大鼠主动脉平滑肌细胞

大鼠主动脉平滑肌细胞（通用7篇）

大鼠主动脉平滑肌细胞 篇1

摘要：目的改进大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)的培养方法。方法采用机械刮除、差异贴壁等手段进行组织贴块法原代培养,胰蛋白酶消化传代,并应用相差显微镜和即用型SABC免疫组化染色试剂盒对细胞进行形态学和免疫组化鉴定。结果镜下培养细胞呈典型的“谷-峰状”生长,免疫组化染色显示胞浆内α-actin阳性表达。结论本法可获纯度高、结构和功能良好的VSMCs。

关键词：血管平滑肌细胞,细胞培养,大鼠

血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)是构成血管壁组织结构及维持血管张力的主要细胞成分之一。目前认为,VSMC从血管中膜迁移到内膜、增殖并分泌大量的细胞外基质而使内膜增生是动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄等病理过程发生的主要机制[1]。因此,获得良好生长状态的离体VSMC是研究其生物学行为的基础。本文参考有关研究报道,进行适当改进,运用组织贴块法、胰蛋白酶消化法进行细胞的原代及传代培养,应用多种方法纯化细胞,成功培养出纯度高、结构和功能良好的VSMCs,为相关研究提供实验材料[2,3,4]。

1 材料与方法

1.1 实验动物

Wistar大鼠,雌雄不限,体重(150±10) g,购于汕头大学医学院实验动物中心。

1.2 仪器与试剂

DMEM(高糖型)培养基、胰蛋白酶粉(1∶250),均购自Hy-Clone公司;标准胎牛血清购自杭州四季青公司;青霉素钠、硫酸链霉素购自华北制药厂;兔抗大鼠α-actin单克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司,中国);即用型SABC免疫组化染色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司,中国)。

1.3 细胞培养

大鼠用10 g/L戊巴比妥按1 mL/100 g体质量腹腔注射麻醉,仰卧固定在超净工作台上。用0.78 mol/L硫化钠脱毛,碘伏充分消毒皮肤。沿腹中线剖开胸腔、腹腔,剪开膈肌,翻开左侧肺叶,可见在脊柱前走行的胸主动脉。小心分离取出主动脉放在洁净的平皿中,加入含体积分数20%标准胎牛血清的培养基反复冲洗去除血污。用两把眼科镊轻轻夹住血管向相反的方向稍用力牵拉,呈袖套样剥除外膜。更换平皿,清洗血管。固定血管一端,用眼科剪纵行剖开血管。将血管铺开,内膜面向上,用棉签刮去血管内膜及血迹、脂肪滴等杂质,再次用培养基冲洗。此时可见血管中膜为白色,有一定的韧度。血管中膜的主要成分为VSMC,将其剪成约1 mm×1 mm×1 mm的组织块,边缘整齐、光滑,均匀贴放于25 cm2培养瓶底面,间隔约5 mm,向培养瓶内加入约4 mL含体积分数20%胎牛血清的培养基(不接触组织块),并滴2～3滴于组织块上,使其保持湿润。将培养瓶细胞面向上,放入37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中,稍微松开瓶口(使CO2能够进入瓶中)。静置1.5 h～3.0 h,轻轻翻转培养瓶使组织块浸没在培养基中,继续培养。静置3 d后视细胞状态给予换液,待细胞生长至约90%融合时给予传代。

1.4 细胞换液

在超净工作台上,吸弃原培养基,用PBS轻轻冲洗后,加入新鲜的含体积分数20%胎牛血清的培养基继续培养。动作应轻柔,尽量不要碰到组织块。周期为2 d～3 d。

1.5 细胞传代

在超净工作台上,小心吸弃原培养基,加入PBS 2 mL轻晃培养瓶冲洗细胞,吸弃,加入2.5 g/L胰蛋白酶2 mL,37 ℃消化约40 s。倒置显微镜下见细胞回缩、变圆、折光性增强,立即吸弃胰蛋白酶。加入PBS 4 mL冲洗残余胰蛋白酶,吸弃。加入含体积分数10%胎牛血清的培养基4 mL终止消化。盖好瓶盖,对称拍打培养瓶侧壁,使大部分细胞脱落,然后轻轻吹打瓶壁细胞使其完全脱落,形成的细胞悬液按1∶2或1∶3接种。周期为5 d～7 d。首次传代时,脱落的组织块可以转移到新的25 cm2培养瓶中,按原代培养的方法使组织块重新贴壁。

1.6 细胞纯化

1.6.1 自然纯化法

由于进行了前期的血管预处理(去除了大部分内膜和外膜组织),原代培养时虽为多种细胞混杂生长,但平滑肌细胞仍占绝大多数。随着传代次数的增加,平滑肌细胞可排挤其他细胞的生长而优势增殖。

1.6.2 机械刮除法

虽然去除了大部分内膜组织,但培养中仍可见内皮细胞的小范围生长。传代前在镜下用记号笔在培养瓶表面划出内皮细胞生长区域,用弯头吸管在该区域内反复推刮、破坏细胞,吸弃培养液后再进行传代。

1.6.3 差异贴壁法

残留的内膜和外膜组织中含有少量的成纤维细胞,为了去除残留的成纤维细胞,在传代时,将消化吹打形成的细胞悬液静置15 min,使部分细胞贴壁,转移培养液至下一个培养瓶中,再次静置、贴壁,重复上述步骤1次或2次,最后一个培养瓶中可获较纯的平滑肌细胞。

1.7 细胞鉴定

将第5代对数生长期的细胞悬液接种到置有盖玻片的六孔板中。待细胞基本长成单层后,取出盖玻片,PBS清洗,4%多聚甲醛室温下固定15 min,PBS再次清洗。根据即用型SABC免疫组化染色试剂盒说明书逐条进行操作(一抗是兔抗大鼠平滑肌肌动蛋白单克隆抗体)。传代细胞成活率的检查取消化传代的细胞悬液9 mL,加入1 mL 0.4%台盼蓝液,混匀后吸取1滴于血球计数板上,3 min之内在显微镜下分别计数活细胞和死细胞。

2 结 果

2.1 原代培养

原代培养第4天～第7天,在倒置显微镜下可观察到少量细胞以垂直方向自组织块边缘游出,渐向外生长形成细胞晕,进而形成细胞簇,且形态多样(梭形、多角形、星形或不规则形),大小略有差异。此后细胞呈放射性生长,至培养2周～3周左右局部成束的细胞平行排列,部分区域细胞多层重叠,部分区域高低起伏呈“峰、谷”状生长。传代后80%～90%的细胞可重新贴壁生长,其生长方式及形态特点同前。

2.2 传代细胞生长状况

原代细胞一般2周余可长满瓶壁且形成致密单层,这时可进行首次传代。胰蛋白酶将消化细胞呈圆形,根据传代时比率不同,24 h～72 h内又可长满瓶壁,继续传代培养。随着传代次数的增加和反复的人工纯化,平滑肌细胞越来越占据优势,5代后纯度可达98%以上。平滑肌细胞在传代过程中形态变化不大,连续培养多代仍可保持较好状态。

2.3 平滑肌细胞的鉴定

培养第5代细胞经特异的平滑肌肌动蛋白免疫细胞化学染色后,高倍镜下可见胞质内大量棕色、与细胞长轴平行的纤维细丝,即平滑肌α肌动蛋白丝。核卵圆形居中,呈淡蓝色。

2.4 台盼蓝结果

共计数1 053个细胞,其中51个为阳性,约有95%以上的细胞染色呈阴性,表明培养的细胞消化传代后成活率较高。

3 讨 论

细胞培养主要分为原代培养和传代培养两大类。目前国内细胞库中没有动物或人的正常血管平滑肌细胞株,国外虽有,但价格昂贵,因此均采用原代法培养。常用的方法有酶消化法和组织块法:酶消化法培养周期短,但酶作用时间不易掌握,且消化酶本身对细胞有毒性作用,可致培养失败;组织块法虽培养周期相对较长,但操作简便,污染机会小,培养效率高[5]。本研究采用组织块培养法。细胞培养前的准备工作繁多,包括培养用液的选择、过滤、分装,特殊成分的添加,手术器械、培养器皿的收集、清洗、消毒等,我们的体会是不要忽略每一个细节。例如:外购的培养基中通常需要加入适当比例的Na2CO3,它的作用并非完全是调节溶液的pH值,同时还与培养箱中的CO2形成缓冲对,维持溶液pH值的稳定,因此不能用其他碱如NaOH代替。又如:不同种类的培养基、血清的质量和浓度、特殊成分的添加与否都对细胞的生长有较大影响,因此应根据既有资料和实际需要进行全面评价和选择[6]。

