大鼠肝癌细胞

大鼠肝癌细胞（共7篇）

大鼠肝癌细胞 篇1

微小RNA (micro RNA, mi RNA) 是一类非编码的单链小分子RNAs, 长度约为20~24个核苷酸, 由高等真核生物基因组编码, 在细胞核与细胞质中由RNA聚合酶通过序列加工而成。与靶基因信使RNA (m RNA) 通过碱基配对方式引导沉默复合体 (RNA-induced silencing complex, RISC) 降解m RNA或阻碍其翻译, 在转录后水平调控基因的表达[1]。mi RNA具有空间和时间特异性, 利用此特点, 有的学者将特异性表达在B淋巴细胞上的mi RNA表达在造血干细胞中, 成功增加了分化出B细胞的数目[2]。由此, 筛选调控分化发育的mi RNA将为细胞的基因干预提供可能。

有研究表明mi RNA与干细胞的自我更新、多能性的维持、分化和分裂增殖等过程有关[3,4]。本研究采用哺乳动物micro RNA表达谱芯片技术检测大鼠卵圆细胞分化为肝癌细胞过程中micro RNA的差异表达变化, 以发现可能参与调控卵圆细胞分化为肝癌细胞的相关micro RNA, 从而为阐明并掌控卵圆细胞向肝癌细胞分化的micro RNA调控机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

SPF级健康的Wistar大鼠40只, 体质量 (120±20) g, 雄性30只, 雌性20只, 由南方医科大学实验动物中心提供 (动物合格证号:2002-2009, 2004B023, 2004A068) , 大鼠按标准实验室动物要求, 正常饲料喂养。

1.2 试剂

3'-甲基-4-二甲基偶氮苯 (3'-Me-DAB) (日本东京化成工业株氏会社) , 他克莫司 (Tarcrolimus) (日本藤泽药厂) , 小鼠抗大鼠c-kit单克隆抗体、Thy-1单克隆抗体 (Santa Cruz, USA) , FITC标记山羊抗小鼠Ig抗体为北京中杉金桥生物技术有限公司提供, DMEM (高糖) (北京鼎国生物技术有限责任公司) , 胎牛血清、F12、Hanks液、PBS (广州威佳责任有限公司) 。mir Vana TM mi RNA Isolation Kit (Ambion, USA) , mi RNA Complete Labeling and Hyb Kit (Agilent) 。DNA抽提试剂盒、Taq DNA聚合酶 (1.667×108) nkat/L (北京鼎国生物技术有限责任公司) , Marker (100 bp DNA Ladder) 及引物合成 (北京鼎国生物技术有限责任公司) 。

1.3 大鼠肝卵圆细胞增殖模型的建立

30只雄性Wistar大鼠稳定饲养1周后, 改喂含0.06%3'-Me-DAB的饲料, 饲养温度为28℃, 湿度为40%~70%。4周后, 参照SIRICA等[5]介绍的PER-COLL密度梯度离心法进行卵圆细胞分离。2 m L DMEM悬浮细胞, 接种于含20%小牛血清、20 g/m L表皮生长因子 (EGF) 及各种氨基酸的DMEM/F12培养液。在37℃、50 m L/L二氧化碳孵箱中培养[6]。新分离的细胞用0.25%台盼蓝染色观察细胞活力和进行干细胞表面标志鉴定。台盼蓝染色细胞活力达95%。调整细胞浓度为5×105/m L接种于血清培养基。

1.4 肝卵圆细胞的鉴定和恶性分化

1.4.1 激光共聚焦扫描显微镜 (LSCM) 观察

细胞爬片, 0.01 mol/L PBS漂洗1 min×3, 4℃下4%PFA固定15 min, 0.01 mol/L PBS漂洗3 min×3;加入一抗 (小鼠抗大鼠Thy-1单抗和C-kit单抗) , 4℃过夜, 洗涤5 min×4, 移入适当稀释度的荧光素FITC标记抗体二抗, 4℃孵育数小时, 避光洗涤5min×4, 室温下封片, 避光保存。在LSCM下进行荧光素抗体标记的图像采集、合并和分析, 激发波长为488 nm, 发射波长为504 nm。胞浆和胞膜呈绿色为阳性。

1.4.2 观察

前10代每2代观察1次, 自第10代开始, 每5代观察1次, 并提取mi RNA。

1.4.3 利用大鼠Y染色体特异性PCR技术检测卵圆细胞源性肝癌细胞

按25 mg/kg的戊巴比妥腹腔麻醉20只雌性Wistar大鼠, 随机平分为实验组和对照组, 实验组消毒开腹, 用4号针头吸取新分离的雄性Wistar大鼠卵圆细胞悬液, 接种至肝包膜下, 每点106个细胞。两组雌性Wistar大鼠0.06%3'-Me-DAB的饲料饲养14周, 促进肝肿瘤的生成, 并用免疫抑制剂他克莫司0.1 mg/ (kg·d) 喂饲抑制免疫排斥反应。

1.5 基因芯片分析

根据mir Vana TM mi RNA Isolation Kit生产厂商提供的标准操作流程进行样品总的mi RNA抽提, 抽提所得总mi RNA经安捷伦Agilent Bioanalyzer2100生物分析仪电泳质检合格后备用。将准备好的总mi RNA样品用Cy3标记, 然后与Agilent Rat mi RNA芯片 (Agilent rat mi RNA (8×15K) V16.0Kit, 该款芯片覆盖676条大鼠相关mi RNA) 杂交, 杂交后芯片清洗扫描, 芯片结果采用Agilent Microarray Scanner (Agilent) 进行扫描, 用Feature Extraction software 10.7 (Agilent) 读取数据, 对原始数据进行预处理, 信号值去除背景, 然后进行中值归一化, 将每个micro RNA对应的四个探针信号值计算均值作为micro RNA的信号值, 并用此均值计算ratio (Si/N) 。同时, 用T-test计算P-value, 表示micro RNA在两个样品间差异的显著性。ratio大于2倍, 且P-value<0.001的micro RNA作为上调micro RNA被筛选出来;ratio小于0.5倍, 且P-value<0.001的micro RNA作为下调micro RNA筛选出来。

1.6 生物信息学分析

1.6.1 差异micro RNA靶基因预测

非编码区靶基因预测由mi Randa等多个软件 (Pic Tar、Target-Scan、mi Randa等) 分别进行预测, 对于有些无法对应的micro RNA, 则参考了mi RGator软件。我们取几种软件预测结果的交集, 即overlap部分。

1.6.2 功能分析 (GO-Analysis)

将得到的靶基因进行GO分析, 根据P-value大小判断靶基因中具有显著性意义的GO term。

1.6.3 信号转导通路分析 (Pathway-Analysis)

将得到的靶基因进行Pathway显著性分析。分析每个Pathway中所包含的靶基因个数, 用超几何分布的统计检验方法计算出反映Pathway中靶基因分布富集显著性的P-value, 根据P-value大小找出与靶基因功能显著相关的生物通路。

1.7 大鼠Y染色体的标本收集、引物的设计和PCR检测

1990年由SINCLAIR[7]发现在哺乳动物包括人类的Y染色体短臂上存在着决定性别的主宰基因SRY (sex-determining regin of the Y) , 并定位于Yp11.3。我们利用Y染色体的这种特异性PCR技术检测卵圆细胞源性肝癌细胞。实验组和对照组共10只雌性Wistar大鼠均诱发出肝癌结节, 提取肝癌组织, 提取DNA。从Gen Bank调出雄性大鼠的SRY基因, 用ABI公司prime express引物设计软件设计如下:SRY 68F:5'-AGGCGCAAGTTGGCTCAAC-3';SRY 168R:5'-GGCCTTTTTTCGGCTTCTG-3'产物长度296 bp。SRY PCR反应体系:反应总体积25μL, 5×PCR Buffer 5μL, d NTP (10 mmo L/L) 0.5μL, 引物SRY 1μL, Taq DNA聚合酶 (1.667×108nkat/L) 0.15μL, 模板DNA 1μL, 补足灭菌去离子水至总体积25μL。PCR反应条件:PE 9600扩增仪上, 93℃预变性3 min, 93℃30 s, 55℃25 s, 72℃45 s, 共30个循环, 72℃延伸10 min。反应后检测:取8μL扩增产物在20 g/L琼脂糖凝胶电泳25 min后, 紫外灯下观察、拍照。

