术和熟练的手术技巧是减少小鼠因过麻死或手术出血过多而死亡的关键, 更是模型成功的重中之重; ( 2) 严格无菌操作, 防止因感染造成小鼠死亡影响实验结果; ( 3) 利用自身的腹水提取癌细胞, 其性质稳定, 异质性小, 直接接种于原位环境更有利于在体内生长; ( 4) 接种鼠在性别选择上, 尽量为雄性小鼠, 以防激素依赖性影响实验结果; ( 5) 在小鼠体重选择上, 以18 ~ 22g为宜, 体重过轻则因肝脏过小增加手术难度, 反之增加肝脏的排斥反应影响移植瘤的生长; ( 6) 癌细胞本身具有较强的恶性行为表达能力; ( 7) 开腹直接接种肿瘤细胞, 用烧红的铁丝轻灼针眼, 减少术中出血, 防止肿瘤细胞逃逸等造成腹腔种植及早期腹水的形成。
参考文献
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小鼠肝癌细胞 篇6
本课题组根据我国青海玉树地区民间藏医治疗肿瘤验方的提供, 对藏药治疗肿瘤的主味藏药玉树地区生长的莨菪 (译音:唐冲那保) 提取物进行了抗肿瘤研究, 根据本课题实验设计采用动物体内药理学实验方法, 研究结果如下。
1 材料
1.1 动物
昆明种小鼠, 6～8周龄, 体重20±2.0g, 雌雄兼用, 由甘肃省医学科学研究院实验动物中心提供, 合格证号为:医动字第14-009号 。
1.2 实验环境
温度20～22℃, 相对湿度45%～50%。环境设施合格证:医动字第14-019号。
1.3 瘤株
肝癌 (H22) , 由北京中国医学科学研究院药物所提供, 本室传代保种。
1.4 样品及配制
1.4.1 玉树莨菪提取物, 咖啡色膏状物
称取玉树莨菪提取物1.50、3.00 g分别加双蒸水至20 mL, 配制不同浓度的混悬液备用。
1.4.2 环磷酰胺 (CTX)
白色晶体, 上海华联制药有限公司, 批号070408。精密称取20 mg临用前以生理盐水稀释至10 mL使用。
1.5 剂量设计
根据相关资料, 确定玉树莨菪提取物抗肿瘤试验剂量为1.50 g/kg-1、3.00 g/kg-1, 阳性对照组 (环磷酰胺20 mg/kg) 。
2 实验方法
2.1 接种
无菌条件下取传代8d生长良好的H22小鼠腹水, 用生理盐水按1:6稀释成细胞悬液, 胎盼蓝染色后显微镜下计数活细胞数为2.0～3.0×106/mL。每只小鼠右腋皮下接种0.2 mL。
2.2 分组
接种次日, 随机将动物分成样品2个剂量组、蒸馏水阴性对照组及环磷酰胺 (CTX) 阳性对照组。每组9～10只动物, 高剂量组重复1批实验。
2.3 给药
接种24 h开始给药, 样品组、阴性对照组灌胃给予, 给药容量为0.2 mL/10g体重。阳性组腹腔注射0.1 mL/10g体重。所有动物每天给药1次, 连续10d。并隔日称体重一次, 根据体重调整给药量。停药次日处死动物, 剖取瘤块、胸腺、脾脏称重。
2.4 疗效评价
2.4.1 计算肿瘤抑制率。
肿瘤抑制率 (%) = (1-给药组平均瘤重/对照组平均瘤重) ×100%。
2.4.2 计算胸腺、脾脏重量指数及增长率
胸腺 (脾) 重量指数 (mg/10 g) =胸腺 (脾) 重量/去瘤体重×10。
胸腺 (脾) 重量指数增长率 (%) = (给药组胸腺 (脾) 重量指数/对照组胸腺 (脾) 重量指数-1) ×100%。
2.4.3 计算各组动物体重增重及增长率动物增重=去瘤体重-起始体重
动物体重增长率 (%) = (给药组增重/对照组增重-1) ×100%。
2.5 数据处理
所有数据用SPSS10.0统计软件处理, 多组均数比较用单因素方差分析, 两组均数比较用t检验。
2.6 病理组织学观察
取小鼠瘤块, 用10%甲醛固定, 常规脱水, 石蜡包埋切片, HE染色。光学显微镜*100倍视野下观察肿瘤细胞组织坏死情况:1) (+) 肿瘤的1/3以下; (++) 肿瘤的1/3～2/3之间; (+++) 肿瘤的2/3以上。