细胞培养的几点技巧:①细胞生长具有接触抑制和密度依赖性,取2只或3只大鼠的胸主动脉组织块必须均匀接种于25 mL培养瓶中,间隙约2 mm ～3 mm。当部分组织块周围细胞密集、重叠,停止增殖时,即使整瓶细胞未达到传代标准,仍可用酶消化,吹散密集细胞,1∶1方式传代生长。②原代培养初期,当部分组织块漂浮未贴壁,可将其重新摆放至瓶底,翻转干涸2 h～3 h后,再浸没于培养液中,使其重新贴壁。该法不会影响同瓶中其他已萌出的细胞的生长。③取材时,因其胸主动脉较细,操作时动作一定要轻柔,避免对血管的过度损伤。一般受牵拉少,剪切时边缘整齐圆滑的组织块萌出细胞的概率较大。④细胞传代时,酶消化时间不应固定或硬搬他人经验,应在镜下观察至胞质回缩,间隙增大时及时终止消化。细胞培养的关键之一是无毒和无污染。由于重视每个工作环节,本实验在培养中仅发生过3次小范围污染,2次为真菌,1次为支原体。真菌污染时,肉眼可见淡黄色或白色的漂浮物,镜下显示纵横交错的丝管状菌丝。有报告称:用双层0.22 μm混合纤维素酯滤膜过滤可有效去除污染的真菌[7]。支原体污染时培养液未浑浊,但镜下可见圆形或梨形的微小颗粒,细胞变粗糙,胞浆内有较多的颗粒状物质,细胞停止增殖。支原体的检测方法有多种,巢式PCR法为不错的选择,该法快速、简便、灵敏度高[7]。细胞原代培养另一常见的问题是其他细胞的污染,如何进行高质量的细胞纯化是众多培养者面临的难题。正常动脉血管分为3层:内膜由单层内皮细胞、少量平滑肌细胞及胞外基质构成,中膜层唯一的细胞成分是平滑肌细胞,外膜有成纤维细胞和平滑肌细胞。本研究综合运用了3种方法纯化细胞,效果良好。首先对接种前的动脉进行了预处理,尽量刮去外膜和内膜层,保证接种的组织块中平滑肌细胞占绝对优势,为细胞的自然纯化打下了基础。然后用机械刮除法去除了小范围生长的特殊形态的内皮细胞。而成纤维细胞与平滑肌细胞形态上难以鉴别,利用二者贴壁的时间差,反复贴壁去除了成纤维细胞。最终5代左右平滑肌细胞的纯度达98%以上。

参考文献

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[5]梁若斯,陈德.成人动脉平滑肌细胞体外培养模型的建立[J].中国现代医学杂志,2002,12(10):31.

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[7]周晓莉,雷寒,柳青.血管平滑肌细胞的培养及鉴定[J].重庆医学,2005,34(6):877-879.

大鼠主动脉平滑肌细胞 篇2

1 材料与方法

1.1 实验动物清洁级健康SD雌性大鼠,(2~3)月龄,体重150 g~200 g,由武汉大学医学部实验动物中心提供。

1.2 主要试剂DMEM/F-12 液体培养基(Gibco公司)、青霉素(Amresco公司)、链霉素(Amresco公司)、Ⅱ型胶原酶(Worthington Biochemical公司)、β-巯基乙醇(Sigma公司)、谷氨酰胺(Thermo公司)、炭吸附特级胎牛血清(Biological Industries公司)、兔抗平滑肌肌球蛋白重链抗体(Abcam公司)、Hoechst(Sigma公司)、FITC标记的山羊抗兔IgG抗体(Beyotime公司)等均通过商品化途径购置。

1.3 SMC的原代培养按0.25 mL/100 g腹腔注射2%戊巴比妥钠,待大鼠麻醉后,无菌条件下迅速分离大鼠主动脉,置于盛有无菌D-Hank’s液(4 ℃预冷)的培养皿中清洗3次,清洗过程中同时剔除血管表面的脂肪组织、结缔组织以及血凝块。将主动脉转移至另一洁净盛有无菌D-Hank’s液(4℃预冷)的培养皿中,眼科剪剪开血管,无菌棉签沿血管纵轴来回擦拭主动脉内膜3次,以去除血管内皮细胞。从D-Hank’s液中取出主动脉,放入含有1 mL0.2% Ⅱ 型胶原酶的EP管中,置于37℃水平摇床中消化12 min。显微镊小心撕下血管中膜,置入盛有完全培养基的培养皿中,用显微剪将中膜剪成1 mm×1 mm大小碎片,均匀摆置铺平于T25细胞培养瓶瓶底并在瓶内侧壁加入3 mL含10%胎牛血清的完全培养基。将培养瓶侧放竖立(见图1a)于37℃恒温、饱和湿度、5%CO２培养箱内放置1h,然后翻转T25培养瓶使瓶底朝上(见图1b)再静置1h~1.5 h。待观察到组织块稍变干与培养瓶底黏附后,缓慢将培养瓶翻转平放(见图1c),绝对静置培养箱内3 d~5 d,期间禁止震荡或移动培养皿,以防贴壁的组织碎片脱落。5 d后每日用相差倒置显微镜观察细胞生长情况。

1.4 SMC的传代培养及纯化当细胞生长达到亚融合状态(约80%融合)时即可进行传代培养。弃去旧培养基,37℃预热的无菌D-Hank’s液清洗细胞表面3次,清洗过程中晃动培养瓶以除去组织块和残余的血清。吸尽D-Hank’s液后,在细胞表面均匀地加入0.125%胰酶和0.02%EDTA的混合液600μL,37℃ 条件下消化3 min。待显微镜下观察到大部分细胞收缩变圆从皿底脱落后,立即加入1.5 mL完全培养基中止消化反应,离心后按照1∶3的比例分瓶培养。

由于培养的细胞中可能含有成纤维细胞混杂生长,因此可采用差异贴壁法纯化中膜SMC［４］。即在传代时将细胞悬液静置(15~25)min,使成纤维细胞贴壁,转移培养液至另一个培养瓶中,再次静置贴壁,重复上述步骤(2~3)次即可获得纯化的平滑肌细胞。

1.5 SMC的鉴定将传代时制备好的细胞爬片置于24孔板内,0.1 mol/L PBS浸洗细胞爬片5 min×3次;然后4% 多聚甲醛室温固定10 min,PBS浸洗5min×3次。0.1%Triton X-100室温孵育10 min,PBS浸洗细胞爬片5 min×3次。5%BSA室温封闭30 min后吸尽封闭液,按照1∶50比例稀释一抗(兔抗平滑肌肌球蛋白重链抗体),每张爬片滴加50μL一抗,4℃湿盒内孵育过夜。次日,PBS浸洗细胞爬片5 min×3次,按照1∶200比例稀释带荧光的二抗(FITC标记的山羊抗兔IgG抗体),湿盒内避光条件下室温孵育2 h。每张爬片滴加20μL Hoechst染核2 min,PBS浸洗后甘油封片,荧光显微镜下采集图像。阳性染色以胞质出现绿色为标准,选择着色均匀的区域,在荧光显微镜40倍视野下计数绿色细胞占该视野细胞总数的百分比。每张切片选择6个视野,每组取6张切片,计算平均值。

2 结果

2.1 SMC体外培养生长状况改良的组织贴块法成功培养出大鼠血管壁中膜SMC,3 d~5 d见细胞从组织块边缘迁移萌出,细胞体积小,形态不一,大部分呈长梭形,少量呈三角形或不规则形,折光性强,胞质丰富。约7 d~9 d细胞生长致密成层,融合成片,呈典型“峰-谷”样生长状态时即可传代(见图2)。

a:原代培养第4天见组织块旁少许细胞爬出(×10)b:原代培养第4天见爬出的细胞大部分呈长梭形,折光性强,胞质丰富(×20)c:原代培养第7天见细胞呈典型“峰-谷”样生长(×40)

2.2 SMC的鉴定培养的第3代SMC经平滑肌特异性蛋白-平滑肌肌球蛋白重链(smooth muscle myosin heavy chain,SM MHC)免疫化学染色后,正置显微镜下见SM MHC沿细胞纵轴呈肌丝状整齐排列于细胞质内,胞质呈绿色,细胞核呈卵圆形居中,阳性细胞率在95%以上(见图3),这表明本方法分离培养的SMC纯度高。

a:绿色荧光表示SM MHC呈肌丝状整齐排列于细胞质内(FITC标记)b:蓝色荧光表示Hoechst染核c:a和b的融合图

3 讨论

血管壁中膜SMC原代培养的方法主要有酶消化法和组织贴块法,酶消化法由于受中膜组织需求量大、得率低、消化步骤多、酶作用时间难以掌控、污染概率高等因素的影响[5],限制了其广泛应用。目前,国内广泛应用的是组织贴块法,组织贴块法具有经济实用、操作简单、细胞活性好、得率高等优点,不足之处是培养周期长。本研究在传统组织贴块法基础上通过反复实践,并借鉴前人的经验,经过改良不仅缩短了培养周期,而且获得纯度较高的SMC。现就关键环节做以讨论。

3.1动物及麻醉方式的选择众所周知,年幼大鼠的组织块具有更强的增殖潜能,原代培养成活率更高,但体重太小的大鼠取材困难且细胞得量少[6]。经过反复摸索,本课题组认为选取(2~3)月龄、体重(150~200)g大鼠最为适宜,这样既方便操作,又保证细胞未过于老化。传统方法采用颈椎脱臼处死大鼠,这可能导致大鼠处死过久尚未完成取材。本研究采用麻醉动物的方法不仅减少了动物的痛苦,而且保证了组织的活性,减少组织变性,从而确保细胞活力。

3.2 取材要迅速并严格执行无菌操作加强取材训练,尽量在30 min内完成从取材到贴壁的全过程,减少细胞活性的降低。麻醉后的大鼠用70% 酒精消毒皮肤,剪开皮肤后更换一套消毒的器械,打开胸腔后再更换一套;获取大鼠主动脉时,采用消毒后纱布保护肺,避免损伤肺引起污染。

3.3 彻底去除血管内、外膜用棉签擦拭内膜避免内皮细胞的污染,分离中膜,去掉外膜,避免了外膜成纤维细胞的污染。同时在传代时采用差异贴壁法进一步纯化了中膜SMC,保证细胞的高纯度。