1.8 统计学处理

数据用mean±SD表示, 应用SPSS 17.0统计软件分析, 基因芯片分析进行t检验。

2 结果

2.1 激光扫描共聚焦显微镜结果

肝卵圆细胞胞浆和胞膜表达干细胞标志物Thy-1及C-kit (见图1) 。

A:Thy-1;B:C-kit

2.2 卵圆细胞的生长速度及倍增时间

卵圆细胞呈多角型, 椭圆形或圆形。在体外培养传代后, 繁殖速度加快, 细胞质逐渐增多, 并分化为圆形的肝癌细胞和细长纺锤样胆管细胞。细胞的群体倍增时间逐渐延长。

2.3 基因芯片结果

基因芯片样品总RNA的质量鉴定:紫外分光光度计检测结果表明, RNA的A260/A280比值介于1.89~2.02;凝胶电泳结果提示各样本的18 S和28 S条带清晰, 28 S条带无明显降解。见图2。总RNA质量完好, 结果合格, 可以进行芯片实验。

基因芯片检测结果及验证:mi RNA芯片杂交代表性图像显示荧光信号分布均匀, 信号点饱满, 背景较低, 杂交效果理想。将芯片扫描图像导入Feature Extraction software 10.7读取数据, 从中共鉴定到1210个mi RNAs, 将数据导人Gene Spring Software11.0分析, 得到差异表达mi RNAs 22个 (P≤0.001, fold change≥2) , 其中上调19个, 下调3个。见图3。

1:卵圆细胞分离后即测组;2:恶性分化后的卵圆细胞组

2.4 生物信息学分析

基于Sanger数据库对差异micro RNAs进行靶基因预测, 共得到1 295个靶基因;将上述差异micro RNA预测的靶基因基于Gene Ontology数据库进行GO注释, 并进行了生物学功能分类与整合, 其中主要涉及轴突导向 (axon guidance) 、血管发生 (angiogenesis) 、转录后蛋白修饰、小分子代谢过程、O-连寡糖过程 (O-glycan processing) 、胰岛素受体信号转导途径、对缺氧的反应、信号转导、对药物反应等。将上述差异micro RNA预测的靶基因基于KEGG数据库进行Pathway注释, 其中主要涉及癌症途径 (pathways in cancer) 、细胞-基质黏附途径 (focal adhesion) 、Hedgehog信号途径、MAPK信号途径、O-连寡糖生物合成、胰岛素信号通路、胞吞作用、黏附连接、细胞外基质受体相互作用、类固醇激素生物合成等信号通路。

2.5 SRY基因检测

连续喂DAB 14周后, 20只雌性Wistar全部肝脏组织都有肿瘤生成, 肿瘤组织呈现结节状或者菜花状。由电泳条带 (图4) 可见:雄性大鼠与实验组雌性大鼠的肿瘤组织样本 (T) 有相同的电泳条带 (M与T1、T2和T3相同) , 雄性大鼠与对照组雌性大鼠有不相同的电泳条带 (M与F不相同) 。

1:Marker为100 bp DNA ladder 100~2 000 bp;2:正常雄性大鼠;3:正常雌性大鼠;4~6:移植的雌性大鼠的肿瘤组织样本

3 讨论

mi RNA为22个左右核苷酸的小分子RNA, 具有强大的调控功能, 成为当前研究的热点。mi RNA与目的基因3'非编码区 (3'UTR) 结合降解m RNA和抑制其翻译, 控制着细胞的分化、增殖和凋亡等重要的生命活动, 与肿瘤的发生、发展密切相关[8,9];mi R-NA在肿瘤干细胞的“干性”相关基因和信号通路调控方面发挥着重要作用, 被称为Stem Cells mi R-NAs[10]。例如:mi R-135a和mi R-135b家族在结肠腺瘤和腺癌中表达上升, 他们调控着APC基因的表达, 并参与Wnt信号通路的激活, 在结肠癌干细胞中发挥重要作用[11]。let-7在乳腺癌干细胞中的表达缺失, 从而导致它负性调控的HMGA2基因高表达, 而后者对于乳腺癌干细胞的自我更新发挥着重要作用[12]。mi R-34家族在胰腺癌中低表达, 通过靶向Bcl-2、HMGA2和Notch等信号通路在胰腺癌干细胞中起抑制作用[13]。本研究基于上述研究观点, 采用mi RNA芯片技术分析大鼠肝卵圆细胞向肝癌细胞分化过程中mi RNAs表达差异有显著性, 这些mi R-NAs可能从一个侧面反映其与肝癌干细胞“干性”的关系。

虽然缺乏直接的证据, 但越来越多的实验结果支持肝癌起源于肝干细胞“成熟受阻”的观点。DUMBLE等[14]对敲除p53基因的小鼠喂缺乏胆碱却补充乙硫氨酪酸的饮食, 从而诱导卵圆细胞的大量增生, 随后分离出卵圆细胞进行培养后, 将这些细胞接种于裸鼠皮下后长出与肝细胞癌相似的肿瘤, 并确定其由卵圆细胞分化而来, 该细胞种植成瘤实验提示卵圆细胞可能参与肝癌的发生。GROZ-DANOV等[15]报道癌胚蛋白Gpc3可以做为肝祖细胞的标志物, 并通过建立Solt-farber肝癌模型研究证实肝祖细胞/卵圆细胞与肝癌的发生有关。最近研究在肝癌组织中的具有干细胞特征的Ep CAM+细胞引导了肝癌细胞的生长和转移, 进一步提示肝干细胞与肝癌的发生有着密切的联系[16]。

本研究基于上述研究观点, 采用mi RNA芯片技术分析肝卵圆细胞分化为肝癌细胞过程中的mi R-NAs差异有显著性, 这些mi RNAs可能从一个侧面反映其与肝癌干细胞“干性”的关系。为了确认试验用的卵圆细胞为“干性”的肝癌干细胞, 笔者利用Y染色体体细胞的特异性来寻找卵圆细胞分化为肝癌细胞的直接证据, 并获得了证实, 从而为本研究提供理论依据。国外有人用Y染色体荧光原位杂交法追踪骨髓源干细胞[17]。由于真核表达载体表达效率和表达时限[18,19]的限制, 移植到体内的基因标记的干细胞常不能被检测到。相反Y染色体是雄性个体的特异性基因结构, 不受时间和细胞表型变化的影响[20]。为此, 笔者用Y染色体体细胞的特异性来寻找卵圆细胞在体内分化为肝癌细胞的直接证据。把分离出的雄性大鼠肝脏卵圆细胞接种于雌性大鼠肝内, 然后对雌性大鼠进行致癌剂诱导, 分析雌性大鼠肝癌细胞的来源。如果在癌细胞中发现有Y染色体 (+) 的细胞, 则可以证明植入的卵圆细胞可以在体内分化为肝癌细胞, 从而得出肝癌细胞可以来源于卵圆细胞的直接证据。

本芯片研究显示:在肝卵原细胞向肝癌细胞分化过程中, 具有显著性差异且差异倍数在2倍及以上的mi RNAs 22个, 其中上调表达19个, 下调表达3个。笔者进一步采用荧光定量PCR验证22条差异micro RNAs, 22条均与芯片结果相符, 表明实验芯片结果可靠。

