大鼠成骨细胞增殖

大鼠成骨细胞增殖（通用7篇）

大鼠成骨细胞增殖 篇1

骨折愈合是一个复杂的生理过程, 该过程中需要大量新的成骨细胞产生, 从而加快骨质合成与钙化, 增加骨的体积和密度。因此, 成骨细胞的增殖及分化在骨折愈合过程中且有重要意义。松果菊苷是一种苯乙醇苷类化合物, 是中药肉苁蓉的主要活性成分之一[1], 研究表明松果菊苷有类似雌激素的功能, 在卵巢切除大鼠中表现出抗骨质疏松的作用[2], 松果菊苷还能够促进小鼠胚胎成骨细胞 (MC3T3-E1) 的增殖和分化[3], 提示松果菊苷可能促进骨骼的发育和形成。然而, 松果菊苷促进成骨细胞增殖分化的作用通路仍不清楚。骨形态发生蛋白 (BMP) 是促进骨形成和诱导成骨细胞增殖分化的最重要的细胞信号之一, Smads家族是BMP信号转导蛋白, BMP/Smad信号通路在成骨细胞的增殖分化中起重要的作用[4]。此外, 细胞外信号调节激酶 (ERK) 是丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 信号通路中的一条途径, 研究表明ERK通路也能够调节成骨细胞的增殖分化[5]。而松果菊苷能否影响BMP-2/Smad和MAPK/ERK信号通路还未被证实。本研究的目的在于考察松果菊苷对大鼠成骨细胞增殖的影响, 并进一步研究其作用通路, 为松果菊苷在骨折愈合方面的新药研发提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

松果菊苷标准品 (111670-201304) 购自中国药品生物制品检定所, MAPK/ERK信号通路抑制剂PD98059购自美国Sigma, 大鼠骨钙素 (BGP) 和BMP-2 ELISA检测试剂盒购于南京森贝伽生物科技有限公司, RT-PCR试剂盒购于宝生物工程 (大连) 有限公司, Smad4、ERK1/2、p-ERK1/2和β-actin一抗及二抗购自美国Santa Cruz Biotechnology, 胎牛血清购于美国Invitrogen。

1.2 实验动物

10只出生24 h内的SD乳鼠由种鼠交配获得 (购自第四军医大学动物实验中心) 。

1.3 成骨细胞的分离和培养

采用酶消化法分离大鼠颅盖骨成骨细胞[6], 将细胞于含10%胎牛血清的DMEM培养液中传代培养。取第4代指数期的大鼠成骨细胞, 配制为4×104个/m L细胞悬液, 接种于96孔培养板中, 分为3组:对照组、松果菊苷 (ECH) 给药组、ECH和PD98059给药组 (PD, 20μmol/L) 。

1.4 MTT比色法检测成骨细胞增殖

不同浓度的松果菊苷 (0.01, 0.1, 1, 10, 100 nmol/L) 作用于成骨细胞48 h, 或者浓度为1 nmol/L的松果菊苷分别作用于成骨细胞12, 24, 36, 48, 60 h之后, 采用MTT法检测成骨细胞的增殖情况。每孔加入0.5%MTT溶液20μL, 37℃孵育4 h, 弃去上清液, 每孔加150μL二甲基亚砜, 缓慢振荡10 min, 用酶联免疫检测仪于波长为490 nm处测定各孔的OD值。

1.5 ALP活性测定

药物作用成骨细胞48 h后, 弃去上清液, 用PBS清洗细胞3遍。每孔加入50μL 0.1%的Triton X-100, 4℃孵育过夜, 每孔加入ALP底物100μL, 37℃孵育30 min, 加入0.2 mmol/L Na OH 50μL终止反应, 酶联免疫检测仪于波长为410 nm处检测各孔的OD值。

1.6 ELISA法测定细胞上清中BGP和BMP-2的含量

药物作用成骨细胞48 h后, 收集细胞上清液, 采用ELISA检测试剂盒, 根据说明书中的步骤进行操作, 检测上清中BGP和BMP-2的含量。

1.7 q RT-PCR检测成骨细胞中BGP和BMP-2的m RNA水平

收集成骨细胞, Trizol法提取总RNA, 测定浓度后使用试剂盒进行反转录。BGP和BMP-2的扩增引物由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成, 引物序列如表1所示。PCR扩增条件:95℃预变性10 min, 95℃变性30 s, 60℃延伸1 min, 共45个循环。经Real-time PCR仪检测, 根据Ct值比较基因的表达量, 用β-actin做内参, 2-△△Ct为相对表达量, 实验重复3次后进行统计分析。

1.8 Western blot法测定成骨细胞中Smad4、ERK和p-ERK的含量

药物作用24 h后, 收集成骨细胞, 提取细胞总蛋白, 用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。定量好的蛋白经SDS-PAGE分离后转至PVDF膜上, 室温封闭2 h, 加入Smad4、ERK1/2、p-ERK1/2或β-actin一抗 (1∶1 000) , 4℃孵育过夜。TBST洗膜3次, 加入二抗 (1∶1 000) , 室温孵育1 h。TBST洗膜后, ECL发光液曝光显影, 凝胶图像分析系统采集图像, Image J2x软件分析条带的灰度值, 实验重复3次后进行统计分析。

2 结果

2.1 松果菊苷对大鼠成骨细胞增殖的影响

不同浓度的松果菊苷 (0.01, 0.1, 1, 10, 100 nmol/L) 作用于成骨细胞48 h后, MTT法检测成骨细胞的增殖情况。如图1所示, 松果菊苷能显著提高成骨细胞的增殖能力, 并呈浓度依赖性。浓度为1 nmol/L的松果菊苷分别作用于成骨细胞12, 24, 36, 48, 60 h, 成骨细胞增殖有分别有不同程度的升高, 呈时间依赖性。

注: (a) 不同浓度松果菊苷作用48 h对成骨细胞增殖的影响; (b) 不同作用时间下1 nmol/L松果菊苷对成骨细胞增殖的影响。

2.2 松果菊苷对大鼠成骨细胞ALP活性的影响

不同浓度的松果菊苷 (0.1, 1, 10 nmol/L) 与成骨细胞共培养48 h后, ALP活性的测定结果如图2所示, 各浓度的松果菊苷均能显著提高成骨细胞ALP活性。

2.3 松果菊苷对大鼠成骨细胞BGP表达的影响

提取细胞中的总RNA, RT-PCR法检测BGP的m RNA水平, 收集细胞上清液, ELISA法检测细胞上清液中BGP的含量。结果表明松果菊苷能够促进成骨细胞中BGP的表达 (见图3) 。

注: (a) 成骨细胞中BGP的m RNA水平; (b) 细胞上清中BGP的含量。

2.4 松果菊苷对通过诱导ERK/BMP-2信号通路影响成骨细胞的增殖

松果菊苷作用于成骨细胞48 h后, 分别采用RT-PCR和ELISA法检测成骨细胞和细胞上清液中BMP-2的表达。结果如图4a和4b所示, 松果菊苷能够显著提高BMP-2的m RNA水平和蛋白水平, 同时松果菊苷也能提高成骨细胞中Smad4的表达 (图4c) 。MAPK/ERK信号通路在成骨细胞分化过程中发挥重要作用, 松果菊苷能够促进ERK的磷酸化从而激活MAPK/ERK信号通路 (图4c) 。进一步研究发现, 当细胞中加入ERK信号通路抑制剂PD后, 松果菊苷诱导的成骨细胞增殖和BMP-2的表达受到抑制 (图4d) 。