3.4 组织碎片的选取及翻瓶方法组织碎片一定要“剪”而不能“撕”,剪切时要轻柔,大小以1 mm×1 mm为最佳。组织碎片过小,操作频繁且损伤细胞较多,不利于其生长;组织碎片过大,SMC因营养摄取不足而迁出困难。组织碎片移入T25培养瓶后,文献多报道将有组织碎片的培养瓶底面朝上静置(2~3)h后再翻转培养瓶,使组织碎片与培养基接触。本课题组在实验中发现采用这种方法(2~3)h后组织碎片周围仍然很潮湿,组织碎片不能很好贴于瓶底,翻瓶后有多数组织碎片飘起。于是,改进为将培养瓶侧放竖立于培养箱内1 h,利用液体重力作用使瓶底和组织碎片周围的液体流至瓶底,然后翻转T25培养瓶使瓶底朝上再静置(1~1.5)h后,缓慢将培养瓶翻转平放。这样不仅减少翻瓶的等待时间(时间太长组织会干涸),而且飘起的组织碎片极少。因此,组织碎片能够尽早接触培养基,有利于细胞更早迁出［７］。

本研究对传统的中膜SMC原代培养进行了改良,获得了较为理想的结果,该方法能为动脉粥样硬化等心血管疾病的病因、病理生理机制及防治研究提供理想的实验材料。

摘要：目的 探讨一种方便、快捷、大量原代培养大鼠血管壁中膜平滑肌细胞的方法,为心血管疾病的体外研究提供可靠的实验材料。方法 利用改良的组织贴块法进行血管壁中膜平滑肌细胞原代培养,使用倒置相差显微镜观察细胞形态,并用免疫荧光染色鉴定分离培养的细胞。结果 改良的组织贴块法成功培养出大鼠血管壁中膜平滑肌细胞,3 d5 d可见细胞爬出,7 d9 d即可传代。镜下见细胞以长梭形为主,呈典型“峰-谷”样生长,免疫荧光染色鉴定阳性细胞率在95%以上。结论 本研究介绍的改良组织贴块法技术成熟,具有操作简单、方便等优点,使用该法不仅可以获得纯度高、活性好的血管中膜平滑肌细胞,而且缩短了培养周期。

关键词：血管壁,中膜,平滑肌细胞,原代培养

参考文献

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[3]Rivard A,Andres V.Vascular smooth muscle cell proliferation in the pathogenesis of atherosclerotic cardiovascular diseases[J].Histol Histopathol,2000,15(2):557-571.

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[5]倪伟,刘涛,王浩宇,等.酶联合消化法培养小鼠主动脉平滑肌原代细胞[J].西部医学,2013,25(7):968-970;973.

[6]张浩,王志维,吴红兵,等.大鼠血管平滑肌细胞的培养和鉴定[J].武汉大学学报(医学版),2014,(3):378-380.

大鼠主动脉平滑肌细胞 篇3

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

清洁级雄性SD大鼠40只,体质量(80±5)g,由徐州医学院实验动物中心提供。

1.1.2 主要试剂

卵蛋白(OVA)(美国Sigma公司);LP(美国Alexis公司);总RNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司);RT-PCR试剂盒(美国Promega公司);大鼠β-actin引物(上海生工生物工程技术服务有限公司);GR-β抗体(美国Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 肥胖模型的复制

适应性饲养1周后将40只大鼠随机分为正常体质量组及肥胖组,每组均20只。正常体质量组喂食基础饲料,肥胖组喂食高能饲料。饲料配方参照美国官方分析化学家协会(AO AC)实验大鼠饲料配方及实验大鼠合成饲料配方(AIN-93),并根据实际情况适当调整[8]。喂食之前,所有饲料均需经过高温灭菌处理。

1.2.2 哮喘模型的复制

将正常体质量组再分为正常体质量对照组(A组)和正常体质量哮喘组(B组),肥胖组再分为肥胖对照组(C组)和肥胖哮喘组(D组)。参照文献[9]复制大鼠哮喘模型:B、D两组喂养7周后第1天和第8天腹腔内注射抗原液0.5 m L(含OVA 1 mg,氢氧化铝20μg)致敏。自第15天开始以1%OVA雾化激发,每次30 min,持续2周,每周3次。A、C两组致敏和激发均以生理盐水(NS)代替OVA。

1.2.3 致敏血清的留取

用脱臼法处死B、D组大鼠,以手术剪剪开胸部,用5 m L注射器从心尖处抽取血液后离心取致敏血清灭火滤菌备用,分别用于B、D组培养ASMC的干预。

1.2.4 ASMC的培养和传代

无菌摘取A、B、C、D组大鼠气道平滑肌组织,贴壁法进行细胞的原代培养。用胰酶消化法进行ASMC传代并自然纯化,实验用第5~6代细胞。培养的ASMC经形态学观察和免疫组织化学法测肌动蛋白(a-actin)的表达进行鉴定[10]。

1.2.5 反转录PCR(RT-PCR)检测OB-R的表达

各收集1瓶A、B、C、D组未干预的ASMC提取细胞总RNA,采用一步法行RT-PCR反应。OB-R上下游引物序列如下:上游为5'-CAGATTCGATATGGCT TAAATGG-3';下游:5'-GTTAAAATTCACAAGGGAG GCA-3'。OB-R片段长度为474 bp。反应条件:48℃45 min,1个循环;94℃2 min,1个循环;94℃、50℃各30 s,68℃2 min,各40个循环;最后68℃7 min,1个循环。以β-actin基因作为内对照。取PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳,采用美国UVP公司GDS8000型凝胶成像分析系统采集电泳图像对目的条带进行扫描分析,以待检测指标与β-actin吸光度的比值来表示其相对含量(目的基因相对表达量=目的基因条带吸光度/β-actin基因条带吸光度)。

1.2.6 Western blotting检测GR-β蛋白表达

将第5代ASMC按5×105接种于6孔板,分别用NS和LP(50 ng/mL)干预A、B、C、D组细胞48 h后提取细胞总蛋白,经电泳、转膜后杂交,一抗为小鼠抗大鼠Caspase-3单克隆抗体,二抗为碱性磷酸酶偶联马抗小鼠IgG,以NBT/BCIP显色。条带灰度分析用Image J软件。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行分析,所有数据以均数±标准差(x±s)表示,数据均为正态分布。多组间用单因素方差分析,组间两两比较用q检验,采用Pearson相关分析进行相关性检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ASMC的鉴定

倒置显微镜下,培养的ASMC呈梭形,平行生长,束状排列,密集与稀疏处相互交错呈“峰谷状”。免疫细胞化学检测法表明,抗平滑肌α-actin抗体呈阳性染色即胞浆内可见大量绿色荧光,证实所培养细胞是ASMC(见图1、2)。

2.2 RT-PCR法检测OB-R的表达

电泳结果示在500 bp处有明显条带,其大小与OB-R目的基因片段相符,说明AMSC上有OB-R表达,结果见图3,且B组(0.389±0.046)、C组(0.404±0.037)OB-R表达量均较A组(0.305±0.043)明显增高(均P<0.05),均较D组(0.552±0.066)明显降低(均P<0.05),而B、C两组OB-R表达量之间差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 LP对肥胖哮喘AMSC GR-β蛋白表达的影响

Western blotting检测显示,在NS干预的情况下,B、C两组细胞GR-β蛋白表达量分别为(0.40±0.02)和(0.37±0.05),均较A组蛋白表达量(0.17±0.03)明显增加(均P<0.05),均较D组蛋白表达量(0.48±0.02)明显减弱(均P<0.05),而B、C两组蛋白表达量之间差异无统计学意义(P>0.05)。在LP干预的情况下,各组细胞GR-β蛋白表达量均分别较相应的NS干预组的蛋白表达量有明显增加(F=377.04,均P<0.01),且B、C两组细胞GRβ蛋白表达量分别为(0.72±0.03)和(0.71±0.06),仍较A组蛋白表达量(0.42±0.04)明显增加(均P<0.05),较D组蛋白表达量(0.82±0.05)明显减弱(均P<0.05),而B、C两组蛋白表达量之间差异仍无统计学意义(P>0.05),结果见图4。

3 讨论

肥胖是哮喘发病的一个主要危险因素,它不仅使哮喘的发病率增加,而且还与哮喘的严重程度呈正相关[11]。FORNO等[12]也指出,超重或肥胖哮喘的孩子与正常体质量者相比,对布地奈德治疗不敏感,表现在长期肺功能无改善,且因哮喘急性发作引起急诊率或住院率提高。此外,KILIC等[7]已证实肥胖是哮喘难以控制的一个重要因素,而这可能与患者血清中LP水平较高有关联。因此实验中笔者复制肥胖哮喘大鼠模型,并以LP干预AMSC模拟肥胖哮喘患者血清高LP水平的环境,进一步观察LP在肥胖哮喘致病中的作用。

LP是肥胖者脂肪组织表达的促炎分子,它能够独立于肥胖而促进哮喘的气道炎症[13],并以中性粒细胞和Th1型炎症反应增强为特点[14]。此外,LP还可以直接作用于人的AMSC,诱导其分泌血管内皮细胞生长因子(VEGF)以参与哮喘气道重塑的发生[6]。其生物学效应是通过游离的LP与相应的OB-R结合后发挥的,在小鼠和人的肺泡、支气管上皮细胞和AMSC[15]上均有OB-R的表达。本实验中笔者应用RT-PCR法检测大鼠AMSC OB-R的表达,结果与上述一致,而且进一步发现,肥胖哮喘性大鼠ASMC OB-R的表达量明显增加,这就为LP可以直接作用于AMSC及其能够诱导肥胖哮喘性大鼠发生激素抵抗提供了理论前提。