TERRIS等[21,22]发现:在高表达上皮细胞黏附分子Ep CAM且甲胎蛋白阳性的癌细胞中, mi R-181家族表达上升。而这类细胞通常被认为是肝细胞肝癌的肿瘤干细胞。转染mi R-181后, 发现Ep CAM表型的癌细胞增多。mi R-181能激活肿瘤信号途径Wnt/β-catenin, 并抑制一些促分化分子。调节细胞分化的COX2和GATA6, 以及抑制Wnt/β-catenin通路的激酶NLK是mi R-181的直接靶点, 使它们沉默能导致Ep CAM+癌细胞数量的增加。这些说明mi R-181对维持肝癌干细胞Ep CAM表型即其“干性”具有重要意义。与本研究结果相似, CARD等[23]的研究也发现, 多能性因子Oct4/Sox2结合在mi R-302的启动子上, 可以上调mi R-302的表达, mi R-302可直接作用于细胞周期调控蛋白Cyclin D1和D2, 过表达mi R-302可使S期延长, G1期缩短。另有研究发现, mi R-92b可抑制细胞周期抑制因子p57的翻译, 促进胚胎干细胞迅速通过G1/S限制点[24]。由此可以推论, 干细胞特异性mi RNAs可促进干细胞通过G1/S限制点, 保持其快速增殖的特性。上述筛选的差异mi RNAs可能参与肝癌干细胞的“干性”, 有深入研究的价值。

mi RNAs作为新的治疗靶点主要优点就是调控多个基因和信号通路[25], 而si RNA则是通过特异的序列作用于单个靶基因[26]。因此, 对mi RNAs调控靶基因及其信号通路的生物信息学分析尤为重要。基于Sanger数据库对差异mi RNA进行靶基因预测是常用的预测mi RNA靶基因方法, Sanger数据库即mi RBase, 它是整合了micro Cosm、Target Scan和Pictar 3个数据库, 本组选用了Target Scan 6.0数据库进行靶基因预测共得到2 895条靶基因, 将上述差异mi RNA预测的靶基因基于Gene Ontology数据库进行GO注释, 并进行了生物学功能分类与整合, 使大家了解这些mi RNA在整体水平发挥的主要生物学功能。笔者的分析结果显示, 它们主要涉及轴突导向、血管发生、转录后蛋白修饰等。信号通路的研究一直是研究生物学功能的机制及设计药物治疗靶点的主要方法, 笔者将上述差异mi RNA预测的靶基因基于KEGG数据库进行Pathway注释, 其中主要涉及癌症途径、细胞-基质黏附途径、Hedgehog信号途径、MAPK信号途径等, 对这些信号通路在肝癌干细胞的“干性”中的作用深入研究, 有望发现新的肝癌干细胞发生机制。总之, 本组通过芯片技术筛选了22条与肝癌干细胞相关的mi RNAs, 并对他们进行了生物信息学分析, 这些mi RNAs及其靶向的基因和信号通路可能涉及调控肝癌干细胞的各种生物学特性, 进一步对他们的生物学功能和调控机制进行研究, 并结合全基因组学及蛋白组学方法, 有助于从整体上分析肝癌干细胞的发生机制, 寻找并设计新的治疗靶点。

大鼠肝癌细胞 篇2

关键词：IL-2,大鼠,肝癌,ELISA

肝细胞癌 (hepatocellular carcinoma, HCC) 是我国常见的恶性肿瘤之一, 早期诊断较困难, 一旦发现, 大多已属肝癌晚期。白细胞介素-2 (IL-2) 于1976年由Morgan等在小鼠脾细胞培养上清液中发现。作为免疫调节网络中的核心物质, IL-2激活单核-吞噬细胞, 并增强其杀伤肿瘤活性;解除肿瘤浸润淋巴细胞的免疫抑制状态并增强其免疫功能等。本研究通过检测大鼠肝癌过程中血清IL-2水平, 以期能阐明IL-2在肝癌发生、发展中的作用, 为肝癌的早期诊断及治疗提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 建立肝癌模型

体重150-200g清洁级雄性Wistar大鼠150只 (由山东大学实验动物中心提供) 。将大鼠随机分为模型组和对照组。模型组饲以含二乙基亚硝胺 (DEN, sigma公司, 76mg/L) 饮水, 连续12周。对照组则常规喂养。

1.2 标本采集

于实验第4、8、12、16、18、20、22、24、25周, 随机抽取模型组动物各10-15只, 心尖取血并分离血清后置-80℃保存备用。肝组织4%多聚甲醛缓冲液固定24小时, 常规石蜡包埋。对照组于第4、12及24周分别取5只, 予以同样处理。

1.3 病理组织学检查

石蜡包埋肝组织, 5?m厚切片, HE染色, 光镜观察。

1.4 采用酶联免疫吸附法检测血清IL-2水平

大鼠IL-2 ELISA检测试剂盒购自上海轩昊科技发展有限公司。具体步骤按说明书进行操作。

1.5 统计学分析

运用SPSS 13.0统计软件, 采用单因素方差分析及q检验对相关数据资料进行统计处理, 所有数据以±s表示。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 大鼠肝脏病理学改变

对照组大鼠肝脏肉眼观未见明显异常。光镜下肝组织结构正常, 肝细胞排列呈索状, 围绕小叶中央静脉呈放射状排列。肝细胞胞浆嗜酸性, 核嗜碱性, 多为单核, 位于细胞中央。模型组大鼠肝脏病理学改变可大致归纳为3期: (1) 诱癌早期-肝细胞损伤期 (第1~8周) , 光镜下可见大鼠肝脏呈弥漫性肝细胞水肿, 部分肝细胞可见嗜酸性变。肝小叶有灶性坏死伴炎性细胞浸润; (2) 诱癌中期-增生-硬化期 (第9~16周) , 肝脏表面逐渐出现数量不等、大小不一、弥散分布的灰白色病灶。光镜下见肝细胞水肿进一步加重, 出现嗜酸性或透明细胞增生灶, 并逐渐形成肝细胞增生结节及非典型增生结节, 第12周起可见典型假小叶形成; (3) 诱癌晚期-癌变期 (第17~25周) , 肝脏表面布满多个大小不一的灰白色结节, 切面可见出血和坏死。镜检为肝细胞癌, 癌周组织有肝细胞增生灶、增生结节及非典型增生结节。

2.2 大鼠血清IL-2水平见表1。

与癌变组比较△:P<0.05;*:P<0.01

3 讨论

1976年Morgan等发现小鼠脾细胞培养上清液中有一种能够促进和维持T细胞在体外长期生长的因子, 将其称为T细胞生长因子 (T cell growth factor, TCGF) , 1979年统一命名为IL-2。IL-2主要由CD4+和CD8+T细胞产生, 此外, 淋巴因子激活的杀伤细胞 (lymphokine activated killer cell, LAK细胞) 、自然杀伤细胞 (natural killer cell, NK细胞) 、转化的B细胞、白血病细胞等亦可产生。

研究发现[1], IL-2对肝癌有直接抗癌作用, 可明显抑制肝癌细胞的侵袭力和转移力。但IL-2并无直接杀灭肿瘤细胞活性, 其抗肿瘤机理在于刺激、活化其效应细胞, 间接发挥抗肿瘤作用[2]。尤天庚等[3]的研究显示, 移植肝癌大鼠脾内转染白细胞介素2和/或12基因后CD4+细胞数量显著增加, 病理观察显示肿瘤局部有大量淋巴细胞浸润, 提示可明显增强T细胞活性。杜俊蓉等[4]报道, 重组人白介素2腺病毒 (advh IL-2) 肿瘤局部注射可明显增强皮下接种肝癌H22荷瘤小鼠脾细胞的LAK与CTL杀伤活性, 增加肿瘤组织内CD4+与CD8+T淋巴细胞浸润, 具有显著的抗肿瘤作用。同时, IL-2可抑制肝癌细胞CD44表达并明显增强细胞间粘附分子-1 (intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1) 和人白细胞抗原-Ⅰ (human leucocyte antigen-Ⅰ, HLA-Ⅰ) 的表达, 使肝癌细胞对细胞外基质的亲和力及肝癌细胞的聚集作用减弱, 因此具有抑制肝癌细胞的侵袭力和转移力的作用[1]。

应用鼠脾细胞增殖检测法, 毛华等[5]发现在DAB诱发大鼠肝癌过程中非特异性肝炎组、肝硬化组及肝癌组IL-2活性明显低于正常对照组, 而肝癌组又低于非特异性肝炎组, 提示癌变过程中IL-2活性呈进行性下降。对原发性肝癌患者和肝硬化患者外周血的检测得到同样的结论[6]。Kong L等[7]的研究也显示慢性乙型肝炎、肝硬化及肝癌患者血清IL-2水平较正常人明显降低, 而且随着肝癌患者病情进展及肿瘤不断生长, 血清IL-2水平降低更趋明显。

本研究显示在诱癌过程中, 大鼠血清IL-2水平随肝组织学形态的改变呈一定的变化趋势, 表现为正常对照组>肝细胞损伤组>增生-硬化组>癌变组。其中, 正常对照组、肝细胞损伤组和增生-硬化组之间表现出来的的IL-2浓度差异无统计学意义, 癌变组大鼠血清IL-2浓度低于正常对照组 (P<0.01) 、肝细胞损伤组 (P<0.01) 及增生-硬化组 (P<0.05) 。诱癌过程中IL-2水平的降低, 考虑可能由于产生IL-2的CD4+T细胞亚群数量减少和功能不全, 或荷瘤宿主体内产生了肿瘤诱导的非特异性免疫抑制因子, 或生成IL-2所必需的IL-1等淋巴因子活性降低等原因所致。大鼠血清IL-2水平随病变进展而逐渐降低, 提示检测血清IL-2水平有助于了解病情发展和机体免疫状态, 是早期发现癌变的敏感指标。

参考文献

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[6]刘占锋, 刘明.原发性肝癌与肝硬化患者外周血IL-2及NK细胞活性的研究[J].医学检验与临床, 2006, 17 (3) :10-11.