注: (a) 成骨细胞中BMP-2的m RNA水平; (b) 细胞上清液中BMP-2的含量; (c) 成骨细胞中Smad4、ERK和p-ERK的蛋白表达水平; (d) PD作用后成骨细胞的增殖情况。

3 讨论

骨折发生时, 损伤附近骨髓中的间充质干细胞 (MSC) 在各种细胞因子刺激下分化为成骨细胞, 成骨细胞进行大量的增殖, 最终导致细胞外基质的积聚和矿化从而形成新骨[7]。该过程由一系列复杂的体系来调节, 而成骨细胞的调控对骨折愈合过程中新骨的形成非常重要。BMP是TGF-β超家族中的一组多功能细胞因子, 具有诱导间充质细胞迁徙、增殖、分化, 最终导致软骨、骨形成的作用[8]。BMP/Smad信号通路在成骨细胞的存活和增殖中起重要作用[9,10], 体外和体内实验也证明了BMP-2能够诱导成骨细胞增殖及其促进骨折愈合[11,12]。松果菊苷能够诱导大鼠成骨细胞中BMP-2的表达, 而具体机制并不清楚。本研究结果表明松果菊苷能够促进大鼠成骨细胞的增殖和分化, 并提高BMP-2的m RNA和蛋白表达水平, Western结果表明松果菊苷还可以提高Smad4的表达, 提示松果菊苷有可能通过诱导BMP/Smad信号通路而促进成骨细胞的增殖与分化。

MAPK信号通路是一条经典的调控细胞增殖的信号通路, 包括细胞外信号调节激酶 (ERK) 、c-Jun N端激酶 (JNK) /应激活化蛋白 (SAPK) 、p38 MAPK和ERK5/大丝裂素活化蛋白激酶 (BMK1) 五种主要途径, 以上途径都参与了成骨细胞的细胞增殖和细胞分化[13,14,15,16,17], 而ERK途径最为重要。研究发现ERK能够参与调控糖皮质激素诱导的成骨细胞增殖[18], 神经调节肽B也能够通过激活ERK途径从而促进成骨细胞的增殖[19]。本研究发现松果菊苷能够促进ERK的磷酸化从而激活MAPK/ERK信号通路。有研究表明山奈酚能够激活ERK通路, 并诱导BMP-2的表达从而影响细胞的增殖[20]。此外, 牛膝总皂苷也能够激活ERK/BMP-2信号通路从而促进骨髓基质细胞的增殖[21]。本研究中发现松果菊苷能够激活大鼠成骨细胞中的BMP-2/Smad和MAPK/ERK信号通路, 而在加入ERK途径的抑制剂PD后, BMP-2/Smad途径被抑制, 细胞增殖能力降低, 表明松果菊苷是通过激活ERK/BMP-2信号通路从而促进成骨细胞的增殖。

本研究结果表明, 松果菊苷能够促进大鼠成骨细胞的增殖和分化, 且该作用是通过激活成骨细胞的ERK/BMP-2信号通路来实现的。

大鼠成骨细胞增殖 篇2

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要试剂及仪器

唑来膦酸(吉林省西点药业科技发展股份有限公司);IGF-1酶联免疫试剂盒(美国安迪生物科技有限公司);MTT(美国Sigma集团公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 成骨细胞培养

取新生24 h内的雄性SD乳鼠(山西医科大学实验动物中心提供)6只。培养方法见参考文献[1]。

1.2.2 实验药物的配制

唑来膦酸粉剂用PBS溶解,制成10-2mol/L作为储备浓度,保存在-20℃冰箱中。用PBS稀释,制成含药浓度为10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9 mol/L的培养基。对照组不加药。

1.2.3 MTT法检测成骨细胞增殖

取第三代成骨细胞以每孔5×103个接种于96孔板中,在37℃、5%CO2培养箱中培养24 h后,改用含有唑来膦酸的DMEM培养基,样本含量为10孔,7 d后,于培养终止前4 h换液并加入MTT(5 g/L)20μl,继续培养4 h。吸弃上清液,每孔加入DMSO 100μl,振荡10 min,490 nm波长下测定个孔吸光度(OD值)。

1.2.4 ELISA检测IGF-1含量

取第三代成骨细胞以每孔3×104个细胞接种于2块24孔板内,样本含量为8孔,于第2天加入含有唑来膦酸的培养液,以后每2天半换液1次,7 d时取上清液,按照ELISA试剂盒的说明书进行操作,并计算IGF-1的含量。

1.3 统计学分析

数据以均数±标准差表示,采用SPSS 13.0统计软件进行分析,总体上有无差异采用单因素方差分析,组间比较采用LSD法分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 唑来膦酸对成骨细胞增殖的影响

唑来膦酸在较高浓度时(10-4 mol/L和10-5 mol/L)与对照组相比,成骨细胞数目减少,差异有统计学意义(P<0.01);而在较低浓度时(10-6 mol/L和10-7 mol/L),与对照组比较,成骨细胞减少不明显,差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2 唑来膦酸对成骨细胞IGF-1表达的影响

唑来膦酸浓度在10-4、10-5 mol/L时IGF-1表达水平低于对照组(P<0.01);在浓度为10-6、10-7 mol/L时,IGF-1的表达量与对照组相差不大,差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。量与对照组相差不大,差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

与对照组相比,*P<0.01,**P>0.05Compared with control group,*P<0.01,**P>0.05

与对照组相比,*P<0.01,**P>0.05Compared with control group,*P<0.01,**P>0.05

3 讨论

双磷酸盐被广泛应用于临床治疗骨代谢疾病,例如骨质疏松、Paget病和转移性骨癌[2]。双磷酸盐能促进破骨细胞凋亡[3],但是最近有使用唑来膦酸后发生下颌骨坏死的报道。所以唑来膦酸对成骨细胞和成骨质量可能也有影响。IGF-1是促进骨合成代谢的主要细胞因子[4],并且是骨骼中最丰富的生长因子[5],它能作用于骨质疏松骨愈合的全过程[6]。Hock等[7]研究也发现IGF-1作用于颅盖骨后,胶原合成增加。

大鼠成骨细胞增殖 篇3

关键词：大豆异黄酮,成骨细胞,骨钙素

随着老龄化时代的到来, 绝经后骨质疏松症患病率逐年增高。雌激素治疗虽能减少绝经后妇女的骨丢失及骨折发生率[1], 但同时也增加了患乳腺癌和子宫内膜癌的风险[2,3]。近年来, 植物雌激素以其在女性健康中的潜在作用而成为研究的热点, 为防治绝经后骨质疏松提供了一条新思路。

大豆异黄酮类 (isoflavones) 主要是糖苷结合形式的染料木苷和黄豆苷, 在体内细菌作用下, 释放出具有生物活性的物质被吸收。近年研究表明, 大豆异黄酮在动物试验和人群调查中对骨骼代谢、预防骨质疏松有重要作用, 但在细胞水平, 一直尚少有报道。本实验结合血清药理学方法采用体外细胞培养, 目的在于从胞内信号转导水平探索成骨细胞骨钙素 (BGP) 的基因表达变化, 研究大豆异黄酮防治骨质疏松症的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂

低糖DMEM培养液、HEPES、胎牛血清 (联星生物有限公司) 、MTT (南京建成生物有限公司) 。RNA试剂盒 (美国GIBCO) , 逆转录酶为Roche公司。大豆异黄酮购自天津市康宁生物化学工程有限公司, 总含量为50.27%。

1.2 原代成骨细胞的培养

将新生SD大鼠 (中国医科大学实验动物中心) 放入75%酒精中浸泡消毒15 min, 无菌操作下取出颅盖骨。除去附着的血管及结缔组织, 用PBS溶液清洗3次。剪成l mm×l mm大小的碎块。加入0.25%胰蛋白酶, 于37℃消化30 min, 弃去消化液, PBS溶液清洗干净后, 加入0.02%Ⅱ型胶原酶, 于37℃消化5次, 每次20 min, 弃除前两次消化液, 取最后3次消化液, 1000 r, 离心10 min。弃上清液, 所得白色沉淀物即为制得的成骨细胞样细胞团。用含10%胎牛血清 (FBS) 的DMEM培养液重悬细胞至2×104/m L的细胞悬液, 吹打均匀后。接种到100 m L培养瓶。置入37℃, 含5%CO2饱和湿度的培养箱内进行培养, 24 h换液。弃去悬浮细胞.每隔2 d换液1次。

1.3 细胞增殖MTT测定方法

取培养至第3代的成骨细胞以1×105个/m L密度接种于96孔培养板, 每孔300μL, 24 h细胞贴壁后, 弃培养液, 分别加入含有大豆异黄酮 (20、40、60、80μg/μL) 浓度培养液, 另设加DMEM培养液作为阴性对照, 每组8孔。继续培养48 h后, 每组分别收集50μL上清液。每孔加入MTT溶液20μL, 37℃孵育4 h, 终止培养, 小心吸弃上清;每孔加入DMSO溶液150μL, 振荡10 min, 立即测定吸光度值 (波长490 nm) 。比较各组OD值的大小。

1.4 大豆异黄酮对成骨细胞BGP基因表达的影响

1.4.1 细胞总RNA提取

培养细胞经消化后, 弃消化液, PBS洗涤2次;加入TRIZOL细胞裂解液。刮下细胞, 连同裂解液一起转移至新的1.5 m L, Ep管中, 室温放置5 min。加氯仿0.2 m L, 剧烈震荡振荡15 s, 室温静置3 min, 4℃离心, 12000 r, 15 min, 小心吸取上层水相, 移至另一1.5 m L Ep管中。加等体积异丙醇, 室温放置10 min, 4℃离心, 12000 r, 10 min。弃上清, 加预冷75%乙醇1 m L, 旋涡振荡充分洗涤总RNA沉淀, 4℃离心, 12000 r, 5 min。弃上清, 快速离心5 s, 将管底残余乙醇用移液器小心吸去, 室温下晾干沉淀20 min。加20μL无RNA酶水, 溶解总RNA沉淀, 用分光光度计测定其在260、280 nm处OD值, 以确定核酸的纯度及浓度, 并按照公式[m RNA] (μg/μL) =OD260×40×稀释倍数/1000。

1.4.2 RT-PCR

取3μg总RNA用Ta Ka Ra RNA PCR Kit (AMV) Ver试剂盒逆转录合成c DNA。再用9700型PCR扩增仪 (PE公司) 进行PCR。BGP引物利用primer3软件设计, BGP上游:5'-GCA GGA GGG CAA TAA GGT-3';BGP下游:5'-CGT AGA TGC GTT TGT AGGC-3'。用于扩增BGP基因c DNA, 片段大小为164 bp。扩增条件为94℃5 min, 94℃15 s, 55℃30 s, 68℃20 s, 共30个循环。β-actin引物序列, 上游:5'-CAT CTC TTG CTC GAA GTC CA-3';下游:5'-ATC ATG TTT GAG ACC TTC AACA-3', 扩增片段:300 bp。扩增条件为94℃5 min, 94℃15 s, 55℃30 s, 68℃20 s, 共30个循环。

1.4.3 PCR产物半定量分析

取5µLPCR产物经1.5%琼脂糖凝胶 (含0.5μg/m L EB) , 120 V恒压, 40 min, 紫外透射仪上观察结果, 凝胶分析软件对电泳谱带进行半定量分析, 用任意单位 (AU) 表示凝胶谱带的面积×荧光强度值, BGP与β-actin的AU比值代表各自的m RNA相对表达水平。

1.5 统计学处理

用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。数据用 (±s) 表示, 各组均数的比较行单因素方差分析 (ANOVA) 。P<0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1 不同浓度的大豆异黄酮对成骨细胞增殖活性MTT结果显示:

随大豆异黄酮浓度的上升, 成骨细胞增殖活性呈上升趋势。其中, 60、80μg/μL与对照组相比, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 见表1。

注:*P<0.05 vs control group

2.2 RT-PCR半定量结果显示

与对照组 (0.5386±0.028) 相比, 20μg/μL (0.5620±0.020) 和40μg/μL (0.6228±0.012) 组BGP m RNA表达没有统计学意义 (P>0.05) ;60μg/μL (0.7813±0.010) 和80μg/μL (0.8121±0.013) 组BGP m RNA表达增强, 有统计学意义 (P<0.01) (图1, 图2) 。

3 讨论

骨组织中存在的细胞主要有3种:骨细胞、成骨细胞、破骨细胞。其中成骨细胞是骨组织中最活跃的细胞。成骨细胞存在于骨的表面以及骨间隙的孔隙内。其主要功能是合成、分泌骨基质并促进基质矿化形成骨组织[4,5,6]。骨钙素是成骨细胞合成分泌的一种非胶原蛋白, 是反映成骨细胞分化成熟的指标, 能准确表示成骨细胞的活性。当骨形成和骨吸收耦联时, 骨钙素的主要生理作用是反映骨转换的指标;当骨形成和骨吸收解耦联时, 骨钙素是反映骨形成的特异指标;它能准确反映成骨细胞的成骨功能[7,8]。

大豆异黄酮是植物雌激素的一种, 主要包括大豆苷原、染料木黄酮和黄豆黄素, 它们的结构与雌激素相似。本实验通过不同浓度的大豆异黄酮对体外培养的成骨细胞的增殖活性和BGP基因表达影响, 结果表明, 大豆异黄酮可以增加细胞水平的成骨细胞的增殖活性, 并随浓度的增大呈上升趋势。在基因水平上, 大豆异黄酮可促进大鼠成骨细胞BGP基因的表达, 亦表现出明显的剂量依赖关系。由此可以推测, 大豆异黄酮对骨骼代谢、预防骨质疏松的作用, 可能是促进成骨细胞的增殖活性和增加细胞中BGP基因表达而介导, 并表现出明显的剂量依赖关系。细胞培养研究表明, 大豆异黄酮对成骨细胞增殖、大鼠骨代谢有促进作用, 但其机制仍需进一步研究。成骨细胞增殖、分化的过程是一个受多种因素调节的复杂过程, 其可能受到多种因素的影响。