在哮喘的发病机制中,ASMC不仅参与气道狭窄的形成,其在气道炎症和气道重塑中也充当了重要的角色,这主要起因于ASMC内在的异常性。其异常性主要表现在增殖速率加快、分泌更多的细胞因子、化学因子及各种不同类型的细胞外基质蛋白等[16]。此外,ASMC还可发生自身基因的改变,最终导致对常规激素治疗不敏感。如IFN-γ及TNF-α联合长期干预ASMC可通过上调GR-β引起皮质醇抗炎作用降低[4]。GC是控制哮喘气道炎症的首选药物,其抗炎作用的发挥是由其受体(glucocorticoid receptor,GR)介导的,GR分为GR-α及GR-β两种亚型。GR表达变化、配体与GR间亲和性改变、GR与DNA结合力降低、辅助阻遏蛋白的表达减少或活性降低、炎症转录因子(如NF-кB和AP-1)表达增加等可能是GC抵抗的分子机制[17]。

大鼠主动脉平滑肌细胞 篇4

1 材料与方法

1.1 实验动物和试剂:

SD大鼠由山西医科大学动物实验中心提供。吡格列酮 (沈阳施德) , GW9662 (sigma公司) , DMEM高糖型培养基 (Gibco) , 胎牛血清 (杭州四季青公司) , 特异性小鼠抗大鼠α-平滑肌肌动蛋白 (武汉博士德) DAB显色试剂盒 (武汉博士德) , 钙离子定量检测试剂盒和碱性磷酸酶 (ALP) 检测试剂盒 (南京建成生物工程研究所) , TUNEL试剂盒 (罗氏公司) SP免疫组化试剂盒 (北京博奥森) , 余为市售分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 VSMCs培养及鉴定:

采用无菌方法取160 g左右Sprague-Dawley雄性大鼠胸主动脉中膜, 将中膜剪成约1 mm×1 mm大小, 贴培养皿底部, 放入含20%胎牛血清的DMEM培养基, 置于37℃、5%CO2的孵箱中培养, 用0.125%胰蛋白酶消化传代。实验选用第5~10代细胞。经SMα-actin免疫细胞化学染色确定为平滑肌细胞。

1.2.2 分组及处理:

取上述平滑肌细胞生长至融合状态后, 分别置于六孔板中进行试验。本实验分6组: (1) 空白对照组 (加入10%DMEM细胞培养液) ; (2) 钙化组 (加入钙化培养基, 钙化培养基是在常规培养基中加入10 mmol/Lβ-甘油磷酸 (β-GP) 和10 mmol/L丙酮酸钠) ; (3) 钙化+PPAR-γ抑制剂 (加入钙化培养基、25 mmol/L GW9662) ; (4) 钙化+PIO (10、50、100μmol/L) 组 (加入钙化培养基中以及加入不同浓度 (10、50、100μmol/L吡格列酮) 。每组设3个复孔, 细胞每隔两天换液1次, 连续培养15 d[4]。

1.2.3 VSMCs钙化的染色鉴定:

取1.5 cm×0.5 cm的盖玻片数枚放入6孔板内, 以1.2×105接种密度进行细胞爬片。分别制作实验组和对照组的细胞爬片。取出盖玻片先用预冷4℃的PBS缓冲液洗涤2次, 浸入冰丙酮中固定20 min。 (1) 将细胞玻片放入1%茜素红S溶液内染色30 min, 用0.2%醋酸溶液快速冲洗l次, 滤纸吸干。系列酒精脱水, 二甲苯固定、封片。显微镜下钙盐沉积处被染为橘红色。 (2) Von Kossa染色:将细胞玻片放入5%硝酸银溶液避光孵育15 min, 紫外灯照射10 min, 洗涤后浸入1%硫代硫酸铵溶液1 min, 洗涤后碱性品红复染。显微镜下观察钙盐沉积处为黑色。

1.2.4 VSMCs的钙含量测定:

弃上层培养基, 用PBS缓冲液冲洗细胞2次, 加入适量0.6 N盐酸, 37℃去钙化作用24 h。采用钙离子定量检测试剂盒测定。剩余细胞用PBS洗3次, 加入0.05 mol/L Na OH/0.1%SDS细胞裂解液, 30 min后提取胞质蛋白, 用BCA法蛋白分析试剂盒测定总蛋白, 钙含量用蛋白含量标准化。

1.2.5 VSMCs的碱性磷酸酶活性测定:

弃上层培养基, 用PBS缓冲液冲洗细胞2次, 加入适量含1%Triton X-100的生理盐水, 置于4℃冰箱24 h。用超声波处理25 s后反复吹打, 使细胞充分破裂 (倒置显微镜下观察到细胞破碎、无完整的细胞结构) , 离心后取上清用碱性磷酸酶 (ALP) 检测试剂盒测定ALP活性。测量时提取胞质蛋白并测定总蛋白含量, 用其校正细胞层ALP活性。

1.2.6 流式细胞术检测VSMCs凋亡率:

各组细胞用0.25%胰酶 (无EDTA) 消化, 血清终止消化后转移至离心管, 1000 rpm离心10 min, 弃上清, 用PBS冲洗2~3次, 弃上清, 每管500μL buffer重悬, 分别加入Annexin V-FITC, PI染液各5μL, 避光反应15 min, 流式细胞仪检测细胞凋亡百分率。

1.2.7 TUNEL法检测VSMCs凋亡率:

弃上层培养基, 收集细胞, 采用细胞凋亡原位检测试剂盒, 即TUNEL法进行检测, 之后用DAPI染液染色封片, 荧光倒置显微镜下观察。TUNEL阳性呈绿色荧光, DAPI呈蓝色荧光。每个细胞爬片观察4个独立视野, 计算每100个细胞的凋亡个数, 计算凋亡率。

1.2.8 RT-PCR测定GRP-78, caspase-12和PPAR-γm RNA的表达:

见表1。应用RNA提取试剂盒提取RNA, 并用微量分光光度计进行检测其吸光度在1.8~2.0, 其后取5μL RNA按照反转录试剂盒制备c DNA后, 进行PCR扩增。

1.3 统计学处理:

数据用 (±s) 表示, 采用SPSS 13.0统计软件进行处理, 组间比较采用单方差分析, 多重比较采用LSD法。

2 结果

2.1 血管平滑肌鉴定:

倒置显微镜下观察, 可见原代平滑肌细胞从组织块边缘游出 (图1A) 血管平滑肌细胞呈梭型, 逐渐呈现束状排列, 出现典型的“峰谷样”样生长。经特异性免疫组化SMα-actin染色, 可见胞质内SMα-actin表达丰富, 细丝状排列, 符合血管平滑肌细胞特征。

2.2 钙化的血管平滑肌细胞鉴定:

倒置显微镜下观察, 可见血管平滑肌细胞透明度下降, 表现为多层生长状态, 部分细胞脱死亡。空白对照组与单纯钙化组相比:茜素红S染色时, 钙化组 (A2) 与对照组 (A1) 比较可见橘红色区域, 散装分布, 证实有钙盐沉积;Von Kassa染色时, 钙化组 (B2) 与对照组 (B1) 比较可见黑色沉积区域, 证实有钙盐沉积。

图1原代培养大鼠VSMCs及鉴定 (×200) A, B为原代大鼠VSMCs, C为大鼠VSMCs SMα-actin免疫细胞化学染色

图2茜素红S染色细胞结节处可见橘红色沉积;Von Kossa染色细胞结节处可见黑色颗粒沉积

2.3 吡格列酮对VSMCs钙含量、碱性磷酸酶活性:

见表2。与对照组相比, 钙化组的钙含量、ALP活性含量均升高 (P<0.01) ;不同浓度吡格列酮组的钙含量、ALP活性与钙化组相比较均明显升高 (P<0.05) , 且呈剂量依赖。

注:a为P<0.01, 与空白对照组相比;b为P<0.05, 与钙化组相比

2.4吡咯咧酮对VSMCs凋亡的影响:

钙化组与对照组相比, 出现大量细胞凋亡, 差异显著 (P<0.01) ;不同浓度吡咯列酮处理后在流式图中B4区和B2区的细胞分布均明显增多, 即促进了细胞钙化造成的凋亡和坏死, 凋亡率均较钙化组明显减低 (P<0.05) , 且吡咯列酮的作用呈现剂量依赖关系 (表3和图3) 。

注:a为P<0.01, 与对照组比较;b为P<0.05, 与钙化组比较

2.5 TUNEL法检测各组VSMCs凋亡率:

倒置荧光显微镜下观察, 可见TUNEL阳性信号呈绿色荧光, 而所有细胞核经DAPI荧光染料复染后, 呈蓝色。与对照组相比, 钙化组和钙化+PIO处理组凋亡细胞增多, 差异显著 (P<0.01) ;PIO处理组与钙化组相比, 细胞凋亡率显著增高 (P<0.05) 。见图4。

注:倒置荧光显微镜下观察, 可见TUNEL阳性信号呈绿色荧光, 而所有细胞核经DAPI荧光染料复染后, 呈蓝色。柱状图中:1正常组;2钙化组;3钙化+10μmol/L PIO;4钙化+50μmol/L PIO;5钙化+100μmol/L PIO;6钙化+GW9662;a为P<0.05与正常对照组比较;b为P<0.05与钙化组比较。