大鼠肝癌细胞 篇3

关键词：α干扰素,5-FU,联合用药,肝癌,疗效

肝癌是一种常见的恶性肿瘤,近年来,随着诊断水平的提高,肝癌的治疗及预后也有了很大的进展。但是肝癌容易转移,许多肝癌患者在确诊时癌细胞就已经播散转移,手术治疗已经没有意义。目前,肝癌的非手术治疗,尤其是化疗在肝癌治疗中占有重要地位,有研究表明,将α干扰素(IFN-α)与化疗药物合用,可使化疗药物敏感性提高[1,2,3]。本实验通过建立动物模型,进一步研究IFN-α与化疗药物5-FU联用对肝癌的治疗效果,进而为临床提供用药依据。

1材料与方法

1.1 瘤株、药物与试剂

Walker-256瘤株,由上海医药工业研究院提供;戊巴比妥钠,佛山市化工实验厂进口分装,批号:860901;5-FU和IFN-α由上海工业医药研究院提供;大鼠周期素D1(Cyclin D1)酶联免疫分析试剂盒、大鼠核因子κB(NF-κB)酶联免疫分析试剂盒均购自上海西唐生物科技有限公司。

1.2 仪器

显微镜;数码照相机(Sony,日本);SL202电子天平(上海民桥电子仪器厂);TGL-16G高速离心机(上海安亭科学仪器厂);Thermo酶标仪(广东丹利科技有限公司)。

1.3 实验动物

清洁级SD大鼠,雄性,48只,平均体重200±50 g;断奶Wistar大鼠4只,平均体重50～70 g,由北京维通利华实验动物中心提供。

1.4 动物分组

SD大鼠随机分为空白对照组、模型组、5-FU组、IFN-α联合5-FU组,每组12只。断奶Wistar大鼠用于制作传代癌性腹水。

1.5 肝癌模型建立

将Walker-256瘤株注入断奶Wistar大鼠腹腔,传代7 d。从传代的Wistar大鼠腹腔抽取癌性腹水,2 000 r/min离心2 min,弃去上层色淡较清亮的癌性腹水,保留下层较浓稠呈稀糊样的半液态物,抽入1 mL注射器内备用。除空白对照组外所有大鼠腹腔麻醉后,取仰卧位,用橡皮筋固定四肢于实验板上,自剑突下沿腹正中剪去体毛,安尔碘消毒后,沿腹白线逐层开腹,最后暴露大鼠腹腔,轻压大鼠胸腔,肝脏便跳出腹腔,选取最近体表的肝叶(体积最大)种植肿瘤,此时用左手食指、中指轻夹大鼠肝叶,拇指轻压肝叶边缘,以减少肝叶随呼吸而上下运动,右手持抽有离心后半液态癌性腹水的注射器,注射针头斜行进针,针尖与水平面呈30°角,刺入肝脏约1 cm左右,轻推注射器针芯,注入经过浓缩的癌性腹水0.05 mL。拔针后,助手立即用棉签按压穿刺点约2～5 min后,观察沿针道无活动性出血后,轻送肝脏还纳腹腔,逐层关腹[4,5]。

1.6 动物给药

IFN-α联合5-FU组大鼠,IFN-α皮下注射3×105 U/d、5-FU 30 mg/kg腹腔注射;5-FU组大鼠,5-FU腹腔注射30 mg/kg;空白对照组及模型组腹腔注射同等剂量生理盐水[6],连续给药35 d。

1.7 肿瘤生长情况观察

实验35 d后处死所有大鼠,取肝脏,测量肿瘤重量和体积。肿瘤标本以10 %福尔马林固定,苏木精-伊红染色,切片,光镜下观察肝脏癌灶肿瘤数量[7]。

1.8 血清Cyclin D1及NF-κB测定

实验第36 d处死所有大鼠,腹主动脉取血,以3 000 r/min离心,取上清放入EP管中,-20 ℃冷冻,用ELISA试剂盒测定,操作步骤严格按照说明书进行[8]。

1.9 统计学分析

数据采用SPSS 11.5统计软件进行处理分析。所有数据用均数±标准差($\overline{x}\pm s$)表示,组间比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义[9]。

2实验结果

2.1 IFN-α联合5-FU对大鼠肝癌细胞生长的影响

与空白对照组比较,模型组肿瘤生长增快,差异有统计学意义;与模型组比较,5-FU组与IFN-α联合5-FU组大鼠肿瘤生长减慢,差异均有统计学意义;与5-FU组相比,联合用药组肿瘤生长减慢,差异也有统计学意义。详见表1。

※与空白组比较,P<0.01;☆与模型组比较,P<0.01;★与5-FU组比较,P<0.05

2.2 IFN-α联合5-FU对肝癌大鼠血清Cyclin D1与NF-κB的影响

与空白对照组比较,模型组大鼠血清中Cyclin D1与NF-κB水平明显增高,差异有统计学意义;与模型组比较,5-FU组与IFN-α联合5-FU组大鼠血清中Cyclin D1与NF-κB水平明显降低,差异均有统计学意义;与单用5-FU组比较,联合用药组大鼠血清中Cyclin D1与NF-κB表达降低,差异也有统计学意义。详见表2。

※与空白对照组比较,P<0.01;☆与模型组比较,P<0.01;★与模型组比较,P<0.05;*与5-FU组比较,P<0.05

3讨论

干扰素是一种具有多种功能的细胞因子。动物实验和临床观察证实,干扰素对肾癌、膀胱癌等许多肿瘤的治疗有很好的疗效,因此,在肝癌治疗中,干扰素越来越被人们重视。有研究表明,干扰素可以通过抑制肿瘤血管生成来发挥作用,可抑制MMP2、MMP9、VEGF、bFGF等血管生成因子的表达,同时也促进了IP10和MIG等抗血管生成因子表达,从而抑制肿瘤生长[10,11,12]。

5-FU是一种传统的治疗肿瘤药物,其作用途径很多,其中,作为胸苷酸合成酶抑制剂是其最主要的作用方式。5-FU可以在细胞内部转化成多种不同的细胞毒性代谢产物,结合DNA与RNA,最终导致细胞凋亡。

有研究表明,将IFN-α与化疗药物合用,可使化疗药物敏感性提高。本实验通过建立动物模型,进一步研究IFN-α与化疗药物5-FU联用对肝癌的治疗效果,进而为临床提供用药依据。本组实验显示,单用5-FU能明显降低肝内肿瘤生长速度,但联合用药能更有效地控制肿瘤生长,与其他研究结果相同[13]。与对照组比较,单用5-FU能降低肝癌大鼠血清中Cyclin D1和NF-κB的表达,说明5-FU控制肿瘤生长可能与降低Cyclin D1和NF-κB的表达有关[14,15]。与单用5-FU相比,IFN-α和5-FU联合用药能够明显降低Cyclin D1和NF-κB的表达水平,提示了联合用药的重要性,其机制可能与降低炎症反应,控制癌细胞增殖有关。

大鼠肝癌细胞 篇4

1 材料与方法

1.1 动物模型的建立

清洁级Wistar雄性近交系大鼠52只，体重130～150 g，购自延边大学医学部实验动物中心。按清洁级动物要求养在延边大学医学部动物房半屏障系统中。12 h光照和12 h黑暗交替。稳定饲养3 d后，分为：(1)实验组40只：用灭菌自来水配制浓度为95μg/m L的DEN溶液(避光保存，新鲜配制，美国Sigma公司)，供实验组大鼠自由饮用，每天更换1次。连续饮用4周后，改饮一般的灭菌自来水4周，再继续饮含95μg/m L的DEN溶液;(2)对照组12只：整个实验过程中均饮用灭菌自来水。实验组动物分别在诱癌后第12、14、16周随机抽取各宰杀6只，至第18周末处死所有动物，正常组于第12～16周间以上各时间点宰杀2只动物，于第18周末宰杀6只。