参考文献

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大鼠成骨细胞增殖 篇4

关键词：竹节参,MC3T3-E1,增殖,分化

竹节参又名竹节三七、竹节人参、白三七,为五加科植物竹节参(Panax japonicus C.A.Mey.)的干燥根茎,属《中国药典》多年收载的中药材品种。竹节参性温,味甘、微苦;滋补强壮,散瘀止痛,止血祛痰;用于病后虚弱、咳嗽痰多、跌打损伤。现代药理研究表明,竹节参主要活性成分为皂苷类,尚含少量挥发油、多糖和氨基酸等。皂苷类成分是竹节参中研究最多的成分,也是主要活性成分,其含量因产地不同而不同,我国报道竹节参根中皂苷含量约为5.0%,日本报道其根茎中粗皂苷含量约为23.6%[1]。骨质疏松(osteoporosis,OP)是以骨量减少,骨组织显微结构退行性改变为特征,骨脆性增加,易发生骨折的一种全身代谢性骨病。骨质疏松症的西药治疗主要有骨吸收抑制剂和骨形成刺激剂,常用药物为降钙素、维生素D、雌激素等。

然而长期大量使用外源性雌激素会增加子宫内膜增生、子宫癌、乳腺癌、卵巢癌、静脉血栓形成等并发症发生的危险性[2],从而限制了雌激素的临床应用。小鼠颅骨细胞来源的前成骨细胞MC3T3-E1细胞系是体外研究成骨过程的经典模型[3]。本文研究竹节参提取物对成骨细胞MC3T3-E1的增殖、分化作用,为竹节参的抗骨质疏松作用提供体外实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验仪器

HERA Cell 150型细胞培养箱(Thermo Electron Corporation,USA),超净工作台(苏州艾可林净化设备有限公司),COIC XDS-1B型倒置光学显微镜(重庆光电仪器有限公司),Synergy2型酶标仪(Biotek公司),TB-25型十万分之一电子天平(Sartorius,USA)。

1.1.2 细胞株

MC3T3-E1,购于中国医学科学院基础医学研究所。

1.1.3 药物与试剂

竹节参药材(产地:湖北恩施),95%乙醇(南京鼎新化工轻工有限公司),17-β雌二醇(湖北大仝生物化工科技有限公司),α-MEM培养基干粉(GBICO,批号:1115822),HyClone胎牛血清(赛默飞世尔公司,批号:NWK0489),胰蛋白酶(GBICO,货号:27250018),四甲基偶氮唑盐(AMRESCO,货号:0793),二甲基亚砜(南京化学试剂有限公司,批号:11031810313),Western及IP细胞裂解液(碧云天生物技术研究所,产品编号:P0013),碱性磷酸酶测试盒、BCA总蛋白定量测试盒(南京建成生物技术有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 药物制备

取竹节参药材饮片50g,浸泡2h,以10倍量蒸馏水80℃浸提3次,每次2h,合并提取液,浓缩,减压干燥后得水提物。取竹节参药材饮片50g,浸泡2h,以10倍量95%乙醇85℃回流提取3次,每次2h,合并提取液,回收乙醇,减压干燥后得95%乙醇提取物。称取上述两种提取物适量,分别配制成10mg生药/mL的样品贮备液。

1.2.2 细胞培养

小鼠成骨细胞株MC3T3-E1,采用含10%胎牛血清的α-MEM培养基,在5%CO2、37℃培养箱中培养,2d换液1次,3～4d传代1次。

1.2.3 MC3T3-E1细胞增殖作用、ALP活性测定

(1)细胞数目与吸光度的线性关系考察,将MC3T3-E1细胞用0.25%胰蛋白酶制成细胞悬液,分别以1×104、2×104、3×104、4×104、5×104、6×104、7×104、8×104和9×104cell/mL密度接种于96孔板,每孔200μL,每组设6个复孔,培养24h后,每孔中加入5mg/mL的MTT溶液20μL,37℃孵化4h,有蓝紫色沉淀生成。吸去培养液,每孔加入150μLDMSO溶解,用酶标仪于490nm测定吸光度。(2)增殖作用测定,将MC3T3-E1细胞以2×104cell/mL密度接种于96孔培养板,每孔200μL,培养24h后给药。实验组分别加入水提物、95%醇提物的终浓度分别为10-1、10-2、10-3、10-4 mg生药/mL,阳性对照组加入等体积终浓度为1×10-8mol·L-1的雌二醇,空白对照组加入等体积的不含药的α-MEM培养液,每组均设6个复孔。继续培养44h,每孔中加入5mg/mL的MTT溶液20μL,37℃孵化4h,有蓝紫色沉淀生成。吸去培养液,每孔加入150μL/孔DMSO溶解,用酶标仪于490nm测定吸光度。(3)碱性磷酸酶(ALP)活性测定,将MC3T3-E1细胞以5×104cell/mL密度接种于24孔培养板,每孔1mL,培养24h后给药。实验组分别加入水提物、95%醇提物的终浓度分别为10-1、10-2、10-3、10-4 mg生药/mL,阳性对照组加入等体积终浓度为1×10-8 mol·L-1的雌二醇,空白对照组加入等体积的不含药的溶剂α-MEM培养液,每组均设3个复孔,继续培养96h。到规定的时间点后,弃去培养液,加入细胞裂解液裂解细胞,收集裂解液,4℃条件下,4 000rpm离心5min,收集上清液。按碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒及BCA蛋白定量法分别测定ALP值和蛋白含量,计算细胞内ALP的活性(U/g·port)。(4)统计学分析,应用SPSS 11.0对实验数据进行统计学分析,所有数据均以(珚x±s)表示,实验组与对照组比较,采用t检验,*P<0.05表示有显著性差异,**P<0.01为有极显著性差异。

2 实验结果

2.1 MC3T3-E1细胞的增殖作用考察

2.1.1 细胞数目与吸光度的线性关系

以实验测得的6个复孔吸光度的平均值(Y)与细胞数目(X)作线性回归,得回归方程:Y=0.0219X+0.3286(r=0.9987,n=6)。由实验结果可知,在(1～9)×104cell/mL范围内,细胞数目与吸光度OD值呈较好的线性关系。见图1。

2.1.2 对MC3T3-E1细胞增殖的影响

由表1可知,10-1 mg/mL的水提物和10-4 mg/mL的95%乙醇提取物明显促进MC3T3-E1增殖,增殖率明显高于空白对照组(P<0.05)。其他各浓度的竹节参提取物对MC3T3-E1无明显增殖作用。说明10-1 mg/mL的水提物和10-4 mg/mL的95%乙醇提取物能加速成骨细胞的增殖。见表1。

2.2 对MC3T3-E1细胞分化的影响

由表2可知,10-1 mg/mL的水提物和10-4 mg/mL的95%乙醇提取物明显提高ALP活性,ALP活性明显高于空白对照组(P<0.05)。但是其他各浓度的竹节参提取物对MC3T3-E1细胞的ALP活性无明显提高作用。实验结果说明10-1 mg/mL的水提物和10-4 mg/mL的95%乙醇提取物能够明显的促进成骨细胞的分化。

(n=6)

Contrast to normal group,*P<0.05,**P<0.01。

Contrast to normal group,*P<0.05,**P<0.01。

3 讨论

成骨细胞(osteoblast)是骨形成的主要功能细胞,它既分泌骨基质参与骨形成,还参与破骨细胞吸收功能的调节,在骨代谢过程中起着重要作用[4]。成骨细胞在骨形成过程中经历增殖、分化和矿化三个阶段[5]。碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP或AKP)由成骨细胞产生,富含于胞浆中,它既可作为成骨细胞的功能标记物,又可反映其分化成熟程度[6]。本文选用经典的前成骨细胞模型MC3T3-E1细胞为研究对象,其具有体外培养成骨细胞的各种生物学特性,包括碱性磷酸酶活性、Ⅰ型胶原合成和基质矿化等[6,7]。

本实验采用将竹节参提取物与MC3T3-E1共同培养的方法,考察不同提取物对MC3T3-E1的增殖分化作用。实验结果表明竹节参水提物及95%醇提物均可显著促进MC3T3-E1的增殖与分化,且对增殖、分化影响大小与其浓度有密切关系。由此可推断竹节参中含有一些药效物质,既可促进细胞的增殖,又能进一步促进细胞成熟分化。因此加速成骨细胞的增殖与分化,增强成骨细胞活性,可能是竹节参抗骨质疏松作用的部分机制。

本实验在细胞水平上证实了竹节参的抗骨质疏松活性,结果表明竹节参具有开发成抗骨质疏松药物的潜质,但发挥作用的主要有效物质以及具体作用途径有待于进一步研究。

参考文献

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[2]邓廉夫.骨质疏松的雌激素药物治疗与降低其不良反应的对策[J].实用老年医学,2008,22(6):413-417.