2.6 GRP-78、caspase-12及PPAR-γm RNA的表达:

与空白组比较, 钙化组和钙化组+PIO处理组, GRP-78、caspase-12及PPAR-γm RNA表达增高, 差异显著 (P<0.01) ;与钙化组比较, 钙化+PIO处理组GRP-78、caspase-12及PPAR-γm RNA表达显著增高 (P<0.05) , 且呈剂量依赖。见图5。

3 讨论

血管钙化与冠心病、心肌梗死、脑卒中等多种疾病相关, 是发生心、脑血管急症的重要危险因子。以往认为VC是钙盐在细胞内和细胞外基质的被动沉积, 近年来研究发现VC是一种与骨发育类似的主动的、可调控的生物学过程, 类似于骨和软骨形成过程中的骨化, 主要特征是血管细胞尤其是血管平滑肌细胞成骨样表型转换[5,6]。随血管平滑肌细胞组织钙化的进展, 原有的细胞功能发生改变, 具备了骨细胞的特征和功能, 呈现出骨细胞特异性蛋白及基因表达。

图5各组VSMCs m RNA表达的比较a为P<0.01, 与空白对照组相比;b为P<0.05, 与钙化组相比。

内质网应激是内质网内环境在外界环境影响下, 内质网折叠蛋白质发生未折叠或者异常蛋白蓄积, 导致“未折叠蛋白反应。”已有研究证实内质网应激参与细胞凋亡的过程, 通过上调GRP78来发挥作用[7], 同时GRP78被公认为内质网应激的标志。caspase-12的激活是促发内质网凋亡的重要途径。Proudfoot等[8]实验发现:人体VSMC在钙化发生前就出现细胞凋亡特征, 其培养l周后出现来源于VSMC凋亡小体的基质囊泡 (基质囊泡是正常软骨内骨钙化的生发中心) ;进而说明了凋亡小体的功能类似骨基质囊泡, 其能够蓄积钙, 促进VSMC骨相分化。

吡格列酮作为PPAR-γ激活剂已广泛应用于临床糖尿病的治疗, 除此之外, 有报道称该类药物可减轻动脉粥样硬化和促进血管平滑肌细胞凋亡的作用, 其机制可能是通过快速激活TGFβ1, 进而引起细胞凋亡[9]。研究发现, PPAR-γ激活时, 凋亡相关基因p53和bal-2出现异常表达, 促进平滑肌细胞凋亡[10]。但吡咯咧酮是否通过激活PPAR-γ, 进而影响血管平滑肌细胞凋亡, 促进血管平滑肌细胞钙化鲜有报道。因此, 本实验采用体外BGP诱导血管平滑肌细胞钙化, 观察比格咧酮对血管平滑肌细胞钙化的影响及机制。结果发现离体的血管平滑肌细胞可以形成明显的矿化结节, 钙含量及ALP活性较对照组明显增加, 标志着局部细胞已发生成骨细胞样化。血管平滑肌细胞钙化后, 凋亡率明显增加, 内质网应激指标GRP78及caspase-12m RNA水平明显增加;同时比格咧酮处理后, 上述改变加重。结果证实比格咧酮可以促进PPAR-γ的表达, 促进血管平滑肌细胞钙化, 促使血管平滑肌细胞向成骨样细胞表型转化, 其机制可能是作用于内质网, 通过上调GRP78及caspase-12, 促使内质网应激状态加重, 引起过度内质网应激, 加重细胞钙化。但抑制PPAR-γ活性作为很有前途的抗血管钙化手段, 还需对其在VC中的作用做进一步研究。

摘要：目的 探讨吡咯列酮通过内质网应激致凋亡途径对大鼠血管平滑肌细胞钙化影响。方法 利用β-甘油磷酸钠联合丙酮酸钠制备钙化血管平滑肌细胞模型, 予不同浓度 (10、50、100μmol/L) 吡咯咧酮干预。用Von Kossa染色及茜素红S染色观察细胞钙化程度, 用甲基百里香酚蓝法测定各组细胞中钙含量, 磷酸苯二钠法测定细胞中碱性磷酸酶 (ALP) 活性。采用流式细胞术及TUNEL法检测细胞凋亡率, 实时荧光定量RT-PCR检测各组细胞PPAR-γ、GRP78和caspased-12表达。观察吡咯列酮通过内质网应激致凋亡对大鼠血管平滑肌细胞钙化影响及其可能的分子机制。结果 钙化血管平滑肌细胞其钙含量、ALP活性较普通细胞增多 (P<0.01) , 而吡格列酮呈剂量依赖性地促进钙化大鼠血管平滑肌细胞的钙含量、ALP活性, 以及PPAR-γ、GRP78、caspase-12m RNA表达 (P<0.05) 。结论 吡咯列酮通过内质网应激致凋亡途径作用可促进β-磷酸甘油诱导的血管平滑肌细胞钙化, 其作用可能与PPAR-γ及GRP78、caspase-12表达上调有关。

关键词：血管钙化,内质网应激,血管平滑肌细胞,吡咯列酮

参考文献

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[3]Kapustin AN, Davies JD, Reynolds JL, et al.Calcium regulates key components of vasculμLar smooth muscle cell-derived matrix vesicles to enhance mineralization[J].Circ Res, 2011, 109 (1) :e1-12.

[4]Bear M, Butcher M, Shaughnessy SG.Oxidized low-density lipoprotein acts synergistically with beta-glycerophosphate to induce osteoblast differentiation in primary cultures of vascular smooth muscle cells[J].Cell Biochem, 2008, 105 (1) :185-193.

[5]Sasaki T, Nakamura K, Sasada K, et al.Matrix metalloproteinase-2deficiency impairs aortic atherosclerotic calcification in ApoEdeficient mice[J].Atherosclerosis, 2013, 227 (1) :43-50.

[6]Shimizu T, Tanaka T, Iso T, et al.Azelnidipine inhibits msx2-dependent osteogenic differentiation and matrix mineralization of vascular smooth muscle cells[J].Int Heart J, 2012, 53 (5) :331-335.

[7]Proudfoot D, Skepper JN, Hegyi L, et al.The role of apoptosis in the initiation of vascular caleification[J].Z Kardiol, 2001, 90 (3) :43-46.

[8]Xin W, Li X, Niu K, et al.Involvement of endoplasmic reticulum stress-associated apoptosis in a heart failure model induced by chronic myocardial ischemia[J].Int J Mol Med, 2011, 27 (4) :503-509.

[9]刘厂辉, 李建平, 阳辉.罗格列酮对高脂血症大鼠平滑肌细胞凋亡的影响及机制探讨[J].中国动脉硬化杂志, 2012, 20 (3) :199.

大鼠主动脉平滑肌细胞 篇5

1 材料与方法

1.1 材料

健康纯系雄性SD大鼠40只,质量250 g左右(泸州医学院动物科提供,Ⅰ级动物,许可证号:川实动管质第17号);Annexin V-FITC和PI细胞凋亡检测试剂盒(Beckman公司);JC-1线粒体膜电位检测试剂盒(Biovision公司);链脲佐菌素(streptozotocin,STZ,Sigma公司),Trizol(美国MRC公司);Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(立陶宛MBI公司);EPICS-XL型流式细胞仪(美国Beckman公司);FTC2000实时荧光定量基因扩增仪(加拿大FUNGLYN公司)。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病模型建立

参考文献方法[3],以血糖持续一周≥16.9 mmol/L为造模成功。(1)一般指标:测进食量、饮水量、尿量等,每周测体重1次,取材前1d再测体重。(2)血糖测定:造模后3 d及第1、4和8周采尾血测空腹血糖,取材前再测血糖1次。

1.2.2 胃肠动力学指标

造模成功10周,两组大鼠禁食不禁水24 h,将1 mg/mL的美蓝溶液0.4 mL经口胃管灌入,30 min后处死大鼠:(1)取全胃,将胃内残留物用4 mL生理盐水冲洗并收集冲洗液,低速离心机3 500 r/min,离心15 min,取上清液,用722分光光度计在640 nm波长检测吸光度值(OD)。大鼠胃排空情况用胃内色素的残留率表示,胃内色素残留率=测定管OD值/标准管OD值×100%。

1.2.3 流式细胞术

取胃体部平滑肌,机械与胶原酶消化混合法获单细胞悬液,调整细胞悬液密度为1×106/mL。Annexin V-FITC和PI双染法检测细胞凋亡率。JC-1荧光检测线粒体膜电位(△φm)。△φm正常时,JC-1以聚合物形式在线粒体内,发红色荧光,被FL-2(PI)通道纪录;△φm降低时,JC-1以单体形式留在胞浆内,发绿色荧光,被FL-1(FITC)通道纪录。

1.2.4 荧光定量RT-PCR检测ANT1

mRNA(1)取材:取胃体部平滑肌组织,每块1 cm3,迅速至-196℃液氮冻存。(2)引物设计合成及染料:从Genbank中调出ANT的c DNA序列,根据引物设计原则,上游引物序列为5'-TAGGCAATAGCATAA-GAGCGGC-3',下游引物序列为5'-GTCCAGTGGGT AGACGAAGC-3'。引物由四川大学华西分子遗传实验室合成。(3)组织总RNA的提取:按照RNA抽提试剂盒的操作步骤,取冻存大鼠胃平滑肌组织50 mg提取总RNA,并制备cDNA。(4)荧光定量RT-PCR法检测胃平滑肌细胞ANT mRNA。经过最后循环后,用PCR扩增仪自带软件进行荧光定量分析,并计算出△ct值。荧光定量RT-PCR结果使用比较阈值法进行定量分析,其计算方法是:目的基因相对量=2-△△Ct,Ct值是热循环仪中荧光达到荧光阈值的循环数,△△Ct=实验组△Ct(目的基因Ct-管家基因Ct)-对照组△Ct(目的基因Ct-管家基因Ct)。