1.2 取材方法、标本处理及观察方法

1.2.1 大体观察

每天观察动物的精神状态、饮食状况、背毛的变化及活动情况。动物处死后，立即进行解剖学检查，称体重、肝重，观察肝脏大小、色泽、质地及有无肿瘤结节形成，无癌灶者，取肝组织，出现癌灶者取肉眼癌结节及距癌灶边缘0.5～1.0 cm癌旁组织。

1.2.2 组织学检查

对所取组织在10%甲醛溶液中固定、浸泡24 h;然后行脱水、透明、浸蜡，常规石蜡包埋制备成5μm厚的切片，HE染色，常规组织学检查。

1.2.3 电镜标本制作

取病变肝组织切成1 mm×1mm×1 mm的小块，迅速于30 g/L戊二醛进行前固定，之后用10 mmol/L磷酸缓冲液浸洗3次，每次10min，然后用10 g/L锇酸后固定2 h，经磷酸缓冲液浸洗后，梯度乙醇脱水，浸透，Epon812环氧树脂包埋，半薄切片光镜定位，LKB-Nova型超薄切片机切片，铀铅染色后，JEM-1200透射电镜下观察并拍片。

1.3 统计学分析

采用SPSS14.0 for Windows统计分析软件进行处理，进行t检验、方差分析。

2 结果

2.1 一般情况

对照组动物正常，无自然死亡，大鼠肝脏未见任何相应的病理改变。实验组大鼠在诱癌前期，未见有任何变化，其食欲良好，活动自如，体质量也未减轻。到第14周后，诱癌组大部分动物开始出现不同程度的竖毛、精神萎靡、活动减少、食欲不振、消化不良等表现。实验组在第6周死亡2只，经病理确诊死亡原因为肝脏炎症、肺部感染。死前精神萎靡，活动减少，背毛倒竖、无光泽，体质量明显下降。第11周死亡1只，经病理确诊为肝硬化，死前无异常表现。第14周因消化不良、空、回肠胀气死亡1只。第16周死亡2只，经病理确诊肝癌、大量腹水。第17周死亡1只解剖发现腹腔大量出血。总死亡率为15.22%(7/46)。实验组第14周末病理证实6只中3只形成肝癌，第16周末6只中5只形成肝癌，至第18周末，成癌率100%(15/15)。

2.2 大鼠癌结节、体重、肝重、肝/体重比

比较对照组、实验组第18周后的肝脏结节数、肝脏重量和肝/体重比，见表1。

注：覮P<0.01

2.3 大体病变

肝硬化前期(第12周末)：肝表面无明显结节，部分大鼠肝表面出现黄色、黑色斑点。

肝损伤硬化期(第12～14周)：肝脏表面有出血点，见到散在、某一个肝叶较为集中的灰白色结节，与周围肝组织分界较清。

肝癌发生期(第14～16周)：肝脏肿大、表面粗糙、色彩暗淡，肝表面出现空泡，灰白色结节集中于某一、二肝叶形成。

肝癌发生发展期(第16～18周)：肝脏体积增大，表面粗糙、色彩暗淡，多个大小不一的灰白色圆形结节。结节个数多且大，多为类圆形，直径多在4～15 mm之间，最大可达20 mm以上。

2.4 组织学改变

肝硬化期(第12周末)：肝小叶结构破坏、再生结节形成及假小叶形成、间质炎症细胞浸润。电镜下线粒体肿胀，基质变淡透亮，基质颗粒消失和空泡变，嵴变短、碎裂、减少。见图1A、1B。

肝癌前期(第12～14周)：以肝结构的破坏、再生结节及假小叶形成、实质细胞较为广泛的核异常及透明样变性、水变性、胞浆嗜碱变为多见。电镜下细胞核异染色质边集，部分形成线粒体-内质网复合体。见图2A、2B。

肝癌发生期(第14～16周)：肝小叶结构完全破坏，肝细胞增生结节增多，小叶塌陷，肝板消失，合并出血多见。形成嗜碱性和透明肝细胞增生灶，结节内肝细胞异型性增生明显，胞质染色不均匀，核奇形怪状、深染、密度增加、肝索排列紊乱。电镜下线粒体空泡化、出现脂滴、嵴部分断裂、肿胀、变形，内质网扩张。见图3A、3B。

肝癌发生发展期(第16～18周)：肝硬化，肝细胞肝癌，部分见到胆管扩张、中性细胞。电镜下细胞核碎裂、染色质边集，细胞浆不均，线粒体固缩，内质网肿胀、部分脱颗粒。癌旁细胞线粒体肿胀，基质变淡透亮，基质颗粒消失和空泡变，粗面内质网增生活跃、多核。见图4A、4B。

3 讨论

DEN为强烈的化学诱癌剂，其靶器官主要是肝脏。单纯在饮水中加入DEN可以较为稳定的诱发大鼠肝癌，同时在相应的临床表现及血液学检查方面也出现与人类肝癌相似的改变[2]。由于DEN的毒性作用，使大鼠肝细胞出现坏死，抵抗力下降，诱发肺部感染，肺部感染多出现在第4周后;癌组织形成期导致大鼠死亡的主要原因是肝癌组织破裂出血，此期大鼠的死亡无明显征兆，多数是突然死亡。本实验在第6周死亡2只，经病理确诊死亡原因为肝脏炎症、肺部感染。死前精神萎靡，活动减少，背毛倒竖、无光泽，体质量明显下降。第11周死亡1只，经病理确诊为肝硬化，死前无异常表现。第14周因消化不良、空、回肠胀气死亡1只。第16周死亡2只，经病理确诊肝癌、大量腹水。第17周死亡1只解剖发现腹腔大量出血。

传统诱癌实验均采用DEN连续给药，导致肝功能进行性损伤不能恢复。笔者采用改良法诱发肝癌，在诱癌4周后，停饮含DEN水而改饮灭菌自来水4周，使大鼠修复和代偿增生;同时，肝细胞损伤修复加强，而损伤DNA误配修复和微卫星不稳定导致基因突变加剧，继而在再次DEN诱癌过程中加速癌变，减少肝功能损伤而促进肝硬化及癌变[3]。本试验至第18周末，诱癌成功率达100%。且本研究以低浓度DEN通过自然饮水，诱发大鼠肝脏癌变，接近自然过程，而且采用单一致癌剂，免受其他致癌因子的影响，有利于对病变的观察和分析。

肝癌病变发生过程中出现增生结节，尤其是嗜碱性细胞结节被认为是一种癌前病变，为肝癌发生的前体细胞[4]。癌细胞内常出现脂肪泡，是由于在癌细胞增殖早期，血液供应相对不足，癌细胞相对缺氧所致，随着癌结节内血管的增生，血液供应改善，脂肪变性消失。这种脂肪泡，是嗜碱性小细胞增生旺盛，营养供给不足所致，是向肝癌转变的中间状态，是嗜碱性小细胞病灶发生癌变的有力证据。但也有报道[5]实验诱癌过程中以嗜酸性细胞结节为主，从嗜酸性细胞灶、嗜酸性细胞结节、嗜酸性异型细胞结节到高分化的肝细胞癌，呈连续渐进的演进过程，嗜酸性结节与肝细胞癌发生密切相关。本实验研究表明12周末肝小叶结构破坏、再生结节形成及假小叶形成、间质炎症细胞浸润。肝癌前期(第12～14周)以肝结构的破坏、再生结节及假小叶形成、实质细胞较为广泛的核异常及透明样变性、水变性、胞浆嗜碱变为多见。肝癌发生期(第14～16周)：肝小叶结构完全破坏，肝细胞增生结节增多，小叶塌陷，肝板消失，合并出血多见。形成嗜碱性和透明肝细胞增生灶，结节内肝细胞异型性增生明显，胞质染色不均匀，核奇形怪状、深染、密度增加、肝索排列紊乱。肝癌发生发展期(第16～18周)：肝硬化，肝细胞肝癌，部分见到胆管扩张、中性细胞。

电镜观察有助于从亚细胞水平了解肝细胞的癌变过程。通过电镜笔者观察到DEN诱癌过程中一些细胞器变化有一定的规律性。肝硬化期电镜下线粒体肿胀，基质变淡透亮，基质颗粒消失和空泡变，嵴变短、碎裂、减少。肝癌前期以细胞核异染色质结块、边集，部分形成线粒体-内质网复合体。肝癌发生期线粒体空泡化、出现脂滴、嵴部分断裂、肿胀、变形，内质网扩张。肝癌发生发展期细胞核碎裂、染色质边集，细胞浆不均，线粒体固缩，部分脱颗粒。癌旁细胞线粒体肿胀，基质变淡透亮，基质颗粒消失和空泡变，粗面内质网增生活跃、多核。