[3]QUARLES L D,YOHAY D A,WENSTRUP R J,et al.Distinct proliferative and diferentiated stages of murineMC3T3-E1cells in culture:all in vitro model of osteoblastdevelopment[J].J Bone Minor Res,1992,7(6):683.

[4]SUDA T,TAKAHASHI N.Osteoblasts are essential for os-teoclast formation[J].Calcif Tissue Int,1989,44(1):45-47.

[5]LIAN J B,GUNDERG C M,OSTEOCALCIN.Biochemicalconsideration and clinial applications[J].Clin Orthop RelRes,1987,226(2):267-270.

[6]OWEN TA,ARONOW M,SHALHOUB V,et al.Progres-sive development of the rat osteoblast phenotypein vitro:re-ciprocal relationships in expression of genes associated withosteoblast proliferation and differentiation during formation ofthe bone extracellular matrix[J].J Cell Physio,1990,143(3):420.

大鼠成骨细胞增殖 篇5

1 材料与方法

1. 1 材料

SPF级雌性SD大鼠12 只, 年龄10 周, 体重约200g[第四军医大学实验动物中心], α - MEM培养基和胰蛋白酶 ( Gibco公司) , 胎牛血清 ( 杭州四季青公司) , 茜素红 ( 天津科密欧公司) , 油红, Trizol reagent ( invitroge公司) , 反转录试剂盒 ( Toyobo公司) , β - 甘油磷酸钠, 地塞米松, 维生素C, 3 - 异丁基- 1- 甲基黄嘌呤和吲哚美辛 ( Simgo公司) , 胰岛素 ( 万邦制药) , 大鼠 β - actin, OCN, RUNX2 引物 ( 上海生工) , 大鼠碱性磷酸酶, RUNX2, SP7, β - Catenin, active - β - Catenin, PPAR - γ 抗体 ( Abcam公司) 。

1. 2 方法

1. 2. 1 构建ovx和sham模型: ovx组10 周大鼠麻醉后备皮, 在肋骨下一指宽、脊柱双侧一指半宽处切开, 切除卵巢, 缝合; sham组切开后不摘除卵巢, 其余操作相同。饲养2 个月。

1. 2. 2BMMSC的培养: 全骨髓贴壁培养法。以2× 107个接种于75cm2的培养瓶中, 含10% 胎牛血清的 α - MEM培养基, 至于37℃、5% CO2浓度的培养箱, 24h换液, 细胞生长至80% 传代。收集sham组和ovx组培养液。

1. 2. 3 BMMSC的间接共培养: sham组和ovx组细胞分别接种于6 孔板中, 分为sham ( A) 组、ovx ( B) 组、ovx细胞+ sham培养液 ( C) 组、sham细胞+ ovx培养液 ( D) , 共培养48h。

1. 2. 4 BMMSC成骨成脂能力的检测: 以每孔1 ×105个细胞接种于12 孔板。成骨诱导7d, ALP染色, 成骨诱导21d, 茜素红染色, 观察染色能力; 成脂诱导7d, 油红染色, 镜下观察脂滴形成。

1. 2. 5RT - PCR法检测成骨成脂相关基因表达:成骨诱导7d, Trizol法提取RNA, 反转录, 实时定量扩增OPG, OCN、Runx2; 成脂诱导3d, Trizol法提取RNA, 反转录, 实时定量扩增LPL和PPAR - γ。

1. 2. 6Western blot法检测成骨成脂相关蛋白表达: 成骨诱导7d, Western blot法检测碱性磷酸酶, Runx2, SP7 的表达; 成脂诱导7d, Western blot法检测PPAR - γ 的表达。

1. 2. 7成骨成脂相关通路标志蛋白的检测: Western blot法检测各组成骨成脂诱导中WNT / β - catenin信号通路标志蛋白 β - catenin, Active - β - catenin的表达。

2 结果

2.1骨质疏松模型建成:OVX组大鼠与sham组相比, 骨密度下降明显;sham组骨密度无明显变化。

2.2正常大鼠BMMSC分泌的细胞因子等能够促进OVX大鼠BMMSC成骨分化而抑制其成脂分化

2.2.1正常BMMSC分泌的细胞因子能促ovx细胞成骨抑成脂:茜素红染色结果显示C组颜色较B组颜色深, D组较A组浅 (图1) ;油红染色显微镜下结果显示C组油滴较B组少, D组较A组多 (图2) 。

2.2.2正常BMMSC分泌的细胞因子能促进ovx细胞成骨基因表达:C组成骨基因RUNX2、OCN表达明显高于B组, D组略低于A组;C组成脂基因PPAR-γ、LPL表达明显低于B组, D组略高于A组 (图3) 。

2. 2. 3 正常BMMSC分泌的细胞因子能促进ovx细胞成骨蛋白表达: C组成骨蛋白RUNX2、SP7 明显高于B组, D组略低于A组; C组成脂蛋白PPAR - γ明显低于于B组, D组略高于A组 ( 图4) 。

2. 3 正常细胞分泌的细胞因子等能够激活OVX大鼠BMMSC的WNT/β - catenin通路促进成骨分化同时抑制成脂分化: 成骨成脂中, C组 β - catenin的表达B组与C组差异不明显, C组Active - β - catenin的表达明显高于B组, D组低于A组 ( 图5) 。

3 讨论

研究表明, 雌激素缺乏时, 机体内环境改变, 内源性BMMSC成骨能力下降, 破骨细胞增多, 引起骨改建紊乱, 形成骨质疏松[3~5]。无论骨质疏松症患者及动物模型其BMMSCs的成骨能力都是下降的。如果能够恢复内源性BMMSCs的成骨分化能力能够极大的缓解甚至治愈骨质疏松症。帅逸[1]等通过从大鼠尾静脉系统注射BMMSCs, 发现系统注射正常的BMMSCs能够使相关的成骨基因表达上升, MICRO CT结果显示骨小梁增多且骨密度上升, 这说明系统注射BMMSCs确实能够极大的缓解大鼠骨质疏松症。关于干细胞的研究有很多[6], 干细胞治疗也应经在许多疾病中应用[7], 系统注射BMMSCs后主要转移到肺部, 并且很快就消失[2], 但是BMMSCs的治疗效果会持续很长时间。