1.2.5 免疫组织化学检测Cyt C

取胃体部组织常规石蜡包埋、切片,免疫组织化学步骤参考说明书。Cyt C阳性结果判断:胞质着棕黄(褐)色。每组取10个标本,每个标本3张切片,显微数码照像,image-proplus5.0软件计算阳性细胞百分率。

1.3 统计学分析

数据采用SPSS 14.0软件包进行分析,计量资料以均数±标准差表示,各组均数间比较采用t检验,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 动物一般情况

对照组一般状况良好;模型组于造模后3 d开始出现多饮、多食及多尿,至10周时模型组体重明显低于对照组(t=12.097,P<0.01),见附表。

2.2 血糖浓度测定

造模3 d后,模型组空腹血糖始终维持在16.7mmol/L以上,对照组低于7 mmol/L(t=43.434,P<0.01),见附表。

2.3 胃内色素残留率

模型组大鼠胃内美蓝残留率明显高于对照组,(53.49±4.33)vs(38.96±4.97),t=7.733,P<0.01。

2.4 细胞凋亡率测定

模型组胃SMC凋亡率显著高于对照组,(11.32±2.84)%vs(2.27±0.81)%,t=9.699,P<0.01,见图1。

2.5 线粒体膜电位(△φm)

与对照组相比,模型组红荧光强度显著减少,(3.169±0.519)vs(1.706±0.331),t=7.509,P<0.01);绿荧光强度显著增加,(2.529±0.084)vs(2.790±0.115),t=5.768,P<0.01)。

2.6 ANT mRNA测定

用比较阈值法进行半定量分析,模型组大鼠胃平滑肌细胞的线粒体ANT mRNA含量是对照组的2倍,见图2。

2.7 Cyt C表达测定

模型组Cyt C阳性细胞百分率显著高于对照组,(18.20±5.09)%vs(5.10±2.77)%,t=7.145,P<0.05)。

3 讨论

本实验造模10周后检测糖尿病大鼠胃排空减弱,证实糖尿病胃轻瘫造模成功。DGP确切发病机制尚未完全阐明,目前认为与神经病变、胃肠道Cajal间质细胞(ICC)缺失或病理损害、微血管病变和微循环障碍等因素有关。近年来大量研究发现,糖尿病可致不同部位细胞凋亡。糖尿病可致大鼠视网膜神经元凋亡增加[4,5]。糖尿病大鼠心肌细胞凋亡在糖尿病心肌病变中扮演重要角色[6]。糖尿病可导致大鼠肾小管细胞凋亡增加[3]。前期研究及本实验均显示,糖尿病可致大鼠胃SMC凋亡增加,后者则引起正常SMC数量减少,进而减弱胃运动,可见凋亡导致的胃平滑肌损伤可能参与了DGP的发生。目前认为,凋亡主要信号通路是死亡受体信号通路和线粒体信号通路[7]。线粒体通路是20世纪后期提出的。1996年,有学者[8]发现Cyt C具有激活caspase的作用,为线粒体参与凋亡提供了直接证据。目前,已逐渐认识到线粒体是细胞凋亡的“中心执行者”[9]。

大鼠主动脉平滑肌细胞 篇6

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

SPF级SD大鼠 (雄性, 200~250 g) 由广西医科大学实验动物中心提供;I型胶原酶、木瓜蛋白酶、胰酶、戊巴比妥钠、卵清白蛋白、氢氧化铝凝胶、大鼠TN F-α蛋白、四甲基偶氮唑蓝 (M TT) 、二甲基亚砜 (D M SO) 、PD TC为美国Sigm a公司产品;灭活的百日咳杆菌有北京生物所提供;胎牛血清 (Fetal Bovine Serum, FBS) 、D M EM培养基、PBS、D-H ank's液购自美国G ibcol公司;脂质体购自英伟公司;Taq D N A聚合酶、d N TPs、逆转录酶 (M-M LV) 、随机引物 (R andom Prim er) 、琼脂糖、焦碳酸二已酸均由大连宝生公司提供, PCR引物、内参照β肌动蛋白 (β-actin) 引物及特异性引物由上海生物工程有限公司合成;Tunnel试剂盒为南京凯基生物有限公司产品;N F-κB ELISA试剂盒为上海西塘生物有限公司产品。

1.2 仪器与设备

H era cell 150二氧化碳培养箱为美国Therm o公司产品;A xioert 40倒置显微镜为德国ZEISS公司产品;450型ELISA酶标仪为BIO R A D公司产品;PCR仪为美国M J R esearch Co公司产品;低温高速离心机为美国Beckm an公司产品, 紫外分光光度仪为美国Biochrom公司产品;G BO X H R型全自动图像分析仪为德国产品;402A I型超声雾化器为江苏省鱼跃医疗设备有限公司产品;小动物解剖器械一套由上海医疗器械 (集团) 有限公司手术器械厂提供;BG-SU BM IN I水平电泳仪、BG-V ER M IN I垂直电泳仪为北京BA Y G EN E公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1 哮喘大鼠模型的建立

第1、8天将每只大鼠于皮下注射10 m g卵清蛋白 (O V A) 和200 m g氢氧化铝凝胶 (混合于1 m L的PBS中) , 同时腹腔注射5×109个灭活百日咳杆菌。于第15天开始激发:将大鼠置于一密闭容器中, 用超声雾化器给予2%O-V A磷酸盐缓冲液 (O V A.PBS) 50 m L雾化吸入刺激, 每天1次, 每次30 m in。诱喘成功后大鼠表现为前8、9 m in烦躁不安, 进而出现呼吸加快、加深、静伏不动、弓背, 严重者伸颈、缩胸、收缩呈喘息状, 有的大小便失禁等。对照组则以磷酸盐缓冲液 (PBS) 代替致敏原注射和雾化吸入。

1.3.2 哮喘大鼠支气管平滑肌细胞的分离、培养及鉴定

按2.1方法建立哮喘大鼠模型, 取哮喘4周大鼠, 腹腔注射3%戊巴比妥钠 (45 m g/kg) 麻醉, 开胸后迅速取出左肺、右中肺及右下肺叶置于预冷的D-H ank's液中, 沿着支气管的走向分离出主支气管, 在解剖显微镜下, 用显微镊剥离支气管平滑肌周围的肺动脉、肺静脉、神经纤维、结缔组织等, 去除内腔面的上皮组织。以上操作均在冰浴中进行。将获得的单层A SM剪成1 m m×1 m m的小块后, 将组织块转入含有下列成分的D-H ank's液中:胶原酶2m g/m L, 木瓜蛋白酶3 m g/m L, 胰酶2 m g/m L, 37℃5%二氧化碳培养箱中消化40~50 m in, 用吸管轻轻地吹打组织块, 100目不锈钢网过滤除去残余组织块, 800 r/m in离心后, 去上清, 加入含20%FBS、青霉素 (100 u/m L) 、链霉素 (0.1 m g/m L) 的D M EM培养液悬浮所分离的单细胞, 种于25 m L培养瓶中, 37℃5%二氧化碳培养箱中培养。原代培养细胞生长约3周后融合, 用0.25%胰蛋白酶消化传代。以含10%FBS、青霉素 (100 u/m L) 、链霉素 (0.1 m g/m L) 的D M EM培养液传代培养, 每3、4天换液1次, 约5、6d细胞长满后传代, 实验用第4~8代细胞。培养的A SM Cs经免疫组织化学方法鉴定平滑肌细胞特有的α-肌动蛋白。

1.3.3 分组

(1) 空白对照组:取培养的4~6代哮喘大鼠气道平滑肌细胞, 不加任何干预剂; (2) TN F-α组:加入TN F-α (终浓度为20 ng/m L) ; (3) (TN F-α+PD TC) 组:PD TC (终浓度为100μm ol/L) 预处理30 m in后, 加入TN F-α (终浓度为20ng/m l) ; (4) (TN F-α+TLR 4) 抗体组:TLR 4抗体 (终浓度为50μg/L) 预处理30 m in后, 加入TN F-α (终浓度为20 ng/m L) 每组做4个复孔, 每组重复实验2次。各组加入不同试剂培养24h后收集细胞及培养上清液, 进行以下实验。

1.3.4 四甲基偶氮唑蓝 (M T T) 微量比色法测定A SM C s增殖

哮喘大鼠A SM Cs按1×106/m L的密度接种于96孔培养板, 培养及分组如前述, 培养结束时每孔加入20μL M TT (5 m g/m L) , 继续培养4h, 弃培养液。再加入D M SO 150μL, 微量振荡器振荡10 m in, 使结晶物充分溶解。酶联免疫检测仪490nm波长处测定各孔吸光度 (A) 值。

1.3.5 T U N N EL法检测A SM C s凋亡

6孔培养板中加入盖玻片, 哮喘大鼠A SM Cs按1×106/m L的密度接种, 细胞长满盖玻片后按上述步骤加药、培养。培养结束后收集盖玻片, PBS液冲洗, 纯丙酮固定8m in, 制成细胞爬片。制细胞爬片后按TU N N EL试剂盒操作说明步骤进行TU N N EL法检测A SM Cs凋亡。凋亡细胞呈深棕色。凋亡率为每个高倍视野中凋亡细胞所占百分比, 计数5个视野取平均值。