本实验在诱癌过程中发现肝癌前期形成线粒体-内质网复合体。而肝癌发展期癌细胞线粒体固缩，癌旁细胞线粒体肿胀，粗面内质网增生活跃、多核。它是否发生在所有的癌细胞，在肝癌的发生中又有怎样意义，有待进一步研究。

参考文献

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大鼠肝癌细胞 篇5

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

1.1.1 实验材料

人Bel-7404肝癌细胞株购于中国科学院上海细胞生物研究所。

1.1.2 实验试剂

RPMI 1640培养液、胎牛血清(FCS)购于Hyclone公司(美国);Ficoll分离液(1.077 g/m L)购于天津美德生物科技有限公司;T细胞尼龙毛柱为美国GIBCO公司产品,脂多糖(LPS)为Sigma产品;重组人rhGM-CSF、rhIL-4购自Pepro Tech公司;IL-12、IFN-γELISA检测试剂盒购于Boatman Biotech;MTT购自Sigma Chemical Co;FITC标记的CD1a、HLA-DR、CD80,PE标记的CD83、CD86,FITC标记的鼠免疫球蛋白亚型IgG1,k均为美国Immunotech公司产品;丝裂霉素C(Mitomycin C)购自Solarbio公司;LDH 4 h释放法细胞毒性分析试剂盒(CyTo96 NoRn-Radioactive Cytotoxicity Assay)为美国Promega公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 DCs的体外培养、扩增及鉴定

取健康人外周血200 m L,肝素抗凝,常规分离单个核细胞(PBMC),RPMI 1640完全培养基重悬细胞,置37℃、5%CO2培养箱培养4 h后,吸出未贴壁细胞(供分离T淋巴细胞用),留下贴壁细胞,加入含rhGM-CSF(100 ng/mL)、rhIL-4(50 ng/mL)细胞因子的10%FCS的RPMI 1640培养液,隔日半对量换液(吸弃30%,加入50%),同时加细胞因子(首次浓度的1/2),收集培养7 d的细胞即为DCs,通过光镜、电镜及流式细胞术等进行鉴定。

1.2.2 Kinectin-MBP的制备、分离及纯化

详细过程见参考文献[4]。麦芽糖结合蛋白(MBP)的制备与Kinectin融合蛋白相似,但所用的质粒为不插入任何目的基因的空质粒。

1.2.3 Kinectin-MBP致敏DCs的制备

DCs培养的第6天,加入Kinectin-MBP 0.2 m L(100μg/m L)共培养,另设MBP组作为比较,过夜收获悬浮和轻度贴壁的细胞即为致敏DCs,同时将细胞调成1×105/m L备用。

1.2.4 IL-12、IFN-γ的检测

分别收集正常培养至第6天、第8天的DCs以及经Kinectin-MBP、MBP致敏后的DCs(培养至第8天)的上清液,采用ELISA方法检测IL-12、IFN-γ含量。

1.2.5 致敏DCs体外诱导的自体淋巴细胞增殖效应

收集培养第8天的各组DCs作为刺激细胞,完全培养基调整细胞密度为2×106/m L后,分别重新铺入2板六孔板,其中一板加入丝裂霉素C25μg/m L,37℃孵育45 min,生理盐水洗涤3次,完全培养液悬浮;另外一板留后继诱导CTL用。将1.2.1步骤中吸出的未贴壁细胞经尼龙毛过柱后即为纯化的T淋巴细胞,将细胞调成1×105/m L后作为反应细胞,以每孔1×105个加入96孔板,分别将刺激细胞和反应细胞(DCs∶T)按1∶10、1∶50和1∶100的比例加入各孔反应细胞中,每孔设3个复孔,终体积为200μL。同时以T淋巴细胞+1640完全培养液作为阴性对照,置37℃、5%CO2培养箱培养96 h后,每孔加入MTT(5 mg/m L)20μL,再继续培养4h,离心弃上清,加入DMSO 150μL/孔,轻微震荡,10 min后酶标仪检测各孔的A490值。细胞增殖指数(SI)=实验孔OD值/空白对照孔OD值,以此评价DCs刺激自体T淋巴细胞增殖的能力。

1.2.6 致敏DC诱导自体T淋巴细胞增殖分化为CTL

于6孔培养板中加入自体T淋巴细胞(1×106个/孔)作为效应细胞,其中一孔细胞量为1.1×106个/孔作为对照组;分别以培养至第8天的各组致敏DC作为刺激细胞,以1×105个/孔加入各组T淋巴细胞孔,同时加入IL-2,终浓度为200 u/mL,置37℃、5%CO2培养箱培养,分别于培养的第3、6天半量换液,同时补足IL-2终浓度为200 u/mL。第7天收集细胞,即为DC-CTL。

1.2.7 致敏DC诱导的CTL对BEL-7404肝癌细胞杀伤活性的检测

采用乳酸脱氢酶(LDH)4 h释放法,严格按照试剂盒说明书操作。在效靶细胞混合培养前,分别对其进行活力测定,细胞成活率达95%以上方可进行下一步的杀伤实验。效应细胞共分为4组:分别标记为Kinectin-MBP-DC-CTL、MBP-DC-CTL、DC-CTL,同时设立对照CTL组(即NoDC-CTL),靶细胞为Kinectin表达阳性的7404肝癌细胞株。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。计量资料数据以均数±标准差表示,组间差异用方差分析,检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 DCs鉴定结果

正常人PBMC经培养4 h获得贴壁细胞,加入rhGM-CSF和rhIL-4培养到7～9 d,可见大量悬浮状细胞,细胞体积大且形态不规则,出现许多短的毛刺状突起,即为DCs。扫描电镜可见细胞表面较粗糙,形态显不规则状,并有大量皱褶和不规则的突起(见图1、2)。流式结果CD1a表达率为47.47%,HLA-DR为45.84%,CD80、CD83、CD86分别为50.88%、56.25%及69.72%(见图3)。

2.2 各组细胞因子检测结果

Kinectin-MBP与DCs共培养组(Kinectin-MBP-DCs)上清液IFN-γ和IL-12的浓度明显高于MBP孵育组(MBP-DCs)和正常培养DCs组(P<0.01);而正常培养DCs组其上清液IFN-γ和IL-12的分泌量在培养第6天、第8天无明显变化(P>0.05),结果见表1。

2.3 致敏DCs体外诱导的自体T淋巴细胞增殖效应

Kinectin-MBP致敏的DCs在刺激细胞与效应细胞比例为1∶10时,可诱导自体混合淋巴细胞较强的增殖反应,SI值为(46.80±4.48),显著高于MBP致敏DCs组(31.69±0.17)、非致敏DCs组(26.70±0.16)以及正常培养T细胞对照组(11.21±3.57)(均P<0.000),结果见表2。

2.4 致敏DCs诱导的CTL对肝癌细胞的杀伤作用

在实验设置的3种不同的效靶细胞比例条件下,经Kinectin-MBP致敏的DCs所诱导的CTL对7404肝癌细胞具有明显的细胞毒作用,其杀伤率在效靶比为25∶1时达最高峰(65.0±1.47)%,显著高于MBP组(21.83±0.27)%、DC组(3.60±2.35)%和正常对照组(2.07±1.54)%(均P<0.01)。在效靶比分别为10∶1及50∶1时,杀伤活性也较高,但是在效靶比为10∶1时,MBP组也具有较高的杀伤率,各组杀伤结果见表3。

注:1)与MBP-DCs组比较,P<0.05;2)与DCs组(第6天组和第8天组)比较,P<0.05;3)与DCs组(第6天组和第8天组)比较,P<0.05

注:1)与T细胞对照组比较,P<0.05;2)与MBP-DCs组比较,P<0.05;3)与DCs组比较,P<0.05

注:覮与对照组比较,P<0.05

3 讨论

近年来,伴随免疫学、分子生物学的快速发展,以免疫治疗为代表的肿瘤生物治疗已成为肿瘤治疗的研究热点。体外运用抗原物质等致敏DCs后回输体内作为新型肿瘤疫苗则成为肿瘤生物治疗的另一崭新手段,在国外,DCs肿瘤疫苗作为该崭新手段已进入临床试验阶段[5]。目前,研究者们在以DCs为基础的肝癌免疫治疗方面也进行了多方面的研究[6,7,8],这为肝癌的免疫治疗提供了一个崭新的平台。