2.7 电子显微镜超微结构的观察
取小鼠瘤块, 用2%戊二醛固定, 树脂包埋, 超薄切片, 柠檬酸铅染色, 电子显微镜观察。兰州大学电镜室, GEM-123型电镜, 日本电子株式会社生产制造。电镜下观察凋亡之小体, 凋亡细胞, 坏死细胞。
3 结果
3.1 玉树莨菪提取物对小鼠移植性肿瘤H22的作用
结果表明, 玉树莨菪提取物3.00 g·kg-1对小鼠移植性肿瘤H22均有明显的抑制作用, 抑制率达41.27%, 且重复性较好, 经统计学处理差异均有显著性 (P<0.05) 。1.50 g·kg-1对小鼠移植性肿瘤H22抑制率为26.39%, 但统计学处理差异无显著性 (P>0.05) 。环磷酰胺对H22的抑制率达68.45% (P<0.01) , 见表1。
3.2 玉树莨菪对小鼠移植性肿瘤H22的实验实体瘤资料作用
结果表明, 小鼠接瘤后开始给药, 连续10 d同时以对照组观察, 可见对照组实体瘤增长明显大于给药组, 动物解剖结果, 如图1所示。
3.3 玉树莨菪提取物对荷H22小鼠免疫器官胸腺重量的影响
结果表明, 玉树莨菪提取物低、高剂量均可增加荷H22小鼠胸腺和脾脏指数, 其中胸腺增长率分别为15.00%、12.00% (P>0.05) 。脾脏增长率分别为15.35%、11.25%, 但无统计学意义。CTX组胸腺、脾脏指数明显降低 (P>0.05) , 见表2、3。
3.4 玉树莨菪提取物对荷H22小鼠体重的影响
结果表明, 玉树莨菪提取物高剂量组对荷H22雌雄小鼠的体重与对照组相比增长减慢, 低剂量组较对照组略有增加, 但经统计学处理, 差异均无显著性 (P>0.05) ;CTX组小鼠的体重明显增长缓慢 (P<0.01) , 见表4。
3.5 结果
玉树莨菪提取物对荷瘤H22小鼠病理组织学结果表明, 肿瘤组织侵润到肌层、脂肪层, 出现大片坏死区, 如图2所示。
3.6 玉树莨菪提取物诱导荷H22小鼠细胞凋亡
电镜扫描结果可见:①核染色质固缩凝结, 形成高点子密度的斑块, 呈新月形积聚在核膜周边;②裂解的细胞核成为高电子密度的碎块, 周围有质膜包围, 凋亡小体被巨噬吞噬清除, 如图3所示。
4 结论
1) 玉树莨菪提取物对小鼠移植性肿瘤H22均有明显的抑制作用, 抑制率达41.27%, 与对照组肿瘤组织相比, 瘤体缩小, 包膜完整。根据抗肿瘤药物筛选规程疗效评价, 中草药抑制率大于30%, 并经统计学处理有显著性差异, 重复疗效稳定, 则评定此药有一定疗效。表明玉树莨菪提取物有一定的抗肿瘤疗效。
2) 玉树莨菪提取物可使荷H22小鼠免疫器官胸腺、脾脏指数均有不同程度的增长, 提示该样品可在一定程度上提高小鼠非特异性免疫功能。
3) 玉树莨菪提取物各剂量组对荷H22小鼠体重增长无明显影响。
5 讨论
本课题所选的藏药植物, 根据藏药志记载, 称为唐冲那保, 为唐古特莨菪, 在藏药中主要用于麻醉镇痛;治疗病毒恶疮, 并无治疗肿瘤记载, 通过本课题的研究发现, 肿瘤细胞参入所选的天然藏药成分后所处环境因素的特定改变产生的应答, 使肿瘤细胞在生物体内发生的一种生理性的程序性细胞死亡过程。对所选定的藏药通过诱导人肿瘤细胞株凋亡, 利用电镜扫描, 对其形态学上的特征改变及其发生的分子机制以确认并区分肿瘤细胞坏死和肿瘤细胞凋亡的特征。因此, 我们认为, 本实验所选的藏药植物, 可能具有一定的抗肿瘤作用, 应以此为基础进一步研究该药物抗肿瘤的作用。
摘要：根据青海玉树地区民间提供的藏医治疗肿瘤验方, 对藏药治疗肿瘤的主味藏药玉树地区生长的莨菪提取物进行了抗肿瘤研究。实验设计采用动物体内药理学实验方法。
关键词：藏药,玉树莨菪 (译音:唐冲那保) 肝癌H22,抗肿瘤
参考文献
[1]李仪套, 王钦茂.中药药理实验方法学[M].上海科技学技术出版社, 1991:512-520.