1.3.6 ELISA试剂盒检测N F-κB的蛋白含量

哮喘大鼠A SM Cs4-6代细胞按1×106/m L的密度接种于6孔培养板, 培养及分组如前述, 培养48 h后, 离心, 取细胞上清液用ELISA试剂盒检测N F-κB的蛋白含量, 操作步骤按试剂盒说明进行。

1.3.7 逆转录聚合酶链式反应 (R T-PC R) 检测T LR 4的m R N A水平

各组哮喘大鼠A SM Cs按1×106/m L接种于50 m L细胞培养瓶中, 培养及分组如前述。培养结束后PBS洗涤, 0.25%胰蛋白酶消化收集细胞 (每瓶细胞数约为107) , 然后加入TR I-zo1 1m L抽提R N A (按试剂盒说明书操作) , 于-80℃保存, 用于一步法R T-PCR。

(1) TLR 4 R T-PCR扩增反应。TLR 4引物序列, 上游5'-CG CTTTCA CCTCTG CCTTCA CTA CA G-3', 下游5'-A CA CTA CCA CA A TA A CCTTCG G CTC-3', 此对引物扩增出270 bp的片段。β-actin引物序列:上游5'-G A TTA CTG CTCTG G CTCCTG C-3', 下游5'-G A CT CA TCG TA CTCCTG CTTG C-3', 此对引物扩增出150bp的片段。严格按大连宝生生物公司D R R 024A一步法R T-PCR反应体系说明书逐步操作, TLR 4上、下游引物各1μL, β-actin上、下游引物各1μL, 扩增产物置进行琼脂糖电泳。 (2) 琼脂糖电泳反应成功后, 取5μL PCR产物加1μL D N A上样缓冲液和PCR M arker (分子量标准) , 点样在2%琼脂糖凝胶的样板孔中, 凝胶中含有0.5μg/m L的溴化乙锭 (EB) 显色, 电泳电压0.8 V/cm, 时间30 m in。电泳结束后, 采用G BO X H R型全自动图像分析仪对电泳结果进行分析:分别测定每1个目的基因及看家基因β-actin的吸光度值, 取目的基因与β-actin吸光度值的比值。

1.3.8 W estern-Blot检测各组A SM C s中T IR 4的表达

参照《分子克隆》方法:A SM Cs培养结束后, 按通用蛋白裂解液的使用说明提取细胞总蛋白, 用Bradford法测定总蛋白浓度, 适量分装, 置-80℃冰箱冻存, 待测。聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤如下:取40μg蛋白质样品 (使用前, 煮沸变性10 m in) 上样后, 先以10 V/cm电泳, 待染料前沿进入分离胶后, 将电压提高到18 V/cm, 继续电泳直至溴酚蓝达到分离胶底部 (约需2 h) 。分离胶用于电转膜, 依次安装半干式电转移仪后, 根据凝胶面积按0.2 m A/cm 2接通电流, 在电转移液中电转移35 m in。取下硝酸纤维素膜, 放入塑料袋中, 根据滤膜面积以0.1 m L/cm 2加入膜封闭液, 密闭袋口, 并放入摇床上室温孵育1h。弃去封闭液, 立即将硝酸纤维素膜放入塑料袋中, 按0.1 m L/cm 2的量加入一抗稀释溶液 (兔抗鼠TLR 4抗体:一抗稀释液为1∶1 000, 平放在摇床上室温孵育4 h。剪开塑料袋, 弃去稀释液和抗体, 用TBST漂洗滤膜3次, 每次10 m in。然后, 按滤膜面积加入0.1 m L/cm 2 TBS及1∶100辣根过氧化物酶标记的羊抗兔Ig G, 置摇床上室温孵育2 h。取出滤膜, 在TBST中室温平缓摇动, 每次孵育10 m in, 共3次。最后把滤膜按滤膜面积加入0.1 m L/cm 2的底物显色液, 于室温轻轻摇动, 待蛋白条带颜色深度适当 (约3~5 m in) , 即用PBS漂洗, 将滤膜用G BO X H R凝胶成像分析系统进行扫描读取各条带的吸光度 (A) 值。

1.3统计学分析

应用统计分析软件包SPSS17.0版本进行统计分析。实验数据用均数±标准差 (x±s) 表示, 用方差分析检测组间的总差异, 各两两组间差异比较用q检验完成, 以P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 原代哮喘大鼠气道平滑肌细胞鉴定

镜下观察经原代培养的哮喘大鼠A SM Cs和正常大鼠A SM Cs均呈梭形, 有较长的突起, 细胞核位于细胞中央, 呈疏密相间、典型的“峰与谷”样生长, 见图1。采用兔抗鼠α-actin单克隆抗体进行免疫组织化学染色, 免疫反应产物呈棕黄色。98%细胞α-actin染色阳性, 证明所培养的为平滑肌细胞, 见图2。

2.2 四甲基偶氮唑蓝 (M TT) 微量比色法测定A S M C s增殖

TN F-α组A SM Cs的增殖反应与对照组相比差异有显著性 (t=3.2, P<0.05) , (TN F-α+PD TC) 组、 (TN F-α+TLR 4) 抗体组A SM Cs增殖反应显著低于TN F-α处理组 (t=7.62, t=6.86, 均P<0.01) , (TN F-α+PD TC) 组与对照组相比差异无显著性 (t=0.74, P>0.05) , (TN F-α+TLR 4) 抗体组A SM Cs增殖反应显著低于对照组 (t=3.94, P<0.01) , 见表1。

2.3 各组A S M C s细胞凋亡分析

TU N N EL法结果显示:TN F-α处理组细胞凋亡率显著低于对照组 (t=6.37, P<0.01) 。 (TN F-α+PD TC) 组、 (TN F-α+TLR 4) 抗体组细胞凋亡率显著高于TN F-α组、对照组 (t=20.75, t=20.01, t=14.72, t=18.03, 均P<0.01) 。见表1和图3。

注:1) 与TN F-α比较, P<0.01;2) 与对照组比较, P<0.05;3) 与对照组比较, P<0.01

2.4 E LIS A测定各组哮喘大鼠A S M C s的N F-κB的蛋白含量

比较各组细胞培养上清液N F-κB蛋白含量可见:TN F-α组N F-κB含量显著高于对照组、 (TN F-α+PD TC) 组及 (TN F-α+TLR 4) 抗体组 (t=24.91, t=37.51, t=24.64, 均P<0.01) ;对照组N F-κB含量显著低于T (N F-α+PD TC) 组 (t=4.09, P<0.01) ;对照组与 (TN F-α+TLR 4) 抗体组之间差异无显著性 (t=1.57, P>0.05) , 见表2。

注:1) 与TN F-α组比较, P<0.01;2) 与对照组比较, P<0.01

2.5 逆转录聚合酶链式反应 (R T-P C R) 检测各组哮喘大鼠A S M C s的TLR 4的m R N A水平

各组电泳图经扫描发现:TN F-α组TLR 4m R-N A表达水平显著高于对照组及 (TN F-α+TLR 4) 抗体组 (t=6.06, t=7.64, P<0.01) ; (TN F-α+TLR 4) 抗体组TLR 4表达水平与对照组之间差异无显著性 (t=1.03, P>0.05) 。见表3、图4。

2.6 W estern blot检测各组哮喘大鼠A S M C s的TLR 4的蛋白表达水平

各组电泳图经扫描发现:TN F-α组TLR 4表达水平显著高于对照组及 (TN F-α+TLR 4) 抗体组 (t=39.22, t=86.62, 均P<0.01) ;对照组TLR 4表达水平显著高于 (TN F-α+TLR 4) 抗体组 (t=8.58, P<0.01) 。见图5。

3 讨论

支气管哮喘的重要病理特征之一是气道重构, 其中气道平滑肌细胞在疾病的发生、发展中起着重要作用。气道平滑肌细胞增殖在气道重构中占有十分重要的地位, 气道平滑肌增生, 不仅使支气管对刺激的收缩反应更强烈, 加重气道高反应性, 而且增殖的A SM C使气道壁增厚, 导致基础气道阻力增加和不可逆性气流阻塞的发生。

TLR s作为介导固有免疫和获得性免疫的天然细胞膜受体, 在受到前炎症因子及各种配体刺激时能被激活并将信号传递到下游通路从而激活炎症反应。激活的TLR不仅诱导炎症反应, 而且促进抗原特异性获得性免疫反应的分化和成熟[1]。N F-κB是一种重要的、多向性的核转录因子, 普遍存在于细胞质中的快速反应转录因子, 位于TLR s下游信号通路的枢纽位置参与免疫反应及细胞增殖与分化等过程。TLR s识别配体后经过细胞内的一系列信号转导过程最后活化N F-κB, 诱导靶基因表达[2,3,4,5]。有关TLR-N F-κB的信号转导过程主要来自对TLR 2和TLR 4的研究[6], 促进细胞因子合成与释放是TLR s/N F-κB最突出的生物学功能。所以, 笔者推测TN F-α可能通过激活TLR 4后将信号转导至下游激活N F-κB这一转录因子, 从而在哮喘A SM Cs的增殖、凋亡中起作用。因此, 本实验用TN F-α刺激哮喘大鼠A SM Cs, 利用TLR 4抗体及N F-κB特异性拮抗剂PD TC为工具药, 探讨TLR 4/N F-κB在哮喘大鼠A SM Cs中的表达及对A SM Cs增殖凋亡的影响。