Kinectin是生物进化过程中保留下来的一种细胞内膜蛋白,其穿膜区域镶嵌在内质网质膜上,属细胞器蛋白质,其主要功能是与动力蛋白Kinesin结合而参与囊泡的转运,为Kinesin的受体。Kinectin还与一些细胞内的功能及信号蛋白相关联,如整合素、RhoG家族蛋白、EF1复合体等,这些蛋白在细胞的分裂、分化及骨架构建中都发挥着极其重要的作用[9]。目前对Kinectin的研究主要集中在生化特性、运输功能、信号转导关系以及与疾病的关系等方面。关于Kinectin与肝癌方面研究目前报道较少,除课题组报道其相应抗体在肝癌患者中有较高的阳性率外[3],另有研究报道在HCC患者血清中也筛查到了抗Kinectin抗体,在Kinectin的4个选择拼接区中,包含有D2区域(即V4区域)的Kinectin在肝癌中有过度表达,可能与肝癌的发生密切相关[10]。课题组前期已成功制备并分离纯化出Kinectin-MBP[4],笔者研究在前期研究的基础上,探讨经Kinectin-MBP致敏的DCs诱导的自体T淋巴细胞产生特异性抗肝癌效应,为将Kinectin蛋白运用于以DCs为基础的肝癌临床免疫治疗奠定理论基础。

笔者的研究结果表明,经GM-CSF和IL-4诱导、LPS刺激培养10 d后的DCs,表达较高水平的HLA-DR、CD80和CD86分子(表达率分别为45.33%、50.37%和69.17%),结合形态学鉴定结果,以及所借鉴实验方法的成熟度,可确定已成功培养出DCs。实验对Kinectin-MBP、MBP致敏的DCs以及正常培养DCs的上清液进行了IL-12和IFN-γ的检测,结果显示,Kinectin-MBP组IL-12和IFN-γ的分泌量明显高于MBP组及未致敏组,表明Kinectin-MBP可激活DC产生较高水平的IL-12和IFN-γ。而IL-12是促进Th1分化的最主要的细胞因子,可进一步促进T淋巴细胞发挥Th1效应,达到抗肿瘤作用;FIN-γ具有上调肿瘤细胞抗原提呈分子及共刺激分子表达的作用,这种作用不仅能够加强DCs的抗原提呈功能,同时也能够提高CTLs对肿瘤细胞的识别能力及杀伤活性。

此外,MTT法检测各组T淋巴细胞增殖情况,发现Kinectin-MBP致敏DCs组能有效刺激T淋巴细胞的增殖,明显高于未致敏组及MBP孵育组,具有较强的刺激同种T细胞增殖的能力;且Kinectin-MBP致敏DCs可诱导CTL的产生;CTL对Kinectin阳性表达的7404肝癌细胞株产生较明显的杀伤作用,这种杀伤作用在一定范围内随效应细胞的增加而增加,在效靶比为25∶1时杀伤率达最高峰[为(65.00±1.47)%],显著高于MBP-DC-CTL组、DC-CTL组及No-DC-CTL组[分别为(21.83±0.27)%、(3.60±2.35)%及(2.07±1.54)%,均P<0.001]。

笔者实验为排除MBP在其中所起的杀伤作用,另设MBP致敏DCs诱导组作为对照,发现MBP组在效靶比为10∶1时,杀伤率可达(49.83±3.28)%,但在效靶比为25∶1时,其杀伤率仅为(21.83±0.27)%,这就提示在进行肿瘤的免疫治疗时,有一个理想临界点,高于或者低于该临界值,都可直接关系到免疫效应的杀伤结果,故需要摸索好合适的效靶比例,才可达到理想的临床治疗效果。此外,为排除肝癌细胞自然溶解的可能,在进行杀伤之前,采用台盼蓝对细胞进行活细胞记数,细胞活性达95%以上方可用来进行杀伤实验;同时,为排除DCs以及T细胞的非特异性杀伤,还设立了未致敏DCs组以及正常培养T淋巴细胞组作为对照,结果均未见明显的杀伤作用(P<0.05),这就表明,Kinectin融合蛋白作为肝癌相关蛋白性的抗原致敏的DCs在体外具有比较明显的抗肝癌活性。这为肝细胞癌的免疫治疗提供了实验依据,对其他肿瘤的治疗也有一定的借鉴作用,为临床肿瘤的免疫治疗提供了一个可行性方案。

参考文献

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大鼠肝癌细胞 篇6

“我们发现, 循环肿瘤细胞DNA水平能够准确反映肝细胞癌的肿瘤进程和治疗效果, ”广岛大学Atsushi Ono博士在新闻发布会上说。“通过进一步的研究, 循环肿瘤细胞DNA的基因组图谱分析, 可能会指导肝细胞癌的个体化管理。”

Ono及其同事分析了46例肝癌患者的数据, 这些患者都在2009年10月-2012年1月之间行肝切除或肝移植手术。研究人员通过使用针对每个肿瘤体细胞重排测定量化了循环肿瘤细胞DNA (ct DNA) 。外显子测序也采用游离DNA配对行肝动脉化疗栓塞术 (TACE) 后复发性肝癌患者的原发肿瘤组织中的DNA。

“我们研究了ct DNA水平能否反映肝脏肿瘤的动态, 以及能否通过量化每个特定肿瘤基因组排序作为不良诊断的一个预测因子, ”研究人员写道。“我们还在研究肝癌患者游离DNA基因组外显子测序能否识别癌组织的体细胞突变。”

突变可以发生在所有的肿瘤中;然而, 术前46例患者中仅有7例有ct DNA。ct DNA的存在与肿瘤体积大和肝切除术后2年内肝癌的复发是相关联的。此外, ct DNA也会随着疾病进展而增加。

与没有ct DNA的患者 (P=0.0386) 相比, 存在ct DNA的患者复发和肝外转移的累积发生率较低 (P=0.0102) 。

多因素分析显示, ct DNA是门静脉显微血管受侵犯的一个独立预测因子 (OR=6.1;95%CI, 1.11-33.33) 。

此外, 研究人员通过外显子测序在TACE术后游离DNA中发现了45个非同义突变, 在原发肿瘤组织中发现71个非同义体细胞突变。在两个样本都有25个常见的基因突变, 在原发肿瘤组织中发现的突变中有85%在游离DNA也有发现。

大鼠肝癌细胞 篇7

在一项对602例肝癌患者的3期临床试验中,接受索拉菲尼治疗组的患者中位总生存期为10.7个月,安慰剂组为7.9个月,用索拉菲尼治疗肝癌取得了明显的生存优势[5]。作为第1个在肝癌治疗中获得生存优势的靶向药物,索拉菲尼已被美国食品与药品管理局(food and drug administration,FDA)确定用于肝癌患者的治疗。细胞因子活化的杀伤细胞(cytokine-induced killer,CIK),是一群以IFN-γ、抗CD3单抗、IL-2和IL-1α共培养外周血单个核细胞(PBMNC)得到的细胞群,具有强大的体内扩增能力和抗肿瘤细胞毒性[6]。

本文研究索拉菲尼和细胞因子活化杀伤细胞疗法联合对肝癌细胞的体外杀伤作用,为肝癌的综合治疗奠定基础。

1 材料和方法

1.1 药物及试剂

索拉菲尼{N-(3-三氟甲基-4-氯苯基)-N-[4-(2-甲基氨基甲酰嘧啶)苯氧基]尿素}购至Bayer公司;二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司;人淋巴细胞分离液Ficoll-Paque Plus购自Amersham Biosciences公司;IFN-γ购自上海克隆生物技术有限公司;CD3单抗购自北京邦定生物医学公司;基因重组人IL-2购自山东泉港药业有限公司;基因重组人IL-1α购自美国Pepro Tech公司;RPMI 1640培养基购自美国Gibco公司;小牛血清购自浙江四季青公司;FITC标记的鼠抗人CD3单克隆抗体及PE标记的鼠抗人CD56单克隆抗体购自美国BD公司;Cell Counting Kit-8试剂盒(CCK-8试剂盒)购自江苏碧云天生物技术研究所;Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自凯基生物科技发展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