正常的BMMSCs能够分泌很多细胞因子[8,9], 本实验结果显示, 去势后大鼠的BMMSC成骨能力降低而成脂能力升高; 加入培养过正常BMMSC的培养液后, 内源性BMMSC的成骨能力增强而成脂能力降低, 这表明正常BMMSC分泌的细胞因子等能够改善内源性BMMSC成骨分化能力同时抑制其成脂能力;成骨成脂诱导后, 同OVX组相比较, 加入正常BMMSCs培养液的C组的WNT经典通路的标志蛋白Active - β - catenin、p - GSK - 3β 表达上升, WNT信号通路的活化程度较OVX组高。前文提到, WNT经典信号通路能够调节BMMSC的成骨成脂分化, 当其激活时, 能够促进BMMSC的成骨细胞分化并抑制其向成脂细胞分化。本实验表明, 正常BMMSC分泌细胞因子, 并且这些细胞因子能够表现出促进内源性BMMSC成骨同时抑制其成脂的效果是通过增强经典WNT信号通路来实现的。本实验阐明了系统注射正常BMMSCs能够恢复内源性BMMSCs成骨分化能力的机制, 为BMMSC系统注射治疗骨质疏松提供了理论基础; 最近的研究表明, 系统注射BMMSC治疗存在风险, 例如, 通过静脉注射MSC可能会引起急性猝死, MSC治疗可能引起肿瘤, 移植物的排异反应, 增加某些疾病的易感性等等。本实验提供了一个新的干细胞治疗的策略, 我们可以使用干细胞分泌的细胞因子来治疗一些相关疾病, 这样可以避免那些干细胞带来的不良反应及其他并发症的危险。干细胞治疗的使用量是比较大的, 而在不影响供体健康的情况下所能提供的细胞数量是有限的, 这样无法避免干细胞在体外扩增, 而且代数可能会比较高。这样问题也随之而来。随着体外扩增, 干细胞代数的增加, 细胞的干性也会随之减弱[10~12], 治疗效果会大打折扣, 并且治疗风险也会大大增加。应用干细胞分泌的细胞因子来进行相关疾病的治疗能够避免这些风险, , 并且解决了干细胞来源少及达到为治疗细胞数量而体外扩增引起代数变高的问题, 为疾病治疗提供了新的减少风险的思路。

参考文献

[1]帅逸.外源性BMMSCs通过改善内源性BMMSCs成骨分化能力缓解去卵巢大鼠骨质疏松[J].基础医学与临床, 2014, 34 (5) :610-614

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[6]张维烨, 李艳君, 陈立强.神经干细胞分化研究进展[J].黑龙江医药科学, 2005, 28 (3) :89-90

[7]Wei X, Yang X, Han ZP, et al.Mesenchymal stem cells:a new trend for cell therepy[J].Acta Pharmacol Sin, 2013, 34:747-754

[8]Helena Kupcova Skalnikova.Proteomic techniques for characterisation of mesenchymal stem cell secretome[J].Biochimie, 2013, 95 (12) :2196-2211

[9]Saraswati S1, Guo Y, Atkinson J, et al.Prolonged Hypoxia Induces Monocarboxylate Transporter-4 Expression in Mesenchymal Stem Cells Resulting in a Secretome that is Deleterious to Cardiovascular Repair[J].Stem Cells, 2015, 33 (4) :1333-1344

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大鼠成骨细胞增殖 篇6

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级新生SD乳大鼠,1日龄,购自南方医科大学动物实验中心,动物许可证号:SYXK(粤)2010-0106。

1.2 药品与试剂

阿魏酸:中国药品生物制品检定所。DMEM培养基:Gibco公司;胎牛血清:杭州四季青生物公司;Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶:Sigma公司;四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO):南京建成生物工程研究所;碱性磷酸酶试剂盒:南京建成生物工程研究所;RT反转录试剂盒、Taq DNA聚合酶、总RNA提取试剂盒:MBI公司产品;骨活素(OA)mRNA聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)试剂:富酶泰斯生物技术有限公司产品;骨保护素(OPG)逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)试剂盒:Fermentas公司。

1.3 实验仪器

超净工作台:北京半导体设备厂;BB16BB5060型CO2培养箱:德国Heraus公司;倒置显微镜:日本Olympus;96孔培养板:美国Costar公司;3K30高速冷冻离心机:Sigma公司;紫外分光光度计:德国Eppendorf公司产品;DYY-III-7B稳压稳流型电泳仪:北京六一仪器厂;定量PCR仪:美国ABI公司;BIO-RAD 680伯乐酶标仪:美国伯乐公司。

1.4 方法

1.4.1 成骨细胞的原代培养

取24 h内新生SD大鼠,75%乙醇浸泡消毒5 min。无菌取出颅骨,置于PBS液中,彻底清除结缔组织和血管,PBS清洗2次,再将骨块剪碎至肉糜状。用0.25%胰蛋白酶37℃预消化15~20 min,去除消化液以清除成纤维细胞,再用10倍体积的0.1%Ⅱ型胶原酶和0.1%透明质酸酶37℃恒温振荡消化,每次30 min,取第3、4、5、6次消化的细胞悬液,300 r/min离心10 min,弃上清,沉淀的细胞用不含血清的DMEM培养液洗涤离心1次,最后用含10%胎牛血清的DMEM培养液重悬,吹打均匀后以1×105·m L-1接种到培养瓶中,培养瓶置37℃5%CO2培养箱培养,隔日换液,以后每3 d换液1次,细胞融合后,用0.25%胰蛋白酶消化,传代倒置显微镜下观察成骨细胞形态。

1.4.2 阿魏酸对体外培养成骨细胞增殖的影响

取第3次代细胞,以5×104·m L-1细胞接种于96孔培养板中,随机分为组空白组(0μg/L)、阿魏酸高剂量组(200μg/L)、阿魏酸中剂量组(20μg/L)、阿魏酸低剂量组(2μg/L),24孔每组,每d更换新的含药培养基1次,分别在加药后第1、2、3、4、5、6 d每组各取4个复孔,加入5 g/L 20μL的MTT,37℃孵育4 h,将孔中液体吸弃然后加入150μL二甲基亚砜(DMSO),置震荡器上震荡10 min,酶标仪570 nm波长处检测吸光度(OD)值。

1.4.3 阿魏酸对体外培养细胞上清液ALP活性、OPG和OA mRNA表达的影响

取第3次代细胞,以5×104·m L-1细胞接种于48孔培养板中,随机分为空白组(0μg/L)、阿魏酸高剂量组(200μg/L)、阿魏酸中剂量组(20μg/L)、阿魏酸低剂量组(2μg/L),每组24孔,然后每瓶分别加入不同浓度0(空白对照)、2、20、200μg/L阿魏酸的条件培养液,每浓度8孔。每d更换新培养基1次,分别在加药第6 d每组各取16个复孔,取上清液ELISA法测定ALP活性。剩余细胞提取总RNA后RT-PCR测定成骨细胞OPG mRNA和OA mRNA的表达,扩增产物凝胶电泳后摄片,然后进行光密度扫描,并以吸光度的比值表示。

1.4.4 统计学方法

计量资料以均值±标准差(±s)表示,多组间均数的比较采用单因素方差分析,若方差齐,组间均值两两比较采用SNK法,若方差不齐,组间均值两两比较采用Dunnett T3法,均由SPSS15.0进行统计;α=0.05。