本实验发现:TN F-α组TLR 4的m R N A及蛋白表达、N F-κB蛋白含量显著高于对照组; (TN F-α+TLR 4) 抗体组TLR 4的m R N A及蛋白表达、N F-κB含量显著低于对照组和TN F-α组, 笔者推测TLR 4可能通过激活N F-κB后产生一系列生物效应, 这与其他学者的研究结果一致。

A SM Cs的增殖在哮喘气道重构中起重要作用[7,8]。作为效应细胞的A SM Cs受到长期慢性的炎性刺激可出现增生肥大, 从而导致气道壁增厚、气道重构。本实验发现:TN F-α组TLR 4的m R N A及蛋白表达、N F-κB含量显著高于对照组, 同时TN F-α组A SM Cs的增殖反应与对照组相比有增加, 而 (TN F-α+TLR 4) 抗体组A SM Cs增殖反应显著低于TN F-α组及对照组, (TN F-α+TLR 4) 抗体组A SM Cs凋亡率显著高于对照组和TN F-α组。由此推测, TLR 4可能参与调控哮喘A SM Cs的增殖反应和细胞凋亡。在实验中还发现:TN F-α+PD TC组与对照组相比增殖反应差异无显著性, (TN F-α+PD TC) 组增殖反应显著低于TN F-α组;这与BR A R等[9]研究的N F-κB人气道平滑肌细胞增殖的结果一致。A SM Cs的细胞凋亡不足是气道重构的另一重要原因。实验结果显示: (TN F-α+PD TC) 组细胞凋亡率显著高于TN F-α处理组及对照组。因此, 笔者推测, 哮喘大鼠A SM Cs的TLR 4可能调控N F-κB活性从而促进细胞的增殖, 抑制细胞凋亡, 从而参与哮喘的气道重构。

综上所述, 本研究结果显示TLR 4/N F-κB可能参与哮喘大鼠气道平滑肌细胞的增殖、凋亡的调节, 从而在哮喘大鼠气道重构中起重要作用。TLR 4可能成为哮喘治疗干预靶点。

参考文献

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大鼠主动脉平滑肌细胞 篇7

血管平滑肌细胞在胚胎发生期来自中胚层, 在发育过程中, 逐渐分化为不同的细胞群, 并获得具有成年特征的分化表型。VSMC分化的特征是表达平滑肌特异的细胞骨架和可收缩蛋白变异体, 调节细胞外基质和细胞膜整合蛋白的构成。在高血压、动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄等血管病变, VSMC在新生内膜形成过程中暂时变成更接近胚胎期的未分化表型, 而在增厚的新生内膜中逐渐恢复为分化表型。在血管病变部位, 表型发生转化的VSMC在增殖的同时合成与分泌各种细胞因子和细胞外基质, 在AS斑块形成和RS发生过程中发挥重要作用。因此研究VSMC表型转化的分子机制, 对高血压RS和AS等血管疾病的防治具有重要意义。

正常的血管平滑肌细胞 (VSMC) 呈非增殖性的收缩表型, 在神经及激素的影响下调节血管壁张力、维持组织血流量。VSMC分化程度高, 呈典型的纺锤形或条带状, 胞质内有丰富的肌纤维, 可见致密体和致密斑, 粗面内质网和高尔基体等细胞器较少, 仅产生极微量的细胞外基质 (ECM) , 体积相对较小。主要通过表达一系列特异的收缩蛋白和骨架蛋白来维持收缩及调节血管张力、增殖、迁移能力。合成型VSMC分化程度低或未分化, 呈纤维母细胞样形态结构, 胞质内含极少肌丝, 但有大量粗面内质网、核糖体、高尔基体等细胞器, 具有强大的合成和分泌功能。细胞体积比收缩型大, 参与分泌细胞ECM和合成血管活性物质与血管壁的形成和损伤的修复以及在生长因子刺激下的分裂和增殖。

VSMC表型具有多样性和可变性的特点。在胚胎发育过程中, 由未分化表型逐渐分化为具有成年特征的分化表型。当血管受到损伤或体外培养的VSMC受到生长因子刺激时, VSMC又从分化型转化为去分化型并获得增殖能力, 这个过程称为表型转化。

2 影响VSMC表型转化的因素

血管平滑肌细胞 (VSMC) 的病理性增殖主要体现在其表型的转变, 即平滑肌细胞从收缩型向合成型的转变。VSMC表型受控于环境, 包括生长因子及其抑制剂、细胞外基质、机械性作用力、神经调节以及细胞间相互作用。

2.1 生长因子、细胞因子、心血管活性多肽和细胞外基质对VSMC表型转化的影响

血小板源生长因子就是一种较强的有丝分裂因子, 能促进平滑肌细胞的增殖和合成功能。有体外实验发现, 培养的平滑肌细胞由收缩表型转化为合成表型时, 合成胶原的量可增加20~30倍。研究发现, 血小板源生长因子作用后的平滑肌细胞含有更多的线粒体和粗面内质网, 表现为合成表型的平滑肌细胞, 细胞间质内有较多的胶原纤维分布。当肝素与血小板源生长因子同时作用于培养的平滑肌细胞时, 细胞浆内的肌丝成分较血小板源生长因子组的平滑肌细胞增多, 且线粒体、粗面内质网等减少, 细胞类同于收缩表型的特征。这提示血小板源生长因子能够促进平滑肌细胞向合成表型的转变, 而肝素可抑制此过程的发生。

2.2 收缩兴奋剂和神经递质对VSMC表型转化的影响

目前, 神经因素对VSMC表型转化的影响受到关注。去甲肾上腺素 (NE) 是交感神经的主要递质之一, 它作用于VSMC膜上的α1受体, 引起血管的收缩。刘斌等用NE分别作用于体外培养的和血清饥饿的血管平滑肌细胞, 用5-Brd U标记VSMC的增殖、RT-PCR检测VSMC表型标志基因SM22α和增殖负性调控基因高血压相关基因-1 (HRG-1) 的表达, 结果显示NE和OX-LDL分别作用血清培养的VSMC后, SM22α和HRG-1表达下降, 5-Brd U标记的阳性增殖细胞增多;NE分别与α1-肾上腺素受体拮抗剂 (α1-R-) 和β1-肾上腺素受体拮抗剂 (β1-R-) 共作用时, SM22α和HRG-1的表达明显上调。而当NE作用于血清饥饿VSMC时, NE上调, SM22α和HRG-1的表达。因此, NE对VSMC有促进表型转化和增殖的作用, 且这种作用呈现像神经样的可逆性调节作用, 其作用机制主要通过肾上腺受体α1和β1来实现。

2.3 机械性作用力对VSMC分化的影响

实验表明, 让VSMC在三维Ⅰ型胶原基质中伸展, 可使细胞内收缩性肌丝含量增加, 提示机械性作用力可促进VSMC分化。

3 VSMC表型转化的信号转导调节

目前研究最多的相关信号转导通路如下:磷脂酶C (PLC) /蛋白激酶C (PKC) 通路;Ca+/钙调蛋白 (Ca M) 依赖性蛋白激酶Ⅱ通路;丝裂原活化蛋白激酶通路;JAK/s TAT途径;NF-KB信号通路;磷脂酰肌醇3激酶 (PI3-K) /蛋白激酶B (PKB或AKT) 通路;TGF-β/Smad转导通路;环一磷酸腺苷通路。多条通路之间存在着广泛且复杂的交联机制, 形成一个复杂的信号网络。通过这一信号网络调控血管平滑肌细胞的增殖活动。

4 VSMC表型转化在动脉粥样硬化中的调控机制

VSMC表型转化的神经调节机制越来越受到关注, 主要推测血管交感神经对VSMC的调控作用, 其中NE因能促进动脉VSMC的增殖而成为主要的研究切入点。

在动脉粥样硬化的不同阶段, VSMC表型的转换具有重要的病理生理学意义。VSMC表型转化是一个渐进的过程, 虽然整体上人们将之分为收缩表型和合成表型, 但这两种表型代表的仅是两个极端, 大量过渡状态的中间类型可共存于同一血管壁内。VSMC在增殖过程中其表型由收缩型向合成型转变。合成型的VSMC移向内膜并吞噬内膜下的脂质变成泡沫细胞;另一方面各种损失因素导致血管壁受损, 继而释放各种生长因子和细胞因子, 激活VSMC表面受体, 并引起细胞内信号转导, 最终导致细胞核内某些基因的表达, 使VSMC大量增殖。同时合成型的VSMC还分泌大量的细胞外基质。

5 结论

正常情况下, 血管平滑肌细胞接受合适的刺激, 增殖, 迁移, 并合成分泌细胞外基质, 通过存活因子, 丝分裂素, 细胞间接触抑制及细胞基质间的相互作用正常调节细胞的增殖和死亡, 正常动脉的平滑肌细胞更新率很低, 凋亡及分裂指数也很低。病理条件下, 局部因素如炎性细胞因子, 炎性细胞和修饰型胆固醇, 全身因素如高血压等, VSMC表型由收缩型向合成型转变, 打破了细胞增殖和凋亡之间的相对平衡, 使血管壁发生病理改变。因此, 控制和逆转VSMC表型转化成为控制细胞异常增殖的关键性措施, 也为动脉粥样硬化疾病的治疗提供了新的理论思路。

参考文献

[1]庞玲品, 黄石安.血管平滑肌细胞表型转化相关因素及机制的研究进展[J].广东医学院学报, 2010, 28 (3) :312-314.