BEL-7402人肝癌细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心,在含10%小牛血清的RPMI 1640培养基中,于5%二氧化碳、37℃孵箱中培养。CIK细胞培养,应用CS-3000血细胞分离机(美国Baxter公司)干细胞采集程序采集健康志愿者外周血,经Ficoll Paque Plus密度梯度离心获得外周血单个核细胞(PBMNC)。用PBS洗涤2次,悬浮于含10%小牛血清的RPMI1640培养基中,调整细胞浓度1×106/m L,当日加入IFN-γ(1 000 IU/m L),24 h后加入CD3Mc Ab(50ng/m L)、IL-2(300 IU/m L)和IL-1α(100 IU/m L),在37℃、5%二氧化碳培养箱中培养。以后每3天补加新鲜培养基,并补加IL-2(300 IU/m L)。

1.2.2 细胞表型检测

于第1、8、14天收集CIK细胞,PBS洗2次,用1 m L PBS重悬细胞,分别加入FITC标记的鼠抗人CD3单抗和PE标记的鼠抗人CD56单抗,4℃孵育0.5 h,流式细胞仪检测CIK细胞免疫表型。

1.2.3 CCK-8法检测CIK及索拉菲尼对肿瘤细胞的杀伤活性

(1)索拉菲尼对肝癌细胞杀伤活性的检测。将索拉非尼溶于100%DMSO,再用RPMI 1640培养基稀释至所需浓度,DMSO的终浓度为0.1%,同时将0.1%(V/V)的DMSO加入培养基作为溶剂对照。取对数生长期BEL-7402细胞,以1×104/孔的密度接种于96孔板,于5%二氧化碳、37℃孵箱中培养。待细胞贴壁24 h后加入配制好的索拉菲尼(浓度分别为6.9、13.8和20.8μmol/L)20μL/孔,设BEL-7402空白对照及0.1%(V/V)DMSO溶剂对照,每组3个复孔。继续培养48 h后加入CCK-8溶液20μL/孔,37℃孵育2 h,酶联免疫分析仪在450 nm波长检测每孔的光密度值(OD值)。计算细胞增殖抑制率:抑制率=(对照组-实验组)/对照组×100%。(2)CIK对肝癌细胞杀伤活性的检测。同上接种肝癌BEL-7402细胞,于铺板48 h后加入不同效靶比(10∶1,20∶1,40∶1)的CIK细胞,同时设3种浓度的CIK空白对照组,每组3个复孔。CIK与肝癌细胞共培养24 h后加入CCK-8溶液20μL/孔,37℃孵育2 h,酶联免疫分析仪450 nm检测每孔的光密度值(OD值)(波长450 nm)。计算杀伤活性:杀伤活性(%)=[1-(实验组A值-单独效应细胞组A值)/单独靶细胞A值]×100%。(3)索拉菲尼及CIK联合杀伤活性的检测。同上接种肝癌BEL-7402细胞,于铺板24 h加入不同浓度索拉菲尼20μL/孔,次日分别加入不同效靶比的CIK细胞,分别记做联合组1、联合组2和联合组3(6.9μmol/L+10∶1;13.8μmol/L+20∶1;20.8μmol/L+40∶1),继续培养24 h,加入CCK-8溶液20μL/孔,37℃孵育2 h,酶联免疫分析仪450 nm检测每孔的光密度值(OD值)。计算公式同上。

1.2.4 细胞凋亡Annexin V/PI检测

用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡,将处于对数生长期的细胞接种于6孔培养板,分别用索拉菲尼(20.8μmol/L)、CIK细胞(效靶比40∶1)、联合组3(20.8μmol/L+40∶1)作用于肝癌细胞后,收集各组细胞,并用PBS洗涤2次,调整细胞浓度为5×105/m L,用500μL binding buffer悬浮细胞,加入5μL Annexin V-FITC混匀后,加入5μL的PI,室温避光反应15 min,流式细胞仪检测。数据由Win M-DI 2.9软件系统分析。

1.3 统计学分析

以上实验均重复3次,采用SPSS 13.0统计软件分析实验结果。结果采用表示,两样本均数的比较采用成组比较t检验,P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 CIK细胞表型分析

分离的外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子共同培养14 d后,CD3+CD+56细胞比例明显增多,第14天时CD3+CD+56细胞比例达(46.83±2.53)%,绝对数量上扩增了近1 000倍,见表1。

注:1)与第1天比较,P<0.05;2)与第1天比较,P<0.01

2.2 索拉菲尼单药或联合CIK对肝癌细胞的杀伤作用

随着药物浓度升高,索拉菲尼对肝癌细胞BEL-7402的抑制效应逐渐增强,CIK对肝癌细胞的杀伤活性随效靶比的增高而增高,联合组1的抑制率与单独治疗组相比差异并无显著性(P>0.05),联合组2及联合组3对肝癌细胞的杀伤作用明显增强,其中以联合组3的杀伤率最高,达(71.66±3.18)%,是单CIK组的1.5倍,是索拉菲尼单药组的2倍,差异有显著性(P<0.01),见表2。

2.3 Anne xin V/P I检测凋亡率结果分析

索拉菲尼联合CIK能有效促进肝癌BEL-7402细胞凋亡,索拉菲尼单药及CIK组诱导肝癌细胞的凋亡率分别为(45.38±1.76)%和(52.18±8.63)%。联合治疗组凋亡率明显升高,达(70.56±2.58)%,与各单治疗组相比差异有显著性(P<0.05),见附图。

注:1)与CIK组和索拉菲尼组相比,P>0.05;2)与CIK组相比,P<0.01,与索拉菲尼组相比,P<0.05;3)与CIK组和索拉菲尼组相比,P<0.01

a:对照组;b:索拉菲尼单药组;c:CIK组;d:CIK+索拉菲尼组

3 讨论

CIK细胞是一群具有强大抗肿瘤活性的细胞群,该种细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子,故又被称为自然杀伤细胞样T淋巴细胞,兼具有T淋巴细胞强大的杀瘤活性和自然杀伤细胞的非主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)限制性杀瘤特点。CIK细胞疗法可以单独应用于临床治疗肿瘤患者,更重要的是可以作为手术、放疗、化疗的补充,与上述3种疗法联合应用,提高疗效和改善患者生存质量。TAKAYAMA等[7]在一项随机临床试验中证实肝癌术后的患者用过继免疫治疗能明显降低复发率。

索拉非尼是一种多激酶抑制剂,它不但可以抑制RAF激酶活性,还抑制几种受体酪氨酸激酶活性,包括血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)、FLT、Ret和c-Kit[8]。研究证明索拉非尼对2种人类肝癌细胞系Hep G2和PLC/PRF/5均能抑制肿瘤细胞增殖并诱导细胞凋亡,同时其在动物移植模型中也显示了广泛的抗肿瘤活性[9]。索拉菲尼的作用机制以及其表现出的较小的副作用,使其与其他治疗方法联合治疗成为可能。

本实验结果显示,索拉菲尼联合CIK细胞疗法能有效抑制肝癌细胞生长并促进其调亡。索拉菲尼和CIK通过不同的途径抑制肝癌细胞生长,索拉菲尼能阻断RAF/MEK/ERK信号传导通路,抑制肿瘤血管生成并诱导肿瘤细胞凋亡。CIK细胞的抗肿瘤作用机制虽还未完全明了,但目前认为CIK细胞可能是通过黏附因子LFA/ICAM-1途径与肿瘤细胞结合后,分泌含大量BLT酯酶的颗粒,这些颗粒能穿透靶细胞膜,导致肿瘤细胞的裂解[10];同时还能产生大量炎性细胞因子,活化肿瘤细胞凋亡基因,使得FLIP、Bcl-2、Bcl-x L、DAD1和Survivin基因表达上调,并通过配体受体(Fas:Fc)介导的的方式诱导肿瘤细胞凋亡[11]。但是索拉菲尼和CIK杀伤肝癌细胞的联合作用机制还不明确,针对两者机制的关联性的进一步研究正在进行中。

本研究证实索拉菲尼与细胞因子活化杀伤细胞疗法联合应用可有效抑制人肝癌细胞BEL-7402的生长,其效应远大于各自单独的抑制效应。该结果为靶向治疗联合细胞因子活化杀伤细胞疗法治疗肝癌提供了一定的实验数据支持。

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