2 结果

2.1 阿魏酸对大鼠成骨细胞体外增殖的影响

见表1。

由表1可知,体外培养的大鼠成骨细胞1~6 d内呈“S”型曲线增殖,阿魏酸高、中、低3个剂量组均可明显促进成骨细胞的增殖。与空白组相比,除阿魏酸低剂量组给药后第1d细胞吸光度均值与空白组无显著性差异(P>0.05)外,中、高剂量组药后第1 d细胞吸光度均显著增加(P<0.05,0.01),阿魏酸高、中、低剂量组药后2~6 d细胞吸光度均有显著性增加(P<0.01)。

与空白组比较*P<0.05,**P<0.01

2.2 阿魏酸对成骨细胞碱性磷酸酶活性、OPG和OAmRNA表达的影响

见表2。

由表2可知,与空白组比较,阿魏酸高、中、低3剂量组均可不同程度增强体外培养大鼠成骨细胞的ALP活性,促进OPG和OA mRNA的表达(P<0.05)。

与空白组比较*P<0.05,**P<0.01

3 讨论

成骨细胞位于骨组织表面,由间叶质干细胞分化而来,是骨新生以及损伤后修复重建过程中骨生成的唯一效应细胞,可产生胶原、非胶原性骨基质蛋白(如骨钙素等)和细胞因子如骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins,BMP)等,还可以通过线粒体将钙和敷料运送到钙化部位,促进钙化发生,是参与骨代谢的主要细胞[4]。ALP是主要分布于细胞膜的钙结合转运蛋白,可促进细胞成熟、钙化[5],是成骨细胞早期和中期分化的标志物。成骨细胞不仅参与骨形成,而且通过产生核因子κB受体激动剂配体(ligand of receptor-activator of nuclear factor-kappa B,RANKL)、骨保护素(OPG)等多种信号分子,其中OPG通过与RANKL结合,竞争性抑制了RANKL与破骨前体细胞膜上核因子κB受体活化因子(receptor-activator of nuclear factor-kappa B,RANK)分子的结合,抑制破骨细胞的分化、成熟,阻止骨吸收[6],骨细胞树突表达的膜结合的RANKL和破骨前体细胞表达的RANK的直接接触被认为是破骨细胞分化所需要的[7]。骨活素(OA)mRNA和蛋白表达于成骨细胞[8],是成骨细胞的分化所必需,可诱导成骨细胞生长及破骨细胞分化[9],OA表达增加可促进颅骨缺损模型大鼠的骨再生[10]和骨折愈合[11],OA下调则可降低成骨细胞分化和功能[12]。体外培养成骨细胞在骨代谢研究中的作用非常重要,常用于研究骨代谢机制及药物筛选[13]。

阿魏酸钠是我国自行研发的一类新的啡肽类内皮素受体拮抗剂,普遍存在于当归、川芎、蜂胶、酸枣仁等中药中[14]。本研究证实阿魏酸可促进体外培养大鼠成骨细胞的增殖,增强成骨细胞ALP活性,并诱导OPG mRNA和OAmRNA的表达,提示阿魏酸能通过促进成骨细胞增殖与分化,并刺激成骨细胞骨代谢,促进骨蛋白质合成和钙沉积,促进骨形成。这与阿魏酸钠关节腔注射可促进关节炎模型大鼠退变软骨修复[15],以及与成骨诱导剂合用促进骨髓基质干细胞的成骨分化与增殖、提高骨髓基质干细胞ALP活性和细胞内骨钙素含量[16]的结果相符,也有研究证实阿魏酸可作用于成骨细胞和破骨细胞的骨吸收阶段,增加去卵巢骨质疏松大鼠的骨密度和ALP活性,促进骨生成和骨重塑[17]。

大鼠成骨细胞增殖 篇7

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物SPF级雌性SD大鼠65只,其中3月龄60只,体重255~290 g,1月龄5只,体重90~95 g, 购于上海斯莱克实验动物有限责任公司[许可证号: SCXK(沪):2007-0005;合格证号:2007000532861]。

1.1.2主要仪器CO2培养箱(BB16/BB5060型;美国Thermo公司)、超微量蛋白核酸酶分析仪(ND-2000C型;美国Thermo公司)、倒置显微镜(Olympus IX70;日本Olympus株式会社)、多用电泳仪(DYY-12型;美国Bio-Rad公司)、凝胶成像系统(GEL DOC2000;美国Bio-Rad公司)、PCR仪(S1000型;美国Bio-Rad公司)、PVDF膜(美国Bio-Rad公司)。

1.1.3主要试剂LG-DMEM培养基、胎牛血清、0.25% 胰蛋白酶购于美国Hyclone公司;SD大鼠BMSCs成骨诱导分化培养基购于广州赛业生物科技有限公司; 茜素红-S粉购于美国Sigma公司;Axin-2、Fzd-2和 β-actin兔抗大鼠单克隆蛋白抗体购于美国CST公司;BCA蛋白分析试剂盒购于美国Pierce公司。

1.1.4实验药物龟鹿二仙胶由鹿角胶6 g、 龟甲9 g、 枸杞子9 g、人参6 g组成,药材选用培力药业有限公司“农本方”浓缩中药配方颗粒,各药物浓缩比例及人与大鼠体表面积换算[6]后的等效剂量见表1。

1.2实验方法

1.2.1龟鹿二仙胶含药血清制备60只3月龄大鼠从腹腔入路切除双侧卵巢,分为A、B两组,各30只。 术后第二天开始8∶00 am和2∶00 pm灌胃,A组灌服人等效剂量的龟鹿二仙胶[1080 mg/(kg·d)],B组灌服等容积生理盐水,连续7 d。 最后一次灌胃2 h后腹主动脉取血,1000 r/min离心15 min后取上层血清并将同组血清混合,56℃水浴灭活,0.22 μm滤器过滤后分装,-20℃保存备用。

1.2.2 BMSCs分离及培养1月龄SD大鼠断颈法处死后,75%乙醇浸泡5 min,游离股骨和胫骨并显露骨髓腔, 用含10%胎牛血清的LG-DMEM培养基反复冲洗骨髓腔,200目滤网过滤冲洗液,置于CO2培养箱记为F1。48 h后首次全量换液,后每2天换液,至细胞融合80%~90%时传代。 首次传代时,计数并调整细胞浓度,以1×105个/瓶传至25 m L培养瓶,后每2天换液,至融合80%~90%时1∶4比例传代,至F3代。

1.2.3 BMSCs形态观察自F1代开始,倒置显微镜每天观察BMSCs生长情况。

1.2.4 MTT法检测龟鹿二仙胶含药血清对BMSCs增殖影响F3代细胞以4×103个/孔密度传至96孔培养板,细胞分组及干预条件,见表2。 细胞贴壁后血清饥饿24 h,加入相应条件培养基1 d后,每组取8孔,每孔加入浓度为5 mg/m L的MTT液,37℃孵育4 h,吸除残余MTT液,每孔加入100 μL的DMSO溶解淡蓝色结晶,570 nm波长测OD值,连测8 d,观察龟鹿二仙胶含药血清对生长曲线的影响并选择促进增殖作用最明显的浓度进行后续实验。

1.2.5龟鹿二仙胶含药血清对BMSCs成骨分化的影响F3代细胞以1×104个/孔接种于6孔培养板,将细胞分为10% FBS(LG-DMEM+10%胎牛血清)组、10% KB (LG-DMEM+10% 大鼠空白血清) 组、10% GLEX (LG-DMEM+10%龟鹿二仙胶含药血清)组和Classica [LG-DMEM+10%胎牛血清+地塞米松(1×10-8mol/L)+ β-甘油磷酸钠(10 mmol/L)+维生素C(50 mg/L)]组饥饿24 h后更换条件培养基,每2天全量换液。

1.2.6碱性磷酸酶(ALP)比活性检测细胞培养第7 14、21天后,比色法测细胞培养液ALP活性。 按试剂盒操作说明测各管吸光度值, 计算各测试管ALP活性。 另用紫外分光光度计以595 nm波长测OD值,测定蛋白浓度(mg/L),ALP比活性(U/mg)=ALP浓度/总蛋白浓度。

1.2.7 BMSCs钙结节染色诱导21 d后,PBS洗涤细胞,10%福尔马林固定45 min,蒸馏水缓慢冲洗2遍, 晾干后每孔加入新鲜配制的茜素红-S染液(p H=4.2) 1 m L,37℃遮光孵育30 min,蒸馏水反复冲洗,干燥后显微镜下观察并拍照。

1.2.8 RT-PCR法检测Fzd-2和Axin-2基因的表达诱导21 d后,Trizol法提取细胞总RNA, 测定浓度后取总RNA 1 μg,用Revert Aid TM c DNA第一链合成试剂盒,20 μL反应体系逆转录为c DNA为PCR模板。 PCR反应体系为20 μL, 由Dream Taq Green PCR Master Mix(2×) 10 μL、nuclease-free Water 8.2 μL、 前后引物各0.4 μL和c DNA 1 μL组成。 上海生工生物工程有限公司合成引物,见表3。 反应条件:94℃预变性3 min,94℃变性30 s,退火,72℃延伸45 s,完成各自循环后,72℃再延伸10 min。 取PCR产物5 μL行琼脂糖凝胶电泳20 min, 以Image Lab 3.0软件分析图像,以目的条带和内参GAPDH的灰度值比值进行分析。

1.2.9 Western blot法检测Fzd-2和Axin-2蛋白的表达诱导21 d后提取细胞总蛋白,BCA法测蛋白浓度。 蛋白变性每孔取20 μg,聚丙烯酰胺凝胶电泳,TBST液洗涤后室温封闭1 h,加入稀释后的兔抗大鼠Fzd-2(1∶200)、Axin-2(1∶1000)、β-actin(1∶1000)一抗,4℃摇床过夜后湿式转膜,TBST洗涤,加入二抗,室温孵育1 h。 TBST洗涤后将PVDF膜置于显影垫片, 在PVCF膜蛋白面滴加显影液,1 min后显影。 美国UVP分析仪对胶片扫描, 目标蛋白灰度值与 β-actin灰度值之比作为目的蛋白表达水平的相对值。

1.3统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析,计量资料数据用均数±标准差(±s)表示,组间比较用单因素方差分析,两组间比较采用t检验;计数资料用率表示,以P < 0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 BMSCs形态学观察

3~4 d后可见少许细胞贴壁,呈细长外形,部分有突起。 6~8 d后,细胞簇状生长,10 d左右细胞形态均一,按一定方向紧密排列,呈典型旋涡状。 传代细胞增殖快,每5~6天即可铺满瓶底。 至F3代时,细胞形态一致,均匀贴壁于瓶底。 见图1。

2.2龟鹿二仙胶含药血清促进BMSCs增殖和成骨分化

2.2.1 MTT结果除DMEM组外,其余各组OD值自第2天起即显著增高, 其中10%的GLEXJ组增高明显,显著高于其余各组,说明10%浓度的龟鹿二仙胶含药能促进BMSCs增殖。 见图2。

2.2.2 ALP比活性的比较各组细胞ALP比活性随时间延长而增高, 且10%的GLEXJ组和Classical组显著高于10%的KB组和10%的FBS组,差异有统计学意义(P < 0.05),随着培养时间的延长,该两组细胞培养液ALP比活性增加更明显,差异有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01), 但10%GLEXJ组ALP比活性与Classical比较,差异无统计学意义(P > 0.05)。 见图3

2.2.3钙结节染色10%FBS组和10%KB组细胞因互相重叠致形态不规则,茜素红染色未见钙结节形成。10%GLEXJ组和Classical组细胞密度大,梭形外观不明显,细胞重叠,形状、排列极不规则,呈明显的团簇样聚集,茜素红染色可见数个明显的橘红色钙结节着色(白色箭头)。见图4(封三)。

2.3 Fzd-2和Axin-2 m RNA的表达10%GLEXJ组Fzd-2 m RNA表达水平显著高于10%FBS组、10%KB组和Classical组, 差异有统计学意义(P < 0.05),而10%KB组、10%FBS组和Classical组之间无显著性差异(P > 0.05)。 10%GLEXJ组Axin-2 m RNA的表达水平显著低于10%FBS组、10%KB组和Classical组,差异有高度统计学意义(P < 0.01)。 见图5。

2.4 Fzd -2和Axin -2蛋白表达10% GLEXJ组Fzd-2蛋白表达显著高于10%FBS组、10%KB组和Classical组,差异有高度统计学意义(P < 0.01),而10% FBS组、10% KB组和Classical组间无显著性差异10%GLEXJ组和Classical组Axin-2蛋白水平显著低于10%FBS组和10%KB组,差异有统计学意义(P < 0.0或P < 0.01);10%GLEXJ组Axin-2蛋白表达水平显著高于Classical组,差异有统计学意义(P < 0.05)。 见图6。

3讨论

中医认为“肾藏精,精生髓,髓养骨”,肾精和骨之间关系密切。 女性绝经后肾中精气衰微致使骨骼失去濡养引起“骨痿不能起于床”、“腰脊不举”等[7,8],与现代医学中骨质疏松症临床表现相似[9,10], 而骨质疏松症的发生与BMSCs关系密切。 研究表明“补肾”中药具有“壮骨”功能,推测其与促进BMSCs增殖[11]作用相关。本实验结果显示浓度为10%的龟鹿二仙胶含药血清具有促进BMSCs增殖的作用, 说明龟鹿二仙胶增加骨密度的作用与其增强BMSCs增殖有关。

同时,BMSCs可在体内某些因素的作用下向成骨细胞分化,并参与和维持骨的构建过程[12,13]。 “补肾”中药除了能促进BMSCs增殖外, 还能诱导其向成骨细胞分化[1,2]。 本研究结果显示龟鹿二仙胶含药血清组ALP比活性显著增高,茜素红染色可见橘红色钙结节形成, 表明龟鹿二仙胶含药血清能诱导BMSCs向成骨细胞分化。 而在BMSCs向成骨细胞分化过程中,受多条信号通路[14,15,16]的调控。 研究表明,Wnt/β-catenin信号通路可通过诱导成骨细胞分化方式促进骨形成[17]且中药可通过对该通路相关因子基因和蛋白的表达的影响参与BMSCs成骨分化的过程[18,19]。 在Wnt/β- catenin信号通路中,Fzd是一种跨膜蛋白, 与通路的激活密切相关,而Axin-2与BMSCs成骨分化关系密切,敲除Axin-2基因能增加骨祖细胞、增加成骨标志物表达并能加速骨化[20]。 本实验中龟鹿二仙胶含药血清诱导BMSCs向成骨细胞分化过程中,Fzd-2 m RNA和蛋白表达水平显著升高, 而Axin-2活性受到显著的抑制。 所以,龟鹿二仙胶可通过调控Fzd-2和Axin- 2的活性激活Wnt/β-cateinin信号通路促进BMSC向成骨细胞分化。